Transgenèse animale 

: méthodes de transferts
de gènes

Transgenèse : transfert de gènes étrangers (notion d’au moins de différences notables),

nécessitant des artifices visant un transfert stable.
Le transgène est transmis dans un organisme et devra pouvoir le transmettre à sa descendance

 Là où la totalité des cellules portent le transgène

 Là où seule une partie de l’organisme porte une partie des transgènes : mosaïques

Notion de traçabilité (tracer l’existence de ce transgène)

→ fluorescence comme traceur existant du transgène

Quand on fait un animal transgénique l’idée est de bénéficier de ce transgène

→ bénéfice de production de qqch & compréhension
→ interrompre expression d’un gène et permettre d’étudier ce gène
→ créations d’anomalies

Si phénotype d’intérêt (chez animal ou humain) on cherche le/les gènes qui seront candidats par
des méthodes d’analyses génétiques qui permet d’obtenir un gène candidat.

Un gène candidat s’obtient par clonage positionnel et microsatellites

→ corrélation entre un phénotype et un gène candidat
N’est pas une cause à effet, pour l’établir on fait intervenir la synthèse génétique (ou génétique
expérimentale).
L’animal pourra servir de cause à effet.

Première utilisation sur la GH : quand on inhibe le gène de l’hormone de croissance on obtient du
nanisme, les premières souris réalisées portaient un transgène de GH : souris géantes.

Pertinent de travailler chez animal ?

Quand utilise animal transgénique on a un postulat
→ les animaux possèdent assez de similitudes avec l’homme/la pathologie pour être des

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 animaux expérimentaux
→ phylogénétique proche

Les modèles animaux fournissent de bons modèles analogiques : permettent de poser des
hypothèses (les valider) mais certains modèles animaux peuvent être de mauvais modèles d’un
point de vue causalité. Même phénotype mais avec des causes différentes.

Souris : mauvais modèle pour la tuberculose, reproduction différente de celle de l’homme, mais
reste un bon modèle pour poser hypothèses → modèle fondamental.

Modèles in silico qui remplace les animaux

→ modèle qui va être totalement artificiel
Augmentation de l’espérance et qualité de vie humaine
→ ne peut se faire qu’en sacrifiant des animaux
→ pour établir une causalité en génétique expérimentale

Droits des animaux ?

→ obtention d’un statut à part, cadre réglementaire imposé
→ directives de l’Europe imposée à tous ses membres
→ comité d’éthique régional
→ évaluent les protocoles expérimentaux

Pour être autoriser à manipuler l’animal on doit avoir une formation en expérimentation animale
(3 niveaux : personnel de l’animalerie, niveau technicien, niveau du responsable du protocole).
Si chirurgie dans protocole : formation en chirurgie expérimentale sur l’animal.
Animalerie qui doit être agrée : locaux conformes à la réglementation en vigueur.

Liste d’animaux sur lesquels on a le droit de travailler : justificatif de certificat de capacité

d’élevage non domestique. Convention de Washington protège les animaux en voie d’extinction.

Décret qui protège les batraciens depuis 1987 : risque de pénal si on vole des œufs dans les marre
ou des bestioles.

Pour pouvoir travailler sur des transgènes doit déclarer des OGM.

Droit animal repose sur notion de plaisir et de souffrance : protocole ne doit pas être douloureux
→ minimisation maximale
Dans certains cas on ne peut pas éviter la souffrance.

Règle des 3R : réduire (le nombre d’animaux à utiliser), remplacer (questions auxquelles on peut
répondre sans passer par l’animal → modèles in silico), raffiner (ne peut pas refaire n’importe
quel expérimentation).

Animal qui ne souffre pas : verre de terre. Embryons de mammifères sont protégés à partir du
dernier tiers de gestation. A partir de la neurulation l’embryon doit être protéger.

Prémices :

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  Il est mal de tuer l’un des nôtres
 L’embryon précoce est l’un des nôtres
 Le clonage thérapeutique implique la destruction d’un embryon précoce

Les méthodes de transferts de gènes sont caractéristiques du mode de cellules qu’on utilise. On
considère 3 types de cellules

 Les gamètes
 Les zygotes : stade une cellule
 Les cellules somatiques et embryonnaires

Si objectif est de transmettre la totalité du transgène, les gamètes sont au début et toutes les
cellules exprimeront le transgène.

I - Méthodes de transfert

A. Gamètes 
(1) Ovocyte

Facile à manipuler, pls avantages (volumineux), subissent des arrêts (synchronisation à 2

moments : avant la maturation de l’ovocyte, ou avant la fécondation).

Utilisation de vecteurs rétro viraux (séquences longues répétées terminales x2 LTR, un promoteur
et une séquence qui encode pour GAG, Pol les protéines d’enveloppe).

Rétro virus qui prennent pour passager des transgènes, on retire GAG, Pol et on insert le gène
étranger.

Utilisation de cellules transcomplémentantes CT aussi

→ exprime les gènes permettant de former des particules virales vides
→ ces cellules forment des particules virales qui n’ont aucune incidence car
pas les AN

Si on transfecte les CT avec le transgène elles fabriqueront des particules virales avec un pouvoir
infectieux de 1.

La particule virale produit par les CT contient les LCR, les promoteurs et les transgènes
→ libération du transgène

Utilisation de rétrovirus désarmés (plus de GAG, Pol), transfecte dans des CT qui permet création
de virions avec un pouvoir infectieux de 1.

Fonctionne dans les ovocytes de bovins et de singes.

Si injection directe ADN dans ovocyte intégration tardive avec faibles %.

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(2) Spermatozoïde

Très bon transporteur d’ADN étranger

→ association assez bonne
→ mais pas d’intégration derrière.

Un des modèles qui fonctionne bien pour l’utilisation des spermatozoïdes est le xénope. On peut
faire 1500/2500 embryons transgéniques.

Préparation femelle pour la ponte (ovocytes bloqués en M2), testicules chez le mâle (on les broie,
2 centrifugation pour isoler les têtes spermatiques).
Ces noyaux on les met 1h à 37° avec l’ADN étranger.
Au bout de cette heure, intégration du transgène dans l’ADN des têtes spermatiques
→ suspensions puis ICSI (injection intra cytoplasmique de spermatozoïdes qui mime la
fécondation)

Expression du transgène constaté après qq jours.

Marqueur comme GFP ou protéines marquées avec des étiquettes (His, Myc → plus invasif, pour
vérifier présence transgène on coupe la nageoire caudale, on la broie et Western Blot).

Alternatives chez les gamètes mâles : isolation de cellules souches germinales, 3 postulats
possibles.

 Cellules souches en culture

 Obtention de spermatozoïdes en culture in vitro
 Etape de transfection
 Différenciation in vitro
 Récolte des spermatozoïdes et injection uns à uns

 Cultivation des CGT

 Introduction dans animal
 Produira des spermatozoïdes qui produiront le transgène animal
 Trie des spermatozoïdes car pas sûr d’avoir tous les spermatozoïdes marqués du
transgène par trieur de cellules

 On peut directement injecter dans les tubes séminifères

 Obtention de spermatozoïdes qui portent le transgènes

→ permet d’avoir fécondations et animaux
transgéniques

B. Zygote 
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Les 2 matériels se retrouvent envelopper dans une membrane nucléaire (pronucléi).
Injection dans le noyaux (pronucléus) : 1/2pL
→ 500 à 5 000 copies d’un gène

Pour 100 embryons injectés : 1 à 5 souriceaux transgéniques.

Diminue encore si on considère le lapin, le rat, le porc, les ruminants.
Pas utilisation chez les bovins.

Faible rendement car ADN injecté induit une forte mortalité, le taux d’intégration est de 1 à 20%
selon les espèces.

Injection dans le cytoplasme 

→ dans les modèles mammifères on a un cytoplasme translucide (œuf dit alécithe)
→ on peut augmenter le volume d’injection (qq nanos litres du gène) →
→ 20 millions de copies du gènes injectés par ovocytes
Fonctionne bien chez le poisson (saumons), inefficace dans les autres modèles.

Inconvénient : intégration du transgène pas tjs au stade du zygote

→ reste dans cytoplasme et peut être intégré 2 cellules (moitié de la population qui
porte le transgène → chimère), 4/6/8 cellules
1/3 des animaux sont mosaïques.

C. Cellules somatiques embryonnaires 

(1) Utilisation des cellules du blastocyste

Stade ou on a chez les mammifères la synthèse de population de cellules

→ cellules qui forment une sphères (cellules du trophoblaste)
→ donnent structures extra embryonnaires
→ cellules du bouton embryonnaire
→ donnent l’embryon proprement dit

Sont appelées des ESC (cellules souches embryonnaires).

Chez embryon précoce belle plasticité.
Capacité à association pour former un seul embryon se retrouve au niveau des ESC (cellules de
souris pelage blanches et grises : s’associent, donne souris zébrée).

Donne tjs des animaux chimères

→ les cellules souches qui portent le transgène ont participé à l’élaboration des
gonades
→ si les cellules souches qui portent le transgène n’ont pas participé à l’élaboration des
gonades a à la génération suivante on perd le transgène

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Fonctionne bien chez les bovins, mais faut utiliser pls générations pour obtenir des transgéniques
pour les 2 allèles.

(2) Utilisation des cellules souches germinales

Chez oiseau les CGP apparaissent dans le mésoderme extra embryonnaire

→ hors de l’embryon

CGP intègrent ADN étranger et poussins chimériques avec cellules somatiques normales et dans
les gonades l’ADN étrangé qui aura été intégré.

D. Clonage par transfert de noyaux 

Nécessite des ovocytes
→ seront énucléés
→ mécanique ou UV

Embryons sur lequel on prélève des fibroblastes embryonnaires murins

→ se cultivent bien

Pendant culture on peut intégrer un transgène, cellules par cellules on peut prendre cellule
transgénique et la mettre au contact de l’ovocyte énuclée
→ choc pietso électrique
→ fusion des membranes
Noyau cellule somatique se retrouve contexte d’ovocyte → reprogrammation nucléaire → noyau
change d’aspect
→ changement des expressions des gènes.

Cet embryon reconstitué se dév jusqu’à donner un blastocyste qu’on réimplante dans une femelle
pseudo gestante
→ Dolly

E. Clonage thérapeutique
Production d’embryons précoce en ayant remanier le matériel génétique de façon à ce qu’il
fournisse des cellules in vitro dirigeables dans les voies de differentiation après
→ greffons pour corriger une pathologie.

Les protéines transcomplémentantes sont capables de fabriquer les protéines virales qui
manquent aux virus défectifs.
Ces cellules présentent des tropismes cellulaires.

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II - Stratégies de modification de l’expression génique 

 Directes (possible que si connaissance du gène)

 Indirectes (pls natures)
o On ne sait pas où est le gène mais on inhibe de manière systématique les
ARNm, les protéines ne sont pas XPmées

Technique des siRNA (ARN interférents)

→ dans une cellule au niveau des AN on a peu d’hybridation, les seuls AN hybridés sont
seuls de l’ADN

Si on regarde de l’ARN très rarement hybridé ou association ADN monobrin à ARN.

Dans une cellule, quand détection association 2 ARN db mise en place de systèmes qui conduisent
à la dégradation de ces ARN db.

Existe si association db > 30pdb et les 2 voies se font en même temps, si < est spécifique.

Prise en charge des ARN db < 19pdb par un système RISC (complexe qui va rendre silencieux les
gènes et qui sera induit par l’ARN db).

Ce complexe prend l’ARND db, déshydride et utilise ARN comme amorce, dans l’amorce
s’hybrident des ARNm, les ARNm qui ne s’hybrident pas ne leur arrive rien mais ceux qui le font se
dégradent.

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Une partie des exons doit être connue pour faire ça, un truc qui ressemble au RISC sont les
ribosimes (ARN anti sens qui présente une activité ribonucléasique).

o Mettre le produit du gène (protéine) en compétition avec un dominant négatif

ou un leurre

Dominant négatif 
→ protéine modifiée mais qui n’aura pas l’effet de la protéine sauvage

Idée de l’insuline : dans un R à l’insuline on a 3 domaines (extramembranaire, transmembranaire

et intracellulaire responsable de la transduction).
Cette voie de transduction permet d’aller dans le noyau pour moduler l’XPssion génique.
Si la cellule surexprime le transgène avec un récepteur tronqué, les récepteurs à la membrane
n’auront plus d’effets de transductions.
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Ces récepteurs tronqués rentrent en compétition avec le récepteur sauvage.
On diminue la réponse à l’insuline
→ phénomène de compétition

Quand un virus passe dans une cellule, ce virus pourra se répliquer grâce à une pol virale, pour
que le cycle continue aura besoin d’une séquence reconnaissable au niveau des AN du virus.
Si dans la cellule on surexprime un leurre qui occupe et fixe la pol virale, alors cette pol virale au
lieu d’aller sur la séquence reconnue des ARN des AN viraux ira se fixer sur les séquences leurres.

o Stratégie de destruction systématique sélective du type cellulaire qui XPrime

le gène

Un intracorps et un Ac privé de peptide signal

→ n’est pas en surface, reste dans la cellule

On utilise un promoteur d’une lignée cellulaire spécifique avec une toxique diphtérique
(promoteur tissu spécifique) et un assassin (toxine diphtérique ou lectine de ricin).

Dès XPssion de molécules de la diphtérine

→ mort des cellules et des cellules voisines
→ puissant qui induit des nécroses tissulaires ou altérer des tissus voisins

Si on considère l’ensemble des 3 stratégies : on doit construire une séquence qui aura une
spécificité, nécessité de promoteur pour l’XPmé (ubiquitaire ? dans toutes les cellules ? cellules
spécifiques ? XPssion forte ? inductible ?).
Séquence qui permet une polyadénylation de l’ARNm, rapporteur derrière séquence intérêt
(luminescence avec luciférase, β galactosidase, système d’étiquette FLAG/Myc/GFP).

Où s’introduit le transgène ?
→ pas de séquence qui permet de cibler, ce type de transgène est une recombinaison
hétérologue
→ recombinaison aléatoire (on ne sait pas où le transgène s’intègre
ni combien)

XPssion dépend du lieu d’intégration

→ si dans lieu ou la chromatine environnante ne permet pas la transcription ou si après
intégration se retrouve dans lieu ou chromatine très transcrite alors XPssion
plus forte du transgène

Quand AND linéaire dans cellule

→ instable
→ essaye d’entrer/rejoindre la chromatine
Cette intégration se fait au moment de la réplication.
L’ADN circulaire serait plus stable et moins exposé aux nucléases mais s’intègre très peu.

Intérêt d’un transgène qui s’insère partout

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  Choix d’embryon qui présentent un taux correct d’un rapporteur pour étude
 Phénomènes aléatoires à son avantage
→ piégeage de gènes
On prend un transgène avec rapporteur connu, on produit des embryons de façon à
espérer toucher un gène, donne un phénotype, l’embryon qui le possède on fait un
génotypage à partir des amorces du rapporteur
→ clonage de gènes
Technique qui ne fonctionne que là ou grande production d’embryons (xénope, poisson
zèbre)

III - Recombinaison homologue

Repose sur des échanges de fragments d’ADN db qui présentent des séquences ID. On veut
comme évènement un échange d’ADN de séquences. Avantage on cible, désavantage :
évènement rare. On peut espérer 2 types de recombinaisons,

Utilisation de casettes de sélections

 Une positive 
→ XPssion de la cassette confère un avantage aux cellules qui l’XPriment

G418 inhibe la traduction des protéines

→ résulte la mort des cellules, dans les cellules qui XPment le gène de la néomycine
inhibition de G418 et traduction survie
Néomycine permet de survivre en présence de G418.

 Une négative 
→ confère un désavantage aux cellules qui l’XPriment

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HPRT/HAT, DTA, HSV gancyclovire.
Les cellules qui XPriment le gène de HVS transformation du gancyclovire en composé toxique et
mort de la cellule.

Parmi les diverses utilisations on peut utiliser le knock out (invalidation d’un gène, on l’éteint), on
peut faire des mutations subtiles (micro délétions/ajouts), on peut humaniser (protéine humaine
dans un contexte animal), duplication de gènes, remaniements chromosomiques complexes.

Systèmes d’invalidation conditionnels pour dans un système et pas l’autre : Cre-Lox, FRT-FLP.

Le système Cre-Lox a été découvert chez les bactériophages, l’action recombinante de Cre est
réversible, système utilisable chez les eucaryotes. Système analogue FRT-FLP qui permet excision
fragment ADN.

Les séquences LoxP peuvent être altérées pour être optimiser, les séquences sont
palindromiques, l’orientation des sites a une importance, translocation possible sur chromosomes
différents.

Contrôle spatiaux temporel : promoteur rénal, recombinase des souris ne s’exprime que dans les
reins. Ce qu’on fabrique, càd on génère des souris donc le génome d’intérêt produit 2 séquences
LoxP introduites dans les souris.

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Animal : source de matière

2 volumes intéressants

 Sang : selon animal varie, se renouvelle, 3 prélèvements au cours de la vie de l’animal →

traumatisant
 Lait : permet de récupérer des protéines, lait de lapin hyper concentré → permet
récupération plus rapide

Les cellules immortalisées sont celles utilisées en labo.

Tissu musculaire : chez Belgian Blue Bill permet d’avoir une masse musculaire importante qui aura
des qualités gustatives importantes.
Augmentation de la masse musculaire de 20% par rapport aux autres races, mais sont très peu
tolérantes au stress, augmentation masse musculaire au détriment des organes génitaux.
Gène qui augmente masse musculaire au niveau chromosome 2
→ GDF8
La perte de la myostatine est corrélée avec la prise de masse musculaire.

Tissu musculaire : souris Schwarzenegger

→ augmentation de 200%

On fait intervenir FLP pour retirer la casette de sélection positive.

Recombinaison homologue, sélection des évènements de recombinaisons, excision de la casette

de sélection avec la FLP, expression dans le temps et l’espace de la séquence Cre, quand
recombinase XPmée excision de ce qui se trouve entre les 2 séquences de LoxP.

L’expression du gène de la myostatine provoque une augmentation de la masse musculaire.

Xénogreffe
→ utilisation d’un animal comme source de matériel biologique pour des greffes

α1-3 galactosyl transférase qui produit des épitopes chez le porc, pas chez humain. Quand humain
rencontre ces tissus → reconnaissance comme étranger.

Clonage de cochons à partir de transfert de noyaux de cellules somatiques d’adultes.

Clostridium reconnait tous les épitopes α1-3 et les détruit.

Certains rétro virus peuvent être transmis de l’animal à l’homme.

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