Immuno Analyse

Ceci est la VERSION NUMERIQUE des CAHIERS BIOFORMA dj parus et
distribus l'ensemble des LABORATOIRES D'ANALYSES de BIOLOGIE

MEDICALE en FRANCE.
TOUT LE CONTENU DE CE FICHIER RESTE LA PROPRIETE DE BIOFORMA.

LES DROITS D'AUTEURS SONT PROTEGES A LA B.N.F.
Toute reproduction, toute utilisation, partielle ou totale, des textes, schmas et

photos de cet ouvrage, sans l'autorisation crite de BIOFORMA, seront
poursuivies devant les tribunaux comptents.
Seule une impression pour une copie personnelle ( tudiant, interne, biologiste
de labm ) est permise.
BIOFORMA
230 bd raspail 75014 Paris
1
Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995
P R E F A C E
La nouvelle forme de publication des Annales du Contrle National de Qualit couples un cahier de
Formation met laccent sur laspect ducatif du contrle de qualit. Ce deuxime numro est consacr
limmunoanalyse apparue dans les laboratoires danalyses mdicales privs depuis une dizaine
dannes seulement et dont la place actuelle est de plus en plus importante.
Le prsent fascicule concerne la onzime opration de Contrle Nationale en immunoanalyse,
organise en juin 1994 sous lautorit de lAgence du Mdicament par convention avec Bioforma.
A lore dune priode au cours de laquelle des modifications dans lorganisation du Contrle
National vont intervenir, il nous a paru intressant, dans un premier chapitre, de faire le bilan et de
soumettre quelques rflexions sur plus dune dcennie de fonctionnement dans le domaine de
limmunoanalyse.
Lapparition dans les laboratoires de nouvelles techniques ncessite, de la part des biologistes, une
priode de familiarisation avec les difficults analytiques ou linterprtation. Cest pourquoi, on
trouvera ensuite un rappel sur les critres qui permettent dapprcier la qualit dun immunodosage et
une mise au point gnrale sur les piges et problmes rencontrs dans ce domaine de la biologie, de
ltape pranalytique au rendu du rsultat en passant par le marqueur et la mesure du signal en
immunoanalyse.
Le dernier chapitre comporte ltat de lart des pratiques biologiques en France et ltat des
connaissances sur certains analytes dont le dosage prsente des volutions techniques et/ou pose des
problmes de standardisation. Nous avons choisi dvoquer dans ce numro deux marqueurs tumoraux,
lantigne carbohydrate 19-9 (CA 19-9) et lantigne spcifique de la prostate (PSA), et deux hormones
glycoprotiques, lhormone chorionique gonadotrope (hCG) et lhormone thyrostimulante (TSH).
Agence du Mdicament
143-147, boulevard Anatole France
93285 Saint-Denis Cedex
Bioforma
Fonds dAssurance Formation
4, rue Pasquier 75008 Paris
2
L I S T E D E S A U T E U R S
! Professeur Ren BADOR
Professeur des Universits
Laboratoire de Biophysique
Facult de Pharmacie Universit Claude Bernard Lyon I
8, avenue Rockefeller 69373 LYON CEDEX 08
! Mademoiselle Andre BEAUDONNET
Praticien Hospitalier
Laboratoire de Biologie
Hpital de lHtel Dieu Hpitaux de Lyon
1, place de lHpital 69288 LYON CEDEX 02
! Madame Marie-Claude PATRICOT
Praticien Hospitalier
Laboratoire dHormonologie
Centre Hospitalier Lyon Sud Hpitaux de Lyon
69310 PIERRE-BENITE
! Monsieur Richard COHEN
Matre de Confrence des Universits Praticien Hospitalier
Laboratoire de Biophysique Facult de Pharmacie
8, avenue Rockefeller 69373 LYON CEDEX 08
Service de Radiopharmacie et Radioanalyse Hpital Neuro-Cardiologique
59, boulevard Pinel 69394 LYON CEDEX 03
! Mademoiselle Anne-Claude RENARD
Pharmacien
PROBIOQUAL
281 C, cours Emile Zola BP 4016 69615 VILLEURBANNE CEDEX
3
LE CONTRLE DE QUALITE NATIONAL
EN IMMUNOANALYSE
Rflexions aprs onze annes de fonctionnement
R. COHEN, A. BEAUDONNET, A.C. RENARD
Lutilisation de limmunoanalyse en routine remonte au dbut des annes 1970. Il sagissait alors de dosages
utilisant des radioisotopes, pratiqus par un petit nombre de laboratoires spcialiss en raison de la lgislation
franaise relative la dtention et la manipulation des produits radioactifs. Actuellement les laboratoires
autoriss pratiquer ce type de dosages sont au nombre de cent vingt cent cinquante et se caractrisant encore
par des mthodes qui se prtent mal une automatisation complte. Trs rapidement, les biologistes concerns ont
ressenti le besoin dune valuation externe de la qualit. Cest pourquoi, ds 1977, un tel programme leur a t
propos dans le cadre dune association rgie par la loi de 1901 et gre par les biologistes bnvoles : le centre
lyonnais dtudes pour la PROmotion de la BIOlogie et du contrle de QUALit (PROBIOQUAL). Une grande
majorit (80 90%) dentre eux y adhre de manire volontaire depuis cette poque.
Les techniques dimmunoanalyse avec marqueur non radioactif sont apparues au dbut des annes 1980 sous
forme de trousses de ractifs prts lemploi, utilises dabord manuellement puis sur automates. La nomenclature
des actes de biologie mdicale a fait lobjet des modifications ncessaires an avril 1985 et une large diffusion de
limmunoanalyse tous les laboratoires publics ou privs franais en a rsult.
Le laboratoire National de la Sant, devenu depuis un service de lAgence du Mdicament, a alors dcid de
mettre en uvre, en "hormonologie" plasmatique , un contrle de qualit externe semblable celui qui
fonctionnait dj dans dautres secteurs de la biologie mdicale. Lexcution technique en a t confie, par arrt
ministriel du 1
er
fvrier 1983, renouvel le 23 novembre 1988, lassociation PROBIOQUAL en raison de
lexprience quelle avait acquise dans ce domaine depuis plusieurs annes. Les lignes qui suivent sont consacres
la description des caractristiques, aux problmes rencontrs et au bilan du contrle de qualit obligatoire en
"hormonologie plasmatique", instaur en 1984.
! I. CARACTERISTIQUES DE LECHANTILLON STATISTIQUE DE PARTICIPANTS
Tout dabord, comme le montre le tableau I des Annales du Contrle National de Qualit, (n 2, Avril 1995),
laugmentation du nombre de participants a t considrable pendant les onze annes de fonctionnement de ce
contrle : on est pass dun peu moins de cinq cents laboratoires en 1984 prs de quatre mille laboratoires en
1994, ce qui est voisin de la participation aux oprations de contrle national menes en biochimie, hmatologie,
bactriologie-virologie ou parasitologie. La stabilisation note au cours des trois ou quatre dernires annes semble
indiquer que le maximum est atteint.
Si lon excepte les annes de mise en place, lassiduit des participants, traduite par le pourcentage de rponses,
oscille entre 80% et 87%. La diminution observe en 1994, rsulte des laboratoires travaillant dans le cadre de
groupements : selon nos indications, en effet, seuls les laboratoires ralisant effectivement les dosages devaient
faire parvenir les valeurs trouves. De plus, pour interprter les donnes concernant lassiduit des participants, il
est ncessaire davoir lesprit que les analyses effectues par chaque laboratoire et, par consquent, que la
participation telle ou telle opration de contrle national sont dtermines partir dun questionnaire. Ce dernier,
tabli et envoy par lAgence du Mdicament, est rempli priodiquement par les biologistes.
Les analyses soumises au contrle ont volu paralllement lapparition sur le march franais des trousses
correspondantes et leur introduction la nomenclature des actes de biologie mdicale. Actuellement,
limmunoanalyse permet de raliser le dosage de vingt vingt-cinq analytes relevant non seulement de
lhormonologie plasmatique mais aussi de loncologie ou de lallergologie. Parmi les analytes les plus
couramment doss on peut citer : ACE, AFP et PSA pour les marqueurs tumoraux , hCG, FSH, LH, prolactine et
4
TSH pour les hormones glycoprotiques, cortisol et estradiol pour les hormones strodiennes, T4 libre pour les
hormones thyrodiennes ainsi que ferritine et IgE totales. En raison du faible nombre de trousses disponibles
(tableau II des Annales du Contrle Nationale de Qualit, n 2, Avril 1995), les dosages de CA 15-3, CA19-9,
CA125, B2-microglobuline, progestrone et testostrone sont moins rpandus. Enfin dans lvaluation de la
fonction thyrodienne, la mesure de la forme libre, a en grande partie, remplac celle de lhormone totale pour T4.
Le dosage de T3 suit une tendance analogue avec un dcalage dans le temps.

! II. SCHEMA DORGANISATION

La non-linarit de la relation dtalonnage de la plupart des immunodosages, ainsi que la forme de lerreur
commise sur la mesure du signal en fonction de lintensit de celui-ci, rendent ncessaire un contrle plusieurs
niveaux de concentration. Cest pourquoi, au cours des trois premires enqutes interlaboratoires, trois spcimens
de contrle ont t distribus. Des raisons matrielles lies laugmentation importante du volume ncessaire nous
ont conduits proposer par la suite un seul spcimen par opration. En 1994, la collaboration avec Bioforma a
permis de proposer deux spcimens deux niveaux de concentration et de raliser pour la premire fois deux
oprations au cours de lanne, lune en juin et lautre en dcembre. Les prochaines oprations devraient se
drouler la mme frquence et selon un schma proche de celui adopt en 1994.

Depuis juin 1994, les participants assurent eux-mmes le codage de la technique et de lappareil grce la
disponibilit de tables de codage dveloppes par la SFBC dont la dernire version a t diffuse par Bioforma.
Auparavant, ces indications taient donnes en clair et le codage tait effectu par nos soins.

! III. PROBLEMES POSES PAR LES SPECIMENS DE CONTROLE

Ceux-ci doivent thoriquement tre reprsentatifs des situations physiopathologiques les plus frquentes. Or les
spcimens le plus souvent utiliss pour des raisons pratiques dorganisation, sont des srums du commerce
renfermant un grand nombre danalytes des concentrations variables. Au cours de leur prparation, le matriel de
dpart est surcharg ou au contraire " priv en certains analytes. Signalons, par exemple, que lobtention de
concentrations trs basses en TSH est un problme difficile, incompltement rsolu encore par les firmes
commerciales spcialises dans la fabrication de srums de contrle pour limmunoanalyse. De mme, lobtention
de concentrations basses en hormones thyrodiennes totales ou libres ncessite un traitement du matriel de dpart
susceptible dintroduire des artefacts. Ces conditions vont lencontre de lexigence prcdente et les rsultats
obtenus partir de tels spcimens risquent de conduire une interprtation errone car diffrente de celle
provenant de spcimens de patients.

Les qualits du spcimen de contrle idal pour limmunoanalyse pourraient tre rsumes de la manire suivante :

le matriel de dpart doit imprativement tre du srum humain,

en raison de la spcificit des techniques, certains analytes ne peuvent tre simultanment prsents dans
le mme spcimen des concentrations diffrentes des principales situations physiopathologiques
rencontres (estradiol avec estriol et estrone, digoxine avec digitoxine, hCG avec LH),

les concentrations des diffrents analytes doivent tre choisies de manire couvrir les zones critiques du
domaine de mesure,

lorigine des prparations danalytes purifis, surtout de nature glycoprotique, servant enrichir le
matriel de dpart joue un rle primordial. On peut citer, par exemple, la reconnaissance des degrs
divers par les couples danticorps prsents dans les trousses de prolactine recombinante, dinsuline
dorigine animale ou de marqueurs tumoraux obtenus par extraction.

Seule lexprience acquise dans lorganisation du contrle de qualit externe permet de reconnatre ces piges et
de soumettre au fabricant un cahier des charges qui permette den viter les principaux.
5
! IV. EXPLOITATION DES RESULTATS

En immunoanalyse, il est particulirement difficile daccder la connaissance de la valeur vraie dun analyte dans
un spcimen biologique ce qui rend dlicate lapprciation de la justesse des techniques. Lapproche retenue en
France consiste utiliser la valeur de consensus cest--dire la valeur obtenue aprs un traitement statistique
correct des rsultats fournis par un grand nombre de laboratoires. Ce traitement consiste, dans le cas du contrle
national, en une double troncature, opration dont le but est dliminer les valeurs situes plus de deux carts
types de part et dautre de la moyenne. La validit de la moyenne gnrale comme valeur de consensus est dautant
meilleure que les techniques adoptes sont nombreuses et varies. Les conclusions sur la justesse des techniques
doivent, par consquent, prendre en compte la plus ou moins grande contribution la moyenne gnrale des
valeurs fournies par les diffrentes trousses.

Une solution ce problme existe pour les petites molcules telles que les hormones strodiennes puisque la
chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse peut tre considre comme une mthode
de rfrence. Dans certains pays, tels que lAllemagne, la valeur fournie par cette mthode est choisie pour cible.
Sans aller jusque l, nous avons dcid, ds 1990, dappliquer cette mthode tous les spcimens de contrle
distribus en France pour cortisol, estradiol, progestrone et testostrone et dindiquer les valeurs obtenues aux
participants.

En ce qui concerne les molcules de masse molaire plus leve, telles que les hormones glycoprotiques ou les
marqueurs tumoraux, aucune mthode nest susceptible, lheure actuelle, de fournir une valeur vraie. Par ailleurs,
lhtrognit des formes circulantes de ces composs tant un phnomne de mieux en mieux tudi et connu
pour tre responsable de discordances importantes entre trousses, nous avons choisi de caractriser sur ce plan les
spcimens de contrle. Cest ainsi quune chromatographie dexclusion-diffusion effectue sur ces spcimens nous
permet de renseigner les participants, depuis 1990, sur le pourcentage de trois formes molculaires de prolactine
(monomre, "big prolactin" et "big-big prolactin") et depuis 1994, sur la proportion de formes libres et complexes
de PSA.

Le compte-rendu dune opration de contrle, calqu sur la biochimie, comporte un message individuel et une
prsentation de synthse (les Annales du Contrle National de Qualit) associe depuis la prsente opration un
cahier de formation.

! V. RENSEIGNEMENTS OBTENUS

Les objectifs du contrle de qualit externe sont doubles :
court terme, il consiste estimer les composants systmatique et alatoire de lerreur entre les
laboratoires et les mthodes et suivre leur volution au cours du temps,

plus long terme, il contribue lharmonisation des rsultats entre laboratoires par lamlioration des
mthodes cest--dire la standardisation des dosages. Il permet, alors, au biologiste de sassurer que les
rsultats quil rend sont conformes ceux des autres laboratoires utilisant ou non la mme mthode. En
outre, la consquence long terme du contrle est de faciliter linterprtation des rsultats par le
clinicien.

Les principaux enseignements tirs du contrle national en immunoanalyse remplissent les objectifs fixs plus
haut.

En premier lieu, lexploitation statistique toutes techniques confondues fournit une estimation de la variabilit
totale qui dpend du niveau de concentration. Celle-ci comporte deux composantes : lune, systmatique, qui
correspond aux carts entre les valeurs moyennes des diffrentes trousses et lautre, alatoire, qui dpend de la
dispersion des valeurs obtenues par les utilisateurs dune mme trousse. Lexploitation statistique par technique
permet de dterminer cette dernire. Le coefficient de variation (CV) obtenu est un indice de robustesse de la
trousse : un CV faible signifie que les valeurs obtenues restent trs proches malgr les diffrences dutilisation qui
existent dun laboratoire lautre. La srie des CV fournis par les principales trousses peut tre reprsente par la
valeur centrale ou CV mdian qui indique la reproductibilit atteinte par la moiti des trousses disponibles. Ainsi,
en comparant la valeur du CV refltant la variabilit totale avec celle du CV mdian, on dispose dun moyen
6
simple pour sparer la part de la dispersion globale des valeurs qui revient aux carts entre trousses de celle qui
doit tre attribue leur robustesse : une grande diffrence entre les deux CV signe la prsence de discordances
importantes entre trousses. Il existe une mthode statistique, lanalyse de variance avec dcomposition de la
variance totale, qui permet destimer rigoureusement les deux composantes prcdentes. Cependant, son
application ncessite des hypothses et un schma exprimental souvent peu compatibles avec lorganisation
pratique du contrle de qualit externe.

De cette manire, on apprcie ltat de lart des dosages et on met en vidence ceux dont la standardisation nest
pas satisfaisante comme cest le cas par exemple, actuellement, des dosages de TSH ou estradiol au niveau des
basses concentrations et des dosages de CA 19-9 OU PSA.

Lvolution, au cours du temps, de la qualit est galement intressante considrer. Une diminution notable de la
variabilit des immunodosages est intervenue au tout dbut des annes 1990. Celle-ci concide avec la
familiarisation des biologistes aux problmes poss par ce nouveau type de dosages (talonnage, piges
mthodologiques, interprtation).

Les autres informations utiles, tires des oprations de contrle national et difficiles obtenir par dautres moyens,
concernent la "popularit des trousses", cest--dire la connaissance des trousses effectivement utilises dans les
laboratoires des participants.

Pour terminer, insistons sur lun des points forts du contrle national franais qui est envi par les organisateurs du
contrle externe dautres pays : il sagit du nombre trs important de participants qui permet dobtenir de bonnes
estimations sur ltat de lart des immunodosages, sur la "popularit" et la qualit des trousses mme sil introduit
une lourdeur certaine au niveau de lorganisation.
7
CRITERES DE QUALITE
EN IMMUNOANALYSE
R. COHEN, A.C. RENARD

Les critres de qualit des immunodosages ne sont pas a priori trs diffrents de ceux utiliss dans les autres
domaines de la biologie clinique (voir cahier de formation de biochimie). Pourtant la matrise de la raction Ag-Ac
et de la mesure du signal pose des problmes nouveaux : en particulier, les courbes de calibrage (signal en fonction
de la concentration) sont loin dtre toujours linaires. Nous passerons en revue les critres de qualit classiques
(prcision, limite de dtection, justesse, spcificit) en insistant sur leurs particularits lorsquils sont appliqus
limmunoanalyse. Ce chapitre a pour but de donner les lments permettant le choix du meilleur ractif.
Concrtement lheure actuelle, ce choix est li le plus souvent celui de lautomate en raison du grand nombre
de "systmes ferms". Toutefois, lutilisation des ractifs dans les meilleures conditions passe par la
comprhension du mcanisme et la connaissance des points critiques dun immunodosage.

! I. ERREUR DE MESURE

Chaque rsultat de mesure est entach dune erreur qui sexprime par la diffrence entre la valeur trouve et la
valeur "vraie" que lon cherche estimer. Cette erreur dite totale peut tre dcompose en deux termes : lerreur
systmatique et lerreur alatoire (Figure 1).

Figure 1 : Densit de probabilit P(x) des valeurs x de concentration obtenues au cours dun dosage.
Composantes systmatique et alatoire de lerreur totale.

x
V
: valeur "vraie" de concentration,
x
j
: valeur obtenue lors de la i
me
mesure,
x : moyenne des valeurs exprimentales,
e
j
: erreur totale commise dans la i
me
mesure,
e : partie non alatoire de lerreur totale ou erreur systmatique,
e
j
- e : erreur alatoire (fortuite, accidentelle).
8
I.1. Erreur systmatique
Elle reprsente lcart toujours de mme signe entre un rsultat et la valeur "vraie" ou sa meilleure estimation.
Suivant le cas, sa grandeur est proportionnelle la concentration ou, au contraire, indpendante de celle-ci.
On lapprcie en rptant un grand nombre de fois les mesures et en calculant lcart entre la moyenne de la
distribution des valeurs exprimentales et la valeur "vraie". La principale difficult pour valuer lerreur
systmatique rside dans la ncessit de connatre la valeur "vraie" dun compos dans un chantillon biologique
dtermin. Or, la plupart du temps, pour les substances concernes par les immunodosages, la valeur "vraie" reste
inconnue, except pour les petites molcules telles que les hormones strodiennes qui peuvent tre doses par
chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse. En rgle gnrale, lerreur gnrale,
lerreur systmatique dont la cause est le plus souvent identifiable, provient du fait quil sagit de mthodes
relatives dans lesquelles le comportement des solutions de calibrage peut tre diffrent de celui des spcimens
doser.
Parmi les paramtres susceptibles dentraner une erreur systmatique se trouvent principalement : ltalon qui est
en cause la fois par sa nature, son titre et sa stabilit au cours de la conservation, les anticorps qui sont
responsables de la spcificit du systme de dosage et la mthode de calcul des rsultats. Il faut ajouter un certain
nombre de facteurs, qualifis de non spcifiques, tels que :
le pH ou la prsence de composs susceptibles de modifier la raction Ag-Ac (anticoagulants,
hmoglobine, etc.),
la destruction de lanalyte au cours des tapes prcdant le dosage (prlvement, transport,
centrifugation, dcantation, etc.),
la liaison de lantigne marqu aux parois des tubes, des protines de transport naturelles ou
dventuels anticorps circulants conscutifs une auto-immunisation ou une thrapeutique comme, par
exemple, chez les diabtiques traits linsuline.
I.2. Erreur alatoire
Elle reprsente lcart, de signe et de grandeur imprvisibles, entre un rsultat et la valeur "vraie" ou sa meilleure
estimation.
Lerreur alatoire prsente plusieurs caractristiques. Elle suit gnralement une distribution normale de moyenne
nulle car les erreurs sont nombreuses et du mme ordre de grandeur. Elle est quantifie par lcart type de cette
distribution. Elle dpend troitement de la concentration : en effet, dans le cas des immunodosages lcart type
augmente avec celle-ci.
Il existe, en immunoanalyse, de nombreux facteurs qui sont susceptibles dintroduire une erreur alatoire. Certains
ont un effet prpondrant sur lerreur de mesure du signal : opration de distribution des volumes de spcimens
doser ou de ractifs, mthode de sparation car la sparation des formes libre et lie peut tre plus ou moins
complte dun tube lautre et erreurs de mesure du signal. On sait, pour un signal radioactif par exemple, que le
phnomne de dsintgration nuclaire est lui-mme alatoire.
Dautres facteurs agissent principalement sur la pente de la courbe dtalonnage tels que, par exemple dans le cas
des mthodes par dfaut danticorps, la dilution de lanticorps, la puret ou la masse de lantigne marqu et les
conditions dincubation.
9
! II. NIVEAUX DERREUR DANS UN IMMUNODOSAGE
Figure 2 : Niveaux derreur dans un immunodosage
La Figure 2 reprsente les diffrents niveaux derreur et le domaine dapplication du contrle de qualit intra- ou
inter-laboratoire. Les principales erreurs surviennent diffrents niveaux qui sont, par ordre croissant
dimportance : la srie de dosages, le laboratoire effectuant plusieurs sries dans le temps, le groupe de
laboratoires utilisant la mme technique et enfin le groupe de laboratoires utilisant des techniques diffrentes.
On comprend bien que les erreurs soient peu importantes au sein dune srie de dosages dans laquelle les
conditions sont strictement contrles (ractifs, oprateur, temps dincubation identiques). En revanche, au cours
du temps les ractifs voluent, le manipulateur peut changer ce qui augmente la dispersion des rsultats rendus par
un laboratoire. Lorsque le patient se dplace et que le clinicien se trouve face des rsultats provenant de
laboratoires diffrents mais utilisant la mme technique, ce sont alors lexprience et lquipement du laboratoire
qui interviennent. Enfin, lorsque les rsultats sont obtenus par des laboratoires qui ont adopt des techniques
diffrentes, la variabilit est, en grande partie, lie aux caractristiques des ractifs notamment de ltalon et des
anticorps.
En rsum, il existe une hirarchie des erreurs. A chaque niveau, se retrouvent la fois erreurs alatoires et
systmatiques qui en se combinant concourent, toute deux, la variabilit cest--dire lerreur alatoire du niveau
suprieur.
! III. DEFINITION DES CRITERES DE QUALITE
III.1. Prcision
Elle est dfinie comme la qualit de laccord, dans une zone dfinie de concentration, entre des mesures rptes,
effectues dans des conditions dtermines.
On lexprime habituellement par lcart type ou le coefficient de variation (cart type divis par la moyenne) de la
distribution des valeurs exprimentales de concentration obtenues lors de la rptition des mesures sur le mme
DANS UN LABORATOIRE
UTILISANT DES
METH. DIFFERENTES
UTILISANT LA
MME METHODE
DANS UN GROUPE
DE LABORATOIRES
D'UNE SERIE
A LAUTRE
DANS UNE SERIE
CONTROLE DE QUALITE
INTERLABORATOIRE
CONTROLE DE QUALITE
INTRALABORATOIRE
ERREURS
SYSTEMATIQUE ALEATOIRE
10
spcimen. La prcision est dautant meilleure que lerreur alatoire est faible. Elle est fonction de deux
paramtres : lerreur (reprsente par lcart type) faite sur la mesure du signal et la pente de la courbe de
calibrage. De plus, sa dfinition sous-entend quelle dpend de la concentration mesurer, phnomne
particulirement vrai dans le domaine des immunodosages, et des conditions de rptition des mesures. Cest
pourquoi, on est amen affiner cette notion et proposer diffrentes expressions pour la prcision. On parle de
rptabilit, de reproductibilit intra- ou inter-laboratoire lorsque la rptition des mesures est effectue
respectivement dans la mme srie de dosage, dans le mme laboratoire ou entre laboratoires diffrents.
Pour apprcier la prcision, il suffit par consquent de rpter les mesures sur le mme spcimen et de calculer
lcart type ou le coefficient de variation de la distribution des valeurs exprimentales. Il est, cependant, ncessaire
deffectuer cette opration plusieurs niveaux de concentration. Un procd pour apprcier, trs commode et
rpandu en immunoanalyse, consiste tablir le profil de prcision cest--dire la courbe reprsentative de
lvolution de lcart type ou du coefficient de variation en fonction de la concentration. Celui-ci peut reprsenter
nimporte lequel des niveaux de prcision dfinis prcdemment. Nous dcrirons les tapes conduisant son
obtention ainsi que ses applications en prenant comme exemple la courbe montrant la variation de la rptabilit
selon le niveau de concentration. Pour lobtenir il faut passer par les tapes indiques sur la Figure 3 :
calcul par une simple rgression linaire, diffrents, niveaux de signal, de lcart type s
R
exprim en
valeur de signal,
calcul, diffrents niveaux de concentration, de lcart type exprim en concentration s
c
partir de s
R
et
de la pente dy/dC de la courbe de calibrage :

trac de la courbe de variation de lcart type s
c
ou du coefficient de variation s
c
/C en fonction de la
concentration C.
Le profil de prcision rvle tout son intrt plusieurs niveaux. Dans le cadre du contrle de qualit, il permet de
valider les rsultats dune srie de dosages. En ralit cela nest possible que lorsquon dispose dau moins deux
dterminations pour chaque spcimen ; or cette pratique tend disparatre avec le dveloppement de
lautomatisation. Grce aux profils de prcision intra- et inter-laboratoire, il est possible dapprcier ltat de lart
de limmunodosage dun analyte. Au moment de la mise au point dun dosage, cette mthode statistique savre
particulirement utile en permettant dvaluer dun seul coup dil la prcision dans tout le domaine de
concentration. Ainsi le fabricant de la trousse dispose dun critre objectif pour choisir les conditions
exprimentales (concentrations des ractifs en prsence, modalits dincubation, nombre doprations de lavage
lors de la sparation des formes libre et lie, etc.) optimales cest--dire celles qui conduisent la meilleure
prcision aux niveaux de concentration qui reprsentent des seuils de dcision importants sur le plan clinique.
Enfin signalons quon en dduit lcart type s
Co
, correspondant des valeurs de concentration faible voire nulle,
partir duquel on estime la limite de dtection.
11
Figure 3 : Etapes conduisant la confection dun profil de prcision pour un immunodosage par dfaut (partie gauche) ou par
excs (partie droite) danticorps.
Les valeurs couramment obtenues pour les diffrentes formes de prcision lorsquon les exprime en coefficient de
variation sont, dans le cas des immunodosages : infrieures 5% pour la rptabilit, comprises entre 5 et 10%
pour la reproductibilit intralaboratoire et suprieures 10% pour la reproductibilit interlaboratoire. Les valeurs
les plus leves sont observes transitoirement lorsquapparaissent des techniques prsentant des caractristiques
nouvelles
12
(meilleure spcificit par exemple des techniques immunomtriques par rapport aux techniques par comptition)
ou bien pour des dosages dont la standardisation est mauvaise comme cest le cas actuellement (1994) des dosages
destradiol, CA 19-9 et PSA. De plus, rappelons que les mthodes par excs danticorps fournissent le plus souvent
des coefficients de variation plus bas que les mthodes par dfaut danticorps.

III.2.Sensibilit, dtectabilit

Ces critres expriment, tous deux, laptitude dune mthode diffrencier les signaux fournis par deux spcimens
de concentrations voisines.

Il ne faut cependant pas les confondre : la sensibilit sadresse toutes les concentrations diffrentes de zro alors
que la dtectabilit intresse le domaine des concentrations faibles ou nulles. Dans ce dernier cas, ont dfini la
limite de dtection analytique comme la plus petite concentration fournissant un signal significativement
diffrent de celui dun blanc (chantillon identique en tous points au spcimen doser mais de concentration
nulle). La comparaison doit se faire en termes statistiques par un test appropri.

Modalits pratiques du calcul de la limite de dtection analytique :
La relation donnant la limite de dtection L peut scrire :

0
. .
/
O
b
C
C
S
L k k s
dy dC
=
= =
( )
1 1
, .
b y
dans laquelle k t v
n n
= +

avec t(, v) : variable de Student pour un risque donn (ou risque de conclure tort la prsence de la
substance dans le liquide biologique) et v degrs de libert (correspondant lestimation de s
Co
).
n
b
,n
y
: nombre de rptitions du blanc et des spcimens respectivement, dans les conditions habituelles
dutilisation de la mthode
s
b
: cart type des signaux fournis par le blanc
et s
Co
: cart type, exprim en concentration, pour des mesures de concentration nulle.

Pour calculer la limite de dtection analytique, il faut par consquence
a) dterminer s
Co
: pour cela, deux conditions doivent tre respectes :
effectuer les rptitions sur un chantillon dpourvu de la substance doser mais le plus proche possible
dans sa nature et sa composition du liquide biologique utilis,
travailler, dans un premier temps, sur les valeurs de signal pour obtenir lcart type s
b
, puis dterminer
s
Co
en divisant par la pente lorigine de la courbe dtalonnage.

Pour les laboratoires qui effectuent les dosages en double, la meilleure mthode consiste dduire du profit de
prcision la valeur de s
Co
. Cette dernire est la limite de la fonction s
C
=f (C) lorsque la concentration tend vers
zro.

b) multiplier s
Co
par k ; le choix de la valeur de k doit se faire en fonction du protocole de dosage adopt en
routine (n
b
,n
y
) comme la relation exprimant k le montre. La valeur habituellement utilise comme limite de
dtection est de 3,0 s
Co
pour des dterminations en simple (n
b
=n
y
=1). Dans ce cas la variable de Student est gale
2,1 ce qui correspond un risque de conclure tort la prsence de la substance (risque ) de 1,7%. Pour une
valeur quivalente du risque , la limite de dtection est gale 2,1 s
Co
lorsque les dterminations sont effectues
en double (n
b
=n
y
=2).

Un autre moyen dvaluer la limite de dtection analytique, la mthode des dilutions limites , consiste diluer
progressivement un spcimen de faible concentration de manire dterminer partir de quel moment la rponse
devient incohrente. Lvaluation prcise est difficile et dpend, ici aussi, de la qualit du diluant.
13
La dfinition prcdente plusieurs inconvnients :
elle nest valable que si un vritable spcimen zro est disponible ce qui est loin dtre toujours le cas,
elle prend uniquement en compte la variabilit intrasrie ; cela implique que, pour tre reprsentative,
son estimation doit tre ralise partir de plusieurs sries de dosages,
elle fournit la concentration significativement diffrente de zro mais nindique pas la prcision avec
laquelle celle-ci est mesure ; en calculant le coefficient de variation thorique correspondant une
limite de dtection analytique de 3 s
Co
, on obtient CV=s
Co
/3s
Co
=33 %. Cette valeur peut se rvler
inacceptable pour une dtermination quantitative dans certaines situations cliniques.
Pour remdier, au moins en partie, ces inconvnients on dfinit la limite de dtection fonctionnelle comme la
plus petite concentration pour laquelle le coefficient de variation inter-sries est gal 20 %. Cest ainsi, par
exemple, que lon qualifie de "troisime gnration" les dosages de TSH qui possdent une limite de dtection
analytique infrieure 0,005 mUI/l et surtout une limite de dtection fonctionnelle comprise entre 0,01 et 0,02
mUI/l.
III.3. Justesse
La justesse dune mthode reprsente la qualit de laccord entre la valeur mesure et la valeur "vraie" ou sa
meilleure estimation en dehors des erreurs alatoires. Ce critre se rapporte, par consquent, lerreur
systmatique. Pour lapprcier, il est ncessaire de disposer de la valeur "vraie" ce qui est un problme non rsolu
lheure actuelle (1994). En effet, il nexiste pas de mthode de rfrence permettant de doser les composs
concerns par les immunodosages. Tout au plus, assiste-t-on au dveloppement de mthodes utilisant la
chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse pour les petites molcules telles que les
hormones strodiennes (cortisol, estradiol, progestrone, testostrone, etc.).
Dans ces conditions, les procds disponibles sont les suivants :
a) Comparaison des rsultats obtenus laide dune mthode consacre par une longue priode dutilisation :
pour cela, on fait appel aux mmes mthodes de rgression que dans les autres domaines de la biologie clinique.
Soulignons, en outre, que la comparaison doit porter sur des spcimens reprsentant le plus large ventail
possible de situations physiopathologiques.
b) Epreuve de dilution : celle-ci consiste, partir dun ou plusieurs spcimens de concentration leve en analyte,
raliser une srie de dilutions dans un milieu appropri. Lorsquil sagit dune trousse de ractifs du commerce,
le milieu utiliser imprativement est le "diluant" prconis par le fabricant pour le traitement des spcimens de
concentration leve.
Linterprtation des rsultats de cette preuve peut se faire en tablissant la relation entre la concentration
observe et la dilution. Celle-ci est, de manire idale, une droite passant par lorigine et de pente gale la
concentration du spcimen pur. En prsence dune erreur systmatique, on observe une ordonne lorigine non
nulle ou une relation non linaire. Enfin, cette preuve ne permet pas de mettre en vidence une erreur constante
en valeur relative.
c) Epreuve de surcharge : celle-ci consiste ajouter ; un ou plusieurs spcimens de faible concentration (C
o
) en
analyte, des quantits connues (Q
i
) dtalon.
La courbe reprsentative de la concentration observe (C
i
) en fonction de C
o
+Q
i
est une droite, de pente gale
lunit, passant par lorigine en labsence derreur systmatique ou en prsence dune erreur constante en valeur
absolue.
d) Etude de spcimens dont la valeur de concentration est nulle : dans certaines circonstances (sujets
hypophysectomiss ou ayant subi une preuve de freinage par exemple), il est possible de disposer de liquides
biologiques dpourvus danalyte. Le signal fourni par ceux-ci dans le systme de dosage tudi peut se rvler
extrmement utile pour loptimisation de sa justesse.
III.4. Spcificit
14
La spcificit dun dosage est son aptitude mesurer lanalyte dsir et seulement celui-ci, mme en prsence de
quantits importantes de substances dont la structure est proche.
Il est vident que cette qualit du dosage est directement lie la nature de limmunsrum ou des anticorps utiliss.
Les tests de spcificit sont lourds mettre en uvre et, pour cette raison, sont gnralement pratiqus par le
fabricant lors de la mise au point de la trousse. Il existe deux faons dvaluer la spcificit :
a) Dtermination des pourcentages de raction croise : cette mthode ne sapplique quaux dosages par
comptition car elle repose sur lvaluation de la concentration dplaant 50 % du traceur, difficile dfinir dans
le cas des dosages par excs danticorps. Elle consiste raliser des courbes de calibrage avec tous les
composs qui sont susceptibles dinterfrer dans le dosage (Figure 4). Linterprtation du pourcentage de
raction croise obtenu doit se faire en tenant compte des concentrations relatives de lanalyte et de la substance
interfrante.
Figure 4 : Dterminations des pourcentages de raction croise de la dsoxycorticostrone (DOC) et du cortisol dans
un immunodosage de progestrone
DOC (4,4 / 70) 100 = 6,3 %
Cortisol (4,4 / 2.10
4
) 100 = 0,022 %
b) Dtermination de la plus petite concentration de substance interfrante fournissant un signal non nul : cest la
seule valuation possible pour une mthode "sandwich".
15
PIEGES ET PROBLEMES
EN IMMUNOANALYSE
A. BEAUDONNET-R. COHEN
ETAPE PRE-ANALYTIQUE CONSERVATION DES ECHANTILLONS
PROBLEMES LIES AUX REACTIFS ET AU PROTOCOLE EXPERIMENTAL
- Etalon
- Anticorps
- Effet crochet
- Composition du milieu ractionnel
- Traitement des donnes
PROBLEMES LIES A LECHANTILLON
- Anticorps htrophiles
- Auto-anticorps
- Molcules anormales
- Interfrences spcifiques par analogie de structure
MISE EN EVIDENCE DUNE INTERFERENCE
- Test de dilution
- Test de surcharge
- Tests particuliers
16
PIEGES ET PROBLEMES
EN IMMUNOANALYSE
A. BEAUDONNET-R. COHEN
! ETAPE PRE-ANALYTIQUE CONSERVATION DES ECHANTILLONS
Les donnes indiques ci-dessous concernent plus particulirement les vingt-deux analytes proposs dans le cadre
du contrle de qualit national en hormonologie plasmatique et marqueurs tumoraux.
En fonctions des systmes analytiques utiliss et des analytes doss, les conditions de prlvement peuvent tre
diffrentes et les interfrences cites ci-dessous plus ou moins importantes.
! I. ANTICOAGULANTS
Certains anticoagulants peuvent tre dconseills par (suite dinterfrence avec lanalyte ou avec la mthodologie
utilise) :
- hparine qui perturbe la raction antigne-anticorps
- EDTA, fluorure de sodium et citrate lorsque la fluorescence en temps rsolu est utilise car ces
anticoagulants dissocient le chlate deuropium ; lEDTA peut aussi inhiber la raction enzymatique si le marqueur
utilis est la phosphatase alcaline.
Dune faon gnrale, il est prfrable dutiliser des tubes sans anticoagulant.
! II. GEL SEPARATEUR
Lutilisation de gels sparateurs est viter, en particulier lors du dosage dhormones libres.
! III. CONSERVATEURS
Lazide de sodium est un inhibiteur de la peroxydase et son utilisation est donc dconseille avec les dconseille
avec les techniques utilisant cette enzyme.
! IV. CENTRIFUGATION
La centrifugation doit tre ralise le plus rapidement possible aprs le prlvement et doit tre suffisante pour
liminer tous les globules rouges et toutes les particules en suspension dont la prsence peut perturber les
diffrentes ractions (I).
! V. ASPECT MACROSCOPIQUE DU SERUM
V.1. Srum hmolys
La prsence dhmoglobine peut perturber la raction antigne-anticorps et/ou altrer la qualit du signal mesur.
Les fabricants indiquent en gnral partir de quelle concentration lhmoglobine devient gnante. Il faut
nanmoins noter que dans le cas du dosage de la ferritine, lhmolyse doit tre vite car linterfrence dpend de
la concentration de ferritine intra-rythrocytaire qui est trs variable selon les pathologies.
V.2. Srum hyperlipidmique
17
Lhyperlipidmie peut aussi tre nfaste en perturbant la raction antigne-anticorps et en modifiant les conditions
de pipetage par augmentation de la viscosit du milieu. Lhyperlipidmie modifie galement les coefficients
dextraction de certains strodes lorsquune extraction pralable est ncessaire. Les prlvements seront donc
raliss de prfrence sur un sujet jeun depuis au moins 8 heures.
V.3. Srum ictrique
Les fabricants indiquent en gnral la concentration de bilirubine en dessous de laquelle, aucune interfrence na
t note.
! VI. CAS PARTICULIERS DES DOSAGES HORMONAUX
Plusieurs facteurs influencent le rsultat dun dosage hormonal.
VI.1. Position du sujet
Un repos prolong est ncessaire avant de prlever certaines hormones : prolactine par exemple.
VI.2. Stress
Le stress augmente artificiellement la concentration de plusieurs hormones dont la prolactine et le cortisol.
VI.3. Rythme circadien
Linterprtation du rsultat dpendra du moment du prlvement pour les hormones dont la scrtion est soumise
un rythme circadien. Dans le tableau ci-dessous sont rassembls quelques exemples dhormones dont les
amplitudes de variation sont importantes ou modres selon les heures de la journe (2).
HORMONE HEURES
DACROPHASES
AMPLITUDE DE VARIATION
leve (>50%)
modres (10-50%)
Cortisol 8 14 h leve
Prolactine 22 8 h leve
Testostrone 6 7 h leve
Hormone thyrostimulante
(TSH)
20 23 h leve
Hormone folliculostimulante
(FSH)
Hormone lutinisante (LH) variables modres
Estradiol 12 h modre
VI.4. Cycle menstruel
La connaissance de la date des dernires rgles est ncessaire pour linterprtation des rsultats des dosages de
FSH, LH, prolactine, estradiol, progestrone, testostrone.
VI.5. Caractre pulsatile de la scrtion des hormones gonadotropes
Le caractre trs pulsatile de la scrtion de LH peut ncessiter deffectuer le dosage sur un mlange de srums
(mlange volumes gaux de 3 srums prlevs 10 minutes dintervalle).
18
VI.6. Etat physiologique (grossesse, mnopause)
Bien entendu, linterprtation dun dosage hormonal devra tenir compte de ces situations.
VI.7. Mdicaments
Il est conseill dans la mesure du possible de supprimer quelques jours avant le prlvement les mdicaments qui
prsentent des analogies de structures avec la substance doser ; cest le cas en particulier des contraceptifs oraux
et des corticodes pour le dosage des hormones strodiennes.
Lors dun dosage de T4 libre, le dosage sera ralis avant la mise en place dune hparinothrapie. En effet,
lhparine favorise la libration dacides gras libres non estrifis (AGLNE) partir des triglycrides (par
activation de la lipoprotine lipase), AGLNE qui dplacent la T4 de sa liaison avec ses protines vectrices et
peuvent interfrer surtout dans les techniques utilisant un analogue marqu de la T4.
Avec les techniques utilisant le systme streptavidine-biotine, chez les patients traits par de fortes doses de
biotine, le prlvement devra tre effectu au moins six heures aprs la dernire administration.
! VII. AUTRES CAS PARTICULIERS
Le prlvement pour dosage de PSA doit tre fait avant toutes manipulations prostatiques (biopsie, massage,
chographie transrectale, etc.) susceptibles daugmenter artificiellement et transitoirement la concentration de ce
marqueur.
! VIII. CONSERVATION DES ECHANTILLONS
Ces conditions sont variables selon lanalyte, mais dune faon gnrale, les chantillons doivent tre centrifugs
le plus rapidement possible et conservs congels sils ne sont pas analyss dans les 24 heures suivant le
prlvement.
Il faut galement viter les conglations et dconglations successives.
Ltape de dconglation doit tre lente ; aprs dconglation le prlvement doit tre soigneusement homognis
et subir une ventuelle centrifugation lorsque des particules en suspension sont prsentes.
Cas des prlvements expdier
Lorsque le prlvement peut tre effectu sur EDTA (ceci dpend de la mthodologie utilise et de lanalyte),
laddition dagent anti-protolytique (aprotinine=Zymofren ou Iniprol) au plasma permet une conservation de
48 heures temprature ambiante de la plupart des hormones protiques (3).
Dans le cas contraire, il est important denvoyer les chantillons centrifugs congels et de maintenir la
conglation pendant le transfert (caissons isothermes).
PROBLEMES LIES AUX REACTIFS ET
AU PROTOCOLE EXPERIMENTAL
! I. ETALON
La validit dun immunodosage repose sur labsolue identit de structure entre la molcule talon et la molcule
doser. Les problmes poss par la prparation des solutions talons sont diffrents selon la structure des analytes :
analytes de faible masse molaire et de structure chimique bien dfinie et analytes de masse molaire leve et de
structure complexe.
I.1. Analytes de faible masse molaire et de structure bien dfinie
Cest le cas des hormones strodiennes et thyrodiennes. Ces hormones existent sous forme purifie et les
prparations issues de diffrents lots seront identiques.
19
La concentration sera exprime en mole ou sous-multiple par litre.
I.2. Analytes de masse molaire leve et de structure complexe
Dans le cas des hormones glycoprotiques et des marqueurs tumoraux, le problme est beaucoup plus complexe.
Les talons sont obtenus par extraction de liquides biologiques, de tissus sains ou pathologiques. Mais les talons
ne correspondent pas toujours lanalyte doser car il existe des variants gntiques et de nombreuses formes
molculaires dont les proportions varient selon les situations physiopathologiques (prolactine, LH, hCG, PSA par
exemple). Il nest donc pas possible dutiliser une substance talon reprsentative du mlange de ces diffrentes
formes. En consquence, selon ltalon utilis (et la spcificit des anticorps), la rponse du systme conduira
des rsultats diffrents.
La prparation de ces talons est confie des organismes spciaux tel que le National Institute for Biological
Standards and Controls ou NIBSC (Herfordshire, United Kingdom) la demande de lOrganisation Mondiale de
la Sant (4).
- Prparations disponibles
Pour les analytes proposs dans le cadre du contrle national de qualit, de telles prparations sont disponibles et
distribues pour hCG, hCG, FSH, LH, Prolactine, TSH, alpha-ftoprotine (AFP), ferritine et IgE totales.
La prparation de ces talons de rfrence ncessite une tude collaborative entre de nombreux laboratoires qui
dterminent quelle est la prparation la plus adapte, dfinissent les conditions de prparation et de conservation et
attribuent une valeur de rfrence.
- Dfinitions
Deux types de prparations sont disponibles :
"International Standard" ou IS, prparation laquelle une unit internationale (UI) a t attribue la
suite de ltude collaborative de laboratoires utilisant lventail le plus large possible de mthodes de
dosage. A lorigine, ces prparations destines aux dosages biologiques taient des prparations peu
purifies. On peut citer lexemple du 2
me
IS 61/6 pour dosage de lhCG prpar partir dextrait durines
de femmes enceinte et contenant de lhCG dimre, des sous-units et libres et de la LH.
"International Reference Preparation" ou IRP, prparation purifie destine aux dosages
immunologiques. Le 2me IS 61/6 pour dosage dhCG a t remplac par le 1
er
IRP 75/537 contenant
essentiellement de lhCG dimre. Ces prparations (IRP) sont mises en service au terme dune tude
collaborative moins importante.
Lunit internationale (UI) et dfinie comme lactivit biologique contenue dans une masse dfinie dun IS ou
dune IRP.
- Remplacement de ces talons
Ces prparations doivent tre utilisables ou moins pendant 10 ans. Lorsquun talon doit tre remplac, la nouvelle
prparation est compare lancienne afin de dterminer la quantit du nouvel talon contenant une unit
internationale, ce qui permet la constance dans le temps de lUI. La masse de prparation qui dfinit une UI peut
donc varier en fonction des talons successifs.
- Etalons secondaires
Le nombre dampoules dIS ou dIRP tant limit, les fabricants de trousses utilisent des talons secondaires dont
lactivit immunologique est compare aux talons de rfrence. Cependant, les conditions dextraction et de
purification ne sont pas toujours identiques, les activits par unit de masse sont diffrentes et les facteurs de
conversion entre g/l et UI/l sont variables (prolactine AFP par exemple).
Lexpression des rsultats en UI/l est fortement recommande car elle permet une meilleure concordance entre
valeurs obtenues avec diffrentes trousses.
20
Actuellement, pour un certain nombre danalytes, les fabricants calibrent leurs talons par rapport aux diffrents IS
ou IRP, par exemple :
- LH : 2
me
IS 80/552 ou 1
er
IRP 68/40
- Prolactine : 1
er
IRP 75/504, 2
me
IS 83/562, 3
me
IRP 84/500
Dans le cas du dosage de lhCG la rfrence par rapport au 2
me
IS 61/6 est pratiquement abandonne.
En ce qui concerne la ferritine, la plupart des fabricants calibrent leurs trousses partir de ltalon 80/602 prpar
partir de ferritine de foie humain. Dans le cas de lAFP, la majorit des trousses et calibre par rapport la 1
re
IRP 72/225 prpare partir de "pool" de srums provenant de sang de cordon.
! II. ANTICORPS
Le dveloppement des anticorps monoclonaux issus des travaux de KOHLER et MILSTEIN (5) associ la mise
en uvre de dosages de type immunomtrique a permis damliorer la spcificit, la prcision et la limite de
dtection de nombreux dosages.
II.1. Avantages
Les anticorps monoclonaux permettent lobtention de ractifs homognes de lot lot.
Par ailleurs, lutilisation danticorps monoclonaux dans des systmes immunomtriques a permis notamment :
- La mise au point de dosages spcifiques dhormones prsentant une grande similitude de structure : hCG-
FSH-LH-TSH,
- Le dosage spcifique de lACE sans interfrence avec les autres glycoprotines de structure proche : NCA
(non specific cross reacting antigen), BGP1 (biliary glycoprotein 1), NFA1 (normal ftal antigen 1),
- La mise au point de dosages prsentant une limite de dtection trs basse : TSH (permettant la
discrimination entre sujets euthyrodiens et hyperthyrodiens),
- La dcouverte dantignes associs des tumeurs, dont le dosage est trs utile au suivi de certaines
tumeurs : antignes carbohydrates tels que CA 15-3 et cancer du sein, CA 125 et cancer de lovaire, CA 19-9 et
cancers digestifs par exemple.
II.2. Inconvnients
Les anticorps monoclonaux prsentant nanmoins certains inconvnients lis leur manque daffinit et leur
"surspcificit".
- Affinit
Laffinit dun anticorps monoclonal est en gnral infrieure celle dun anticorps polyclonal. Ce manque
daffinit ne pose pas de problme avec les systmes immunomtriques o lon est en excs danticorps. par
contre, dans le cas des dosages par comptition, cette baisse daffinit est un inconvnient et les anticorps
polyclonaux sont en gnral utiliss avec ce type de mthodologie.
- " Surspcificit "
Un anticorps monoclonal est spcifique dun pitope et non de la molcule entire. Selon le cas, cette
"surspcificit" se traduira par une sur-estimation ou une sous-estimation des rsultats.
Si lpitope reconnu est prsent sur une molcule diffrente, on pourra avoir des ractions croises importantes.
Inversement, le dosage de molcules complexes et htrognes (hormones glycoprotiques, marqueurs tumoraux)
pourra tre en dfaut si lpitope reconnu nest plus exprim ou si les pitopes prsents ne sont pas reconnus par
les anticorps utiliss (formes molculaires variables).
Plusieurs exemples peuvent tre cits :
hCG scrte sous forme de sous-units libres au cours de certaines tumeurs, formes non reconnues par
les systmes immunologiques dosant spcifiquement lhCG dimre,
21
ACE dont la structure antignique peut tre variable selon la tumeur lorigine de sa scrtion,
prolactine dont la forme molculaire principale est monomrique ("little prolactin"), mais qui circule
galement sous forme dimrique ("big prolactin") et polymrique ("big-big prolactin"), formes glycosyles
ou non dactivit biologique diffrente (6),
LH, hormone glycoprotique prsentant une microhtrognit lie aux chanes glycosyles et pour
laquelle une quinzaine disoformes a t dcrite (7). Certaines formes de LH scrtes chez des femmes
endocrinologiquement normales ne sont pas dtectes par certains systmes immunologiques et on parle de
LH "invisible" (8)
! III. EFFET CROCHET
III.1. Dfinition
Leffet crochet (effet dinversion haute dose dantigne ou "hook effect") se traduit par une chute paradoxale du
signal mesur en prsence dune forte concentration de lantigne doser et par lobtention dune courbe en
cloche. A une mme valeur du signal correspondront donc deux valeurs diffrentes de lanalyte, avec le risque de
rendre une valeur normale ou trs sous-estime (9).
III.2. Caractristiques
Cet effet crochet concerne les molcules possdant au moins deux sites antigniques diffrents et nest dcrit que
pour les techniques immunomtriques.
Ce phnomne est observ pour les molcules prsentant de larges marges de variations physiopathologiques :
hCG, prolactine, marqueurs tumoraux (ACE-AFP-antignes carbohydrates-PSA), ferritine par exemple.
III.3. Explications
Lexplication est diffrente pour les techniques en un temps et pour les techniques en deux temps.
Dans le cas des techniques en un temps, le phnomne est assimilable au phnomne de prozone observ avec les
techniques par hmagglutination (lexcs dantigne est tel que tous les sites anticorps sont saturs rendant
impossible la liaison anticorps de capture-antigne-anticorps marqu).
Le phnomne disparat si on utilise une mthode en deux temps.
Dans le cas des techniques en deux temps, plusieurs explications ont t proposes :
- lavage incomplet aprs la premire incubation
- anticorps marqu en quantit insuffisante
- utilisation danticorps htrognes sur le support, cest--dire danticorps de forte et de faible affinit ;
cependant, leffet crochet a t dcrit aussi avec les anticorps monoclonaux.
III.4. Mise en vidence et solutions
La dilution du srum permet la mise en vidence de ce phnomne. La poursuite des dilutions (dans le diluant
fourni par le fabricant) est ncessaire jusqu lobtention de deux rsultats concordants.
En labsence dindication clinique, seule la dilution systmatique du srum permet de se mettre labri de leffet
crochet.
Nanmoins, les techniques en deux temps sont moins "sensibles" que celles en un temps et les concentrations
partir desquelles on peut observer ce phnomne sont en gnral leves, mais doivent tre dtermines et connues
pour chaque trousse de ractif.
Dans le cadre de la lgislation actuelle qui impose une double dtermination pour certains marqueurs tumoraux, la
possibilit de pratiquer cette double dtermination sur deux dilutions du mme srum permet la mise en vidence
dun ventuel effet crochet. Cette lgislation concerne le PSA, les antignes carbohydrates (CA 15-3, CA 19-9 et
CA 125).
22
! IV. COMPOSITION DU MILIEU REACTIONNEL EFFETS DE MATRICE
Le droulement de la raction antigne-anticorps est troitement li aux conditions de pH, force ionique,
concentration en protines en gnral et concentration en protines de liaison de lanalyte en particulier, prsence
ventuelle dagents tensioactifs. Le dosage de molcules de faible masse molaire (strodes) est particulirement
"sensible" aux effets de matrice. Par consquent, le milieu de dilution de la gamme talon et lchantillon doser
doivent avoir des compositions aussi proches que possible. Une trousse adapte au dosage dun chantillon srique
ne sera pas obligatoirement adapte au dosage de ce mme chantillon dans un autre milieu biologique.
Par ailleurs, en cas de dilution de lchantillon, le choix du diluant doit tenir compte des conditions cites ci-
dessus : pH, force ionique, etc. (10).
! V. TRAITEMENT DES DONNEES
En immunoanalyse, il ny a pas de relation linaire entre lintensit du signal et la concentration de lanalyte. Selon
les diffrents modles mathmatiques utiliss pour ltablissement de la courbe de calibration, les rsultats
pourront tre diffrentes, expliquant une partie des carts intertechniques (11).
PROBLEMES LIES A LECHANTILLON
Lchantillon analyser peut contenir des molcules inhabituelles ou prsentes une concentration anormalement
leve qui vont perturber le droulement des ractions immunologiques.
! I. ANTICORPS HETEROPHILES
I.1. Dfinition
Les anticorps htrophiles sont des anticorps prsents dans certains srums et qui sont dirigs contre les
immunoglobulines animales du ractif. Ces anticorps pourront interfrer au cours des diffrentes tapes
immunologiques, en particulier dans les techniques immunomtriques lorsque les deux anticorps ractifs ont la
mme origine animale. On peut noter galement une interfrence dans les techniques par comptition (12).
I.2. Origine
Lorigine de ces anticorps est multiple. Ils peuvent apparatre :
- aprs immunisation par vaccins prpars sur tissu animaux,
- par suite de contacts frquents avec les animaux,
- au cours de maladies auto-immunes (facteurs rhumatodes des affections rhumatismales et du lupus
rythmateux),
- par suite dinjection danticorps monoclonaux de souris dans le cadre dimmunoscintigraphies et
dimmunothrapies.
Enfin, dans un certain nombre de cas, on ne trouve pas dexplication leur prsence.
I.3. Caractristiques
Ces anticorps peuvent tre dirigs contre les diffrents motifs antigniques de limmunoglobuline : motifs
isotypiques, allotypiques et idiotypiques. Actuellement, les anticorps htrophiles lorigine des interfrences les
plus souvent dcrites sont des anticorps anti-isotypes dirigs contre la partie constante des immunoglobulines
23
(fragment Fc) et des anticorps anti-idiotypes dirigs contre la partie hypervariable de limmunoglobuline. Ces
anticorps sont de classe IgG et/ou IgM.
I.4. Problmes poss par la prsence des anticorps htrophiles.
- Avec les techniques immunomtriques, ces anticorps vont tre le plus souvent lorigine dune sur-
estimation des rsultats en se fixant dune part sur lanticorps de capture et dautre part sur lanticorps traceur,
simulant ainsi la prsence de lantigne (13-14). Plus rarement, ces anticorps peuvent aussi tre lorigine dune
sous-estimation des rsultats (cas dIgM anti-immunoglobulines animales qui, par suite dencombrement strique,
empchent la fixation de lantigne sur lanticorps spcifique).
- Avec les techniques par comptition, bien que moins souvent signal, ce type dinterfrence peut
nanmoins exister (cas dIgM anti-IgG animales qui par suite dencombrement strique empchent la fixation du
traceur sur lantisrum).
I.5. Solutions pour liminer ou minimiser ces interfrences
Plusieurs solutions sont possibles :
- laddition de srum animal provenant de la mme espce que celle ayant fournie les anticorps ractifs
permet de neutraliser les anti-immunoglobulines (13-14) ; cependant, la concentration dimmunoglobulines
neutralisantes peut tre suffisante pour certains spcimens et insuffisante pour dautres ; par ailleurs, il et difficile
de neutraliser compltement les anticorps de classe IgM,
- lutilisation de fragments F(ab) 2 comme anticorps de capture ou traceur au lieu de lanticorps complet,
ce qui vite la fixation des anticorps htrophiles dirigs contre le fragment Fc, mais nvite pas la fixation des
anticorps anti-idiotypes (15),
- lutilisation de techniques en 2 temps ; les anticorps htrophiles se fixent sur deux molcules danticorps
de capture et ne sont plus disponibles pour lier lanticorps traceur ajout au cours de la deuxime raction
immunologique (15).
I.6. Cas particuliers des patients soumis une immunoscintigraphie ou une immunothrapie
Linjection danticorps monoclonaux de souris (ou de leur fragments) entrane lapparition danticorps anti-souris
(HAMA ou Human Anti-Mouse Antibodies) une concentration telle quils ne sont plus "neutralisantes" par les
solutions prcdentes (16).
Les techniques immunomtriques avec deux anticorps monoclonaux de souris sont particulirement "sensibles"
la prsence danticorps anti-isotypes. Par consquent, tous les analytes doss ainsi sont concerns (ACE-AFP-
PSA-ferritine-hCG-antignes carbohydrates-etc.).
Llimination des "HAMA" ncessite un traitement pralable du srum avant immunodosage, traitement par le
polythylne glycol 130 g/l ou chauffage du srum 90C dans le cas de lACE (17).
La prsence danticorps anti-idiotypes pertubant fortement le dosage du CA 125 a t dcrite chez des patientes
ayant subi plusieurs immunoscintigraphies (avec injection danticorps OC 125) pour surveillance post-opratoire
dun cancer de lovaire. Dans ce cas, les anticorps anti-idiotypes se comportent comme le CA 125 en se fixant sur
les anticorps anti-OC 125 du ractif. Ces anticorps anti-idiotypes peuvent tre limins par chromatographie
daffinit pralable sur protine A (18).
! II. AUTO - ANTICORPS
II.1. Anti-T3, anti-T4
Les auto-anticorps (anti-analytes) rencontrs en pathologie thyrodienne vont galement perturber, plus ou moins
selon le type de mthodologie, les rsultats de dosage de T3 et T4 libres.
Origine
Ces auto-anticorps peuvent tre prsents chez les malades atteints de maladies thyrodiennes (Basedow,
Hashimoto) ou non thyrodiennes et mme quelquefois chez des sujets sains (19-20).
24
La frquence de ces auto-anticorps est denviron 1/1000 dans la population gnrale est plus importante dans les
pathologies auto-immunes.
Mcanisme daction
Linterfrence observe (positive ou ngative) dpendra de la mthode de sparation des formes libres et lies.
- Avec les techniques de type ELISA en une seule tape, ces auto-anticorps en se fixant sur lhormone
marque diminuent la disponibilit du traceur pour lantisrum, entranant une augmentation artefactuelle des
hormones libres.
- Avec certaines techniques radioimmunologiques, o le complexe analyte-immunoglobuline anti-analyte est
retrouve avec la fraction lie, on observe une diminution des valeurs.
Les techniques en deux temps (immunoextraction de lhormone libre, suivie de lavages, puis de laddition du
marqueur), ou les techniques reposant sur le principe dune comptition vis--vis danticorps marqus sont moins
"sensibles" la prsence de ces auto-anticorps (20-21-22).
Mise en vidence
Ces auto-anticorps sont mis en vidence par la mesure du pourcentage des hormones T3 ou T4 radioactives
prcipites par le polythylne glycol 20%.
II.2. Anti-TSH
Les anticorps anti-TSH (synthtiss la suite de lintroduction de TSH dans lorganisme dans un but
thrapeutique) se fixent sur la TSH doser et inhibent la fixation de lanalyte sur les anticorps ractifs. On aura
une sous-estimation des rsultats avec les techniques immunomtrique.
! III. MOLECULES ANORMALES
Dysalbumine et dosage de T4 libre
La prsence dune dysalbuminmie, anomalie de lalbumine se caractrisant par une affinit anormale de cette
protine pour la T4 marque peut entraner une augmentation artefactuelle de la T4 libre avec les techniques de
dosage en un temps (20).
! IV. INTERFERENCES SPECIFIQUES PAR ANALOGIE DE STRUCTURE
Lorsque le srum contient des molcules proches structurellement de lanalyte doser, on pourra observer une
surestimation des rsultats par suite de ractions croises entre ces molcules et lantisrum : interfrences
mdicamenteuses et situations pathologiques particulires.
IV.1. Interfrences mdicamenteuses
Certaines de ces interfrences sont bien connues, parmi lesquelles :
- Triac (acide triiodothyroactique) et dosage de T3 totale et libre,
- Prednisolone (et prednisone transforme en prdnisolone dans lorganisme) et dosage direct du cortisol,
- Progestrone orale et dosage direct de la progestrone (lorsque lantisrum prsente des ractions croises
avec les mtabolites rduits de cette molcule),
- 17 estradiol micronis et dosage direct de lestradiol, par suite de ractions croises avec les mtabolites
(23).
IV.2. Situations pathologiques particulires
Le choix dune technique de dosage des strodes sriques (dosage immunologique direct ou dosage aprs
extraction et sparation chromatographique) devra tenir compte des situations physiopathologiques, du sexe et de
lge qui vont modifier les concentrations relatives du strode et de ses mtabolites (24).
25
- Cortisol
Le dosage direct de la cortisolmie est surestim :
en cas de forte augmentation des prcurseurs (17 hydroxy-progestrone, 11 dsoxycortisol) qui
prsentent des ractions croises avec les antisrums anti-cortisol ; ces situations se rencontrent lors de
dficit enzymatique des surrnales, en particulier dficit en 21 hydroxylase et au cours du test la
mtopirone
en cas daccumulation des strodes conjugus et non conjugus, au cours de linsuffisance rnale
chronique (25).
- Testostrone, le dosage direct sera surestim chez la femme en raison des ractions croises en gnral
importantes avec la dihydrotestostrone (qui reprsente environ 50% de la concentration en testostrone). Le
dosage direct est galement surestim chez lhomme trait par la dihydrotestostrone.
MISE EN EVIDENCE DUNE INTERFERENCE
Lorsque le rsultat trouv ne correspond pas au rsultat attendu, des tests simples de dilution et de surcharge
peuvent permettre de mettre en vidence des problmes dexactitude (26).
- Test de dilution
Un test de dilution non linaire permettra de mettre en vidence :
un effet crochet
une diffrence daffinit de lanticorps entre lantigne doser et lantigne de lchantillon (soit en
raison dune diffrence de structure, soit en raison de la prsence dune substance interfrente).
- Test de surcharge
Ce test est ralis en mlangeant le srum et ltalon le plus lev ; lobtention dune valeur plus faible que celle
attendue doit faire suspecter galement la prsence dune substance interfrente.
Tests particuliers
Par ailleurs, la recherche des facteurs rhumatodes est possible (test de Waaler-Rose, test au latex) ainsi que celle
des "HAMA" laide de trousses commerciales.
26
BIBLIOGRAPHIE
1. Hodgson D, Meguid S, Giannopoulos P, Boscato L, Lazarus L (1993) Incomplete separation of erythrocytes
from serum causes significant error in the IMx free triiodothyronine assay. Clin. Chem. 39/5, 908-909
2. Yvert JP (1989) De la bonne qualit des prlvements biochimiques. 1. Principales hormones et substances
apparentes. Revue Franaise des Laboratoires. 184, 81-88
3. Chambon C, Valat C, Besnard JC (1986) Conservation des prlvements sanguins destins aux dosages radio-
immunologiques (sang complet, plasma diffrentes tempratures). Trait dunion 1, 29-32
4. Bangham DR (1982) Update on standardization and standards in : Hunter WM, Corrie JET. Immunoassays for
clinical chemistry, second edition, Churchill Livingstone pp 27-44
5. Kohler G, Milstein (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Nature
256, 495-497
6. Blacker C, Feinstein MC, Gervasi G (1990) Multiplicit des prolactines : consquences pratiques, Immunoanal.
Biol. Spc. 22, 53-57
7. Snyder PJ, Bachey HM, Montecinos A, Odell WD, Spitalnik SL (1989) Secretion of multiple forms of human
luteinizing hormone by cultured fetal pituitary cells. J. Clin. Endocrinol. Metab. 68, 1033-1039
8. Roger M (1990) Le dosage des gonadotropines en 1990. Immunoanal. Biol. Spc. 22, 59-65
9. Masseyeff R, Ferrua B (1987) Les erreurs par dfaut en grand excs dantigne : phnomne de prozone et
"hook effect". Immunanal. Biol. Spc. 6, 23-26
10. Colas Linhart N (1989) Influence du traitement prliminaire des chantillons : dilution, rle du diluant.
Immunoanal. Biol. Spc. 15, 13-18
11. Daspet JP, Chatelain F, Baud M (1989) Piges en immunoanalyse : causes derreurs associes au traitement
informatique des courbes de calibration. Immunoanal. Biol. Spc. 15,51-17
12. Grassi J (1994) Interfrences dues aux anticorps anti-immunoglobulines, un poison pour tous les dosages
immonologiques. I. Origine des anticorps anti-Immunoglobulines et mcanisme des interfrences.
Immunoanal. Diol. Spc. 9, 60-67
13. Boscato LM, Stuart MC (1986) Incidence and specificity of interference in two-site immunoassays. Clin.
Chem. 32/8, 1491-1495
14. Clark PM, Raggatt PR, Price CP (1985) Antibodies Interfering in Immunometric Assays. Clin. Chem.
31/10,1762
15. Grassi J (1994) Interfrences dues aux anticorps anti-immunoglobulines, un poison pour tous les dosages
immunologiques. II. Interfrences, mises en vidence et suppression. Immunoanal. Biol. Spc. 9, 124-133
16. Schroff RW, Foon KA, Beatty SM, Oldham RK, Morgan AC (1985) Human antimurine immunoglobuline
responses in patients receiving monoclonal antibody Therapy. Cancer Research. 45, 879-885
17. Primus FJ, Kelley EA, Hansen HJ, Goldenberg DM (1988) "Sandwich" - type immunoassay of
carcinoembryonic antigen in patients receiving murine monoclonal antibodies for diagnosis and therapy. Clin.
Chem. 34/2, 261-264
18. Turpeinen U, Lehtovirta P, Alfthan H, Stenman UH (1990) Interference by human anti-mouse antibodies in
CA 125 assays after immunoscintigraphy : anti-idiotypic antibodies not neutralized by mouse IgG but
removed by chromatography. Clin Chem. 36/7, 1333-1338
19. John R, Henley R, Shankland D (1990) Concentration of free thyroxin and free triiodothronine in serum of
patients with thyroxin and triiodothyronine binding autoantibodies. Clin. Chem. 36/3, 470-473
27
20. Sapin R, Gasser F (1986 Autoanticorps anti-T4 et hyperthyroxinmie familiale avec dysalbuminmie :
identification et incidence sur le dosage de T4 libre. Trait dunion. 4,33-34
21. Sapin R, Gasser F, Schlienger JL, Chambron J (1993) Dosages de la triiodothyronine libre utilisant un
anticorps marqu : valuation et comparaison un dosage avec traceur analogue, Ann. Biol. Clin. 51, 13-18
22. Sheehan CP, Christofides ND (1992) One-step, labeled-antibody assay for measuring free thyroxin. II.
Performance in a multicenter trial. Clin. Chem. 38/1, 19-25
23. Thomas C, Vandenberg RJ, Segers M, Bartelink ML, Thien T (1993) Inaccurate measurement of 17-estradiol
in serum of female volunteers after oral administration of milligram amounts of micronized 17B-estradiol.
Clin. Chem. 39/11, 2341-2342
24. Fiet J, Galons H, Villette JM, Boudou P et al. (1990) Problmes particuliers poss par limmunodosage des
strodes. Immunoanal. Biol. Spc. 22, 41-52
25. Nolan GE, Smith JB, Chavre VJ, Jubiz W (1981) Spurious overestimation of plasma cortisol in patients with
chronic renal failure. J. Clin. Endocrinol. Metab. 52/6, 1242-1245
26. Baud M, Cohen R, Ingrand J (1991) Piges et problmes en immunoanalyse. XXX
e
Colloque Mdecine
Nuclaire VIIIe Colloque CORATA Montpellier, 16-19 octobre, p 55
28
PROBLEMES LIES AU MARQUEUR ET A SON SIGNAL
EN IMMUNOANALYSE
R. BADOR
! !! ! INTRODUCTION
Au cours des deux dernires dcennies on a assist un essor considrable de limmunoanalyse, avec un
largissement sans cesse croissant de son champ dapplication et une diffusion de plus en plus grande dans les
laboratoires danalyses. Cet essor a t favoris principalement par lapparition des anticorps monoclonaux et par
lutilisation des marqueurs non radioactifs encore appels marqueurs froids.
Limmunoanalyse regroupe un ensemble de mthodes danalyse chimique dans lesquelles la spcificit de
dtection dune espce molculaire est due sa liaison in vitro avec un ou plusieurs anticorps spcifiques. Afin de
quantifier la formation du complexe antigne-anticorps, la plupart des techniques courantes emploient un
marqueur. Dune manire gnrale, ont peut dfinir un marqueur pour immunodosage comme tant une entit
(atome, molcule, ion, ) lie chimiquement un antigne ou un anticorps et dlivrant un signal, direct ou
indirect, quantitativement mesurable.
Les techniques dimmunodosages, comme toute technique danalyse, peuvent tre values au moyen dun certain
nombre de critres de qualit : prcision, exactitude, dtectabilit (ou limite de dtection). A ces critres
statistiques classiques bien dfinis, il faut ajouter dautres caractristiques importantes : tendue de la gamme de
concentration accessible (dynamique du dosage) et praticabilit (degr dautomatisation, temps danalyse,
conservation des ractifs,).
Quelle est linfluence du marqueur et de son signal sur la qualit globale dun immunodosage ? Cest la question
laquelle tente de rpondre les lignes qui suivent.
! LES MARQUEURS
Les principaux marqueurs utiliss en immunoanalyse courante sont :
- les radiolments dans les techniques RIA (radioimmunoassay) et IRMA (immunoradiometric assay),
- les enzymes dans les techniques EIA (enzymoimmunoassay) et IEMA (immunoenzymometric assay),
- les fluorophores dans les techniques FIA (fluoroimmunoassay) et IFMA (immunofluorometric assay),
- les molcules chimiluminescentes dans les techniques CLIA (chemiluminoimmunoassay) et ICMA
(immunochemiluminometric assay).
Les fluorophores et les molcules chimiluminescentes sont souvent regroups sous la dnomination plus gnrale
de luminophores, cest--dire groupements chimiques susceptibles dmettre un signal luminescent sous leffet
dune excitation approprie, lumineuse dans le premier cas, chimique dans le second cas.
Outre la distinction habituelle entre mthodes de comptition et mthodes immunomtriques deux anticorps, il
existe un autre niveau de classification des immunodosages faisant intervenir la ncessit ou non dune sparation
physique des formes libre et lie avant la mesure du signal. Pour cette raison, on parle dimmunodosages en phase
htrogne et dimmunodosages en phase homogne, ces derniers ne pouvant tre mis en uvre que si le marqueur
dlivre un signal modul par la formation du complexe antigne-anticoprs.
29
Les marqueurs peuvent galement tre classs selon leur nature chimique. Il peut sagir datomes (
125
I,
3
H), dions
(Eu
3+
,
57
Co
3+
), de molcules organiques de faible masse molaire (fluorescine, ester dacridinium, ) ou de
molcules de masse molaire leve (enzymes).
Les diffrents marqueurs pour immunoanalyse doivent possder un certain nombre de qualits gnrales. En
premier lieu, leur liaison chimique une molcule dantigne (traceur) ou danticorps (anticorps de rvlation)
doit perturber le moins possible la formation du complexe antigne-anticorps. De plus, le signal physique mis doit
avoir une intensit (par unit de concentration de marqueur) leve, proprit dont dpendent troitement la
prcision des mesures et la limite de dtection du marqueur. Enfin, la spcificit du signal est une proprit
essentielle garantissant un faible bruit de fond des mesures, donc contribuant galement une bonne dtectabilit.
Outre les trois qualits cites prcdemment, il est souhaitable quun marqueur soit dtectable quantitativement sur
une large gamme de concentration, cest--dire que son signal possde une grande dynamique ; cette proprit est
lie la fois la nature du signal physique lui-mme et lappareil de mesure pouvant prsenter un niveau de
saturation.
La figure 1 met en vidence les critres de qualit caractrisant la dtection intrinsque des marqueurs (ou des
molcules marques), sans prendre en compte les autres sources de variabilit des immunodosages. La sensibilit
dS/dC est constante dans toute la zone de proportionnalit et diminue au voisinage de la zone de saturation.
Lerreur C sur la concentration dpend la fois de la variabilit du signal exprime ici par S et de la sensibilit
dS/dC, puisque C = S.(dS/dC)
-1
. La limite de dtection LD, o concentration minimale dtectable, dpend la
fois de lincertitude ks
0
sur le bruit de fond S
0
et de la sensibilit lorigine (dS/dC)
0
: LD = ks
0
(dS/dC)
0
-1
. Le
signal minimum net dtectable est estim en multipliant lcart type s
0
sur le bruit de fond par le coefficient k
ncessaire pour considrer que la mesure effectue est significativement suprieure S
0
.
! LES DIFFERENTS SIGNAUX
Tout marqueur met un signal physique direct ou indirect, spontan ou provoqu, sensible ou non
lenvironnement physico-chimique. Ce signal physique est mesur au moyen dun instrument qui le convertit en un
signal lectrique lui-mme transform ensuite en un signal numrique. Au cours de ces oprations de conversion
apparaissent diffrents bruits qui sajoutent au signal net pour donner un signal numrique brut S (voir figure
2). Selon la nature du marqueur et le principe de sa dtection les contributions relatives des diffrents bruits
sont variables.
30
Figure 1 : Relation entre signal et concentration en molcules marques
Figure 2 : Signal et bruits lors de la dtection dun marqueur
S = signal
C = concentration en molcules marques
dS/dC = sensibilit
LD = limite de dtection
S
net
= signal numrique net
S = signal numrique brut
B
int
= bruit interne
B
ext
= bruit externe
31
Le signal radioactif
En immunoanalyse, les deux principaux radiolments marqueurs tant liode 125 et le tritium, le signal consiste
donc soit en une mission de photons X et , soit en une mission de particules : ces deux types dmission sont
aisment dtectables au moyen de spectromtres appropris. On utilise parfois le Cobalt 57 metteur dans le cas
des dosages simultans.
Le Signal physique lui-mme est un signal direct (directement mis par le marqueur), spontan (ne faisant pas
intervenir une source dnergie externe) et trs spcifique (les rayonnements parasites ou les contaminations tant
exceptionnels) ; son mission est indpendante du milieu, lactivit (amplitude du signal physique) tant seulement
proportionnelle au nombre de molcules marques. Dautre part, la dtection de ce signal est une dtection
numrique (comptage dimpulsions), donc facilement corrige du bruit de fond rsiduel.
Le tableau suivant indique les limites de dtection (LD) des espces marques avec de liode 125 et avec du
tritium.
Par rapport aux autres marqueurs, en particulier les enzymes, le marqueur radioactif prsente aussi lavantage dun
faible encombrement strique.
Malgr ces proprits trs favorables, il existe certains inconvnients dans lutilisation des molcules
radiomarques : dune part, le temps dacquisition du signal doit tre suffisamment long pour obtenir une prcision
et une limite de dtection satisfaisantes, dautre part le phnomne de dcroissance radioactive, et ventuellement
la radiolyse, limitent la dure de conservation des molcules marques.
LD ABSOLUES DES ESPECES MARQUEES
2000 Ci / mmol
125
I BF = 35 cpm LD 10
-18
mol
t min
3
H 100 Ci / mmol
BF = 25 cpm 10
-16
mol < LD < 10
-17
mol
t min
32
Le signal fluorescent direct
En immunoanalyse, le signal fluorescent peut tre produit soit directement par le marqueur lui-mme (fluorophore
li un antigne ou un anticorps), soit indirectement la suite de la transformation dun substrat fluorigne en un
produit fluorescent par une enzyme spcifique employe comme marqueur (figure 3).
Dans le cas du marquage fluorescent, le signal lumineux mis par le marqueur est un signal direct, provoqu par
une excitation photonique. Lamplitude S
F
du signal reu par le dtecteur peut sexprimer sous la forme :
S
F
= k.
0
..Q.N
o k est un facteur gomtrique,
o
le flux excitateur, labsorptivit molaire du fluorophore, Q le rendement
quantique du fluorophore et N le nombre de molcules marques.
Par rapport au signal radioactif, on constate lexistence de deux causes de variabilit supplmentaires :
o
nest
jamais parfaitement constant puisque toutes les sources lumineuses excitatrices sont susceptibles de fluctuation, Q
dpend de la composition du milieu. En outre se pose le problme de la spcificit du signal et de la slectivit de
sa dtection en raison de linterfrence possible de fluorescences parasites et de rayonnements diffuss ; ce
problme ne peut tre rsolu dans le cas des fluorophores classiques comme la fluorescine et la
mthylombellifrone. Seul lemploi des chlates deuropium a permis, grce la technique de fluorimtrie pulse,
de saffranchir la fois des rayonnements parasites et du bruit interne du dtecteur, avec pour consquence une
limite de dtection trs favorable (environ 10
-18
mol). Les principaux avantages du marquage fluorescent sont : un
temps dacquisition du signal trs bref et une dynamique de dtection pouvant atteindre cinq ordres de grandeur.
(a)
(b)
Figure 3 :
Emission du signal fluorescent.
(a) mission directe
(F* = fluorophore)
(b) mission indirecte
(E = enzyme)
33
Le signal chimiluminescent direct
Comme dans le cas du signal fluorescent, lmission lumineuse peut provenir soit du marqueur (luminophore)
ragissant directement avec un ractif en excs, soit dune espce molculaire transforme par une enzyme
spcifique utilise comme marqueur (figure 4).
Dans le premier cas on a affaire un signal direct, provoqu par une raction chimique. Lamplitude du signal S
CL
reu

par le dtecteur un instant t aprs linjection du ractif peut sexprimer sous la forme :
k, Q et N ayant la mme signification que prcdemment, tant la vitesse de raction chimique.
Il existe diffrentes causes de variabilit de S
CL
: le rendement quantique et la vitesse de raction dpendent de la
composition du milieu ; le volume de ractif et linstant du dbut de la dtection ne peuvent tre parfaitement
reproductibles. En revanche la spcificit de lmission, donc la slectivit de la dtection, est meilleure que celle
du signal fluorescent puisquil ny a pas de source de lumire parasite. Il faut galement noter que le bruit interne
du dtecteur peut tre en grande partie supprim lorsquon emploie la technique du comptage de photons grce
laquelle la limite de dtection atteint dans certains cas 10
-19
mol.
Les avantages du marquage chimiluminescent sont les mmes que ceux du marquage fluorescent en ce qui
concerne le temps dacquisition du signal et la dynamique de dtection. Linconvnient majeur en est la fugacit
de lmission qui a pour consquence limpossibilit de vrifier une mesure effectue sur un tube.
Le tableau suivant prsente les principaux marqueurs chimiluminescents (en marquage direct) ainsi que les
ractions de chimiluminescence.
dN
dt
S
CL
= k.Q. dN
dt
Figure 4 :
Mode dmission du signal
chimiluminescent.
(a) mission directe par le
marqueur (L*)
(b) mission indirecte grce
un marqueur enzymatique (E)
34
PRINCIPAUX MARQUEURS CHIMILUMINESCENTS
PHTALHYDRAZIDES : LUMINOL, ISOLUMINOL, DERIVES
peroxydase
Luminol + H
2
O
2
Aminophtalate + hv
OH
ESTERS DACRIDINIUM
Ester dacridinium + H
2
O
2
N-Mthylacridone + hv
OH
Le signal enzymatique
Les marqueurs enzymatiques nmettent pas un signal physique direct, ils sont dtects par lintermdiaire dun
substrat spcifique en excs qui est transform en un produit mettant un signal physique dont lamplitude est
proportionnelle la quantit du marqueur enzymatique et au temps dincubation. Le signal enzymatique est donc
un signal indirect, soit dmission lorsque le produit form est fluorescent ou chimiluminescent, soit dabsorption
lorsque le produit form est dtect par une mesure dabsorbance une longueur donde caractristique (Figures 5
et 6).
Figure 5 : Principe dmission du signal enzymatique
35
Figure 6 : Diffrentes possibilits de mesure du signal enzymatique
Lorsquon procde des mesures fluorimtriques ou luminomtriques, on retrouve les causes de variabilit cites
prcdemment auxquelles sajoute la variabilit de la raction enzymatique elle-mme. Quant aux mesures
photomtriques dabsorption les plus frquemment employes, elles souffrent en plus dun certain manque de
spcificit (influence des bulles, imperfections des tubes de mesure, ) et dune dynamique rduite.
Cependant, malgr ces inconvnients, le marquage enzymatique est le seul offrir la possibilit damplification du
signal par simple augmentation du temps dincubation de ltage de rvlation.
Le tableau suivant prsente les principales enzymes utilises en immunoanalyse ainsi que les modes de dtection
possibles (photomtrie dabsorption, fluorimtrie, luminomtrie).
Les deux enzymes les plus employes sont la peroxydase de raifort qui peut tre rvle par mesure photomtrique
dabsorption et par chimiluminomtrie et la phosphatase alcaline qui offre les trois possibilits de dtection :
absorption, fluorescence et chimiluminescence.
PRINCIPALES ENZYMES UTILISEES EN I.A.
Dtection
Absorption Fluo. C.L.
Peroxydase de raifort (HRP) + +
Phosphatase alcaline + + +
-D-Galactosidase (GAL) + + +
Glucose 6 Phosphate dshydrognase
(G6PD)
+ +
36
Signalons que la malate dshydrognase est utilise dans les mthodes de comptition en phase homogne.
Cette liste nest pas exhaustive, on peut citer galement le lysozyme, lactylcholine-estrase,
Trois exemples de rvlation du signal enzymatique sont prsents ci-aprs.
Premier exemple : rvlation photomtrique dabsorption de la PEROXYDASE au moyen dun ractif contenant
de lo.phnylnediamine et H
2
O
2
Le mesure dabsorbance est effectue 492 nm, aprs 30 minutes dincubation.
Ractif PEROXYDASE Produit
La dynamique de mesure est plus grande que par photomtrie dabsorption : au moins quatre ordres de grandeur.
La limite de dtection de la phosphatase alcaline peut tre estime une valeur infrieure 10
-17
mol.
Troisime exemple : rvlation chimiluminomtrique de la phosphatase alcaline au moyen dun Phnyl Phosphate
Dioxtane substitu, lAMPPD (adamantyl mthoxyphnylphosphate dioxtane) qui est stable chimiquement.
Aprs action de la phosphatase alcaline, le produit form est un dioxtane instable qui se dcompose en formant
une espce excite. Par transfert dnergie, lnergie dexcitation de cette espce est communique des molcules
de fluorescine prsentes dans le milieu de rvlation.
La dynamique de la mesure couvre environ trois ordres de grandeur (de 2.10
-3
u. dabsorbance jusqu 2). La
limite de dtection de la peroxydase peut tre estime 10
-17
mol par cette mthode de rvlation.
Deuxime exemple : rvlation fluorimtrique de la phosphatase alcaline au moyen dun substrat fluorigne, le
mthyl ombellifryl phosphate non fluorescent qui est transform en mthyl ombellifrone fluorescente.
H
2
O
2
o.phnylnediamine
o.nitrophnol
[mesure de A 492
nm]
Ractif PHOSPHATASE ALCALINE Produit
Mthylombellifryl
phosphate
Mthylombellifrone
Exc. 364 nm Dt. 448 nm
37
Avec ce systme la limite de dtection atteinte est de lordre de 10
-21
mol de phosphatase alcaline. Par comptage de
photons, la dynamique de mesure peut atteindre cinq ordres de grandeur.
AMPPD stable
PH. ALCALINE
instable
OPO
3
Na
2
OM
e
OM
e
OM
e
Fluorescine
hv
38
CLASSIFICATION DES AUTOMATES DIMMUNOANALYSE
EN FONCTION DU SIGNAL
Seuls sont cits ici les automates les plus utiliss par les participants lopration de contrle de qualit national
qui a eu lieu en juin 1994.
Systmes utilisant un signal dabsorption
Automate Marqueur Chromogne
- BIOTROL "7000 S" PAL BNPP
- BOEHRINGER "ES 300/600/700" HRP ABTS
- CIS BIO INT. "Cispack 4200" HRP OPD
- ROCHE DIAGNOSTIC SYST. "Cobas Core" HRP TMB
- SERONO DIAGNOSTICS "SR1" PAL PNPP
Systmes utilisant un signal fluorescent direct
Automate Marqueur
- ABBOTT "TDX" Fluorescine
- BEHRING DIAGNOSTIC "Opus" Rhodamine
- KABI PHARMACIA "Autodelfia" Eu
3+
Systmes utilisant un signal fluorescent indirect
Automate Marqueur Fluorigne
- ABBOTT "IMX" PAL 4MUP
- BAXTER "Stratus" PAL 4MUP
- BEHRING DIAGNOSTIC "Opus" PAL 4MUP
- BIOMERIEUX "Vidas" PAL 4MUP
- EUROGENETICS "AIA 600/1200" PAL 4MUP
Systmes utilisant un signal chimiluminescent direct
Automate Marqueur
- CIBA CORNING DIAG. Magic Lite Ester dacridinium
- CIBA CORNING DIAG. ACS 180 Ester dacridinium
- BEHRING DIAGNOSTIC Berilux Acridinium acyl
sulfonamide
Abrviations employes dans le tableau ci-dessus : PAL phosphatase alcaline, PNPP paranitrophnyl phosphate,
HRP peroxydase de raifort, ABTS azino-di-[thylbenzothiazolinyl sulfonate], OPD orthophnylnediamine, TMB
tetramthylbenzidine, 4MUP 4-mthylombellifryl phosphate.
39
! DISCUSSION
Si lon compare les qualits intrinsques des signaux des diffrents marqueurs, il apparat que la plus faible
variabilit dans les mesures est obtenue avec le signal radioactif, que les meilleures limites de dtection des
espces marques sont atteintes grce au signal chimiluminescent (direct ou enzymatique), que la plus grande
dynamique de mesure est obtenue avec le signal fluorescent rsolu en temps et avec le signal chimiluminescent.
Lensemble des trois critres prcdents est prendre en considration pour les dosages immunomtriques deux
anticorps, mais il est bien vident que pour les mthodes de comptition cest le premier critre qui prvaut. Donc,
dans la mesure o la limite de dtection du marqueur et la dynamique de son signal ne sont pas des facteurs
limitants, le critre "variabilit" est sans aucun doute le plus important, ce qui situe le marqueur radioactif en
position privilgie.
Cependant un immunodosage ne se rsume pas la seule tape de dtection dune espce marque, il fait
intervenir des tapes immunochimiques pralables, si bien que les critres de qualit habituellement dtermins
pour valuer un dosage sont lis sa variabilit totale qui est la somme de la variabilit immunochimique, de la
variabilit dmission du signal et de la variabilit de mesure de ce signal.
La qualit globale propre dun systme dimmunoanalyse, en faisant abstraction de linfluence de loprateur,
dpend donc de trois facteurs principaux : le systme immunologique, la phase solide (sauf pour les mthodes en
phase homogne) et le marqueur ainsi que son systme de dtection. En consquence, la nature du signal nest
quun paramtre parmi dautres, et lexamen attentif des rsultats du contrle de qualit semble indiquer que le
marqueur nest probablement pas llment prpondrant entranant la plus ou moins bonne qualit dune
technique. Dans cet expos, on a fait volontairement abstraction des conditions opratoires qui jouent cependant
un rle capital dans la qualit des dosages : en particulier le travail en tubes simples induit une variabilit des
rsultats plus grande que si les mesures sont effectues sur "doublets".
Dans ltat actuel des techniques dimmunoanalyse, il est impossible daffirmer quune mthode est meilleure
quune autre partir de la seule prise en compte de la nature du marqueur et de son signal.
BIBLIOGRAPHIE
1. D.W. CHAN, M.T. PERLSTEIN, Immunoassay, a practical guide. Academic Press, 1987.
2. W.P. COLLINS. Alternative Immunoassays. John Wiley and sons, 1985.
3. Y. BARBIER. Les immunodosages, de la thorie la pratique. Editions de lAcomen, 1989.
4. P. TIJSSEN. Practice and theory of enzyme immunoassays. Elsevier, 1985.
5. R. MASSEYEFF. Propositions pour une classification et une terminologie de limmuno-analyse. In
" Instrumentation en biochimie clinique ", Monographie SFBC, 1989, 128-133.
6. J.P. YVERT, B. CAPOLAGHI, A. TRUCHAUD. Classification des systmes dimmuno-analyse en fonction du
signal. Spectra Biologie, 92, 1992, 53-58.
7. I. HEMMILA. Fluoroimmunoassays and Immunofluorometric Assays. Clinical Chemistry, 31, 1985, 359-367.
40
ANALYTES
CA 19-9
PSA
hCG - hCG
TSH
41
ANTIGENE CARBOHYDRATE 19-9
(CA 19-9)
A. BEAUDONNET, R. COHEN
! I. INTERT PHYSIOPATHOLOGIQUE
En 1979, Koprowski et al. (1) ont mis en vidence un antigne dnomm antigne carbohydrate 19-9 (CA 19-9) ou
GICA (gastrointestinal carbohydrate antigen) grce lutilisation dun anticorps monoclonal obtenu partir dune
ligne cellulaire provenant dun carcinome colorectal humain (SW 1116).
Le CA 19-9 est prsent dans de nombreux tissus ftaux et dans diffrents tissus sains de ladulte : pithliums
glandulaires du pancras, foie, voies biliaires, estomac, poumons, canaux des glandes salivaires et la prostate (2).
Lantigne est dtectable dans le srum, le lait, le plasma sminal, les sucs gastrique et pancratique ainsi que dans
la salive.
Le CA 19-9 srique augmente chez les patients atteints de tumeurs du tractus digestif (voies biliaires, foie,
estomac, intestin) et en particulier chez les patients atteints de carcinome du pancras.
Dans les cancers du pancras, le dosage de cet antigne associ aux techniques dimagerie est une aide au
diagnostic. Le CA 19-9 a une valeur pronostique et son principal intrt rside dans la surveillance thrapeutique
et la mise en vidence de rcidives.
Dans les cancers colorectaux, les cancers des voies biliaires et de lestomac, la frquence de positivit du CA 19-9
est moindre. Son dosage est galement utile dans le suivi de ces tumeurs. Une augmentation du CA 19-9 peut tre
galement observe dans les cancers de lovaire et broncho-pulmonaire.
Le CA 19-9 nest pas un marqueur spcifique du cancer, en effet, il peut tre lev au cours de maladies bnignes
digestives (pancratites, hpatites aigus ou chroniques, lithiases biliaires) ainsi quau cours de la mucoviscidose
et du diabte.
! II. STRUCTURE
Le dterminant antignique reconnu par lanticorps monoclonal est un oligosaccharide (lacto-N-fucopentaose II
sialyl) port de manire rptitive, soit par un ganglioside la surface des membranes cellulaires, soit par une
protine de type mucine dans le srum (3). Cet pitope glucidique fait partie de la classe des carbohydrates du
groupe sanguin Lewis.
Les premiers travaux de Koprowski indiquent que la glycoprotine portant ce dterminant antignique a une masse
molaire de 35 000 g.mol
-1
. Plus rcemment, Klug et al. (4) ont extrait de surnageants de cultures cellulaires de
carcinome colorectal des molcules exprimant lpitope CA 19-9 de masse molaire de 210 000 g.mol
-1.
Ces
molcules peuvent sagrger en donnant des polymres de masse molaire trs leve de 600 000 2 000 000 g.mol
-
1
.
! III. TECHNIQUE DE DOSAGE
III.1. Principe
Toutes les techniques de dosage sont de type immunomtrique avec marqueur. En 1983, Del Villano et al. (5) ont
mis au point une technique avec marqueur isotopique (
125
I). Depuis, plusieurs trousses commercialises sont
apparues utilisant diffrents marqueurs non isotopiques.
42
Lors de lenqute du contrle national de qualit (juin 1994), mille soixante six laboratoires ont rendu un rsultat
de CA 19-9. Les techniques avec dtection dun signal photomtrique, fluorescent et radioactif sont utilises par
respectivement 47%, 46% et 4,5% des participants (2,5% des techniques ntant pas codes ou insuffisamment
reprsentes).
III.2. Anticorps
Toutes les trousses de dosage utilisent le mme anticorps monoclonal comme anticorps de capture et comme
anticorps marqu. Cet anticorps est dnomm 1116-NS-19.9.
III.3. Etalon
Actuellement, il nexiste pas dtalon international de rfrence.
Les talons sont prpars partir dantigne isol extrait de surnageants de cultures cellulaires provenant dun
adnocarcinome colorectal. Cet antigne est ensuite dilu dans un "pool" de srums humains, ou dans un mlange
de protines humaines et animales.
Les rsultats de CA 19-9 sont exprims en units arbitraires (U/ml ou kU/l), une unit correspondant 0,8 ng de
glycoprotine portant le dterminant antignique.
III.4. Causes derreurs
- Effet crochet
Lorsque la concentration en antigne est trs leve et trs suprieure celle du dernier point de la gamme
dtalonnage, on peut observer une diminution de la valeur du signal et par consquent un rsultat faussement
abaiss. Les concentrations de CA 19-9 peuvent tre trs leves, en particulier en cas de cancers du pancras et
peuvent atteindre 300 000 kU/l (6). Il est donc important de connatre la concentration partir de laquelle leffet
crochet peut apparatre avec la technique utilise, cette concentration devant tre dtermine pour chaque
technique.
La prsence danticorps anti-souris (HAMA) dans lchantillon peut tre lorigine de rsultats errons (en
gnral surestims) avec les techniques immunomtriques utilisant des anticorps monoclonaux.
! IV. RESULTATS DES ENQUETES INTERLABORATOIRES
Le dosage du CA 19-9 prsente actuellement une grande variabilit intertechnique. Lors de lenqute de juin 1994,
deux chantillons de contrle ont t distribus se caractrisant par des valeurs modrment augmentes (srum
MT 18 de concentration moyenne de 60 kU/l et srum MT 19 de concentration moyenne de 169 kU/l). Les CV
tronqus toutes techniques sont respectivement de 30,5 et 25,8%. Comme on peut le voir sur la figure 1 o sont
reprsentes les moyennes par technique exprimes en pourcentage de la moyenne gnrale, deux trousses
fournissent des rsultats environ deux fois plus faibles que la moyenne gnrale. Au contraire, une autre trousse se
distingue par des valeurs gales une fois et demie la moyenne gnrale.
Les diffrences intertechniques peuvent surprendre tant donn que le mme anticorps monoclonal (1116-NS-19-
9) est utilis par tous les fabricants. Les carts observs sont expliqus par labsence dtalon international de
rfrence, par les diffrences au niveau du marqueur, de la phase solide et des conditions exprimentales (pH,
dure et temprature des ractions immunologiques). Par ailleurs, les carts intertechniques plus ou moins
accentus selon les chantillons de contrle sont vraisemblablement dus lexistence de formes de CA 19-9 plus
ou moins agrges.
Sur la figure 2, sont reprsents les CV% tronqus obtenus par technique. On constate que 87% pour MT 18 et
75% pour MT 19 des systmes analytiques reprsents permettent dobtenir des CV tronqus infrieurs 10%.
43
Enfin, lors de cette enqute, 77,5% des laboratoires utilisaient des ractifs adapts sur automates.
Figure 2 : Reproductibilit par technique.
! V. RESULTATS OBTENUS SUR DES SERUMS DE PATIENTS
Les tudes comparatives ralises sur des srums de patients atteints de diffrentes pathologies montrent des carts
inter techniques plus ou moins importants selon les trousses et/ou selon les srums. Pour certains srums, les carts
peuvent tre considrables avec des rapports de concentration pouvant aller jusqu 9 (7-8-9).
! VI. ETAPES PREANALYTIQUE CONSERVATION DES ECHANTILLONS
VI.1. Prlvement
Sauf indications particulires, le dosage doit tre ralis sur srum.
Les interfrences ventuelles dues lhmolyse, lhyperlipidmie, lhyperbilirubinmie doivent tre analyses
avec chaque systme analytique.
Figure 1 : Moyennes des diffrentes trousses exprimes en % de la moyenne gnrale.
44
VI.2. Conservation des chantillons
Il est conseill de conserver les srums congels si le dosage doit tre diffr de plus de vingt-quatre heures. Les
cycles de conglation-dconglation doivent tre vits.
! VII. INTERPRETATION DES RESULTATS
VII.1. Variations gntiques
Les sujets dpourvus de gnes Lewis (Lewis a- b-), soit environ 7% des individus ne peuvent synthtiser le CA 19-
9 par absence de fucosyltransfrase (10). Ces sujets ont un taux de CA 19-9 indtectable. Cependant, des valeurs
leves de CA 19-9 srique et salivaire ont t observes chez des patients cancreux Lewis a- b- (11) ; ceci
pourrait sexpliquer par lexistence de deux fucosyltransfrases distinctes (lune pour la synthse des substances
du groupe Lewis, lautre pour la synthse du CA 19-9).
Chez les sujets Lewis a- b-, le dosage du CA 19-9 peut tre remplac par le dosage de lantigne carbohydrate 50
(CA 50) qui est un ganglioside isol galement partir de carcinomes du tractus digestif.
VII.2. Variations physiologiques
Age et sexe : chez lhomme, il ny pas de variation significative en fonction de lge. Par contre, selon Del
Villano (5), chez la femme les valeurs sont plus leves dans le groupe dge 20-29 ans et plus basses dans le
groupe dge 60-69 ans ; par ailleurs, les valeurs observes chez les femmes de moins de 60 ans sont plus leves
que chez les hommes. Cependant, cette diffrence en fonction du sexe nest pas retrouve par tous les auteurs.
Fumeurs : contrairement lantigne carcinoembryonnaire, les valeurs de CA 19-9 sont identiques chez les
fumeurs et les non fumeurs (12).
VII.3. Valeurs de rfrence
Les carts intertechniques sont importants et les valeurs de rfrence doivent tre dtermines pour chaque
technique. Nanmoins la valeur-seuil de 37 kU/l dtermine avec la technique immunoradiomtrique de Del
Villano (5) est la plus gnralement utilise comme valeur discriminante entre valeurs ngative et positive (5-6-
13).
VII.4. Variations au cours des pathologies cancreuses
Les valeurs indiques ci-dessous sont donnes titre indicatif.
- CA 19-9 et cancers du pancras
Lindication de prdilection du dosage de CA 19-9 est le cancer du pancras. Son dosage associ aux techniques
dimagerie est une aide au diagnostic, mais il ne peut tre utilis seul comme marqueur de diagnostic ou de
dpistage en raison de son manque de sensibilit et de spcificit.
La valeur prdictive positive (VPP) varie selon la valeur-seuil choisie. Pour une valeur-seuil de 60 kU/l, la VPP est
de 61% et pour une valeur-seuil de 120 kU/l, la VPP augmente 79% (14).
Le CA 19-9 a une valeur pronostique. Les concentrations sont corrles avec la taille de la tumeur (15). Les
concentrations les plus leves sont rencontres en gnral chez les malades ayant une tumeur inoprable et des
mtastases (16). Des valeurs suprieures 1000 kU/l indiquent la prsence de mtastases (17).
Le principal intrt du CA 19-9 rside dans la surveillance thrapeutique et la mise en vidence de rcidives. Une
normalisation du CA 19-9 dans les trois mois suivant lablation de la tumeur est dun pronostic favorable. Par
contre, laugmentation dans les mois suivant lopration indique une rcidive pouvant prcder lapparition des
signes cliniques et lapparition danomalies lchotomographie et la tomodensitomtrie.
45
- CA 19-9 et autres cancers digestifs
Au cours des cancers colorectaux, gastrique et hpatique, la frquence de positivit est plus faible quau cours des
cancers pancratiques et la frquence de positivit augmente avec le stade de lvolution et la prsence de
mtastases. Le dosage du CA 19-9 peut tre utile au suivi de ces patients et permettre la dtection de rcidives.
Dans le cancer des voies biliaires, le CA 19-9 prsente une bonne sensibilit, mais une faible spcificit. Lintrt
majeur rside dans la surveillance post-chirurgicale et/ou thrapeutique.
- CA 19-9 et autres cancers
Lors des cancers broncho-pulmonaires, le CA 19-9 peut augmenter ; mais il prsente une sensibilit faible
(comparable celle de lantigne carcinoembryonnaire) ; par ailleurs, il prsente une spcificit et une VPP
infrieures celle de lantigne carcinoembryonnaire (21).
En cas de cancer de lovaire (adnocarcinome de type mucineux), le CA 19-9 peut tre utile au suivi de ces
patients lorsque lantigne carbohydrate 125 (CA 125) est ngatif.
VII.5. Variations au cours des pathologies bnignes
Le CA 19-9 est augment dans environ 9% des pathologies bnignes. Ces augmentations sont en gnral modres
au cours des pancratites, hpatites et cirrhoses (valeurs infrieures 100 kU/l).
Cependant, des valeurs trs leves ont t dcrites en cas de lithiases du choldoque compliques dangiocholite
aigu : de 2400 kU/l jusqu 32 000 kU/l (14-18-19). Ces concentrations trs leves peuvent tre dues une
augmentation de la scrtion de lantigne au sein du tissu pithlial biliaire inflammatoire et/ou la rtention de
lantigne lie lobstacle biliaire (18). Le CA 19-9 se normalise alors aprs leve de lobstacle et disparition de
linflammation.
Enfin, des augmentations significatives ont aussi t signales chez des malades atteints de mucoviscidose (20). Le
CA 19-9 est galement lev chez les diabtiques en dcompensation aigu, lvations modres, mais corrles
la svrit de la dcompensation juge sur des critres mtaboliques (22).
! VIII. LEGISLATION
La lgislation actuelle impose une double dtermination du CA 19-9 :
- soit avec reprise du srum prcdent (dure maximale de conservation sous forme congele de deux
mois)
- soit dans deux sries de dosage diffrentes,
- soit dans la mme srie sur deux dilutions diffrentes du mme srum.
! IX. CONCLUSION
Le CA 19-9 est un antigne dfini par un anticorps monoclonal dont laugmentation srique est frquente au cours
des cancers du pancras et du tractus digestif. Cest au cours des cancers du pancras que la frquence de positivit
est la plus grande et que les valeurs de CA 19-9 les plus leves sont observes. Des augmentations importantes
sont galement notes lors des lithiases du choldoque compliques dangiocholite. Dans les autres pathologies
bnignes, les valeurs de CA 19-9 sont en gnral faiblement ou modrment augmentes.
Comme pour les autres marqueurs tumoraux, en raison de la variabilit inter techniques observe actuellement, il
est indispensable que le suivi dun mme patient soit effectu avec la mme mthodologie.
46
BIBLIOGRAPHIE
1. Koprowski H, Steplewski Z, Mitchell K, Herlyn M, Herlyn D, Fuhrer P (1979) Colorectal carcinoma antigens
detected by hybridoma antibodies. Somatic Cell Genet. 5, 957-972

2. Dietel M, Arps H, Klapdor R, Huller-Hagen S, Sieck M, Hoffmann L (1986) Antigen detection by the
monoclonal antibodies CA 19-9 and CA 125 in normal and tumor tissue and patient sera. J. Cancer. Res. Clin.
Oncol. 111, 257-265

3. Magnani JL, Steplewski Z, Koprowski H, Ginsburg VA (1983) Identification of the gastro-intestinal and
pancreatic cancer associated antigen detected by monoclonal antibody CA 19-9 in the sera of patients as a
mucin. Cancer Res. 43, 5489-5492

4. Klug TL, Ledonn NC, Greber TF, Zurawski VR (1988) Purification and composition of a novel gastro-
intestinal tumor-associated glycoprotein expressing sialylated lacto-N-fucopentaose II (CA 19-9) Cancer Res.
48, 1505-1511.

5. Del Villano BC, Brennan S, Brock P, Bucher C, Liu V, McClure M, Rake B, Space S, Westrick B et al.
(1983) Radioimmunometric assay for a monoclonal antibody-defined tumor marker, CA 19-9. Clin. Chem. 29,
549-552

6. Ritts RE, Del Villano BC, Gov LW, Herberman RB, Klugt L, Zurawski VR (1984) Initial clinical evaluation
of an immunoradiometric assay for CA 19-9 using the NCI serum bank. Int. J. Cancer 33, 333-345
7. Perret Liaudet A, Beaudonnet A, Revenant MC, Mailliavin A (1990) Dosage de lantigne carbohydrate 19-9
par trois techniques enzymo-immunomtriques. Rsultats dune tude multicentrique. LEurobiolobiste 188,
277-284

8. Talbot JN, Coutris G, Bouyges N, Delahaye N, Machairas M (1991) Dosage du CA 19-9 : comparaison dun
dosage fluorimtrique avec un dosage radio-immunologique. XXX Colloque mdecine nuclaire, VIII
colloque CORATA, Montpellier, 16-19 octobre, p 139

9. Fateh-Moghadam A, Hero B, Stiebek P, Nagel D, Jaworek D (1990) Investigation of different CA 19-9
assays : clinical significance and consequences for the interpretation, the assessment of multicenter trial
results and the test standardization J. tumor marker oncol. (Abstract) 5, 224

10. Brockhaus M, Magnani JL, Blaszcyk M, Steplewski Z, Koprowski H, Karlsson KA, Larson G, Ginsburg V
(1981) Monoclonal antibodies directed against the human Le blood group antigen. J. Biol. Chem. 256, 13223-
13225

11. Ruibal Morell A (1989) Tumor markers and neoplastic and non neoplastic pathology. Communication orale
au 1er Symposium Mditerranen sur les dosages immunomtriques, Naples, 20-22 septembre

12. Andriulli A, Gindrot T, Piantino P, Farini R, Cavallin G, Piazzi L et al. (1986) Prospective evaluation of the
diagnostic efficacy of CA 19-9 assay as a marker for gastro-intestinal cancers. Digestion 33, 26-33

13. Barbier Y, Galvain D (1989) Lantigne carbohydrate 19-9. Immunoanal. Biol. Spc. 18, 41-48

14. Nakad A, Colombel JF, Geubel AP, Cerulus G, Farchakh E et al. (1989) Lictre est-il une cause derreur
dans linterprtation du CA 19-9 srique ? Acta Gastro-Enterologica Belgica LII, 17-22

15. Safi F, Roscher R, Bittner R, Schenkluhn B, Dopfer HP, Beger HG (1987) High sensitivity and specificity of
CA 19-9 for pancreatic carcinoma in comparison to chronic pancreatitis. Serological and
immunohistochemical findings. Pancreas 2, 398-403

16. Steinberg WM, Gelfand R, Andersson KK, Glenn J, Kurzman SH, Sindelar WF, Toskes PP (1986)
Comparison of the sensitivity and the specificity of the CA 19-9 and carcino-embryonic antigen assays in
detecting cancer of the pancreas. Gastro-enterology 90, 343-349
47
17. Klapdor R, Klapdor U, Bahlo M, Kremer B, Dietel M, Dallek M et al. (1984) Sensitivity clinical and
experimental data (nude mice). Dig. Dis. Sci. 29, 955

18. Sawabu N, Takemori Y, Toya D, Yoneshima M, Kidani H et al. (1986) Factors affecting serum levels of CA
19-9 with special reference to benign hepatobiliary and pancreatic diseases. Gastro-enterol. J. 21, 491-498
19. Albert MB, Steinberg WM, Henry JP (1988) Elevated serum levels of tumor markers CA 19-9 in acute
cholangitis. Digestive Diseases and Sciences 33/10, 1223-1225
20. Duffy MJ, OSullivan F, Mc Donnell TJ, Fitz Gerald MX (1985) Increased concentrations of the antigen CA
19-9 in serum of cystic fibrosis patients. Clin. Chem. 31, 1245-1246
21. Dousset B, Vescovi G, Feintrenie X, Belleville F, Nabet P (1987) Adenocarcinomes bronchiques : intrt de
deux marqueurs tumoraux : CA 19-9 et ACE. Md. et Hyg. 45, 3582-3585
22. Behnamou PY, Vuillez JP, Meffre G, Halimi S, Agnius Delord C (1989) Le CA 19-9 est-il un marqueur de
souffrance pancratique dans le diabte ? 7
me
Journes Lilloises de Biologie Clinique, Le Touquet, octobre,
186-187
48
ANTIGENE SPECIFIQUE DE LA PROSTATE
(PSA)
A. BEAUDONNET, R. COHEN
! I. INTERET PHYSIOPATHOLOGIQUE
Le PSA (Antigne spcifique de la prostate) a t isol et purifi par YANG (1) en 1979 partir de tissu
prostatique humain.
Le PSA est une glycoprotine scrte par les cellules pithliales de la prostate et, un trs faible niveau de
concentration, par les glandes pri-vsicales et pri-urtrales. Il est excrt dans le liquide sminal, la circulation
sanguine et lurine. Le PSA est une protase dont le rle physiologique est le clivage dune protine implique
dans la liqufaction du sperme aprs ljaculation.
Jusqu prsent, le PSA tait considr comme presque exclusivement spcifique du tissu prostatique, augmentant
lors des pathologies bnignes (prostatites-hypertrophies bnignes ou adnomes) et au cours des cancers. Cependant
des tudes rcentes montrant la prsence de PSA dans des cellules cancreuses du sein (scrtion associe la
prsence de rcepteurs aux strodes) et dans le lait maternel remettent en question cette spcificit tissulaire (2).
Des tudes complmentaires sont nanmoins ncessaires pour prciser le rle et lintrt clinique de ce PSA extra-
prostatique.
Par contre, lutilit du PSA en pathologie prostatique est bien documente.
I.1. PSA et diagnostic prcoce de cancer
Associ dautres examens, et en particulier au toucher rectal, la dtermination du PSA srique permet
daugmenter le nombre de cancers diagnostiqus un stade prcoce.
I.2. PSA et dtermination du stade
Le PSA ne permet pas, lui seul, de dterminer le stade du cancer bien que sa concentration augmente avec celui-
ci. En effet, il existe une grande dispersion des valeurs pour un stade donn (3) et par ailleurs, plus un cancer est
indiffrenci, moins il scrte de PSA (4).
I.3. PSA et surveillance des cancers traits
Le principal intrt du PSA est la surveillance du traitement du cancer de la prostate (prostatectomie radicale
hormonothrapie ou radiothrapie). Le PSA permet dvaluer lefficacit du traitement, de surveiller une rmission
et un dpistage prcoce des rcidives.
! II. STRUCTURE DU PSA HETEROGENEITE MOLECULAIRE
Le PSA est une glycoprotine (protase appartenant au groupe des kallicrines) compose de 237 acides amins.
Dans le srum, le PSA est prsent sous forme libre et lie des antiprotases : alpha 1 antichymotrypsine (PSA-
ACT) et alpha 2 macroglobuline.
Le PSA libre a une masse molaire de 34 000 g.mol
-1
et les complexes avec lalpha 1 antichymotrypsine et lalpha 2
macroglobuline ont des masses molaires de 100 000 et 780 000 g.mol
-1
respectivement.
49
En ce qui concerne la structure antignique, cinq pitopes ont t dcrits sur la molcule de PSA libre. La liaison
du PSA avec les antiprotases masque partiellement ou compltement ces pitopes. En effet, trois de ces cinq
pitopes sont masqus pour le PSA-ACT et les cinq pitopes sont situs lintrieur de la molcule dalpha 2
macroglobuline et ne sont pas accessibles aux anticorps. Seules les formes de PSA libre et lie lACT seront
donc doses immunologiquement. LACT se fixe toujours sur les mmes pitopes du PSA pour des raisons de
charge et de structure.
Les proportions des formes libre et lie lACT varient selon les situations physiopathologiques, avec une
prdominance de la forme libre au cours de ladnome et une prdominance de la forme PSA-ACT dans les
cancers (5-6).
! III. METHODES DE DOSAGE
III.1. Principe
Le dosage du PSA est ralis par des mthodes immunologiques avec marqueur.
Il existe de nombreuses trousses de dosage (dix-sept taient reprsentes lors de la onzime enqute du contrle
national).
La premire technique radioimmunologique (RIA) dvelopp par YANG et commercialise sous le nom de Pros
check est la seule utilisant le principe de la comptition. Les autres trousses disponibles actuellement sont toutes
bases sur le principe de limmunomtrie.
Ces trousses se diffrencient principalement par :
- la nature de la phase solide (tubes, billes, microplaques, microparticules magntiques, etc.),
- ltalon,
- lorigine et la spcificit des anticorps,
- les diffrences de temps dincubation,
- la nature du signal mesur (comptage de radioactivit, mesure photomtrique, mesure de luminescence ou
de fluorescence).
III.2. Etalon
- Situation actuelle
Actuellement, il nexiste pas dtalon international de rfrence permettant aux fabricants de calibrer leurs
trousses.
Par contre, il existe au moins deux talons (Yang et Hybritech) par rapport auxquelles les trousses sont calibres.
Les valeurs peuvent passer du simple au double uniquement en fonction de la rfrence choisie. Dans le cadre des
enqutes de contrle de qualit, on observe une diminution du nombre de trousses calibres par rapport ltalon
Yang.
- Situation future
Nanmoins, une prparation de rfrence devrait tre disponible dans le futur. En effet, une confrence a t
organise linitiative de Stamey (7) en septembre 1994, runissant notamment les diffrents fabricants de
trousses et des experts mdicaux. Un consensus a t tabli sur la composition de ce futur talon qui contiendra
environ 10% de PSA sous forme libre et 90% sous forme lie, ce pourcentage correspondant la proportion
moyenne de forme libre contenue dans les srums prlevs pour dtection prcoce de cancer.
50
III.3. Anticorps
Une seule trousse drive de la technique Yang est de type comptitif et utilise un anticorps polyclonal. Toutes les
autres trousses sont bases sur le principe de l'immunomtrie utilisant un couple d'anticorps : deux monoclonaux
ou un monoclonal plus un polyconal.
Plusieurs tudes (8-9) ont montr que les diffrents anticorps reconnaissaient de faon trs variable les formes
libre et complexe : reconnaissance quimolaire ou reconnaissance prfrentielle de la forme libre par rapport la
forme lie l'ACT.
III.4. Limite de dtection
Les limites de dtection sont de l'ordre de 0,10-0,20 g/l pour les techniques immunomtriques. Certaines trousses
prsentent une limite de dtection plus faible (infrieure 0,10 g/l) et sont qualifies d'ultrasensibles.
III.5. Causes d'erreurs
- Effet crochet
La concentration de PSA peut tre trs leve (suprieur 10 000 g/l), en particulier au cours des cancers de la
prostate avec mtastases. Il est donc ncessaire de connatre la concentration partir de laquelle l'effet crochet peut
apparatre avec la technique utilise.
La prsence d'anticorps htrophiles, en particulier d'anticorps anti-souris (HAMA) peut tre l'origine de rsultats
errons (en gnral surestims) avec les techniques immunomtriques utilisant des anticorps monoclonaux.
Le dosage du PSA se caractrise par une grande variabilit intertechnique que l'on explique principalement par
l'absence actuelle d'talon international et par les diffrences de spcificit des anticorps utiliss. Par ailleurs, les
diffrences de reconnaissances des formes libre et lie peuvent s'expliquer par les diffrences des temps
d'incubation. La cintique de fixation tant plus rapide pour la forme libre que pour la forme lie, la
reconnaissance de la forme libre est d'autant plus importante que l'incubation est courte.
La dispersion des rsultats est illustre notamment par les rsultats obtenus lors de l'enqute du contrle national
de juin 1994. Au cours de cette enqute, deux chantillons ayant une concentration moyenne de 6,7 g/l (MT 18)
et de 47,9 g/l (MT 19) ont t distribus. Les CV tronqus, toutes techniques confondues, sont de 37,6% et de
35,3% pour les srums MT 18 et MT 19 respectivement. La variabilit intertechnique est indique sur la figure 1
o sont reprsentes les moyennes par technique exprimes en pourcentage de la moyenne gnrale. Seules, les
techniques avec un minimum de dix rponses sont indiques.
Cependant, il faut noter que ces diffrences intertechniques peuvent tre majores sur les chantillons de contrle
du fait de la prsence quasi exclusive de PSA sous forme libre dans ces srums.
Sur la figure 2, sont rassembls les CV % tronqus obtenus par technique pour les deux srums. On constate que
85 % des trousses reprsentes pour MT 18 et 78 % pour MT 19 permettent d'obtenir des CV tronqus infrieurs
ou proches de 10%.
51


! V. ETAPE PREANALYTIQUE - CONSERVATION DES ECHANTILLONS

V.1. Prlvement

Sauf indication Particulire, le dosage doit tre ralis sur srum.

Les interfrences ventuelles provoques par une hmolyse, une hyperlipidmie ou une hyperbilirubinmie doivent
tre dtermines avec chaque systme analytique.

Par ailleurs, le prlvement doit tre effectu avant toutes manipulations prostatiques (massage, biopsie,
chographie, etc.) qui sont connues pour augmenter artificiellement la concentration de PSA. Dans le cas contraire,
il est ncessaire d'attendre deux trois semaines (compte-tenu de la demi-vie du PSA qui est de l'ordre de trois
jours) pour une interprtation correcte du rsultat.

Quant l'influence du toucher rectal, elle est controverse et ne semble avoir une influence que sur une prostate
pathologique.

V.2. Conservation des srums

Il est conseill de conserver les chantillons 4C pendant vingt-quatre heures et de les congeler si le dosage est
diffr au-del de cette priode.

Nanmoins, d'aprs Simm (10), les srums peuvent tre conservs quatorze jours 4C, puis congels au-del de
cette priode.

Les cycles de conglation-dconglation doivent tre vits.
Figure 1 : Moyennes des diffrents trousses exprimes en % de la moyenne gnrale.
PSA
PSA
CV Tr %
Figure 1: Moyennes des diffrentes trousses exprimes en % de la moyenne gnrale
52
! VI. INTERPRETATIONS DES RESULTATS
VI.1. Valeurs de rfrence
En raison de l'importance des variations intertechniques, les valeurs de rfrence sont dterminer avec chaque
technique.
Les valeurs couramment admises varient entre 2,0 et 4,0 g/l.
VI.2. Variation physiologiques
- Nycthmre
Le taux srique est stable au cours nycthmre.
- Position du sujet
On note une diminution du PSA aprs vingt-quatre heures d'hospitalisation (de 10 50%), diminution qui pourrait
tre due la position allonge (11).
- Age
Le PSA augmente avec l'ge, en relation avec l'augmentation du volume de la prostate (par exemple, chez les
hommes de 50 ans : valeurs de rfrence infrieures 2,5 g/l et chez les hommes de plus de 70 ans : valeurs de
rfrence infrieures 6,4 g/l). Une interprtation fiable d'un rsultat ncessite de disposer de valeurs de
rfrence pour chaque tranche d'ge.
VI.3. Variations pathologiques
- Hypertrophie bnigne
L'augmentation de PSA est en gnral modre.
- Diagnostic de cancer
L'augmentation est trs variable et les zones de chevauchement avec l'hypertrophie bnigne sont importantes. Le
PSA ne peut donc pas tre le seul test utilis pour le diagnostic de cancer.
Les valeurs observes sont fonction de la technique. Si ont prend un test de type Hybritech, trs peu de cancers ont
une concentration infrieure 10 g/l. Le PSA a donc une valeur prdictive ngative importante (12).
La dtermination du PSA associe avec le toucher rectal permet d'augmenter le nombre de cancers diagnostiqus
un stade prcoce. C'est ainsi que pour un PSA compris entre 4 et 10 g/l, la valeur prdictive positive augmente de
20 40 % si le toucher rectal est suspect. Quant le PSA est suprieur 10 g/l, cette valeur prdictive positive
augmente de 30 80% si le toucher rectal est suspect (13).
Par ailleurs la densit du PSA (PSAD) qui est le rapport de la concentration de PSA sur le volume de la prostate,
est plus leve en cas de cancer qu'en cas d'adnome. Lorsque la valeur du PSA est comprise entre 4 et 10 g/l, la
dtermination du PSAD permet de slectionner les patients devant subir une biopsie pour confirmer le diagnostic
(14-15).
L'augmentation significative de la concentration sur un an (suprieure 100%) doit faire voquer le diagnostic de
cancer et pratiquer une biopsie.
Enfin, des tudes cliniques rcentes semblent montrer que la dtermination du pourcentage de PSA libre amliore
l'efficacit diagnostique par rapport la seule dtermination du PSA total, en particulier pour des concentrations
modrment augmentes. Des trousses de dosage de PSA libre sont en cours de commercialisation.
- Evaluation du stade
Seules les valeurs peu leves ou trs leves permettent d'valuer le stade : cancer localis dans le premier cas ou
cancer dissmin dans le deuxime cas.
- Suivi de traitement
Dans ce cas, les valeurs prdictives ngative et positive sont proches de 100%.
- Aprs prostatectomie radicale, le PSA doit devenir indtectable trois quatre semaines aprs l'opration. Les
trousses de dosage ultrasensibles permettent une dtection plus prcoce des rcidives, de dix douze mois environ
53
(16-17). Nanmoins, ont ne sait pas encore si la mise en route d'un traitement plus prcoce aura un ventuel
retentissement sur la survie du malade.
- En cas d'hormonothrapie (traitement anti-andrognique) ou de radiothrapie, la diminution et le retour la
normale du PSA indiquent une bonne rponse au traitement et constituent un critre pronostique. En effet, en
l'absence de normalisation du PSA, les risques de rechute sont importants.
! VII. LEGISLATION
La lgislation actuelle impose une double dtermination du PSA :
- soit avec reprise du srum prcdent (dure maximale de conservation sous forme congele de deux
mois),
- soit dans deux sries de dosage diffrentes,
- soit dans la mme srie sur deux dilutions diffrentes du mme srum.
! VIII. CONCLUSION
Bien que des tudes rcentes remettent en question la spcificit du PSA pour le tissu prostatique, cet antigne
reste le marquer le plus fiable dans le cadre d'une pathologie prostatique.
En raison de l'importance des variations intertechniques constates actuellement, il est indispensable que le suivi
d'un patient soit effectu avec la mme mthodologie. Par ailleurs, l'interprtation des rsultats doit tre effectue
en fonction des valeurs de rfrence propres chaque trousse et chaque tranche d'ge.
BIBLIOGRAPHIE
1. Yang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM (1979) Purification of a human prostate specific antigen.
Invest. Urol. 17, 159-163

2. Graves HCB (1995) Nonprostatic source of prostate specific antigen : a steroid hornome-dependent
phenomenon ? Clin. Chem. 41,7-9

3. Oesterling JE (1991) Prostate specific antigen : a critical assessment of the most useful tumor marker for
adenocarcinoma of the prostate. J. Urol. 145, 907-923

4. Partin AW, Carter HB, Chan DW, Epstein JI, Oesterling JE, Rock RC, Weber JB, Walsh PC (1990) Prostate
specific antigen in the staging of localized prostate cancer : influence of tumor differentiation, tumor volume
and benign hyperplasia. J. Urol. 143, 747-752

5. Lilja H, Christensson A, Dahlen U, Matikainen MT, Pettersson K, Lovgrent T (1191) Prostate-Specific
Antigen in serum occurs predominantly in complex with 1 antichimotrypsin. Clin. Chem. 37, 1618-1625
6. Stenmann UH, Leinonen J, Afthan H, Rannikko S, Tunkanen K, Alfthan O (1991) A complex between
Prostate-Specific Antigen and ! 1 -antichymotrypsin is the major form of Prostate-Specific Antigen in serum
of patients with prostatic cancer : assay of the complex improves clinical sensitivity for cancer. Cancer Res,
51, 222-226

7. Stamey TA (1995) Second Stanford conference on international standardization of prostate-specific antigen
immunoassays ; september 1 and 2, 1994. Urology, 45, 173-184
54

8. Zhou AM, Tewari PC, Bluestein BI, Caldwel GW, Larsen FL (1993) Multiple forms of prostate specific
antigen in serum : differences in immunorecognition by monoclonal and polyclonal assays. Clin. Chem.
39/12, 2483-2491

9. Tillye CR, Konings M, Gobin PT, Iqbal J (1994) Disagreement between the Roche Cobas Core, and
Hybritech Tandem E PSA assays when measuring free, complexed and total serum prostate specific
antigen. Ann. Clin. Biochem. 31, 501-505

10. Simm B, Gleeson M (1991) Storage conditions to serum for estimating prostate-specific antigen. Clin. Chem.
37, 113-114

11. Stamey TA, Yang N, Hay AR, McNeal JE, Freiha FS, Redwine E (1987) Prostate-specific antigen as a serum
marker for adenocarcinoma of the prostate. New Engl. J. Med. 317, 909-916

12. Toubert ME, Schlageter, MH, Bron J, Treillac P, Le Duc A, Najean Y (1990) Dpistage du cancer de la
prostate par l'antigne spcifique de prostate. Presse Md. 19, 1139-1142

13. Cooner WH, Mosley BR, Rutherford CL, Beard JH, Pont HS, Terry WJ, Igel TC, Kidd DD (1990) Prostate
cancer detection in a clinical urological practice by ultrasonography, digital rectal examination and prostate
specific antigen. J. Urol. 143, 1146-1154

14. Benson MC, Whang IS, Pantuck A, Ring K, Kaplan SA, Olsson CA, Cooner WH (1992) Prostate Specific
Antigen Density : a means of distinguishing benign prostatic hypertrophy and prostate cancer. J. Urol. 147,
815-816

15. Benson MC, Whang IS, Olsson CA, McMahon DJ, Cooner WH (1992) The use of Prostate Specific Antigen
density to enhance the predictive value of intermediate levels of serum Prostate Specific Antigen. J. Urol.
147, 817-821

16. Stamey TA, Graves HCB, Wehner N, Ferrari M, Freiha FS (1993) Early detection of residual prostate cancer
after radical prostatectomy by an ultrasensitive assay for prostate specific antigen. J. Urol. 149, 787-752

17. Vessela RL, Notebbom J, Lange PH, (1992) Evaluation of the Abbott automated immunoassay of Prostate-
Specific-Antigen. Clin. Chem. 38, 2044-2054
55
HORMONE CHORIONIQUE GONADOTROPE (hCG)
SOUS-UNITE (hCG)
A. BEAUDONNET, M.C. PATRICOT
! I. INTERET PHYSIOPATHOLOGIQUE
L'hCG (hormone chorionique gonadotrope) est une hormone synthtise par les cellules trophoblastiques du
placenta ds le 6
me
jour de la fcondation (1).
Le rle physiologique essentiel de l'hCG est de stimuler le corps jaune permettant ainsi la synthse de la
progestrone et des strognes en dbut de grossesse. L'hCG aurait galement d'autres rles permettant d'expliquer
la faible quantit d'hCG d'origine hypophysaire trouve chez des individus normaux (2)
I.1. hCG et grossesse
*Diagnostic de grossesse
L'hCG srique permet un diagnostic prcoce de grossesse ds la premire semaine suivant la fcondation. La
concentration double en 36-48 heures en dbut de grossesse, est maximale entre la 8
me
et la 10
me
semaine, puis
diminue au 2
me
et 3
me
trimestre de grossesse jusqu' environ 10% de la valeur maximale.
*Grossesses pathologiques
En cas de grossesse extra-utrine (GEU), les valeurs sont beaucoup plus basses et voluent vers une stabilisation
ou une rgression. De mme des valeurs basses d'hCG se rencontrent lors des grossesses arrtes.
En cas de grossesse molaire, les concentrations d'hCG sont trs leves. La courbe de diminution de l'hCG
permettra ensuite la surveillance post-molaire (l'hCG devant se ngativer dans les six semaines suivant l'vacuation
de la mle).
I.2 hCG et trisomie 21 (Syndrome de Down)
Chez la femme enceinte, l'augmentation de l'hCG srique (couple l'ge maternel et l'ge gestationnel) est un
signe d'appel biologique permettant de dfinir une population risque de trisomie ftale (3). Une amniocentse
sera alors ralise pour dterminer le caryotype ftal.
La dtermination spcifique des sous-units libres semblerait plus discriminante que celle de l'hCG (4).
I.3. hCG et tumeurs
L'hCG est scrte par une grande varit de tumeurs : tumeurs trophoblastiques placentaires, tumeurs germinales
de l'ovaire et du testicule, tumeurs non trophoblastiques (ovaire - pancras - clon - poumons - vessie). Les dosages
de l'hCG et sous-units libres sont utiles au diagnostic diffrentiel entre grossesse normale, mle et tumeur
trophoblastique et au suivi des tumeurs trophoblastiques. Ces dosages permettent galement le diagnostic et le
suivi des tumeurs germinales du testicule, Rcemment, l'intrt du dosage des sous-units libres dans le
diagnostic et suivi des tumeurs de la vessie a t montr (5).
56
! II. STRUCTURE - HETEROGENEITE MOLECULAIRE
II.1. Structure
La structure et les diffrentes formes molculaires de l'hCG sont bien connues (6-7).
L'hCG (holo hCG ou hCG dimre) est une molcule glycoprotique de masse molaire d'environ 40 000 g.mol
-1
.
Elle est constitue de deux units polypeptidiques lies de faon non covalente :
* une sous-unit de 92 acides anims commune aux sous-units de FSH-LH et TSH,
* une sous-unit de 145 acides anims qui possde une squence de 24 rsidus Carboxyl-terminaux (CTP
ou Carboxyl Terminal Portion) spcifique de la molcule. En position 44-45 et 47-48, il peut manquer des liaisons
peptidiques et on parle d'hCG clive.
Enfin, en diffrentes positions des chanes et se greffent des oligosaccharides sulfats et sialyls. Le degr
variable de glycosylation va entraner l'apparition de diffrentes isoformes molculaires.
Seule l'hCG dimre possde une activit biologique.
II.2. Molcules d'hCG immunoractives dans le srum et l'urine
Dans le srum peuvent coexister diffrentes formes d'hCG immunoractives : hCG, sous-units libres, sous-
units libres, hCG clive, hCG sans fragment -C terminal, variants glycosyls.
Les proportions de ces diffrentes formes varient selon les situations physiopathologiques et galement selon les
conditions de conservation des chantillons.
Les formes clives constituer les premires tapes dans le processus de dgradation de l'hCG, le processus ultime
tant le fragment -core qui est constitu des peptides 6-40 et 55-92 relis par des ponts di-sulfures. Ce fragment
est retrouv essentiellement dans les urines de femmes enceintes. Dans les urines de femmes mnopauses, la
prsence de fragment -core "like" a t galement mise en vidence (8).
! III. TECHNIQUES DE DOSAGE
III.1. Principe
Le dosage de l'hCG srique et des sous-units libres, est ralise actuellement par des mthodes immunologiques
avec marqueur. Les techniques de dosage sont trs nombreuses et la trs grande majorit d'entre elles est base sur
le principe de l'immunomtrie. Dans le cas de dosage spcifique des sous-units libres, seules les techniques
avec marqueur isotopique sont disponibles actuellement.
Lors de l'enqute du contrle national de qualit (juin 1994), dix-neuf trousses taient reprsentes. Deux mille
sept cents laboratoires ont rendu un rsultant d'hCG.
Parmi les techniques utilises, 79% sont bases sur la dtection d'un signal fluorescent, les autres se rpartissant
entre dtection d'un signal photomtrique, luminescent ou radioactif.
III.2. Anticorps
Le dveloppement des anticorps monoclonaux et des techniques immunomtriques a permis d'amliorer la
sensibilit et la spcificit des dosages (absence de ractions croises avec les hormones hypophysaires et les sous-
units libres).
57
Cependant, des discordances plus ou moins importantes sont observes entre les rsultats obtenus avec les
diffrentes trousses de dosage. Ces discordances sont dues en grande partie la spcificit des anticorps utiliss et
la combinaison de ces anticorps.
En effet, d'aprs la carte pitopique dcrite par SCHWARZ et al. (9), il existe neuf sites antigniques sur la
molcule d'hCG dont trois sont situs sur la sous-unit , quatre sur la sous-unit et deux sur l'hCG dimre.
Du choix et de la combinaison des anticorps dpendront la reconnaissance des diffrentes formes molculaires :
hCG clive + hCG non clive, hCG non clive uniquement, hCG + sous-units libres, sous-units libres
uniquement, hCG sans fragment -C terminal (10).
Les mthodes avec anticorps reconnaissant l'hCG + les sous-units libres reconnaissent de faon trs variable les
sous-units libres et les discordances intertechniques peuvent tre trs importantes dans ce cas (11-12).
III.3. Etalons
Il existe plusieurs prparations internationales de rfrence :
* 2
me
IS (61/6), prparation impure d'hCG contenant aussi des sous-units et libres et de la LH ; cette
prparation tait destine au dosage biologique de l'hCG et n'est plus disponible depuis 1987.
* 1
er
IRP et 3
me
IS (75/537), prparations purifies contenant essentiellement de l'hCG ; ces prparations
sont destines au dosage immunologique de l'hCG.
Ces deux talons sont titrs par des mthodes biologiques et les titres sont exprims en UI/l.
La trs grande majorit des trousses est talonne actuellement par rapport au 1
er
IRP/3
me
IS.
* 1
er
IRP (75/551) contenant des sous-units libres pour dosage spcifique des sous-units libres ; dans
ce cas, l'unit qui correspond une masse donne de l'talon est dfinie arbitrairement, cas les sous-units sont
dpourvues d'activit biologique.
III.4. Causes d'erreurs
- Effet crochet
Lorsque la concentration en antigne est trs leve et trs suprieure celle du dernier point de la gamme
d'talonnage, ont peut observer une diminution de la valeur du signal et par consquent un rsultat faussement
abaiss. Les concentrations d'hCG peuvent tre trs leves, en particulier en cas de mle hydratiforme
(suprieures 10
6
UI/l). Il est donc important de connatre la concentration partir de laquelle l'effet crochet peut
apparatre avec la technique utilise, cette concentration devant tre dtermine pour chaque technique.
La prsence d'anticorps anti-souris (HAMA) peut tre l'origine de rsultats errons (en gnral surestims) avec
les techniques immunomtriques utilisant des anticorps monoclonaux.
58
Lors de l'enqute du contrle national de qualit de Juin 1994, deux chantillons de contrle ont t distribus dont
les concentrations moyennes taient de 7,0 UI/l (TP18) et de 81,3 UI/l (TP19). Plus de 85 % des participants
utilisaient une mthodologie entirement automatise.
La variabilit totale est plus importante pour l'chantillon TP18 (de faible concentration) que pour l'chantillon
TP19 : CV tronqus de 30,6 et 18,5% respectivement. Compte-tenu des diffrences de spcificit des anticorps
utiliss, les diffrences inter techniques peuvent tre importantes. Ces diffrences sont illustres sur la figure 1 o
sont rassembles les moyennes obtenues par technique exprimes en pourcentage de la moyenne gnrale (seules
les mthodes avec un minimum de dix rponses sont reprsentes).
Par ailleurs, comme ont peut le voir sur la figure 2 qui indique la reproductibilit par technique, la moiti des
ractifs permet d'obtenir un CV tronqu infrieur ou gal 19% pour le srum TP18 et 12% pour le srum TP19.
Pour l'chantillon TP 18, la dispersion des rsultats est trs importante avec la plupart des mthodes prsentant un
faible degr d'automatisation.
Figure 1 : Moyennes des diffrentes trousses exprimes en % de la moyenne gnrale.
59
! V. ETAPE PREANALYTIQUE - CONSERVATION DES ECHANTILLONS
V.1. Prlvement
Sauf indications particulires, le dosage doit tre ralis sur srum.
Les interfrences ventuelles dues l'hmolyse, l'hyperlipidmie, l'hyperbilirubinmie doivent tre analyses
avec chaque systme analytique. Dans le cas particulier d'un dosage d'hCG pour dpistage de trisomie 21, plusieurs
facteurs sont susceptibles d'augmenter artificiellement la valeur d'hCG parmi lesquels : voyage rcent, chographie
ralise moins d'une semaine avant la prise de sang (13).
V.2. Conservation des chantillons
La proportion d'hCG clive (forme non reconnue par tous les immunodosages) et des sous-units libres
augmente dans les chantillons non centrifugs et conservs temprature ambiante (11-14). La proportion d'hCG
clive augmente aussi dans les srums conservs + 4C plus d'une semaine. Il est donc important de centrifuger
les chantillons le plus rapidement possible et de congeler le srum si le dosage doit tre diffr. Les cycles de
conglation-dconglation doivent tre vits.
! VI. INTERPRETATION DES RESULTATS
La limite de dtection de la majorit des trousses est de l'ordre de 2 UI/l.
Cette limite de dtection est infrieure 0,10 g/l avec les techniques immunoradiomtriques spcifiques des sous-
units libres.
Les valeurs trouves au cours des grossesses normales et pathologiques, ainsi qu'au cours des processus tumoraux
varient selon les ractifs utiliss. Les chiffres ci-dessous ne sont donns qu' titre indicatif.
VI.1. Variations physiologiques
Des concentrations faibles d'hCG (infrieures 10 UI/l) peuvent tre rencontres chez les sujets de plus de 45 ans
et en particulier chez les femmes mnopauses.
VI.2. Diagnostic prcoce de grossesse
Une valeur infrieure 5 UI/l permet en gnral d'exclure une grossesse. Pour les valeurs faibles comprises entre 5
et 25 UI/l, un dosage effectu 48 heures plus tard et montrant un doublement de la concentration d'hCG permet de
confirmer la grossesse.
VI.3. Variation au cours d'une grossesse normale
Dans ce cas, seul le dosage de l'hCG dimre (seule forme active biologiquement) est intressant. Les trousses de
dosage spcifique de l'hCG seront donc utilises de prfrence. Pendant la grossesse normale, les taux de sous-
units et libres sont peu importants (15). Le pourcentage de hCG libre/hCG n'excde pas 1% au cours d'une
grossesse normale.
60
Les concentrations attendues en fonction de l'ge gestationnel sont indiques dans le tableau ci-dessus. Des
variations individuelles importantes sont observes.
AGE DE LA GROSSESSE ZONE DES CONCENTRATIONS
En UI/I
10
me
jour 10
1.5 2 semaines 40 200
2 3 semaines 100 1 000
3 4 semaines 500 10 000
4 6 semaines 60 000 200 000
6 9 semaines 100 000 300 000
2
me
trimestre 3 000 50 000
3
me
trimestre 1 000 50 000
En cas de grossesse multiple, les concentrations d'hCG sont plus leves.
VI.4. Variations au cours des grossesses pathologiques
* Grossesse extra-utrine
Le dosage de l'hCG (associ l'chographie et l'observation clinique) est un lment capital du diagnostic. Les
concentrations sont beaucoup plus basses qu'au cours d'une grossesse normale et le temps de doublement est
anormal. Aprs chirurgie, les dlais de ngativation de l'hCG dpendent du taux de dpart (entre 4 15 jours).
* Grossesse arrte
L'association de mtrorragies et d'une faible concentration d'hCG doit faire voquer le diagnostic de grossesse
arrte qui sera confirm par l'chographie.
VI.5. Tumeurs bnignes et malignes
* Grossesse molaire et maladie trophoblastique
Une concentration trs leve d'hCG doit faire voquer une grossesse molaire qui sera confirme par l'chographie.
Des concentrations suprieures 10
6
UI/l se rencontrent au cours de cette pathologie.
L'hCG est un paramtre capital dans la surveillance post-molaire. Une mle bnigne s'accompagne d'une
diminution et d'une ngativation de l'hCG en six semaines. La persistance d'un taux positif doit imposer un bilan
pour localisation du tissu trophoblastique et la mise en route d'une chimiothrapie. Dans les maladies
trophoblastiques gravidiques, les concentrations d'hCG et de sous-units sont augmentes. Le rapport
hCG/hCG augmente proportionnellement au caractre envahissant de la tumeur trophoblastiques. Le pourcentage
du hCG libre qui est compris entre 0,05 et 1% dans les grossesses normales, se situe entre 1 et 5% en cas de mle
et dpasse 5% en cas de choriocarcinome (16).
Les dosages spcifiques coupls d'hCG et de sous-units libres permettent d'amliorer le diagnostic diffrentiel
entre grossesse normale, mle et choriocarcinome.
* Tumeurs testiculaires (non-sminomateuses et sminomes)
Le dosage d'hCG et celui des sous-units libres prsentent un intrt surtout dans les tumeurs testiculaires non-
seminomateuses (choriocarcinomes) puisque environ 60% de ces tumeurs scrtent de l'hCG et 41 70% scrtent
des sous-units libres (17-18).
Dans environ 30% des sminomes scrtant, seules les sous-units hCG libres sont retrouves (17-18).
Les dosages d'hCG et des sous-units libres (associs celui de l'alpha-ftoprotine) doivent tre effectus
devant toute suspicion de cancer testiculaire (l'augmentation de l'un de ces trois marques tant observe dans 90%
des cas). Les taux initiaux sont corrls la masse tumorale et sont donc un facteur de pronostic. La diminution de
ces marques est un reflet de l'efficacit thrapeutique.
61
* Tumeurs non trophoblastiques
Dans 10 50% des tumeurs non trophoblastiques (ovaires-pancras-poumons-clon-vessie), ont observe une
scrtion de sous-units libres essentiellement (18).
Le dosage srique spcifique des sous-units libres est trs utile pour la dtection et la surveillance des tumeurs
vsicales, tumeurs pour lesquelles il n'existe pas de marqueur fiable (5).
VI.6. Dpistage de la trisomie 21 (femmes de moins de 38 ans)
Le dosage d'hCG sera ralis sur un srum entre la 15
me
et la 18
me
semaine d'amnorrhe.
Certaines trousses de dosage de l'hCG adaptes la dtermination des faibles concentrations pour diagnostic
prcoce de grossesse peuvent prsenter une dispersion importante dans les valeurs hautes. Dans le cadre d'un
dpistage de trisomie 21, la technique choisie doit prsenter une bonne reproductibilit pour les valeurs leves,
situes dans la zone de 30 000 60 000 UI/l (19).
Une tude multicentrique ralise dans quinze laboratoires en 1991 (tude coordonne par l'Association Franaise
pour le Dpistage et la Prvention des Handicaps de l'Enfant) a permis de dfinir des valeurs seuils (20). Ces
valeurs seuils, exprimes en percentiles, sont dtermines en tenant compte de l'ge gestationnel et de l'ge
maternel. Ces valeurs sont donnes pour une technique dtermine et ne peuvent pas tre extrapoles une autre
technique.
Lorsque l'hCG est suprieure cette valeur seuil, la patiente fait partie d'un groupe risque et une amniocentse
avec dtermination du caryotype ftal est alors indique.
L'amniocentse est conseille si la Concentration d'hCG est :
- suprieure ou gale au 95
e
percentile pour les femmes de 30 34 ans,
e
percentile pour les femmes de 35-36 ans,
e
percentile pour les femmes de 37 ans.
A l'heure actuelle, un groupe supplmentaire a t dfini et l'amniocentse est conseille en cas d'hCG suprieure
ou gale au 90
e
percentile pour les femmes de 32 34 ans
Il faut noter qu'il s'agit d'un test de dpistage statistique et qu'en dessous des valeurs seuils, on ne peut pas avoir la
certitude que le ftus ne sera pas atteint de trisomie 21.
Ces valeurs seuils ne sont pas utilisables en cas de grossesse gmellaire. Par ailleurs, l'origine ethnique est
importante connatre, car il semble que les valeurs d'hCG soient plus leves chez les femmes noires et antillaises
(3-20).
! VII. CONCLUSION
La prsente d'hCG en dehors de la grossesse est toujours anormale ( l'exception des faibles concentrations
rencontres chez les sujets de plus de 45 ans).
La diversit des formes molculaires d'hCG immunoractives et leur variation en fonction des situations
physiopathologiques impose la connaissance prcise de la spcificit des anticorps utiliss et du contexte clinique.
Lorsque le dosage est demand dans le cadre d'un diagnostic ou d'un suivi de tumeurs, il est indispensable d'utiliser
des techniques permettant la reconnaissance de l'hCG et des sous-units libres qui peuvent tre scrtes
simultanment ou isolment. L'utilisation de techniques spcifiques des sous-units libres plus sensibles peut
tre utile dans certains cas. Enfin, il est indispensable d'utiliser toujours la mme technique pour le suivi d'un
mme malade, compte-tenu des diffrences intertechniques existantes.
62
BIBLIOGRAPHIE
1. Hussa RO (1980) Biosynthesis of human chorionic gonadotropin. Endocrine Rev. 1, 268-294

2. Hoermann R, Spoett1 G, Moncayo R, Mann K (1990) Evidence for the presence of human chorionic gonadotropin (hCG)
and free beta-subunit of hCG in the human pituitary. J. Clin. Metab. Endocrinol. 71,179-186

3. Muller F, Bou A (1990) A single chorionic gonadotropin assay for maternal serum screening for Down's syndrome.
Prenatal Diagn. 10, 389-398

4. Knight GJ, Cole LA (1991) Measurement of choriogonadotropin free -subunit : an alternative to choriogonadotropin in
screening for fetal Down's syndrome. Clin. Chem. 37,779-782
5. Marcillac I, Cottu P, Theodore C, Terrier-Lacombe MJ, Bellet D, Droz JP (1993) Free hCG-subunit as tumor marker in
urothelial cancer. The Lancet 341, 1354-1355

6. Bidard JM, Troalen F, Bellet D (1993) L'hormone chorionique gonadotrope et ses formes molculaires. Spectra Biologie
93/6, 33-39

7. Norman RJ, Buck RH, De Medeiros SF (1990) Measurement of human chorionic gonadotrophin (hCG) : indications and
techniques for the clinical laboratory. Ann. Clin. Biochem. 27, 183-194

8. Akar, AH, Gervasi G, Blacker C, Wehmann RE, Blithe DL, Nisula BC (1990) Human chorionic gonadotrophin-like and
-core-like materials in postmenopausal urine. Journal of Endocrinology, 125, 477-484

9. Schwarz S, Berger P, Wick G (1986) The antigenic surface of human chorionic gonadotropin as mapped by murine
monoclonal antibodies. Endocrinology 118, 189-197

10. Cole L. Seifer D, Kardana A, Braunstein G (1993) Selecting human chorionic gonadotropin immunoassays : consideration
of cross-reacting molecules in first-trimester pregnancy serum and urine. Am. J. Obstet. Gynecol. 168, 1580-1586

11. Cole A, Kardana A (1992) Discordant results in human chorionic gonadotropin assays. Clin. Chem. 38/2, 263-270

12. Thomas CMG, Segers MFG (1989) Quantification of choriogonadotropin : differential cross-reactivities of the free hCG
-subunit with eight different monoclonal antibody based hCG and (hCG + ) "sandwich" - type assays. Clin. Chem.
35/8, 1791-1792

13. Connois T, Gautier E (1991) Etude de l'hCG comme marqueur de la trisomie 21. Feuillets de Biologie 180, 59-64

14. Stevenson HP, Leslie H, Sheridan B (1993) Serum -human chorionic gonadotrophin concentrations increase in
unseparated blood specimens. Ann. Clin. Biochem. 30, 99-100

15. Ozturk M, Bellet D, Manil L et al (1987) Physiological studies of human chorionic gonadotropin (hCG), hCG and hCG
as measured by specific monoclonal immunoradiometric assays. Endocrinology 120, 549-558

16. Ozturk M, Berkowitz R, Codstein D et al (1988) differential production of human chorionic gonadotropin and free
subunits in gestational trophoblastic disease. Am. J. Obstet. Gynecol. 158, 193-198

17. Pabot du Chatelard P, Daver A (1993) Intrt clinique de l'AFP et de la hCG dans les tumeurs germinales testiculaires.
Immunoanal. Biol. Spc. 8, 228-233

18. Marcillac J. Troalen F, Bidart JM et al (1992) Free human chorionic gonadotropin subunit in gonadal and non gonadal
neoplasms. Cancer Res. 52, 3901-3907

19. Muller F, Coumaros G, Colombier M, Cassuto G, Dubin MF, Roux F, Ruffie A, Boue A (1992) Spcifications du ractif
hCG pour le dpistage antnatal de la trisomie 21. Immunoanal. Biol. Spc. 33,39-48

20. Poloce F, Pichot J, Malliavin A (1991) L'lvation de l'hCG est-elle un bon marqueur du risque de trisomie 21? Rev. Fr.
Gyncol. Obstt. 86, 691-694
63
HORMONE THYREOSTIMULANTE
(TSH)
R. COHEN, A. BEAUDONNET, A.C. RENARD
! I. RAPPELS PHYSIOLOGIQUES
L'hormone thyrostimulante (TSH) ou thyrotrophine fait partie d'une famille de glycoprotines, comprenant en
outre les gonadotrophines hypophysaires (FSH et LH) et la gonadotrophine chorionique (hCG). Elles drivent
vraisemblablement d'un mme gne ancestral et sont constitues de deux chanes polypeptidiques, dnommes
sous-units alpha et bta, et de glucides reprsentant 15 30% de la masse molaire totale. La sous-unit alpha est
identique pour ces quatre hormones, alors que les sous-units bta diffrent et sont spcifiques de chaque hormone,
laquelle elles confrent l'activit biologique et immunologique (1).
La masse molaire de la TSH est d'environ 28 000 g.mol
-1
. La chane , comprenant 112 acides amins, est runie
la chane par des liaisons non covalentes. La combinaison de deux sous-units est indispensable l'action
hormonale ; in vivo, au pH physiologique, il n'y a pas de dissociation. La TSH comprend trois units
oligosaccharidiques branches sur les deux chanes (2), dont la prsente augmente la solubilit de l'hormone ; elles
n'interviennent pas dans l'interaction avec le rcepteur mais sont essentielles pour stimuler la production d'AMP
cyclique.
Grce l'outil que constituent les anticorps monoclonaux, une carte pitopique de la molcule a pu tre tablie :
deux pitopes sont situs sur la chane , six sur la chane et quatre autres n'apparaissent qu'en prsence des deux
sous-units lies (3). C'est en slectionnant les anticorps les mieux adapts que les immunodosages trs spcifiques
que l'on connat actuellement ont pu tre mis au point.
La TSH produite par l'hypophyse circule sous forme libre dans le plasma. Chez l'homme, la demi-vie de la TSH est
d'environ 60 minutes. Les principaux sites d'inactivation de l'hormone sont le foie et le rein.
La TSH est le principal facteur contrlant la synthse des hormones thyrodiennes. L'administration de TSH
conduit une augmentation de taille et de vascularisation de la glande, de synthse et de scrtion des hormones.
La TSH circulante se lie des rcepteurs spcifiques membranaires de nature glycoprotique. La fixation de la
TSH son rcepteur dclenche l'activation de l'adnylcyclase et la production d'AMP cyclique qui constitue le
mdiateur intracellulaire de la plupart des effets de la TSH.
La scrtion de la TSH est soumise l'effet inhibiteur des hormones thyrodiennes. Le rtrocontrle hypophysaire
de la scrtion de TSH par les hormones thyrodiennes constitue le principal facteur de rgulation. De faibles
variations des concentrations de T
4
et/ou de T
3
provoquent une adaptation immdiate de l'excrtion de TSH et
plus long terme de sa synthse. Ce sont surtout les formes libres de T
4
et de T
3
circulantes qui interviennent dans le
rtrocontrle.
La scrtion de TSH est soumise l'effet stimulant de la TRH (Thyrotropin Releasing Hormone). Premier peptide
hypothalamique de stimulation hypophysaire isol et caractris, TRH est un tripeptide, largement produit dans le
systme nerveux central mais aussi le pancras, le tractus digestif. TRH se lie rcepteurs membranaires prsents
sur les cellules thyrotropes et aussi sur les cellules prolactiniques et les cellules somatotropes des tumeurs
productrices d'hormone de croissance. L'administration de TRH entrane une rponse scrtoire de TSH qui
apparat ds la cinquime minute et qui est maximum entre la quinzime et la trentime minute.
64
D'autres facteurs interviennent dans la rgulation de la scrtion de TSH. Les dopaminergiques ont un effet
inhibiteur tonique qui s'exerce au niveau hypophysaire. Le contrle noradrnergique de la TSH s'exerce par
l'intermdiaire de l'hypothalamus et la production de TRH. Il intervient particulirement lors de l'exposition au
froid qui augmente la TSH et les hormones thyrodienne. La somatostatine (SRIH), en administration aigu,
diminue la TSH. Les strodes sexuels influencent surtout les rponses de TSH TRH qui sont plus importantes
chez la femme que chez l'homme. L'effet inhibiteur des glucocorticodes s'exprime la fois aux niveaux
hypophysaire et hypothalamique. Ils induisent une rduction de la TSH basale, des pics nocturnes de TSH et de
rponse de TSH TRH.
! II. INTERET PHYSIOPATHOLOGIQUE
La mesure de la TSH constitue, l'heure actuelle, le meilleur indicateur de la fonction thyrodienne (4).
L'hypophyse thyrotrope est extrmement sensible au rtrocontrle des hormones thyrodiennes, au point que les
concentrations de T
4
circulante sont inversement corrles au logarithme de la TSH (une rduction de moiti de la
T
4
circulante multiplie par 100 la concentration de TSH). Ainsi de petites modifications de l'imprgnation
hormonale sont susceptibles d'tre dmasques par une augmentation ou une diminution isole de la TSH, alors
mme que les concentrations de T
4
et T
3
restent dans les limites des valeurs de rfrence d'une population tmoin.
De plus, chaque individu possde sa propre corrlation T
4
-TSH, et un moment donn un point d'quilibre qui lui
est spcifique.
Prcocement l'hyperthyrodie abolit la rythmicit nycthmrale de la TSH et diminue l'amplitude des rponses de
TSH TRH. Cependant ces signes ne sont pas spcifiques (tableau I) et leur intrt pratique dans l'exploration des
dysfonctions primitivement thyrodiennes est mis en doute depuis que l'on dispose des dosages de TSH de
troisime gnration.
La production de TSH dpend naturellement de la qualit des fonctions hypothalamiques et hypophysaires. En
revanche, le dosage de TSH connat moins dartefacts mthodologiques (autoanticorps circulants) et de facteurs
d'influence que ceux de T
4
et de T
3
(tableau I). Enfin, l'adaptation de la fonction thyrotrope est lente et la
normalisation de la TSH n'est obtenue que plusieurs semaines aprs la correction d'un tat thyrotoxique. Pour la
mme raison, on ne peut valablement juger du niveau de la TSH que six huit semaines aprs l'adaptation d'une
posologie substitutive par les hormones thyrodiennes.
! III. TECHNIQUES DE DOSAGE
Amliorations du dosage de TSH depuis 25 ans
Historiquement, on a assist une amlioration considrable de la limite de dtection du dosage de TSH (5). Celle-
ci est passe d'une valeur de 1 mUI/L, typique des dosages radioimmunologiques par comptition, utiliss vers la
fin des annes soixante jusqu'au milieu des annes quatre-vingts, un niveau compris entre 0,1 et 0,01 mUI/L,
caractristique des dosages immunomtriques actuels (6).
Les dosages de premire gnration avec une limite de dtection de l'ordre de 1 2 mUI/L, taient incapables de
discriminer les sujets euthyrodiens de ceux atteints de maladie de Basedow.
65
Causes d'abolition des pics nocturnes de TSH (et rduction des rponses de TSH TRH)
hyperthyrodies frustes
hypothyrodies centrales
tats dpressifs
insuffisance rnale
corticothrapie
maladies gnrales non thyrodiennes

Causes d'lvation de la TSH

hypothyrodies protothyrodiennes
adnome thyrotrope
syndrome de rsistance aux hormones thyrodiennes
pic scrtoire de la priode nonatale
certaines hypothyrodies d'origine hypothalamo-hypophysaire
insuffisance surrnale
prise d'amiodarone
anticorps htrophiles

Causes d'abaissement de la TSH

hyperthyrodies protothyrodiennes actuelles et rcentes
grossesse
certaines hypothyrodies d'origine hypothalamo-hypophysaire
imprgnation rcente et massive par la dopamine ou les glucocorticodes
Tableau I : variations physiopathologiques de la TSH (d'aprs (4))
L'avnement de la technologie des anticorps monoclonaux et son application aux immunodosages par excs
d'anticorps vers 1985, a conduit au dveloppement d'une deuxime gnration de dosages de TSH possdant une
dtectabilit meilleur d'un ordre de grandeur (c'est--dire d'un facteur 10) que les dosages radioimmunologiques.
Grce eux, il tait possible pour la premire fois de discriminer les sujets euthyrodiens de ceux atteints d'une
hyperthyrodie franche (7). En 1990, est apparue une troisime gnration de dosages dont la limite de dtection
tait plus basse de deux ordres de grandeur (100 fois) que les dosages par comptition initiaux. Ceux-ci ont permis
de confirmer que la scrtion de TSH dans l'hyperthyrodie franche est compltement abolie ou, tout le moins,
que les niveaux de TSH sriques sont indtectables (infrieurs 0,01 mUI/L) mme avec les techniques de
troisime gnration.
Les progrs technologiques prcdents ont modifi la place du dosage de TSH dans l'exploration thyrodienne. Le
niveau de TSH srique est actuellement considr comme le marqueur de l'action biologique des hormones
thyrodiennes sur les tissus (en l'occurrence l'hypophyse) le plus sensible et le plus facilement accessible. Ces
progrs ont galement permis la description de diffrents degrs de dysfonctions thyrodiennes. Enfin, avec
remplacement des dosages de premire gnration par ceux de deuxime et troisime gnrations, le statut du
dosage de TSH est pass d'un test de confirmation de l'hypothyrodie primaire un test de premire intention dans
un grand nombre de situations.
Principe et classification des dosages immunomtriques de TSH
Les dosages immunomtriques et notamment leur variante "sandwich" ont complment vinc les immunodosages
par comptition en raison de leur meilleure sensibilit potentielle. Un anticorps monoclonal antiTSH, fix sur une
phase solide, est utilis pour extraire la TSH d'un spcimen en prsente d'anticorps mono- ou polyclonaux
marqus. Aprs incubation et sparation des formes libre et lie, la phase solide fournit un signal radioactif,
enzymatique, fluorescent ou chimiluminescent, directement proportionnel la concentration de TSH prsente dans
66
le spcimen. Les immunodosages de TSH sont habituellement calibrs par rapport la seconde prparation
internationale de rfrence (2nd IRP MRC 80/558).
La classification des dosages de TSH est fonde sur leur limite de dtection fonctionnelle. Elle est reconnue par
l'"American Thyroid Association" qui prconise de ne plus utiliser la limite de dtection analytique (8). Cette
dernire prsente, en effet, l'inconvnient majeur de ne pas correspondre la ralit clinique car son estimation
prend en compte uniquement la variabilit intrasrie et nglige les facteurs de fluctuation d'une srie l'autre que
sont, par exemple, le vieillissement des ractifs, le changement de lots ou de manipulateur, les facteurs lis
l'instrumentation ou son environnement. La limite de dtection fonctionnelle doit tre dtermine partir d'un
profil de prcision tabli grce des mesures spcimens, rptes dans diffrentes sries. Celles-ci doivent tre
ralises par des techniciens diffrents, des jours diffrents et l'aide de lots de ractifs diffrents afin de se
placer dans les conditions les plus proches de celles qui correspondent aux soins des patients.
La limite de dtection fonctionnelle est dfinie comme la concentration (la plus basse) mesure avec un CV inter-
sries de 20%. Celui-ci est dtermin l'aide du profil de prcision tabli selon les indications prcdentes. En
pratique, la limite de dtection fonctionnelle est cinq dix fois suprieure la limite de dtection analytique (9).
A partir de ce critre objectif, il est possible de classer les dosages de TSH en plusieurs "gnrations", le passage
d'une "gnration" la suivante correspondant au gain d'un ordre de grandeur en limite de dtection
fonctionnelle (6):
Gnration du dosage de TSH Limite de dtection fonctionnelle (mUI/L)
Premire
Deuxime
Troisime
Quatrime
1-2
0,1-0,2
0,01-0,02
0,001-0,002
Principaux facteurs dterminant la limite de dtection fonctionnelle
Plusieurs paramtres influencent la limite de dtection fonctionnelle d'un immunodosage :
la marque ; ce sont les dosages immunochimiluminomtriques qui permettent, potentiellement,
d'atteindre les limites de dtection les plus basses ; on trouve dans cette catgorie principalement les
dosages rputs de troisime gnration ; cependant, tous les dosages ne sont pas de qualit quivalente
en relation avec la molcule chimiluminescente choisie ou avec d'autres facteurs (10, 11, 12),
l'efficacit du lavage de la phase solide et des agents introduits dans le milieu d'incubation de manire
rduire au niveau le plus bas possible la liaison non spcifique de l'anticorps marqu,
la matrice exemple de TSH dans laquelle sont prpares les solutions talons ; on utilise gnralement du
srum animal (cheval, porc) en supposant que les pitopes existant sur la TSH animale ne prsentent pas
de raction croise avec les anticorps antiTSH humaine ; trs souvent, les protines du srum animal
ragissent avec la phase solide pour engendrer un signal non spcifique incompatible avec l'obtention des
limites de dtection thoriques,
l'htrognit de la TSH circulante ; celle-ci diffre par sa charge et sa glycosylation de la TSH extraite
d'hypophyses et utilise comme talon (13) ; de plus, l'htrognit de la TSH circulante dpend de l'tat
clinique du patient et constitue un facteur important lorsqu'il s'agit de mesurer des quantits de l'ordre de
la femtomole (10
-15
mol) avec les techniques de troisime gnration.
Variations entre laboratoires de la limite de dtection d'un mme immunodosage
La limite de dtection fonctionnelle d'un dosage de TSH peut varier d'un facteur 5 selon le laboratoire dans lequel
il est mis en uvre en relation avec la robustesse de la technique. Ainsi, un dosage de deuxime gnration dans de
mauvaises conditions d'utilisation peut donner des performances de premire gnration. C'est pourquoi, il est
conseill de contrler tout dosage avec un pool faible (0,1-0,2, mUI/L pour un dosage de deuxime gnration).
67
Intrts de l'utilisation d'un dosage de TSH de troisime gnration
Un dosage de troisime gnration permet de garantir au minimum des performances de deuxime
gnration dans tous laboratoires. De mme, pour interprter correctement un rsultat subnormal le
clinicien a besoin de connatre la technique utilise (14).
Il permet un diagnostic plus faible des hyperthyrodies subcliniques. A phase, mme si les hormones
thyrodiennes libres sont encore normales, la TSH s'effondre car elle rend compte du point d'quilibre
individuel chaque patient. Dans cette situation, l'utilit clinique d'un dosage de troisime gnration est
suprieure condition que le statut thyrodien soit stable (absence de traitement par les antithyrodiens
ou substitutif) et que le trouble ne soit pas d'origine hypothalamique ou hypophysaire.
Associ la T4 libre et aux anticorps antithyroperoxydase en tant que tests de seconde intention, il
devient l'un des lments essentiels d'une stratgie efficace de dpistage des dysthyrodies chez les
patients non hospitaliss.
! IV. ETAT DE L'ART
Le dosage de TSH a t inclus ds 1985 parmi les analyses soumis aux oprations de contrle national. Pourtant,
les spcimens de contrle possdant une concentration suffisamment basse pour apprcier la limite de dtection
des trousses, n'ont t disponibles qu' partir de 1993.
La figure 1 indique la "popularit" actuelle des techniques et son volution sur la priode de 1985-1994. Les
trousses incluant une marque enzymatique et s'achevant par une mesure d'absorbance, largement majoritaires au
dbut, ont vu le nombre de leurs utilisateurs diminuer progressivement pour atteindre 18% en 1994. Cette
diminution s'est faite au profit, principalement des techniques avec marque enzymatique et mesure de fluorescence
dont les utilisateurs reprsentent 61% et, un moindre degr, des techniques avec marque chimique et mesure de
luminescence, adoptes par plus de 10% des laboratoires. Le nombre d'utilisateurs des techniques avec marque
radioisotopique, pratiquement constant en valeur absolue, a rgulirement diminu en pourcentage avec
l'augmentation des participants et reprsente moins de 2% en 1994.
Figure 1 : volution de la "popularit" des techniques adoptes par les participants aux oprations de
contrle national sur la priode 1985-1994. Les techniques sont classes dans les grands groupes suivants :
E marque enzymatique et mesure spectrophotomtrique (Biotrol 7000, CIS Pack, Cobas Core, ES, SRI, EIA manuelle)
F marque enzymatique et mesure de fluorescence (AIA, Axsym, IMx, Opus, Stratus, Vidas)
H marque enzymatique et mesure de luminescence (Amerlite, Access)
L marque chimique et mesure de luminescence (Magic Lite, ACS 180, Berilux)
M marque chimique et mesure de fluorescence (Delfia)
R marque radioisotopique
68
La figure 2, qui reprsente l'volution du CV exprimant la variabilit totale (interlaboratoire et inter-trousses) en
fonction de la concentration, a bien l'allure caractristique du profil de prcision d'un immunodosage : la zone de
reproductibilit optimale est situe entre 1 et 20 mUI/L ; la concentration suprieure est insuffisante pour que la
prcision se dtriore ; en revanche, la variabilit totale augmente considrablement en dessous de 1 mUI/L,
indiquant la proximit de la limite infrieure du domaine de mesure des dosages de TSH disponibles. Les accidents
sur la courbe sont dus au fait qu'elle est ralise partir de spcimens distribus sur une longue priode (10 ans) au
cours de laquelle l'chantillon statistique de participants a volu et les techniques se sont amliors grce,
notamment, l'automatisation
Figure 3 : volution du CV toutes techniques confondues, sur la priode 1985-1994, pour des spcimens de contrle de
concentrations en TSH voisines.
Figure 2 : CV tronqus toutes techniques confondues, observs pour huit spcimens classs en fonction
de leur concentration et analyss entre 1985 et 1994 dans le cadre du contrle national.
Au total, entre juin 1985 et juin 1994, quinze spcimens de contrle ont t distribus. Dans la figure 3, tous les
spcimens qui possdent sensiblement la mme concentration de TSH ont t regroups de manire montrer
l'volution de la variabilit totale du dosage au cours de cette priode. On constate une diminution du CV quel
que soit le niveau de concentration, l'exception des valeurs basses pour lesquelles le nombre de spcimens est
insuffisant. Ailleurs dans le domaine de mesure, les valeurs basses pour lesquelles le nombre de spcimens est
insuffisant. Ailleurs dans le domaine de mesure, les valeurs de CV se situent couramment entre 10 et 20 %.
69
En ce qui concerne, prsent, les rsultats de l'opration de juin 1994 (spcimens TP18 et TP19), la figure 4
rcapitule les moyennes exprimes en pourcentage de la moyenne gnrale, et la figure 5 les CV obtenus avec les
principales trousses.
Pour le spcimen TP 19, dont la concentration (5,10 mUI/L) est dans la zone limite des sujets eu- et
hypothyrodiens, les valeurs fournies par les trousses les plus utilises sont, pour la plupart comprises entre 80 et
120% de la moyenne gnrale et les CV interlaboratoires sont pratiquement tous infrieurs 10%.
En revanche, la situation est moins satisfaisante pour le spcimen TP 18, particulirement intressant en raison de
sa concentration en TSH (0,12 mUI/L) qui correspond parfaitement la limite de dtection fonctionnelle d'un
dosage de deuxime gnration. Les carts entre trousses sont importants puisque les valeurs moyennes fluctuent
entre 40 et 170% de la moyenne gnrale. Les valeurs les plus basses, obtenues avec les trousses Q4 et P4, peuvent
s'expliquer par la moindre reconnaissance de la TSH prsente dans le spcimen de contrle par rapport celle
prsente dans l'talon de la trousse, en raison de l'htrognit molculaire. Le mme phnomne se produit avec
les spcimens de patients dont la scrtion de TSH n'a pas subi de stimulation par TRH et n'est pas retrouv sur les
spcimens obtenus aprs injection de TRH (13).
Figure 5 : reproductibilit (CV) interlaboratoire des trousses les plus utilises au cours de l'opration de contrle
national de juin 1994.
Figure 4 : moyennes de TSH des trousses les plus utilises, exprimes en pourcentage de la moyenne
gnrale, au cours de l'opration de contrle national de juin 1994.
70
L'examen des CV interlaboratoires permet de se faire une ide de l'appartenance des trousses telle ou telle
gnration de dosages de TSH, mme si leur classification repose sur les CV inter-sries (intralaboratoires). Les
trousses qui fournissent des CV infrieurs ou lgrement suprieurs 20% (SA, AA, DB, SI, QE) sont soit des
trousses de troisime gnration, soit des trousses de deuxime gnration robustes. Les autres trousses, prsentes
comme appartenant la deuxime voire la troisime gnration, peuvent tre considres, au vu de leur CV
interlaboratoire, comme des techniques de deuxime gnration qui ont des performances de premire gnration
dans certains laboratoires en raison des conditions de leur utilisation. Les remarques qui prcdent mritent,
cependant, d'tre tempres pour deux raisons. Tout d'abord, le CV doit tre interprt en fonction de la valeur
moyenne fournie par chaque trousse dans un domaine o son volution est brutale. Ensuite, ces observations
dcoulent d'un seul spcimen de contrle dont la matrice a subi des traitements et, par consquent, peut diffrer de
celle des spcimens de patients.
! V. ETAPE PREANALYTIQUE
Les dosages peuvent tre raliss sur srum ou plasma. L'interfrence des anticoagulants doit tre tudie pour
chaque systme. Le spcimen peut tre conserv pendant 24 h aprs le prlvement + 4 C ou plus longtemps -
20 C. Il est prfrable d'viter les conglations et dconglations successives.
! VI. INTERPRETATION DES RESULTATS
Variations biologiques
Rythme circadien : il existe un rythme nycthmral de la scrtion de TSH avec un pic nocturne et un
nadir dans l'aprs-midi l'amplitude des variations tant de 50 200% chez un mme individu.
Age : chez le nouveau-n survient un pic de TSH (50 80 mUI/L), dans les minutes qui suivent
l'accouchement ; celui-ci rgresse rapidement dans les 24 72 heures. Chez le sujet g, les donnes sont
contradictoires (15) sur les valeurs basales de TSH ; on considre, toutefois, qu'il n'y a pas de
modification notable avant 80 ans.
A l'exception des situations prcdentes, les variations lies au sexe, la priode du cycle menstruel, la grossesse
sont faibles.
Valeurs de rfrence
Les valeurs dpendent du ractif utilis et ne sont donnes qu' titre indicatif (16) :
- nourrisson
1 jour <70 mUI/L
2 3 jours <30 mUI/L
3 7 jours <10 mUI/L
> 1 semaine 0,20 4,0 mUI/L
- adulte
0,15 4,0 mUI/L
71
BIBLIOGRAPHIE
1. TOURNIAIRE J. Endocrinologie, diabte, nutrition pour le praticien. Simep (d). 1994
2. WEINTRAUB BD, STANNARD BS, MAGNER JA, RONIN C, TAYLOR T, JOSHI L, CONSTANT RB et
al. Glycosylation and posttranslational processing of Thyroid-Stimulating Hormone : clinical implications.
Recent Prog Horm Res, 1986, 41, 577-606
3. BENKIRANE MM, BON D, COSTAGLIOLA S, PAOLUCCI F, DARBOURET B, PRINCE P, CARAYON
P. Monoclonal antibody mapping of the antigenic surface of human thyrotropin and its subunits.
Endocrinology, 1987, 121, 3, 1171-7
4. WEMEAU JL. Les marqueurs de la fonction thyrodienne. Symposium Immunotech, Grenoble 1994.
5. SPENCER CA. New roles for TSH measurement in Thyroid testing. Monographie Kodak Clinical Diagnostics
1993.
6. NICOLOFF JT, SPENCER CA. The use and misuse of the sensitive thyrotropin assays. J Clin Endocrinol
Metab, 190, 71, 553-8
7. SPENCER CA, LAI-ROSENFELD AO, GUTTLER RB, LOPRESTI JS, MARCUS AO, NIMALASURIYA
A, EIGEN A, et al. Thyrotropin secretion in thyrotoxic and thyroxine-treated patients : assessment by a
sensitive immunoenzymometric assay. J Clin Endocrinol Metab, 1986, 63, 349-55
8. HAY ID, BAYER MF, KAPLAN MM, KLEE GG, LARSEN PR, SPENCER CA. American Thyroid
Association assessment of current free thyroid hormone and thyrotropin measurements and guidelines for
future clinical assays. Clin Chem, 191, 37, 2002-8
9. SPENCER CA. Thyroid profiling for the 1990's : FT4 estimate or sensitive TSH measurement. J Clin
Immunoass, 1989, 12, 82-9
10. McCAPRA F, WATMORE D, SUMUN F, PATEL A, BEHESHTI I, RAMAKRISHNAN K, BRANSON J.
Luminescent labels for immunoassay : from concept to practice. J. Biolum Chimilum, 1989, 4, 51-8
11. ROSS DS, DANIELS GH, GOUVEIA D. The use and limitations of a chemiluminescent thyrotropin assay as a
single thyroid function test in an out-patient endocrine clinic. J Clin Endocrinol Metab, 1990, 71, 764-9
12. SPENCER CA, SCHWARZBEIN D, GUTTLER RB, LOPRESTI JS, NICOLOFF JT. TRH stimulation test
responses employing 3rd and 4th generation TSH assay technology. J Clin Endocrinol Metab, 1992, 75, 6
13. WILKINSON E, RAE PW, THOMSON KJ, TOFT AD, SPENCER CA, BECKETT GJ. Chemiluminescent
third-generation assay (Amerlite TSH-30) of Thyroid-Stimulating Hormone in serum or plasma assessed. Clin
Chem, 1993, 39, 10, 2166-73
14. PIKETTY ML. Compte rendu de la confrence sur la TSH de SPENCER CA. Immunoanal Biol Spc, 1995,
10, 62-6
15. MARIOTTI S, BARBESINO G, CATUREGLI P, BARTALENA L, SANSONI P, FAGNONI F, MONTI D.
Complex alteration of thyroid function in healthy centenarians. J Clin Endocrinol Metab, 1993, 77, 1130-34
16. BLACQUE BELAIR A. Dictionnaire des constantes biologiques et physiques en mdecine. Maloine (d),
Paris, 6me dition, 1991, 749-54
72
SOMMAIRE
PREFACE .. p. 1
LISTE DES AUTEURS ........ p. 2
CHAPITRE 1
- Le Contrle de Qualit National en immunoanalyse. Rflexions aprs onze annes de
fonctionnement ....... p. 3
CHAPITRE 2
- Critres de qualit en immunoanalyse ......
- Piges et problmes en immunoanalyse .......
- Problmes lis au marqueur et son signal en immunoanalyse ...
p. 7
p. 16
p. 28
p. 3
CHAPITRE 3
- Antigne carbohydrate 19-9 (CA 19-9) ....
- Antigne spcifique de la prostate (PSA) .....
- Hormone chorionique gonadotrope (hCG) et sous-unit (hCG) .....
- Hormone thyrostimulante (TSH) ....
p. 41
p. 48
p. 55
p. 63

Immuno Analyse

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Immuno Analyse

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Ceci est la VERSION NUMERIQUE des CAHIERS BIOFORMA dj parus et

distribus l'ensemble des LABORATOIRES D'ANALYSES de BIOLOGIE

TOUT LE CONTENU DE CE FICHIER RESTE LA PROPRIETE DE BIOFORMA.

Toute reproduction, toute utilisation, partielle ou totale, des textes, schmas et

Vous aimerez peut-être aussi