TD signalisation n° 1

Marijuana (cannabis), RCPG et inflammation vasculaire

D’après https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.005
Notions de cours et techniques abordées : RCPG, facteur de transcription NF-kappaB,
croisement entre voies de signalisation
Techniques à connaître : Mesure d’expression de gènes cibles par qPCR, Western-blot
phospho-protéines.

Introduction
La marijuana est l'une des drogues illicites les plus consommées dans le monde. Avec La légalisation
croissante de la marijuana, une augmentation de son usage est attendue. De ce fait, il est nécessaire
de connaître ses effets néfastes, notamment ceux affectant le système cardiovasculaire. Des études
rétrospectives indiquent que la marijuana augmente le risque de maladies cardiovasculaires
(cardiovascular diseases : CVD), y compris l'infarctus du myocarde, l'angine de poitrine et les arythmies.
Le but de cette étude est de comprendre au niveau moléculaire le lien entre la marijuana et les maladies
cardiovasculaires.

Deux récepteurs cannabinoïdes sont impliqués dans les effets du Δ9-tétrahydrocannabinol (Δ9-
THC, la molécule responsable des effets du cannabis) : le récepteur cannabinoïde 1 (CB1/CNR1) et le
récepteur cannabinoïde 2 (CB2/CNR2), qui appartiennent tous 2 à la famille des récepteurs couplés
aux protéines G (GPCR). CB1 (abondant dans le cerveau), régule les effets psychoactifs de la
marijuana. Le récepteur CB1 est également exprimé dans d'autres tissus périphériques tels que le cœur,
le système vasculaire et les muscles lisses.

Question 1 : sachant que CB1 est lié à une protéine G trimérique contenant une sous-unité alpha de
type Gαi, et en utilisant vos connaissances de cours, dessiner le lien entre l’activation du récepteur par
le Δ9-THC et l’activité de la PKA, en indiquant les effecteurs et les seconds messagers

Pour débuter cette étude, vingt fumeurs récréatifs de marijuana ont été recrutés pour fumer une seule
cigarette de marijuana et des prélèvements sanguins ont été effectués à différents intervalles de temps,
pour évaluer les niveaux de Δ9-THC dans le sang (on avait demandé aux fumeurs de ne pas fumer
pendant 24h précédent l’expérience). La production de 92 cytokines inflammatoires a été dosée à l'aide
d’une plateforme protéomique. Ces cytokines sont impliquées dans le processus de formation de

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plaques d’athérosclérose dans les vaisseaux, responsables des infarctus du myocarde. Ils ont observé
une augmentation des molécules inflammatoires dans le sang, 90 min après avoir fumé.

Question 2. Quels mécanismes moléculaires pourraient être impliqués dans cette augmentation ?

Pour pouvoir étudier les mécanismes moléculaires au niveau vasculaire, il faut un modèle cellulaire.
Idéalement des cellules endothéliales qui forment des vaisseaux. Ici les auteurs utilisent un système un
peu complexe (mais très élégant) de cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC-EC), puis
différenciées en tubes/vaisseaux. Ils ont vérifié que ces cellules différenciées expriment bien le
récepteur CB1.

Figure 1, cellules souches induites, différentiées en cellules endothéliales formant des tubes

Point de discussion pendant le TD : Comment ont-ils pu faire cette vérification de l’expression de CB1?

Les auteurs ont ensuite traité les cellules (4 lignées différentes) avec le Δ9-THC et mesuré l’expression
de gènes pro-inflammatoires par qPCR. Pour simplifier, les résultats pour seulement 2 cytokines sont
montrées (Figure 2).

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Figure 2 : Expression de l'ARNm des gènes liés à l'inflammation dans les hiPSC-EC après un
traitement au Δ9-THC pendant 48 h.
Mesure par qPCR normalisé à GAPDH dans 4 lignées cellulaires (Line 1, 2, 3, 4).

Question 3 : A quoi sert la normalisation avec GAPDH ? Qu’observez-vous sur la Figure 2 et que
pouvez-vous en déduire ?

Point de discussion pendant le TD : Comment peut-on être sûr que c’est via CB1 ?

Ils ont ensuite effectué un western-blot sur les 4 lignées traitées avec the Δ9-THC pour détecter p65 et
phospho-p65 (pS536 mesure la phosphorylation de la serine 536). Une seule lignée est montrée ici pour
simplifier. Rappel de cours : p65 est la sous-unité principale du facteur de transcription NF-kappaB. Sa
phosphorylation indique qu’elle est active.

Figure 3 : Western-blot NF-kappaB

pS536-p65

p65 total

Question 4 : Quels sont les effets de Δ9-THC sur la voie de signalisation de NF-kappaB ? Est-ce
surprenant au vu de la nature du récepteur CB1 ? Comment ces résultats sont-ils complémentaires de
la Figure 2 ? Compléter le schéma de la question 1 avec ces nouveaux éléments, sachant que les sous-
unités beta/gamma de la protéine G trimérique sont responsables de la régulation de NF-kappaB.

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Les auteurs testent ensuite les effets de la génistéine, un flavonoïde naturel du soja qui peut se fixer au
récepteur CB1. Les cellules ont été traitées avec du Δ9-THC 5 µM, de la génistéine 10 µM ou leur
combinaison pendant 48h. Les lysats cellulaires totaux ont été soumis à une analyse Western blot.

Figure 4 : Effets de la Génistéine

Question 5 : Qu’observez-vous sur la Figure 4A et B ? Que pouvez-vous en déduire sur le rôle de la

Génistéine ?

Les auteurs ont ensuite utilisé un modèle de souris nourries avec un régime hypercalorique (riche en
acides gras) pendant 12 semaines et traitées avec le Δ9-THC, ou le Δ9-THC + génistéine. Ils ont
visualisé les plaques d’athérosclérose dans des coupes de carotide avec 2 marquages (H&E et Oil Red-
O : marquage des lipides). Note : La quantité de Δ9-THC injectée chez les souris produit une
concentration plasmatique de Δ9-THC similaire à celle mesurée chez l’homme après avoir fumé une
cigarette.

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Figure 5 : Formation des plaques d’athérosclérose in vivo

Oil Red O
H&E staining staining

Question 6: Que pouvez-vous déduire des effets de la Génistéine in vivo ? Faites un schéma
récapitulatif des effets de la Génistéine

Discussion et question subsidiaire pour aller plus loin : Quel pourrait être le problème associé à
l’utilisation de la Génistéine en clinique (sachant qu’aucune toxicité n’a été observée) ?