Nov 2006

La transgense vgtale

Patrice Crt Laboratoire de Gntique et Biophysique des plantes TPR2, 9 me Etage Universit de la Mditerrane

Biotechnologie
Ensemble de techniques biologiques, provenant de la recherche fondamentale, qui sont appliques la recherche et au dveloppement de produits. La biotechnologie recouvre l'emploi de l'ADN recombinant, la fusion cellulaire et les nouveaux procds biotechnologiques.

La biotechnologie vgtale est un domaine prcis dans lequel des techniques scientifiques servent mettre au point de nouvelles varits de plante. De nombreux chercheurs considrent la biotechnologie vgtale comme le perfectionnement des techniques d'amlioration gntique qui ont commenc il y a des millions d'annes avec la culture de plantes sauvages pour la consommation humaine.

Petit historique
1982 : la premire plante transgnique est mise au point. Il s'agit d'une plante de tabac qui rsiste un antibiotique. Cette dcouverte ouvre la voie l'incorporation dans des plantes de nouvelles caractristiques, telles que la rsistance un insecte. 1985 : les premiers essais en champ de plantes transgniques qui rsistent un insecte, un virus ou une bactrie ont lieu aux tats-Unis

1994 : l'Administration des produits pharmaceutiques et alimentaires (FDA) autorise la mise sur le march d'une tomate transgnique. (conservation plus longue) 1995-1996 : la mise sur le march du soja et du mas transgniques est autorise, et le premier coton transgnique est commercialis aux tats-Unis. Il s'agit l de l'introduction sur le march de nouveaux produits la plus rapide de l'histoire de l'agriculture 1999 : des chercheurs allemands et suisses mettent au point une varit de riz, le riz dor, qui est enrichi de bta-carotne, ce qui stimule la production de la vitamine A qui peut prvenir certaines formes de ccit. 2000 : le premier squenage complet du gnome d'une plante, Arabadopsis thaliana, offre aux chercheurs de nouvelles connaissances sur les gnes qui sont responsables de traits spcifiques dans de nombreuses plantes cultives.

Objectifs de la biotechnologie vgtale * Modifier le gnotype dune plante

gnie gntique, mutagense, hybridation somatique -introduire un nouveau caractre -supprimer un caractre prexistant

* Produire de la biomasse
cellules, tissus, organes, plantes - Utilisations variables: bio production, multiplication

La culture in vitro

1756: Henri Duhamel du Monceau, des bourgeons apparaissent entre le bois et le cortex quand on enlve lcorce

1839: Scleiden et Schwann: La thorie cellulaire: la cellule vgtale est capable dautonomie et est totipotente
Totipotence: aptitude de la cellule vgtale exprimer la totalit des potentialits du gnome pour donner un organisme entier Cette totipotentialit cellulaire s'accompagne d'une possibilit de multiplication indfinie que l'on peut observer dans les zones de croissance de la plante : les mristmes, cellules restant dans un tat de ddiffrenciation permanent.

La culture in vitro : les explants

Mise au point de la culture in vitro partir : - dexplant avec cellule mristmatique (non diffrencie, juvnile)

- de tout type de tissus sans cellule mristmatiques ( ddiffrenciation-rediffrenciation) Enchanement de mitoses donne - une callogense - une organogense - une embryogense somatique

La culture in vitro : les rgulateurs de croissance

LAUXINE drive dun acide amin: le tryptophane, exp: lacide indole actique

tryptophane

AIA
(photosensible)

Stimulation de l'longation cellulaire, la division cellulaire et de lorganogense (rhyzogense). La synthse de l'auxine s'effectue dans les apex des tiges, dans les mristmes et dans les jeunes feuilles des bourgeons terminaux. Le transport de l'auxine s'effectue de faon polarise, de l'apex vers la base dans la tige.

LES CYTOKININES Drivent dune base de lADN: ladnosine

Stimule la division cellulaire (nom en relation avec cytokinse ) et lorganogense (caulogense: bourgeon) Synthse dans les racines puis migrent dans la plante via la sve brute

Rle des auxines et des cytokinines dans lorganogense

Le rapport auxines / cytokinines dtermine le devenir des tissus en culture En concentrations gales->division de cellules indiffrencies, callogense Auxine -> formation de racines Cytokinines -> bourgeons

La transgense vgtale La galle du collet (crown gall)

Viticulture, sylviculture problmes

Smith et Townsend montrent en 1907 que le crown-gall est caus par une bactrie Agrobacterium tumefaciens cancer des plantes

Braun montre en 1943 que la tumeur peut crotre indfiniment en absence de bactries puis en absence de substances de croissance (auxines, cytokinines ).

Organisation du plasmide Ti (Tumor inducing)

Les agrobactries hbergent de trs grands plasmides ncessaires la formation des tumeurs
ADN circulaire extrachromosomique, autonomie de rplication, plusieurs exemplaires/Cel A. Tumefaciens -> plasmide Ti

Bordures, squences consensus

Les plasmides Ti -1 ou 2 ADN-T (ADN Transfr) -Porte des gnes de: Synthse dauxines Synthse de cytokinines Synthse et scrtion dopines

Les cellules transformes produisent des auxines et des cytokinines

Plasmide Ti octopine

Les gnes ncessaires au transfert du T-DNA sont ports par la zone vir (virulence) des plasmides Ti

Mutations dans vir A, B, D et G abolissent laptitude induire les tumeurs

Mutations dans vir C, E, F et H -restriction du spectre dhte -attnuation du phnotype tumoral

Gne = ORF, Opron = plusieurs ORFs

Dans le plasmide Ti, en dehors de la rgion T et de la rgion vir Gnes impliqus dans les fonctions de : - rplication du plasmide (rgion ori) - dincompatibilit (rgion inc) - de transfert conjugatif (rgion tar) Il y aurait 195 ORF: - 20 gnes impliqus dans la conjugaison - 3 gnes de rplication - 7 gnes de modification du plasmide - 22 gnes de pathogense - 38 gnes assurant le transfert de lADN-T - 24 gnes impliqus dans le mtabolisme des opines - 12 gnes assurant des fonctions diverses telles que le transport de ribose, le chimiotactisme - 84 squences non rpertories

Les inducteurs des gnes de virulence

La transcription des gnes vir est induite par des composs phnoliques mis par les cellules blesses ex: actosyringone

Egalement induction par monosaccharides (arabinose, fucose, xylose constituants de la paroi ) Induction par pH extracellulaire trs bas (5 - 5,5) inhibition de la croissance bactrienne donc favorise le transfert de lADN-T

Reconnaissance cellules vgtales - bactries

Blessure

composs phnoliques, monosaccharides

Chimiotactisme, dplacement de la bactrie via son flagelle

Fixation la cellule vgtale, rcepteurs spcifiques identifier Synthse de filaments de cellulose

Induction des gnes vir

Modle dactivation des gnes de virulence

autophosphorylation

virA expression constitutive, chimiorcepteur membranaire chvE ncessaire dans linduction par les sucres monosaccharides VirG interagit avec boites vir dans rgion promotrice des oprons (12pb conserves) Autorgulation de virG, Souche hypervirulente = forte quantit de virG (quand croissance libre, peu de virG)

Modle de synthse de lADN-T

VIR D2

VIR D2

Modle de synthse de lADN-T

Transfert dans le cytoplasme de la cellule, apparent une conjugaison de type bactrien

Agrobactrie

VirD2 et VirE2 contiennent un signal de localisation nuclaire

Membrane cellulaire

cytosol

Cellule vgtale

Modle dintgration de lADN-T dans lADN vgtal

Recombinaison non homologue ! Utilise la machinerie cellulaire

= dltion de lADN gnomique

Intgration alatoire dans le gnome, plutt rgions transcrites

Possibilit davoir plusieurs copies, nature des tissus, de la souche

Tout les gnes de lagrobactrie possdent les lments de rgulation de la transcription, Pol II

En plus intgration de lADN-T dans gnome de champignons, levure et en 2002 dans cellules humaines en culture par contact avec des agrobactries

Le T-DNA cellulaire (cT-DNA) chez les Nicotianes

-Les hybrides Nicotiana glauca et Nicotiana langsdorfii produisent des tumeurs spontanes (White 1939) dtection de squences similaires aux gnes rol, ORF13 et ORF 14 dAgrobacterium rhizogenes dans le gnome de N. glauca. -Puis on dtecte des squences similaires au gne rolC chez N. tabacum (le tabac cultiv), elles proviennent du parent N. tomentosiformis (N.tabacum = N. tomentosiformis X N. Sylvestris), ce gne est transcrit donc potentiellement actif transfert horizontal dADN entre les agrobactries et plusieurs nicotianes primitives Combien dautres cT-DNA????

La transformation gntique comme outil de biotechnologie

Systme de transformation binaire

Structure dun transgne

BG BD
pNos

ADN-T

gne de slection

p35S

gne exprimer

Les tapes de la transformation gntique du tabac

BD BG

Transformation gntique dArabidopsis thaliana par infiltration

Stade prfloral Donc au moment de la formation des ovules et du pollen

(0,1 3%)

Intgration dans ligne germinale

Lors de la gnration dune plante transgnique, lADN sinsre dans un seul des chromosomes homologues. Pas de locus correspondant sur lautre chromosome -> hmizygote Les des gamtes porteront le transgne

Les gnes marqueurs

La B-glucuronidase de E.coli (GUS)

Les gnes marqueurs

GFP; Green fluorescent protein (Aequora victoria), protine avec chromophore Absorbtion 395 nm

mission 509 nm Marquage des noyaux avec une fusion NLS-GFP dans une plante transgnique

Applications de la transgense vgtale Applications fondamentales

Etude des promoteurs

Etude de ladressage des protines

Recherche de la fonction des gnes par complmentation ou par modification de leur expression (sur ou sous (RNAi) )

Production de banques de mutant dinsertions dADN-T

FST : Flanking Sequence Tags

Gnration de banque de mutants dinsertion dADN de transfert

Gne X

Transgense, insertion au hasard du T-DNA

Gene X BG T-DNA BD Gene X

Squenage dune des bordures du T-DNA

Localisation du T-DNA dans le gne X grce la connaissance de la squence complte du gnome

Production de banques de mutant dinsertions dADN-T

FST : Flanking Sequence Tags Recherche de mutants dans banques de donnes de FST

Indentification dun mutant dinsertion dans un gne dintrt

Recherche dans le gne At1g01010

T-DNA BG Salk_074723 BD

AT1G01010

Applications agronomiques

Rsistance aux pathognes

Rsistance aux insectes Endotoxine de Bacillus thuriengensis (Bt) contre larve de lpidoptre -protoxine clive dans lintestin moyen de linsecte par protase + pH alcalin -Toxine active -se fixe des sites de lintestin -ulcration, perte dapptit -Rupture des cellules, mort des larves Moins dinsecticides. Tomate, pomme de terre, coton, laitue, peuplier, mas

Rsistance aux pathognes

Tolrance aux virus Protine de capside Protine de mouvement ARN interfrence

Rsistance aux herbicides

Rsistance la phosphinotrycine (BASTA)

Tolrance aux stress abiotiques

Salinit, acidit du sol, scheresse, froid

Contrle du mrissement des fruits Tomate, production dthylne mrissement Blocage des gnes de synthse de lthylne Amlioration des qualits nutritionnelles Intervention sur la composition en acides amins des protines de rserve des graines, pour amliorer leur saveur, ou bien leur qualit nutritive Mas, amidon (amylose/amylopectine), agents paississants Introduction de gnes codant pour des enzymes du mtabolisme lipidique -> modifier la longueur de la chane des acides gras ou la position ou le nombre de doubles liaisons, amliorant ainsi la qualit des huiles, usage alimentaire ou non. Riz dor (golden rice) carence en vitamine A (antioxydant), 400 millions de personnes (ccits, sensibilit accrue aux infections) Introduction de 4 gnes synthse de B-carotne (prcurseur de la Vit A) Rduction des teneurs en nitrate

APPLICATIONS INDUSTRIELLES

Industrie papetire, papier partir de cellulose du bois, Prsence de lignine trs coteux liminer et source de pollutions Modifications qualitatives et quantitatives Les plantes transgniques peuvent devenir productrices par exemple d'lastomres et plastiques biodgradables Production de molcules dintrt pharmaceutique
les protines animales dont les gnes ont t clons et exprims dans les bactries, ou mme les levures, ne subissent pas toujours aprs leur synthse les modifications (glycosylations, etc.) ncessaires leur activit biologique ; exprimes dans des plantes, modifications post-traductionnelles les rapprochant davantage des protines natives. Systmes de culture de cellules vgtales rels avantages par rapport animales, substrat moins onreux, pas de risque de contamination par un virus pathogne pour les animaux ou l'homme. protines vaccinales fait actuellement l'objet de recherches approfondies; la perspective de ces travaux est bien entendu le dveloppement de " vaccins comestibles " usage humain, contre par exemple la carie dentaire, le cholra et le SIDA. Production d'anticorps dans les plantes, planticorps.

Quels aliments transgniques trouve-t-on sur le march international ? Toutes les plantes gntiquement modifies conues pour avoir lune des trois proprits fondamentales suivantes : rsistance aux insectes, aux infections virales et tolrance certains herbicides. Culture Caractristique Territoires/pays o elle est homologue Mas Rsistance aux insectes, Tolrance aux herbicides (Afrique du Sud, Argentine, Canada, Etats-Unis d'Amrique, Union europenne, Argentine, Canada, EtatsUnis d'Amrique, Union europenne) Tolrance aux herbicides (Afrique du Sud, Argentine, Canada, Etats-Unis d'Amrique, Union europenne (pour la transformation seulement) Tolrance aux herbicides (Canada, Etats-Unis d'Amrique)

Soja

Colza

Chicore Tolrance aux herbicides Union europenne (uniquement pour les croisements) Courge Rsistance aux virus Canada, Etats-Unis d'Amrique Pomme de Terre Rsistance aux insectes / tolrance aux herbicides (Canada, Etats-Unis)