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Le marquage
moléculaire
Le marquage moléculaire regroupe un ensemble de techniques
révélant des différences de séquences d’ADN (acide désoxyribonucléique)
entre individus.
Les marqueurs moléculaires permettent de détecter ces différences
(polymorphisme) dans des régions spécifiques de l’ADN.

L’ADN : le support de l’information génétique

Transcription

Noyau
Traduction Expression
d’un
caractère
Gène
Plante Cellule Chromosome ADN ARN messager Protéine

Exemples de marqueurs moléculaires

■ Les microsatellites ■ Les SNP
Les microsatellites sont des séquences constituées (Single Nucleotide Polymorphism)
de répétitions en tandem de motifs nucléotidiques. Les marqueurs SNP révèlent des différences d’une seule
Les plus courants sont CA, CAT, GATA ; le nombre base dans une séquence d’ADN connue.
de répétitions de ces motifs varie de quelques unités
à plusieurs dizaines.
Identification
L’analyse d’un marqueur microsatellite permet de pour une même séquence d’ADN
révéler ces répétitions. d’un SNP entre deux variétés

Séquence d’ADN cible

Variété 1 ATCCGCTT AGATCCTA
Microsatellite X Microsatellite Y
monomorphe polymorphe Variété 2 ATCCGCTCAGATCCTA

Variété 1 TCTCTCTC CATCAT

Variété 2 TCTCTCTC CATCATCAT SNP

Liens entre génotype / phénotype Exemple : couleur de la fleur

Le génotype est l’ensemble du patrimoine génétique Variété 1 Variété 2

d’un individu. ADN ADN
L’expression du génotype conduit au phénotype. Génotype
Le phénotype est l’ensemble des caractères observables Gène C Gène C
chez un individu dans un environnement donné.

Phénotype

Les marqueurs moléculaires permettent d’augmenter l’efficacité et

la précision des techniques d’amélioration des plantes, en intervenant
à certaines étapes du processus de sélection.
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Extraction
de l’ADN végétal
C’est le procédé qui permet d’isoler l’ADN contenu dans les noyaux
cellulaires d’un fragment de tissu végétal (feuilles, graines).
Il constitue le matériel de base pour toute analyse de marquage
moléculaire.
L’automatisation de ce procédé permet l’extraction de l’ADN
d’un nombre important d’échantillons par unité de temps.

Echantillonnage

Broyage

Lyse cellulaire
par incubation
au bain-marie
(95° C, 1 h)
dans un tampon
d’extraction
Sels de précipitation
(NH4C2H3O2) + alcool

Précipitation
de l’ADN Centrifugation

Récupération Eclatement
du surnageant des cellules,
(ADN + l’ADN se
protéines) libère dans
Pelote la solution
d’ADN Elimination
du culot composé
de débris végétaux
Centrifugation (membrane…)

Lavage Récupération
du culot
d’ADN Suspension
après séchage de l’ADN

Culot dans un évaporateur- dans une solution

d’ADN concentrateur tampon

Elimination ADN
du surnageant
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PCR ou amplification
de l’ADN
L’objectif de cette technique est de multiplier un fragment d’ADN
en un grand nombre de copies afin de rendre possible sa visualisation.

ADN à amplifier

Préparation de la réaction
de PCR
Préparation robotisée du mélange réactionnel :
■ l’ADN matrice
94°C Dénaturation
■ les nucléotides (A, T, C, G)
■ du MgCl2 et de l’H2O
■ les amorces
■ l’enzyme Taq polymérase

50 à 65°C Hybridation
1er cycle

72°C Elongation

Robot : Tecan

Amplification de l’ADN
Cette amplification par PCR (Polymerase
Chain Reaction) est constituée d’une répétition Dénaturation
de cycles comportant trois étapes :

■ Dénaturation
Séparation des deux brins d’ADN.

■ Hybridation
Accrochage des amorces sur la séquence cible Hybridation
qui seront le point de départ de la synthèse
du nouveau fragment.

■ Elongation
Synthèse de la chaîne nucléotidique par
une enzyme, la Taq polymérase.
2ème cycle

Une trentaine de cycles d’amplification sont

Elongation
suffisants pour détecter l’ADN amplifié.

Thermocycleur : appareil permettant

l’obtention des températures nécessaires Durée du processus : 1h30 à 2h
30ème
cycle

à chaque cycle d’amplification.

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Visualisation de l’ADN amplifié

ou révélation
La révélation est l’étape qui consiste à visualiser les fragments d’ADN
amplifiés. Deux méthodes sont utilisées au laboratoire.

Electrophorèse Système de révélation TaqMan

Cette technique est utilisée pour la séparation
des fragments amplifiés selon leur taille sur un gel
d’agarose ou d’acrylamide dans un champ électrique.
Le système Taqman est basé sur une différence
au niveau d’un nucléotide dans une séquence d’ADN.
Trois étapes sont nécessaires :
■ Hybridation sur l’ADN cible d’une sonde complémentaire
portant une molécule fluorescente (le fluorophore).
Chaque sonde est spécifique d’une séquence d’ADN donnée.
■ Elongation, au cours de laquelle l’enzyme
Taq polymérase libère le fluorophore.
■ Visualisation par excitation et quantification du
fluorophore à une longueur d’onde qui lui est propre.

Dépôt sur gel d’agarose Cuves d’électrophorèse

Variété 1 Variété 2

Fragments
d’ADN Système de révélation SNP Taqman 7900 HT
amplifié
Hybridation
Migration sur gel d’agarose Lumière Fluorescence

Migration des 1 2 F1
fragments d’ADN TCT
selon leurs tailles CGAA
sur un gel Variété 1 ACGTAGCCGCTTAGATCCTATTCG
d’électrophorèse Séquence d'ADN cible
soumis à un
champ électrique Variété 2 ACGTAGCCGCTCAGATCCTATTCG
TCT
CGAG
Lors de
Amorces
F2
F Fluorophore
la migration F1 Sonde spécifique
sur gel, à la variété 1 Lumière Fluorescence
les fragments d’ADN 1 Sonde spécifique
F2 à la variété 2
les plus grands Taq polymérase
sont retardés 2
par rapport
aux plus petits Elongation
ence
resc
Révélation Fluo
ière
L’addition de bromure Lum
d’éthidium permet
F1
la visualisation GAATCT
des fragments d’ADN ultra-violet ACGTAGCCGCTTAGATCCTATTCG
après électrophorèse. Variété 1
Cette molécule Séquence d'ADN cible
s’intercale entre ACGTAGCCGCTCAGATCCTATTCG
les bases de l’ADN et 1 Variété 2
CGAGTC
a la propriété d’être
fluorescente sous 2
lumière ultraviolette : F2
A T G C
scence
Lumière Fluore
Photographie
Visualisation
Echelle de F1
Résultat fluorescence
de la migration pour F1
Variété 1

Echelle de
Variété 2 fluorescence
0 F2 pour F2

L’information est ensuite stockée sur un serveur, pour être analysée

avec des outils statistiques.
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Description
de la variabilité génétique
Chaque individu d’une espèce donnée peut être identifié rigoureusement
par une empreinte génétique ou “fingerprinting”.
Pour établir cette empreinte, une analyse du polymorphisme de l’ADN
est conduite avec un ensemble de marqueurs moléculaires
(quelques dizaines à quelques centaines).

Le profil de chaque individu est observé pour chacun
des marqueurs analysés.
C’est la combinaison de ces données qui constitue
l’empreinte génétique.
La comparaison des empreintes génétiques
au sein de populations ou groupes d’individus permettra
une caractérisation plus poussée de la variabilité
génétique, et fournira une meilleure connaissance des
relations de parenté entre individus.

Caractérisation et structuration de la variabilité génétique

Le “fingerprinting” permet au sélectionneur Variétés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
d’optimiser les décisions stratégiques en ce qui
concerne la gestion des ressources génétiques : 350 pb
300 pb
250 pb
■ le choix des lignées parentales pour la création Marqueur 215 pb
Mon 358 160 pb
200 pb
150 pb
d’hybrides ou de populations à sélectionner. 100 pb
Le sélectionneur privilégie les croisements entre
deux parents complémentaires et suffisamment 50 pb

éloignés pour la production d’hybrides performants.

Marqueur de poids moléculaire
■ la constitution de collections variétales (fragments de taille connue)

assurant la conservation de ressources génétiques

à long terme.
Variétés A B C
Marqueur 1
Marqueur 2

Marqueur 3

Marqueur 4

Etablissement
d’une matrice de lecture

Variétés A B C
Marqueur 1 1 1 1
Marqueur 2 1 1 0
Marqueur 3 0 1 0
Marqueur 4 1 0 1

Calcul des % de similarité

Représentation graphique (dendrogramme) entre individus

Deux types de représentation graphique

de la variabilité génétique

Graphique ACP Dendrogramme

Analyse en Composantes Principales

A C
C
A est plus proche
de C que de B
B
Représentation graphique (ACP)
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La Sélection Assistée
par Marqueurs (S.A.M)
C’est une stratégie qui améliore l’efficacité des processus de sélection
(progrès génétique par unité de temps) pour la création de variétés
hautement performantes.

Par l’utilisation des marqueurs moléculaires, Deux étapes principales :

qui permettent l’étiquetage de régions chromosomiques
favorables à l’expression de caractères d’intérêt,
la sélection assistée par marqueurs rend possible
la construction des meilleures combinaisons de gènes.
■ Identification des régions d’ADN impliquées
dans l’expression des caractères complexes (rendement,
précocité de maturation) : analyse des corrélations
marqueurs-caractères.
■ Recombinaison des individus les plus complémentaires
pour l’accumulation de ces régions favorables.

Utilisation de la SAM pour l’obtention

de nouvelles variétés “élites” Exemple d’un marqueur informatif :
Test statistique au marqueur X
Différence des effets
sur le rendement

Développement Recombiner Nb
BB AA
d’une les caractéristiques
population apportées par
en ségrégation les 2 parents
Parent 1 Parent 2 Rendement
Supériorité de la forme A
au marqueur X

Essais
aux champs
Analyse
des corrélations
Marqueurs-
caractères Parent 1 Parent 2 Individus

Génotypage-
Marqueur X
AA BB AB AA BB BB AA AB BB AB

Sélection et intercroisement

Augmentation Nouvelle population

de la fréquence
des gènes Analyse aux marqueurs
favorables Initiation informatifs
d’un nouveau Sélection des individus
cycle
ayant accumulé le plus Créer la meilleure combinaison :
de régions chromosomiques
favorables Chromosomes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Région
favorable
Parent 1
Gain de
112 rendement : Région
111 favorable
+ 7 % en Parent 2
109
moyenne
Résultats 108
Sélection Profil de l’individu idéal
attendus 107
105 assistée
104 par
103 marqueurs
Sélection
101 Meilleur phénotypique
Rendement 100 hybride
en Qx/ha 99 (parent)
Expérience DEKALB de Sélection Récurrente Assistée par Marqueurs
sur 43 populations de maïs
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Les conversions
assistées par marqueurs
Certains caractères monogéniques présentent un intérêt majeur pour
l’amélioration des variétés et leur réussite commerciale sur le marché :
résistance à des maladies, qualité d’huile, transgènes (ex : Maïs Bt).
Une fois identifiés, ces gènes portés par une plante appelée donneuse,
peuvent être transmis par croisement à toute autre plante receveuse.
Dans un deuxième temps, une succession de rétrocroisements
(Back cross) avec le parent receveur est réalisée afin d’éliminer
les portions d’ADN provenant du donneur à l’exception du gène d’intérêt.
L’efficacité de ce processus est améliorée par l’utilisation de marqueurs
moléculaires bien répartis sur le génôme (marqueurs cartographiés).

Marqueur Plante Plante

moléculaire donneuse receveuse
cartographié
Caractère
d’intérêt

Chromosome 1 2 3 1 2 3 Elimination des

F1 descendants n’ayant pas
le caractère d’intérêt
Sélection des individus
génétiquement les plus
proches de la lignée
receveuse et possédant
le caractère d’intérêt

1 2 3 1 2 3
Back Cross 1

1 2 3 1 2 3
Back Cross 2

1 2 3

Efficacité comparée de la conversion assistée par marqueurs

avec la conversion traditionnelle
% de récupération
Par sélection classique, 6 rétrocroisements sont du parent récurrent Conversion assistée
nécessaires pour obtenir un retour vers le parent receveur par marqueurs
de 97 % alors qu’avec les marqueurs moléculaires 100
97
2 rétrocroisements seulement suffisent. Conversion
La conversion assistée par marqueurs permet un gain 90 traditionnelle
de temps de 2 à 3 ans.
80

70
Nombre de
rétrocroisements
60
1 2 3 4 5 6
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Les marqueurs
diagnostics
Il s’agit de marqueurs moléculaires liés à des caractères
à déterminisme simple (monogénique), comme la résistance à certaines
maladies (mildiou).
Une fois la liaison génétique établie entre le gène et le marqueur,
il devient très facile de suivre et contrôler la présence de ce gène
chez n’importe quel individu sans avoir recours à l’observation
phénotypique du caractère.

Détermination du phénotype
à l’aide d’un marqueur diagnostic
Variété A Variété B

Gène Forme résistante Forme sensible

de résistance ADN
au mildiou
Marqueur Marqueur
diagnostic diagnostic
(résistance) (sensibilité)

PCR

Electrophorèse

Les marqueurs diagnostics

permettent de déterminer
le phénotype de la plante
dès le stade précoce

Plante 1 Plante 2 Plante 3 Plante 4 Plante 5 Plante 6

résistante résistante sensible résistante sensible résistante

La disponibilité d’un marqueur lié à un gène majeur (marqueur diagnostic)

est une aide précieuse pour le sélectionneur.
Comme un fragment de feuille suffit à obtenir l’ADN nécessaire pour
établir l’empreinte génétique d’une plante, un tri précoce peut être établi
dès le début de la croissance des plantes.
Ceci permet un gain de temps et d’argent, car il n’est plus nécessaire
d’attendre le stade adulte pour observer le phénotype.
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Détection d’OGM
dans le contrôle qualité
Aujourd’hui, la biologie moléculaire permet de contrôler
certains paramètres de qualité des semences, de leur conception
à leur commercialisation.
Monsanto a d’ores et déjà mis en place un système de contrôle,
dont les capacités sont uniques en Europe, pour éliminer tout risque
de présence fortuite d’OGM dans les variétés conventionnelles
(un OGM est une plante dans laquelle la présence d’un nouveau gène,
lui confère un nouveau caractère).
On recherche la présence de ce gène dans un échantillon représentatif
(semence ou tissu végétal) de 3 manières possibles.

Echantillon
végétal

Détection Détection Détection

du gène de la protéine du nouveau caractère
Exemples : Exemples : Exemples :
• gène Bt • toxine plante résistante
• gène Roundup anti-insecte • à la pyrale
Ready • enzyme de résistance • au Roundup
au Roundup

Test Test Test

ADN ELISA biologique
Détection Exemples :
immunologique libération d’insectes,
de la protéine pulvérisation
de pesticide
Extraction

PCR
Quantitative

Révélation Différentes analyses

et identification des résultats
du gène

Qualitative

La détection d’OGM est une technique utilisée :

■ actuellement pour mesurer la teneur en OGM dans les semences
conventionnelles.
■ à l’avenir et dans les pays où les OGM sont commercialisés,
garantir la présence et la pureté des nouveaux gènes dans les semences
génétiquement modifiées.