3éme annèe Pharmacie

Stérilisation
I. Introduction
I.1. Définitions
1. Stérilisation
Est une opération pharmaceutique qui a pour but d’éliminer ou de détruire tous les microorganismes vivants
portés par un médicament ou un objet parfaitement nettoyés.

2. Stérilité

- Au sens général, la stérilité est définie comme l’absence de microorganismes vivants.

- Pour les produits pharmaceutiques, la stérilité est définie comme l’absence d’entités capables de survivre et/ou de
se multiplier (selon les BPF).

Les méthodes utilisées et les précautions à prendre doivent être employées de telle façon qu’en fin de stérilisation
la probabilité d’avoir une entité non stérile soit inférieure à 10-6  atteindre un niveau d’assurance de stérilité
(NAS) 10-6 (c'est-à-dire la probabilité de rencontrer une unité non stérile est inferieure a un million).

La stérilité est un état éphémère : il convient chaque fois que possible, de choisir un procédé permettant la
stérilisation du produit dans son récipient final (stérilisation terminale)

I.2. Objectifs de la stérilisation

On stérilise afin d’éviter l’introduction des microorganismes pathogènes ou non dans l’organisme.

Ces microorganismes peuvent etre dangereux :

- Pour l’homme : si pathogène  infection voire septicémie.

- Pour les médicaments : déstabilisation (ex : antibiotiques).

I.3. Applications de la stérilisation

La stérilisation s’applique :

- Au matériel médico-chirurgical : ligatures, articles de pansement, article à usage unique, vêtements des
personnes travaillant en ambiance stérile.
- Aux préparations médicamenteuses par voie oculaire ou parentérale ou appliquées sur peau lésée.
- A l’alimentation des personnes immunodéprimées (alimentation entérale).
- A certaines enceintes de l’industrie pharmaceutique et des hôpitaux, aux blocs et hottes stériles.

II. Différentes méthodes de stérilisation

II.1. Classification générale : voire organigramme 1.
II.2. Classification selon les produits qui ou pas stérilisés dans leur
conditionnement définitif
II.2.1. Pour les produits qui peuvent etre stérilisés a l’intérieur de leur
conditionnement étanche définitif : procédés de destruction
- Stérilisation par la chaleur sèche.
- Stérilisation par la chaleur humide.
- Stérilisation par les rayonnements.
- Stérilisation par les gaz.
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 II.2.2. pour les produits qui ne peuvent pas etre stérilisées a l’intérieur de leur
conditionnement étanche définitif : procédés d’élimination
- Stérilisation par filtration.
- Conditionnement aseptique, enceintes stériles.

Organigramme1. Les différentes méthodes de stérilisation.

II.3. Stérilisation par la chaleur

II.3.1. Sensibilité des microorganismes a la chaleur
La sensibilité des microorganismes à la chaleur dépend :

- De l’espèce microbienne et la forme sous laquelle elle se trouve : sporulée ou végétative.

- Durée du traitement.
- Nombre initial de germes.
- Température.
- Milieu.

1. L’espèce microbienne : tous les microorganismes n’ont pas la même sensibilité a la chaleur : pour une
espèce donnée, la forme sporulée est plus résistante a la chaleur (121°C ou plus) que la forme végétative
(52°C à 60°C).
2. Durée de traitement et le nombre de germes : le nombre de survie varie en sens inverse avec la durée du
traitement selon une équation logarithmique (équation1). Il s’agit d’une courbe exponentielle qui
théoriquement tend vers 0 sans jamais l’atteindre.

N=N0. e-kt. (équation1)

N : nombre initial de germes dans un volume donné.

N0 : nombre de germes revivifiables dans le même volume au temps t.

K : constante de vitesse, t : temps.

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 N Log N

t t

- en théorie, la stérilité totale ne peut jamais etre atteinte.

- l’équation 1 montre que pour augmenter les chances de parvenir a une stérilisation satisfaisante ; il faut partir
d’une valeur de N0 la plus faible que possible, autrement dit : la charge bactérienne de la préparation avant
stérilisation doit etre la plus faible possible ( en utilisant du matériel et verrerie très propres, en partant de
matières premières très pures et bien conservées, en employant de l’eau fraichement distillée pour les solutions
aqueuses et en travaillant dans une atmosphère aussi pauvre en germes que possible).

3. température : le temps nécessaire à la destruction des spores d’une espèce microbienne en fonction de la
température donne une relation logarithmique
température nécessaire pour réduire de
Temps nécessaire pour chaque

1012 a 100

30

110 120
température

-Valeur stérilisatrice F pour une température donnée : le temps nécessaire pour réduire de 10 5 à 100 le nombre des
spores par millilitre de préparation.

- Le temps de réduction décimale DT : C’est le temps nécessaire, à une température donnée, pour diviser par 10
la population d’un germe donné .Ex : Spores Bacillus stearothermophilus D121°C = 1min30s.
-Valeur d’inactivateur thermique Z : C’est l’élévation de température nécessaire pour réduire la valeur DT d’un
facteur 10. Ex : Spores Bacillus stearothermophilus Z = 10°C. DT est spécifique pour chaque microorganisme
- Temps équivalent FT : On détermine le temps de destruction thermique FT à la température T nécessaire pour
obtenir le même effet qu’un temps défini à la température de référence » Ex : 1 min à 121°C équivaut à 2 min à
118°C.

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  Détermination de la valeur stérilisatrice :
Après avoir tracé la courbe de l’évolution de la température versus le temps, on peut déterminer la valeur
stérilisatrice de la façon suivante
a- Calcul du taux de létalité L
Le rapport d’efficacité entre un traitement d’une minute a la température enregistrée T dans un récipient et un
traitement de même durée a la température de référence T’est donné par la formule suivante :

(T-T’)/z
L= 10

L : taux de létalité, T : température enregistrée dans le récipient, T’ : température de référence,z : valeur

d’inactivateur thermique.

b- Détermination de la valeur stérilisatrice a une température T pour un seul cycle de stérilisation FT

Elle traduit l’efficacité d’un traitement thermique pour un germe de valeur DT connue. Elle peut etre calculée
d’après le nombre de germes vivants avant et après le traitement
FT= DT x log (N/N0)

c- Détermination de la valeur stérilisatrice totale en pratique

FT est déduite du cycle de stérilisation : c’est la somme des taux de létalité calculés pour chaque minute du
traitement thermique
FT= t L

 Intérêt de la Détermination de la valeur stérilisatrice :

Lorsque la température de référence T’ = 121°C et Z=10°C ; la valeur stérilisatrice est notée F0.

Le calcul de la valeur stérilisatrice permet de valider un procédé de stérilisation car F 0= 8minutes est considérée
comme un minimum acceptable.
Elle provoque une réduction d’un facteur 10 8 pour des spores très résistants (D121= 1min) et d’un facteur 1016 pour
des spores de résistance moyenne (D121= 30sec).

Exemple 1 : les caractéristiques des spores de Clostridium botulinum sont les suivantes :

A 100°C, DT= 2.4min, Z=12°C

Calculez la nouvelle DT a une température de 112°C et 124°C ?
Réponse : D112°C= 14.4sec et D124°C= 1.44sec.

Exemple 2 : les caractéristiques des spores de Clostridium Perfrigens sont les suivantes :
A 121.1°C, L= 0.21min.
On souhaite réaliser 12 réductions décimales. Calculer la valeur stérilisatrice ?
Réponse : FT= 2.52min.

4. nature du milieu

- humidité : les germes sont beaucoup plus résistants a la chaleur en milieu sec qu’en milieu humide. Il faut
maintenir une température de 170°C pendant au moins une minute dans une atmosphère sèche pour qu’il y ait
destruction des germes bactériens.
Le mécanisme serait différent en chaleur sèche et en chaleur humide ; en chaleur sèche il s’agirait surtout

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d’oxydation et en chaleur humide de coagulation des protéines.

- composition du milieu : certains PA possèdent un pouvoir bactéricide qui ne se manifeste qu’à chaud ex :
carbonate acide de Na.

- pH : la destruction des microorganismes est pH dépendante, elle est plus aisée en milieu acide qu’en milieu
alcalin.

II.3.2. procédés de stérilisation par la chaleur

II.3.2.1.Chaleur sèche
Dans ce système, l’agent stérilisant est l’oxygène de l’air filtré sur filtre HEPA et surchauffé électriquement dans
une étuve à air chaud ou dans un four (type four Pasteur ou stérilisateur Poupinel).

Le four Poupinel est constitué par une enceinte close bien isolée munie d’une ventilation renforcée. Il doit etre
chargé de telle façon qu’une distribution uniforme de la température soit réalisée dans toute l’enceinte.

La pharmacopée européenne préconise un barème de 180°C pendant 30min pour stériliser essentiellement du
matériel métallique et les récipients en verre.

Au-delà de 250°C, on dépyrogénise les contenants en verre pour préparations injectables.

Stérilisateur Poupinel

II.3.2.2.Chaleur humide
1. principe
C’est le mode de stérilisation le plus répandu pour les produits non thermolabiles car elle est efficace, rapide et peu
couteuse.

Elle consiste en une production de vapeur d’eau par chauffage sous pressions  vapeur saturante : gaz
stérilisant.

Il se produit une dénaturation des macromolécules bactériennes (noyau et paroi) sous l’action de la chaleur :
hydrolyse partielle des chaines peptidiques.

- Pour les récipients contenant des solutions a stériliser, l’effet stérilisant est réalisé par l’eau de la solution.

- Pour la stérilisation terminale : le conditionnement doit etre perméable à la vapeur d’eau.

2. Appareils de stérilisation par la chaleur humide

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 2.1.Autoclaves
2.1.1. A l’échelle laboratoire
L’autoclave est une enceinte cylindrique étanche en acier inoxydable ou en cuivre muni d’un couvercle.

L’autoclave contient un panier grillagé pour recevoir les produits a stériliser. Le niveau de l’eau ne doit pas
atteindre le fond du panier mais etre suffisant pour que la stérilisation se fasse en vapeur saturante.

Le couvercle comporte différents systèmes de sécurité a savoir :

Soupape de sureté pour éviter d’atteindre des surpressions dangereuses

Un robinet d’évacuation de l’air

Un manomètre pour régler la température et la pression

En général, le manomètre est gradué en excès d’atmosphère sur la pression normale. Au moment de la fermeture
du robinet d’échappement, le manomètre est au zéro ce qui correspond à 100°C. Ensuite, on a approximativement
les correspondances suivantes :

0,5 atmosphère + 110°C

1 atmosphère + 121°C

2 atmosphères + 134°C

3 atmosphères + 144°C

- fonctionnement
- Cycle de stérilisation au sein d’un autoclave : le cycle de stérilisation comporte les étapes suivantes

a- la purge d’air : elle est indispensable pour une bonne diffusion de la vapeur en tout point de l’enceinte.
Le robinet d’évacuation est maintenue en position ouverte, ensuite le chauffage est déclenchée jusqu'à ébullition de
l’eau, de telle façon la vapeur se propage dans l’ensemble de l’autoclave.
b-pré-traitement ou chauffage de la charge :
Le robinet de purge est fermé dès la sortie de la vapeur car l’air est un mauvais conducteur de la chaleur ensuite la
température est augmentée graduellement et progressivement de 100 à 120°C pendant 20 min.

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c-étape de la stérilisation :
Le palier de stérilisation est une étape où l’on compense les pertes énergétiques liées aux diverses fuites du
système afin de maintenir une température suffisante pour produire l’effet recherché
Conditions de référence applicables aux préparations aqueuses : 121°C pendant 15 min: plateau de stérilisation
d- le refroidissement :
La température est diminuée progressivement de 121 à 100°C, tout en maintenant le robinet de purge fermé
Cette étape doit être maîtrisée en termes de vitesse de refroidissement et de maintien de la pression dans
l’enceinte : risque d’explosion des contenants de solutions
2.1.2. A l’échelle industrielle : autoclaves industrielles

C’est une enceinte à une ou deux portes

étanches par un joint dans laquelle on
admettra de la vapeur ou de l’eau
surchauffée

Ces autoclaves sont en général horizontaux et à ouverture latérale pour permettre un chargement et un
déchargement par chariots à plateaux, et comportent des aménagements pour l’élimination de l’air par le vide et
l’homogénéisation rapide de la température. Ils sont généralement équipés d’un enregistreur de pression et de
température. Certains sont munis d’une enveloppe chauffante recevant de la vapeur, ce qui permet au départ une
mise en température plus rapide.

2.2.Stérilisateurs à la vapeur sous pression en continu

Ils sont constitués de 2 colonnes d’eau A et C, et d’une chambre de stérilisation B. ils fonctionnent de la façon
suivante
-Colonne A : entrée en continu des flacons à stériliser qui vont croiser l’eau chaude et s’échauffent.
-Colonne C : sortie des flacons où ils vont croiser l’eau froide.
-Chambre de stérilisation B : séjour des flacons 20 à 30 min dans la vapeur à 121°C en effectuant des
mouvements de montée et de descente (injection de vapeur d’eau sous pression)

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 Stérilisateurs à la vapeur sous pression en continu

 Contrôle d’un procédé de stérilisation au sein d’un autoclave

En cours de stérilisation, un contrôle est réalisé pour être sûr que la température a bien été atteinte à l’intérieur de
l’autoclave. Dans la mesure du possible, des sondes sont convenablement placées. À défaut, on introduit avec les
produits à stériliser des tubes témoins qui contiennent une substance chimique pure ayant un point de fusion précis
et une trace de colorant (exemple : acide benzoïque qui fond à 120°C). Lorsque cette température est atteinte, la
substance fond et se colore par dissolution du colorant. Ces tubes sont placés dans différentes parties de l’autoclave
et dans quelques flacons.

Il existe aussi des peintures témoins qui changent de couleur en fonction de la température et du temps de
chauffage. Ces peintures sont étalées sur des sparadraps ou des rubans adhésifs collés sur les objets à stériliser. Les
indicateurs les plus efficaces sont des préparations de microorganismes sélectionnés en raison de leur forte
résistance à la méthode de stérilisation choisie. Cette souche doit être non pathogène et se développer facilement.
Des spores de Bacillus stearothermophilus sont recommandées comme microorganismes témoins lors de la
stérilisation par la vapeur.

Pour la stérilisation de produits préparés en grande quantité (exemple : flacons pour perfusion de chlorure de
sodium à 9 ‰ ou de glucose à 10 %), certains appareils permettent de stériliser en continu. Dans ces stérilisateurs,
deux colonnes d’eau hautes de 10 mètres maintiennent sous pression de 2 atmosphères la partie inférieure de
l’appareil où arrive la vapeur, à la température de 120°C. Deux systèmes régulateurs commandent le niveau d’eau
dans les colonnes et l’arrivée de la vapeur. Les flacons à stériliser arrivent en continu et se réchauffent
progressivement dans la première colonne. Ils passent pendant un temps choisi de 25 à 30 minutes dans la vapeur à
120°C où ils sont stérilisés avant de remonter dans la colonne d’eau froide.

II.4. Stérilisation par irradiation

-Stérilisation très efficace du matériel médicochirurgical (seringue, aiguille, nécessaire pour perfusion, articles de
pansement, sutures...) à usage unique, dans un emballage étanche définitif
- Méthode coûteuse et à risque pour l’être humain.
- Elle est réalisée dans des centres spécialisés soumis à des dispositions législatives et réglementaires particulières
- L’effet stérilisant nécessite une dose minimale de rayonnement ionisant, de l’ordre de 25 kGy : il dépend de l’état
de contamination initial et de la sensibilité des germes aux rayonnements.

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 II.4.1. rayons UV (rayons électromagnétiques)
- longueur d’onde   2000°A  les rayons UV présentent un pouvoir microbicide très élevé mais sont
malheureusement absorbés par la matière.

- 2000°A   3000°A  Ils sont microbicides mais ne traversent que l’eau pure.

-   3000°A  ils sont pénétrants mais ne sont pas microbicides.

 Applications des rayons UV en pharmacie

-Stérilisation des préparations aqueuses en ampoules ou flacons.

- stérilisation de l’air des enceintes stériles : il ne faut pas qu’il y ait d’obstacles entre les lampes UV et les germes
à détruire  loi de Beer – Lambert.

 inconvénients des rayons UV

- graves accidents oculaires d’où la nécessité des opérateurs de porter des lunettes protectrices.

II.4.2. radiations ionisantes

Elles agissent de façon plus sélective que la chaleur. Le principal effet permettant la stérilisation est la radiolyse de
l’eau contenue dans les micro-organismes, l’excitation de molécules d’eau entrainant l’apparition de radicaux
libres, très instables, se recombinant en formes plus stables : les péroxydes. Les modifications au niveau de l’ADN
sont responsables d’un fonctionnement cellulaire.

II.4.2.1.les irradiateurs a rayonnement 

- Source à 60Co
- Capsule renfermant 59Co  L’isotope 60Co se transforme en 60Ni en émettant 2 rayonnements  et 1
rayonnement β
- Rayonnement  pénètre la matière, il ionise les atomes en formant des radicaux libres  activité germicide
- Irradiateurs protégés par des murs épais en béton pour éviter les émissions en dehors
II.4.2.2.les irradiateurs utilisant les électrons accélérés β
- Source = système de balayage par faisceau d’électrons émission de rayonnement β.
- Le pouvoir pénétrant dépend de l’énergie de l’accélérateur : avec de grandes intensités : stérilisation en une
fraction de secondes.
- Rayonnement très puissant à des prix intéressants
- Rayonnement moins pénétrant que celui du .

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 Ex. Stérilisation d’un médicament contenu dans une
seringue pré-remplie.

 Contrôle d’un procédé de stérilisation par irradiation

Les matières à stériliser sont placées dans des conditionnements étanches, eux-mêmes placés dans des
conditionnements en carton. À l’intérieur de ces cartons sont placés des dosimètres qui mesurent la dose de
rayonnements reçue et des indicateurs biologiques pour contrôler l’efficacité bactériologique du traitement.

II.5. Stérilisation par les gaz

II.5.1. formaldéhyde
La stérilisation associe la vapeur d’eau à basse température au formaldéhyde. Celui-ci existe sous trois états
possibles : phase gazeuse, dilution aqueuse, phase solide.

- La phase gazeuse n’existe pas en tant que telle dans le commerce. Elle est obtenue par sublimation du
paraformaldéhyde solide ou par évaporation du formol liquide.

Para-formaldéhyde solide gaz (formaldéhyde)

- La solution aqueuse est le formol codex, stable jusqu’à 35 à 40 % P/V.

- La forme solide est constituée par des polymères de formaldéhyde :

 Mode d’action et Propriétés germicides :

la stérilisation vapeur d’eau-formaldéhyde utilise l’action synergique bactéricide de la vapeur d’eau et du

formaldéhyde .La vapeur d’eau est un élément majeur pour la destruction des formes végétatives .Elle pourrait
également favoriser la germination des spores ,donc leur fragilisation
le Formaldéhyde possède une action bactéricide directe par dénaturation des protéines
toutes les bactéries et leur spores sont tuées par ce gaz et il existe une relation linéaire entre la concentration en gaz
et la vitesse d’action .L’accès aux micro-organismes doit être favorisé par l’absence de matières protéiques
diverses qui s’opposeraient au contact avec le formaldéhyde.
Il est efficace seulement en milieu humide  stérilisation en surface

 Cycles de stérilisation :

L’appareil utilisé est généralement un autoclave avec programmateur permettant de réaliser :

- soit des cycles classiques vapeur d’eau sous pression 121°C ou 134°C ;
- soit des cycles sous vide avec vapeur d’eau et formaldéhyde à la température de 55°C ou 80°C.

Déroulement du cycle de stérilisation

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Généralement un cycle de stérilisation se déroule de la manière suivante

- préchauffage et évacuation de l’air résiduel (grand vide) : Le but est d’éviter la condensation de la vapeur
d’eau ou d’eau chaude dans la double enveloppe de la chambre (parois et portes).

Le maintien en température est assuré par des injections de vapeur d’eau saturée à basse température obtenue grâce
au fonctionnement en dépression.
Toute baisse de température s’accompagne d’une injection immédiate de vapeur d’eau ,ce qui évite la formation de
Condensats et diminue le risque de polymérisation du formaldéhyde
Les températures adoptées lors des cycles en dépression varient entre 50 et 80°C
- phase de stérilisation :admission du mélange vapeur d’eau ,formaldéhyde par injections successives (alternées
de vide partiel) dont le nombre peut être très variable selon les appareils
- dégazage par alternance de vide et d’injection de vapeur d’eau puis d’air : L’élimination du formaldéhyde
est obtenue par des injections d’eau alternées de vide ,permettant de rouvrir les pores du papier d’emballage par ré
humidification de la charge ,soit alors une phase de rinçage alternant air et vide ,ayant pour but de soutirer le
formol par aspiration et de sécher les emballages
- retour à la pression atmosphérique : l’admission d’air filtré permet le retour à la pression atmosphérique et
complète la résorption du matériel par balayage de la charge.

 Avantages de la stérilisation par le formaldéhyde :

Ce procédé présente, par rapport à l’oxyde d’éthylène, les avantages suivants :

- Pas de risque d’explosion.

- Fuites de gaz détectables par l’odorat.

- Brièveté du temps de désorption.

- Coût faible de la stérilisation.

II.5.2. Oxyde d’éthylène OE

La stérilisation par l’OE est un procédé de 2éme intention si l a stérilisation par la chaleur est indispensable
(pour le matériel médico-chirurgical qui ne supporte pas l’autoclavage)

Elle est utilisée pour stériliser les dispositifs médicaux thermosensibles à savoir PVC, polyéthylènes, certains
caoutchoucs …etc. Les produits à stériliser sont conditionnés dans des protecteurs individuels de stérilité.

 Mode d’action et Propriétés germicides :

L’alkylation des groupements fonctionnels sulfhydriles, hydroxyles, amines et carboxyles des micromolécules des
microorganismes. Certains germes sont plus difficiles à éliminer que d’autres : Staphylococcus aureus,
Mycobacterium tuberculosis, spores de Bacillus subtilis.

 Paramètres de la stérilisation par l’oxyde d’éthylène :

kct
Nt = N0 . e –

Nt: nombre final de germes après le temps t, N0: nombre initial de germes, c : concentration de l’oxyde d’éthylène,
t : durée de stérilisation, k : facteur relatif aux paramètres température et humidité relative.

La contamination initiale doit être la plus faible possible.

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La meilleure efficacité est obtenue à une température comprise entre 50°C et 60°C.

Le taux d’humidité optimal est fixé entre 30 et 60%. Un maximum d’eau est un catalyseur indispensable à la
réaction d’alkylation bactéricide, un excès d’eau conduit à la formation d’éthylène glycol beaucoup moins actif.

Le conditionnement doit être perméable au gaz, assurant le maintien de la stérilité et permettant l’extraction
aseptique du matériel au moment de l’emploi. Le conditionnement est le plus souvent réalisé dans un emballage
pliable, une face complexe plastique transparente imperméable permettant la visualisation du contenu et une face
de papier perméable au gaz. Les deux faces sont thermosoudées.

 Conduite d’une opération de stérilisation par l’oxyde d’éthylène :

Les procédés consistent à introduire l’oxyde d’éthylène (pur ou en mélange) dans une enceinte hermétiquement
close où le vide a été fait préalablement. Ce vide a pour but d’extraire l’air de l’enceinte d’une part et des objets à
stériliser d’autre part. Après un contact de plusieurs heures, une succession de plusieurs rinçages élimine l’oxyde
d’éthylène de l’enceinte. Un rinçage consiste dans un premier temps à éliminer par dépression de l’oxyde
d’éthylène puis dans un deuxième temps à l’introduction d’air stérile dans l’enceinte.

Après la stérilisation, la désorption sera plus ou moins longue selon la nature des polymères : certains permettront
une désorption rapide, d’autres une désorption lente.

La désorption est accélérée par stockage du matériel stérilisé dans des chambres ou armoires de désorption
chauffées et ventilées ; la température est d’environ 50°C. Une période de dégazage à l’air libre à la température de
50°C dure de 15 jours à un mois. Le dosage de l’oxyde d’éthylène résiduel doit afficher une teneur de 2 ppm.

 Inconvénients de la stérilisation par le l’OE :

- Gaz très inflammable, irritant et manque d’inertie : manipulation avec précaution par un personnel expérimenté.

- lenteur et difficulté d’élimination du matériel.

- L’OE peut provoquer une irritation des muqueuses respiratoires et oculaires. À fortes doses, il agit comme un
dépresseur du système nerveux central.

II.5.3. Acide peracétique

- Libère de l’O2 atomique qui est un agent très puissant d’oxydation : action au niveau de la paroi cellulaire et
des constituants cytoplasmiques
- Activité maximale en présence d’un taux élevé d’humidité, 80 %.
- Stérilisation des enceintes stériles +++
- Très peu pénétrant (comme le formol) mais action stérilisante plus puissante
- Commercialisé sous forme de solution concentrée à 35 %
- Utilisé sous forme diluée au 1/10ème, porté à T° 40 à 47°C
- Grande toxicité et provoque la corrosion des métaux.

II.5.4. Peroxyde d’hydrogène en phase plasma : procédé Sterrad

- A l’intérieur d’une enceinte  vide très poussé  évaporation de H2O2 application d’un champ
électrique intense ionisation du gaz  formation de la phase plasma.
Phase plasma : renferme des radicaux libres O- + HO-  Propriétés bactéricides et sporicides du plasma du
peroxyde d’hydrogène
 Avantages

Absence de trace d’eau

Remplace l’oxyde d’éthylène.
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 Utilisé en stérilisation hospitalière
 Inconvénients

Ne peut pas être utilisé pour les objets creux et longs

II.6.Stérilisation par filtration :
La filtration stérilisante est applicable à tous les fluides soit les liquides monophasiques (solutions) soit les gaz.

Ce procédé s’applique aux produits qui ne supportent pas un traitement stérilisant final par l’un des autres procédés
en raison de leur sensibilité à la chaleur, l’eau, aux gaz ou aux radiations ionisantes. Exemples : vaccins, mélanges
solutés pour alimentation parentérale, poudres lyophilisées, etc…

Selon la taille des particules à retenir, on parle de :

- Filtration : lorsque la taille des particules est > 10 μm

- Microfiltration : lorsque la taille des particules est comprise entre 0,02 μm et 10 μm
- Ultrafiltration : lorsque la taille des particules est < 0,02 μm.

La filtration stérilisante appartient au domaine de la microfiltration.

La porosité de 0,22 μm permet d’arrêter toutes les bactéries pathogènes pour l’homme, y compris les plus petites
(Pseudomonas, Rickettsia).

 Classification des microfiltres : deux catégories distinctes :

Les filtres en profondeur : ils agissent par criblage et adsorption : les particules arrivent à pénétrer dans
la trame inférieure du filtre mais sont arrêtées après un court chemin. Les faces du filtre sont dissymétriques : l’une
est lisse, l’autre est rugueuse : la face doit être déposée coté amont au sens de filtration.

Inconvénients : il existe un relargage de fibres.

Les membranes filtrantes (filtres écrans) : Ils agissent par criblage à la façon d’un tamis. La grande
porosité se traduit par un débit important. Les deux faces du filtre sont symétriques. Leur tendance à l’absorption
ou à l’adsorption est très faible.

Inconvénients : il existe un colmatage rapide du filtre écran d’où la nécessité de l’utilisation d’un pré-filtre
généralement de type profondeur.

 Conduite de la filtration stérilisante :

-Stériliser à l’autoclave tout le matériel de filtration et de répartition.

- Partir d’une solution aussi pauvre en germe que possible : biocharge minimale

- Assurer un débit régulier, éviter toute surpression et ne pas prolonger la filtration.

- Les filtres rigides réutilisables doivent être contrôlés périodiquement car leur porosité peut évoluer.

- la durée maximale de l’emploi d’un filtre

La filtration stérilisante doit être réalisée dans le cadre des bonnes pratiques de fabrication : locaux atmosphère,
matériel, contamination initiale la plus faible possible.

La manipulation devrait se dérouler de préférence sous un flux d’air laminaire horizontal ou vertical ou, selon la
fréquence du recours à ce procédé, en salle blanche.

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 Cuve de fabrication Cuve de stockage
Filtre
Solution non stérile stérilisant Solution stérile
Installation de filtration stérilisante
 Classification des microfiltres : deux catégories distinctes :
 Contrôle de la filtration stérilisante :

Contrôles pendant l’opération de filtration

- On mesure le débit, il prend en compte tous les paramètres de la filtration. S’il y a une variation importante, elle
est témoin de l’altération du filtre, ça permet de voir si il y un colmatage.
- La mesure de la pression en amont et en aval du filtre est également un indicateur de colmatage.
- Le point bulle, on l’a vu c’est la pression nécessaire pour faire passer de l’air à travers un filtre humide. Ce n’est
pas un test destructif c'est-à-dire qu’après on peut réutiliser le filtre.
Le point de bulle permet de vérifier que le diamètre des pores est bien celui du départ.

Contrôles après l’opération de filtration

- Examen optique du filtrat, on vérifie la limpidité : absence de particules visibles en suspension.

- Point bulle, pour vérifier que le filtre n’a pas été altéré.
- On doit faire un dosage du principe actif car il peut y avoir fixation du principe actif sur le filtre on parle
d’adsorption. Il faut que la teneur en principe actif soit d’au moins 95% Choix de la composition du filtre pour
éviter cette adsorption.
- Recherche des impuretés solubles pouvant être apportées par les filtres. Le solvant qui est filtré pourrait
solubiliser des impuretés qui se sont relarguées dans le filtrat.

II.7. La préparation dans des conditions aseptiques :

 Applications du conditionnement aseptique : le conditionnement aseptique
s’applique a

- certaines préparations pour usage parentéral, notamment les poudres pour préparations injectables,
- certains vaccins,
- certaines ligatures résorbables,
- certains réactifs de laboratoire.
Compte tenu de l’absence de traitement final stérilisant dans l’emballage définitif, les risques de recontamination
des produits ainsi préparés sont très élevés. Aussi, des précautions spéciales sont nécessaires :

- en matière de locaux : faciles à décontaminer et à ventiler,

- en matière de matériel : facilement stérilisable,
- en matière d’hygiène : port de vêtement de travail stérile,
- en matières d’intrants : matières premières et articles de conditionnement propres et stérilisés avant
répartition,
- en matière de procédé de fabrication : nécessite une étude préalable qualitative et quantitative des risques
de contamination microbienne (et éventuellement particulaire) à chaque stade de la fabrication.
-

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 II.7.1.Filtration stérilisante de l’air :
La stérilisation de l’air au sein d’une industrie est assurée par des
filtres stérilisants de type HEPA (Haute Efficacité pour les Cadre

Particules de l’Air) précédés de préfiltre qui évitent le colmatage.

Ce sont des filtres de fibres de verre en plaques pliées en Intercalaire

accordéon pour augmenter leur surface de contact et maintenues

dans des cadres en bois ou en métal. Matière

 Contrôle de la filtration stérilisante de l’air : Filtrante

Test DOP (Dioctylphtalate) Encollage
mesure de l'efficacité d'un filtre en termes de rétention des
particules présentes dans l'air, sur la base de la rétention des
gouttelettes d'aérosol de dioctyl phthalate (DOP) calibrées à 0,3
µm, selon la méthode ASTM D 2986-71 * . Elle est généralement
exprimée
II – 4 –en2 –pourcentage. Une rétention
Enceintes stériles : de 99,97% de DOP
caractérise un filtre HEPA
II.7.2.Enceintes stériles
II.7.2.1.les Enceintes stériles classiques
On distingue les vitrines et les salles stériles :
 Les vitrines stériles : isolateurs ou bulles
Un isolateur répond à deux notions essentielles
- Le confinement (volume clos bactériologiquement étanche)
- Le transfert par l’intermédiaire de communications avec l’extérieur soit pour introduire des produits dans
les enceintes soit pour les sortir, soit pour les manipuler.
Les manipulations au sein des isolateurs se font par l’intermédiaire de manchettes équipées de gants dans les
formes tunnel ou par l’intermédiaire d’un ou de plusieurs hémiscaphandres couplés ou non à des manchettes. La
position des manchettes permet d’accéder parfaitement a tout le volume de travail et de manipuler en position
assise afin de faciliter la tâche des préparateurs
 Les salles ou blocs stériles :

Dans ce cas, les manipulateurs se trouvent à l’intérieur et constituent une source de contamination importante.
Des lampes U.V. sont placées un peu partout par précaution supplémentaire. La ventilation est réglée de telle sorte
que la pression aille en décroissant de l’intérieur vers l’extérieur. Ceci pour que les mouvements d’air se fassent
dans le sens d’une enceinte moins contaminée vers une enceinte plus contaminée, en cas de non étanchéité. Le sas
d’accès du personnel est différent du sas du matériel.

Gants Demi-scaphandre Page 15 sur 18

 bulles ou Isolateurs
Le personnel revêt des vêtements stériles : combinaison, masque, bottes, gants, lunettes de protection contre les
U.V.

II.7.2.2.les Enceintes stériles à flux d’air laminaire

Ces enceintes sont traversées par un flux d’air qui se déplace à une vitesse uniforme le long de lignes parallèles
verticales ou horizontales. Les enceintes stériles à flux laminaire comportent deux faces opposées poreuses dont
l’une pour l’entrée de l’air est équipée de filtres stérilisants juxtaposés de type HEPA. On les appelle aussi salles
blanches stériles.
Les hottes à flux laminaire sont des enceintes permettant la protection du produit préparé, mais n’offrant aucune
protection au préparateur
Les hottes à flux laminaire sont généralement équipées d’une lampe UV-C à effet germicide pour stériliser le plan
de travail et son contenu lorsqu’il n’est pas utilisé. Elles sont utilisées :

- Dans les blocs opératoires ou la protection du patient contre les infections est assurée par un flux
généralement Vertical.
- Dans les salles blanches ou la qualité et la sécurité des productions qu’elles soient alimentaires
pharmaceutiques ou encore électroniques dépendent pour beaucoup du niveau d’efficacité des systèmes
de filtration de l’air et des Flux laminaires.
 Enceintes à flux vertical : l’air arrive du plafond (filtres HEPA)  sol (grillage constitué d’une paroi
poreuse = préfiltre) : meilleure installation pour le dépoussiérage.
 Enceintes à flux horizontal : l’air va de de mur à mur  installation moins satisfaisante mais moins
chère.
 Enceintes mixtes : de mur à sol ou de plafond à mur (les plus courantes)

Principe d’une enceinte à flux

Principe d’une enceinte à flux horizontal (recyclage
vertical (avec recyclage)
possible mais non représenté)
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 Exemple d’une hotte à flux d’air laminaire

- Contrôle des enceintes stériles :

La manipulation et le remplissage doivent s’effectuer à un poste de travail de classe A dans un local de classe B.

Classe Nombre de particules par m3 de taille égale

ou supérieure à
Nombre maximal de micro-
0,5 μm 5 μm organismes

A : poste de travail sous flux 3500 0* Moins de 1*

d’air laminaire

B 3500 0* 5*

C 350 000 2000 100

D 3 500 000 20 000 500

L’essai microbiologique consiste à placer des milieux nutritifs, stériles en différents endroits de l’enceinte à
contrôler. Après un séjour d’une durée déterminée, les milieux sont placés dans des étuves à température
convenable. On compte au bout d’un certain temps le nombre de colonies qui se seraient développés.

III. Contrôle de stérilité

- Précautions : l’essai de stérilité doit etre réalisé dans des conditions aseptiques par exemple sous hotte.
- Milieux de culture : préparation de milieux de cultures aérobies, anaérobies, pour les levures et moisissures
Filtration sur membrane
Ensemencement direct du milieu nutritif avec le produit à examiner
En fin d’incubation, les milieux ne doivent pas présenter de signes macroscopiques de prolifération
microbienne
III.1.Choix des milieux de culture :
Le plus souvent, deux milieux de culture suffisent :

germes aérobies et des bactéries anaérobies : milieu au thioglycolate – résazurine : aérobie par
développement au voisinage ; anaérobie par développement au fond. C’est la non recoloration en rouge du
liquide par la résazurine qui atteste d’une anaérobiose.
bactéries aérobies et des champignons : milieu à l’hydrolysat de caséine et de soja (milieu de
Sabouraud).

NB : Le germe utilisé pour la préparation des indicateurs biologiques correspondant au germe de référence sont :
stérilisation par la chaleur sèche : Bacillus subtilis;
stérilisation par la chaleur humide : Bacillus stearothermophilus;
stérilisation par l’oxyde d’éthylène : Bacillus subtilis variété niger;
stérilisation par rayonnement : Bacillus pumilus
III.2.Méthodes :
III.2.1. Filtration sur membranes :

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Chaque fois que la nature des produits le permet. Les membranes à utiliser sont en nitrate ou acétate de cellulose
stériles. La membrane est mise à incuber dans les milieux de culture après filtration du liquide à tester.

Incubation : 7 jours au minimum.

- 30 – 35°C pour le milieu au thioglycolate.

- 20 – 25°C pour le milieu à l’hydrolsat de caséine.
III.2.2.Ensemencement direct du milieu de culture :
Rapport préparation / milieu à respecter :

Liquide : 1/100

Solides : 1/100

Incubation : 14 jours au maximum, mêmes conditions de température que précédemment.

 Observation et interprétation des résultats :

Observer les milieux à certains intervalles et à la fin de la période d’incubation. L’apparition d’un trouble ou de
filaments dans l’un des deux milieux (ou les deux) est provoquée par une prolifération microbienne, signe de non
stérilité du produit.

S’il n’y a aucune manifestation de croissance, le produit examiné satisfait à l’essai de stérilité.

Limites de l’essai :

Un lot est stérile lorsqu’il contient moins d’une unité de conditionnement sur un million qui ne soit pas stérile,
c'est-à-dire contenant au moins un microorganisme revivifiable. La probabilité de trouver une unité non stérile
serait donc inférieure à 10-6. Un résultat favorable signifie seulement qu’aucun microorganisme contaminant n’a pu
être décelé dans l’échantillon examiné dans les conditions de l’essai. L’extension de ce résultat à tout un lot de
produit nécessite la certitude que toutes les unités qui le composent ont été préparées de façon que chacun ait
également satisfait à l’essai avec une grande probabilité (ce qui dépend des conditions prises au cours de la
fabrication).

Néanmoins, l’essai de stérilité permet :

- de mettre en évidence une recontamination après stérilisation,

- de mettre en évidence un lot qui aurait échappé à la stérilisation.
C’est la seule méthode analytique dont puissent disposer les différentes instances chargées de contrôler la stérilité
d’un produit.

III.3.Bonnes pratiques de stérilisation

Définition d’un cahier des charges rigoureux lors du choix de l’appareillage et de ses annexes
Qualification du matériel (examen de conformité aux spécifications et qualification opérationnelles)
Validation des procédés de stérilisation : travailler avec un niveau d’Assurance Qualité. maximal,

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