Parcours:

« Biologie Cellulaire et Moléculaire »

SVI- S6
MODULE:
MÉTHODES D’ANALYSES CELLULAIRE ET MOLÉCULAIRE

TD1
Exemples d’applications de la culture cellulaire
 Méthodologie en culture cellulaire
Test de viabilité/cytotoxicité
1) Par comptage: cellules de Malassez, …avec ou sans colorant

Ce colorant d’exclusion
pénètre dans toutes les
cellules mais seules les
cellules mortes le
retiennent et se colorent
en bleu, les cellules
vivantes apparaissent
brillantes.
 Méthodologie en culture cellulaire
Test de viabilité
2) Par mesure de l’activité métabolique

Esterase: hydrolase qui catalyse l’hydrolyse des liaisons ester

 Méthodologie en culture cellulaire
Test de viabilité
Cette figure indique différents réactifs utilisés pour la détection de
la viabilité cellulaire.
 Ils sont basés sur les fonctions cellulaires variées comme:
- Activité enzymatique.
- Perméabilité de la membrane cellulaire.
- Adhérence cellulaire.
- Production d’ATP.
- Production des coenzymes.
- Activité d’incorporation de nucléotide.

 Plusieurs méthodes ont été établies comme:

• Méthode de formation de colonies

• Méthode violet Crystal
• Incorporation de thymidine tritiée
• Test MTT
• Méthode WST (WST: Water soluble Tetrazolium salts)
 Le cycle cellulaire et les moyens d'études (1)

Méthodes pour étudier le cycle cellulaire

Incorporation de précurseurs
radioactifs dans l’ADN

1 la thymidine tritiée (3H-

thymidine)

2 un marquage de l'ADN par l’

iodure de propidium ou DAPI
(À l'aide de la technique de
cytometrie de flux )

3 Incorporation de la bromo-
deoxyuridine (BrdU) dans leur
ADN.
 Le cycle cellulaire et les moyens d'études (2)

Incorporation de précurseurs
radioactifs dans l’ADN

1 la thymidine tritiée (3H-

thymidine)

pour mesurer l'activité de

l'ADN polymérase, (une façon
indirecte pour mesurer la
division cellulaire)
 Le cycle cellulaire et les moyens d'études (3)
Incorporation de précurseurs
radioactifs dans l’ADN

2 un marquage de l'ADN par l’

iodure de propidium ou DAPI
(À l'aide de la technique de
cytometrie de flux )

Pour estimer l’état

prolifératif d’une
population cellulaire par
une estimation du
pourcentage de cellules
en phase S (estimation du
contenu en ADN par
cellule).
- Le DAPI ou 4',6-diamidino-2-phénylindole est une
molécule fluorescente capable de se lier fortement
aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN.
- Quand le DAPI absorbe la lumière UV, il émet une
fluorescence bleue brillante, ce qui permet de
détecter et quantifier l'ADN grâce à un microscope
à fluorescence ou par cytométrie en flux.
 Le cycle cellulaire et les moyens d'études (4)
Incorporation de précurseurs
radioactifs dans l’ADN

3 Incorporation de la bromo-
déoxyuridine (BrdU) dans leur
ADN.

Pour estimer le pourcentage

des cellules en phase S de
façon plus précise
 Le cycle cellulaire et les moyens d'études
biochimiquement (analysant des
protéines spécifiques)

Détermination de l’activité des

protéines kinases cycline-
dependantes (Cdk)
(des sérine-thréonine kinases)

Les protéines impliquées dans la commande du cycle cellulaire

Les protéines impliquées dans la commande du cycle cellulaire
dans les cellules de mammifères ont été identifiées grâce aux
dans les cellules de mammifères ont été identifiées grâce aux
études chez la levure (Saccharomyces Cerevisiae et
études chez la levure (Saccharomyces Cerevisiae et
Schizosaccharomyces ).
Schizosaccharomyces ).
 Test d’Incorporation de Thymidine tritée (3H)
Historiquement, la viabilité des  au cours d’un test de cytotoxicité
se mesurait par incorporation de nucléotides marqués dans l’ADN
(Thymidine tritiée ou BrdU).

• Le niveau de prolifération des cellules peut être estimé par la

mesure de l'incorporation d'un précurseur radiomarqué de
l'ADN.
• La thymidine tritiée est incorporé au brin d'ADN nouvellement
synthétisé. La radioactivité est mesurée dans un compteur β à
scintillation liquide. Les résultats sont exprimés en coups par
minute (CPM).

Cependant, l’évolution des techniques s’accompagnent de plus en

plus de contraintes sécuritaires pour les utilisateurs et
l’environnement.
 Mesure de l’intégrité membranaire - Test LDH (1)
La LDH est une enzyme cytosolique catalysant en présence de NADH,
la réduction de l’acide pyruvique en acide lactique.
Lors d’une atteinte membranaire, l’enzyme est relarguée dans le
milieu extracellulaire.

LDH: Lactate désydrogénase

Mesure de l’intégrité membranaire - Test LDH (2)

fluorescent

Indicateur coloré
Mesure de l’intégrité membranaire - Test LDH (3)

C’est un test de détection colorimétrique de la sécrétion de LDH.

Cette dernière est une enzyme exclusivement cytoplasmique et
relativement stable. L’augmentation de cette enzyme dans le
surnageant de culture cellulaire permet de détecter une altération
de la perméabilité membranaire et par conséquent une mesure de
la cytotoxicité.
• Dans une première étape, LDH catalyse la réduction du NAD+ en
NADH et H+ par l’oxydation du lactate en pyruvate.
• Dans une seconde étape de la réaction, LDH utilise le NADH et
H+ formés pour catalyser la réduction du sel de tetrazolium (INT)
en un précipité hautement coloré qui absorbe à 490-520nm.
• La quantité de précipité « formazan » produite est
proportionnelle à la quantité de LDH libéré dans le milieu de
culture
 Mesure de l’ATP cellulaire
On évalue la viabilité cellulaire par la mesure de l’ATP présent à un instant
donné dans la culture cellulaire.

Quelques minutes après avoir perdu l’intégrité de leurs membranes, les cellules
perdent leur faculté de synthétiser de l’ATP, les ATPases endogènes hydrolysant
alors les restes d’ATP encore présents: la concentration en ATP s’effondre
rapidement.

• Ce test est basé sur le dosage de la quantité d’ATP des cellules qui est
proportionnelle au nombre des cellules vivantes.
• Les cellules traitées et lysées sont incubées en présence le luciférase et
luciférine. La mono-oxydation de cette dernière par la luciférase, en présence
d’ATP et d’oxygène moléculaire produit un signal lumineux proportionnel à la
quantité d’ATP présente dans les lysats cellulaires.

LUCIFERASE
ATP + D-Luciferin + O2 Oxyluciferin +Mg 2+ + AMP + PPi + CO2 + Light
 Test de viabilité au WST-1

Test colorimétrique qui mesure la viabilité et le taux de prolifération

cellulaire à partir de l’activité des déshydrogénases
mitochondriales.
 
Basé sur le clivage de sels de térazolium incolores WST-1 en dérivés
formazan de couleur jaune, quantifiables par spectrophotométrie à
420-480nm.

WST-1, en particulier WST-8 (2-(2-methoxy-4-nirtrophenyl)-3(4-

nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-terazolium.

(WST: Water soluble Tetrazolium salts)

 Test MTT (1)

L’intensité de cette coloration est proportionnelle au nombre de 

vivantes présentes lors du test et donne une indication sur l’activité
métabolique de ces cellules
 Test MTT (2)

Tests dans lesquels les cellules métaboliquement actives clivent des

substrats incolores en produits colorés, souvent insolubles, qui
peuvent ensuite être mesurés par spectrophotométrie.

• Le sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-

2,5-diphenyl tertrazolium, de couleur jaune) est clivé par des cellules
métaboliquement actives pour former des cristaux violets de
formazan, insolubles.

• L’absorbance de chaque échantillon cellulaire est analysée

directement dans des puits de culture à 570nm, qui est le pic
d’absorbance du formazan.

Plus il ya de cellules métaboliquement actives dans la culture, plus

de formazan sera généré.
 Illustration d’un plaque avec un test MTT

Le test MTT permet de mesurer la prolifération ou la mort cellulaire.

Exemple-1
Exemple-2

Lecture absorbance dans lecteur microplaque

DL50 mg/ml d’extraits capable de réduire

50% de la pop cellulaire.
 Mise en évidence de la mort par apoptose

Mise en évidence de mort cellulaire apoptotique

I. Observation microscopique de corps apoptotique

II. Fragmentation de l’ADN sur gel d’agarose
III. Technique TUNEL
IV. Test Annexin V
V. Mesure de l’activité des caspase 3
VI. Technique d’immunofluorescence
V. Cytométrie en flux
Rappel/Les mécanismes moléculaires de l'apoptose

(Dobzhansky,T. M/S, 2002)

Détection des anomalies de la morphologie cellulaire :
Microscopie photonique optique
Détection des Anomalies de la morphologie cellulaire :
microscopie de fluorescence

Exemple de fluorochrome
Le DAPI (4',6-Diamidine-2'-
phenylindole dihydrochloride) qui se
fixe spécifiquement à l'ADN permet
l’observation de corps apoptotiques
dans une préparation cellulaire .
Détection de la fragmentation de l’ADN par électrophorèse

Puits 1 : Marqueur de poids

moléculaire

Puits 2 : Des cellules sans stimulus

apoptotique;

Puits 3 : Des cellules avec un

stimulus apoptotique

Puits 4 : contrôle positif.

• Source "Roche Diagnostics".

25
 Détection des phosphatidyl-serines par l’annexine-V:
Analyse par cytometrie en flux
Principe
Détection des « flip-flop » des phosphatidyl sérines de la
membrane plasmique par l’Annexine-V couplée au fluorochrome
FITC .
Apoptose: Annexine V

APC: allophycocyanin
 Détection de l’ activation des protéases

Principe :
L'identification des
protéines présentes dans
une préparation cellulaire
ou tissulaire selon leur
poids moléculaire peut se
Analyse par "western blot" du précurseur de caspase-3
faire à l'aide "western blot" dans des "lysats" de cellules de A) Jurkat B) HUT 78 C)
CCRF-HSB-2