REPUBLIQUE DU CAMEROUN REPUBLIC OF CAMEROON

Paix-Travail-Patrie Peace-Work-Fatherland
----------------------- ---------------
Ministère de l’Enseignement Supérieur Ministry of Higher Education
----------------- -------------
Université de Ngaoundéré University of Ngaoundere
----------------- -----------------
Ecole de Génie Chimique et Des School of Chemical Engineering and
Industries Minérales Mineral Industries
----------------- -----------------
Division Des Affaires Académiques De Division of Academic, Activities,
La Recherche Et De La Coopération Research and Cooperation

BP: 454 NGAOUNDERE

FILIERE : GENIE DES PROCEDES ET CHIMIE FINE (GPCF)

UE : GENIE GENETIQUE ET MOLECULAIRE
NIVEAU : V
GROUPE : 6
THEME :

CONCEPTION D’UNE PUCE D’ADN

Rédigé par les élèves-ingénieurs formés de :

Nom (s) et prénom (s) Matricule
NDAOKAI GUIDONA LUCRESSE 19A176CM
NDOUGOUNA WARDA ABRAHAM 21B020CM
NEVOUNSOU ZEPHANIAS 19A103CM
NEWAH HAPPI GUILIANE MORIELLE 19A104CM
NGOUMELA BERNADETTE ORNELLA 19A110CM
NGUIMGO DJEUFACK ANICET RAOUL 19A112CM
NIAMY JIONGO VANELE LESLINE 19A113CM

Sous la supervision de :

Pr NJITIE

Année académique: 2023-2024

 TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 3
I. GENERALITES SUR LES PUCES A ADN...................................................................... 4
1. Définition de la puce à ADN ......................................................................................... 4
2. Historique ....................................................................................................................... 4
3. Types de puces à ADN .................................................................................................. 4
II. PRINCIPE DES PUCES A ADN ....................................................................................... 6
III. SELECTION DES SEQUENCES D'ADN POUR LA CONCEPTION DE PUCE ....... 7
IV. CONCEPTION DE LA PUCE D'ADN .......................................................................... 8
V. ARRANGEMENT DES SONDES SUR LA PUCE. ....................................................... 10
VI. ETAPES D’UNE EXPERIENCE DE BIOPUCE ......................................................... 11
VII. APPLICATION DE LA PUCE A ADN ....................................................................... 12
1) Domaine médical ......................................................................................................... 12
2) En Toxicogénomique ................................................................................................... 12
3) En Agronomie .............................................................................................................. 12
4) En Environnement ...................................................................................................... 12
5) En microbiologie .......................................................................................................... 13
VIII. AVANTAGES, LIMITATION ET PERSPECTIVE DE LA CONCEPTION D'UNE
PUCE D'ADN. ......................................................................................................................... 15
CONCLUSION ........................................................................................................................ 17
REFERENCES ......................................................................................................................... 18
CORRECTION DU TD ........................................................................................................... 20

1
 TABLES DES FIGURES
Figure 1: Principe de mise en œuvre des puces d'ADN ............................................................ 6
Figure 2: Conception de la puce ................................................................................................ 9
Figure 3: Etapes d'une expérience de biopuces ....................................................................... 11
Figure 4: Applications des puces à ADN dans l’analyse microbiologique ............................. 14

2
 INTRODUCTION

Les puces à ADN aussi connues sous le nom de puces à gène ou bio-puces sont des
outils d’analyse dont le principe repose sur l’interaction entre une sonde fixée sur un support et
une cible en solution. On définit comme sonde un fragment d’ADN synthétique représentant
un gène donné. Ce fragment d’ADN est fixé sur la surface de la puce. La cible quant à elle est
un ARNm à identifier et ou à quantifier qui sera marqué par fluorescence pour permettre
l’analyse. Les puces à ADN sont utilisées en biologie moléculaire et en médecine pour étudier
les variations génétiques et les interactions entre les gènes d’une cellule. Elles sont utilisées
dans une variété de domaine tels que la recherche génomique, le diagnostic médicale la
médecine personnalisée. La conception de ces puces est principalement liée à l’analyse et à
l’utilisation de l’information génétique pour des applications médicales, scientifiques et
clinique.

3
 I. GENERALITES SUR LES PUCES A ADN

1. Définition de la puce à ADN

Une puce à ADN est un ensemble de molécules d'ADN fixées en rangées ordonnées sur
une petite surface qui peut être du verre, du silicium ou du plastique.

2. Historique
Les premières puces à ADN sont apparues en 1993, mais leur concept date de 1987 (cité
dans Bellis et Casellas, 1997). Suite logique aux anciennes méthodes de northern blotting
(Alwine et al., 1977) et d’expression différentielle (Liang et Pardee, 1992), la technologie des
puces à ADN est basée sur le principe d’hybridation développé par Southern (1974). Ce
principe stipule que deux fragments d’acides nucléiques complémentaires peuvent s’associer et
se dissocier de façon réversible sous l’action de la chaleur et de la concentration saline du
milieu. Il s’agit simplement d’une miniaturisation du système classique de reverse dot blot
(Lennon et Lehrach, 1991) qui a vu le jour grâce à une technologie pluridisciplinaire intégrant
l’électronique (techniques de dépôt), la chimie (préparation des lames et greffes des sondes
oligonucléotidiques ou synthèse in situ), l’analyse d’images (acquisition des données) et
l’informatique (interprétation des données).

3. Types de puces à ADN

 Puces à ADNc.
 Microréseaux à base d'oligonucléotides.
i. Microréseaux basés sur l'ADNc:
- L'ADNc est utilisé pour la préparation des puces.
- Les ADNc sont amplifiés par PCR.
- Il s'agit d'une technique à haut débit.
- Il s'agit d'une technique d'analyse de l'expression de l'ARN hautement parallèle qui permet
une analyse quantitative des ARN transcrits à partir de gènes connus et inconnus.
ii. Microréseaux basés sur des oligonucléotides :
- Dans ce type de biopuces, les sondes repérées contiennent de courtes séquences synthétisées
chimiquement, de 20 à 25 mers/gène.
- La longueur réduite des sondes permet de limiter les erreurs lors de la synthèse des sondes
et d'interroger de petites régions génomiques, ainsi que des polymorphismes.
- Bien qu'elles soient plus faciles à produire que les sondes d'ADNdb, les sondes
oligonucléotidiques doivent être soigneusement conçues pour que toutes les sondes aient

4
 des températures de fusion similaires (à 50°C près) et pour éliminer les séquences
palindromiques.
- La fixation de la sonde sur les lames de verre se fait par liaison covalente, car
l'immobilisation électrostatique et la réticulation peuvent entraîner une perte importante de
sondes lors des étapes de lavage en raison de leur petite taille.Le couplage des sondes à la
surface des microréseaux se fait par l'intermédiaire des extrémités 5′ à 3′ modifiées sur les
lames revêtues qui fournissent des groupes fonctionnels (époxy ou aldéhyde).

5
 II. PRINCIPE DES PUCES A ADN

L’idée conceptuelle de la puce à ADN est très simple. Il s’agit de greffer sur une surface
de quelques centimètres carrés des fragments synthétiques d’ADN (les sondes) espacés de
quelques micromètres et représentatifs de chacun des gènes étudiés (Ramsay, 1998 ; Rockett et
Dix, 2000). Ce microdispositif est ensuite mis au contact des acides nucléiques à analyser, au
cours de l’étape d’hybridation. Ces acides nucléiques, appelés cibles, correspondent aux ARNm
ou aux ADNc qui ont été préalablement couplés à un marqueur fluorescent ou radioactif. Ce
contact entre cibles et sondes conduit à la formation d’hybrides qualifiés par leurs coordonnées,
et quantifiés grâce à la lecture des signaux radioactifs ou fluorescents.

Figure 1: Principe de mise en œuvre des puces d'ADN

6
 III. SELECTION DES SEQUENCES D'ADN POUR LA
CONCEPTION DE PUCE

Les critères de sélection des séquences d'ADN dépendent du but de la puce. En général,
les séquences d'ADN sélectionnées doivent être pertinentes pour le sujet de recherche et
doivent être spécifiques à l'organisme ou au gène étudié. Les critères de sélection peuvent
également inclure :

 La longueur des séquences d'ADN,

 Leur stabilité et leur spécificité.

Selon la technologie de microarray : Cette technologie utilise des sondes d'ADN pour détecter
la présence ou l'absence de séquences d'ADN spécifiques dans un échantillon ; La sélectionner
des séquences d'ADN pour cette technologie, on peut utiliser des outils bioinformatiques pour
identifier des séquences d'ADN spécifiques à l'organisme ou au gène étudié. On peut également
utiliser des séquences d'ADN connues pour être associées à des maladies ou à des traits
spécifiques. Les séquences d'ADN sélectionnées doivent être suffisamment longues et
spécifiques pour permettre une détection précise.

Selon la technologie PCR en temps réel : La réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
est déjà considérée comme un outil valable pour les études d’épidémiologie moléculaire, la
détection d’agents pathogènes émergents et la mise en évidence de résistances aux antibiotique
; les séquences d'ADN sélectionnées doivent être spécifiques à l'organisme ou au gène étudié
et doivent être suffisamment longues pour permettre une amplification spécifique. Les
séquences d'ADN doivent également être choisies en fonction de leur taux de GC, de leur
stabilité et de leur spécificité.

Selon la Méthode Sanger : les séquences d'ADN sélectionnées doivent être suffisamment
longues et spécifiques pour permettre une lecture précise. Les critères de sélection peuvent
également inclure la présence de polymorphismes, les régions codantes ou non codantes, la
localisation chromosomique, le nombre de copies.

7
 IV. CONCEPTION DE LA PUCE D'ADN

Le principe à la base des puces à ADN repose sur l’hybridation. Quatre étapes sont à
distinguer :

1. Conception de la puce

La puce est constituée d’une surface solide, généralement du verre, recouverte de

polylysines, molécules capables de fixer des fragments d’ADN (sondes). Chaque sonde
correspond à une séquence d’ADN spécifique d’un gène donné et caractéristique d’une espèce
recherchée. Les copies d’une même sonde sont déposées sous forme de « spot » via des
interactions électrostatiques à des emplacements précis sur la puce. Les sondes sont ensuite
dénaturées afin que leurs fragments d’ADN se retrouvent sous forme simple brin et soient par
la suite en mesure de capter un brin complémentaire (cible) présent dans l’échantillon à
analyser. Les molécules de polylysines en périphérie des spots, n’ayant pas reçu de sondes lors
de cette étape de fabrication, sont bloquées lors de l’analyse de l’échantillon afin qu’elles ne
captent pas de cible et qu’elles ne faussent pas la lecture du résultat.

2. Préparation de la cible

Les ARN extraits de l’échantillon à analyser sont transformés en ADNc par transcription
inverse. L’ADNc ainsi formé est marqué par un fluorochrome en vue de sa révélation une fois
fixé à une sonde de la puce.

3. Hybridation

Les ADNc marqués sont placés sur la puce qui est mise à incuber à 60°C pendant une nuit.
Dans ces conditions, les brins d’ADNc simple brin constituant les cibles et marqués au
fluorochrome sont en mesure de s’apparier avec leurs sondes complémentaires présentes sur la
puce et de former de l’ADN double brin.

4. Lecture

Les spots sont passés sous un laser et la fluorescence émise est visualisée via un photo-
multiplicateur (PMT) couplé à un microscope confocal. Cet appareil fournit une image dont le
niveau de gris représente l’intensité de la fluorescence lue. En fonction du ou des spots
présentant une fluorescence, il est possible de déterminer quels sont les micro-organismes
présents.

8
Figure 2: Conception de la puce

9
 V. ARRANGEMENT DES SONDES SUR LA PUCE.

Les puces à ADN peuvent être conçues selon différentes méthodes d'arrangement des
sondes, tels que l'utilisation de matrices ou de grilles. Les matrices sont des puces à ADN où
les sondes sont disposées de manière linéaire, tandis que les grilles sont des puces à ADN où
les sondes sont disposées selon une grille régulière. Les grilles peuvent être plus compactes que
les matrices, ce qui permet d'analyser plus d'échantillons en même temps. Cependant, les
matrices peuvent être plus flexibles en termes de disposition des sondes, ce qui permet une
analyse plus personnalisée.

La densité des sondes sur une puce à ADN peut avoir un impact sur la précision et la
sensibilité des mesures effectuées. Une densité plus élevée peut permettre d'analyser plus
d'échantillons en même temps, mais peut également entraîner des erreurs de mesure et une
moins grande fiabilité des résultats. En ce qui concerne la disposition spirale, elle peut être
utilisée pour augmenter la densité des sondes et permettre une analyse plus précise de l'ADN.
Cependant, elle peut également rendre la puce plus complexe et plus difficile à utiliser. Il est
donc important de prendre en compte à la fois la densité des sondes et la disposition de la puce
lors de la conception d'une puce à ADN.

Les puces à ADN sont des multi capteurs permettant de caractériser et quantifier un
acide nucléique dans un échantillon. Elles apportent une solution innovante au problème ancien
de la détection, de l’identification et du typage de bactéries dans un échantillon. Elles permettent
la caractérisation génomique rapide de bactéries pathogènes et facilitent les études
épidémiologiques, par exemple pour le contrôle des maladies nosocomiales ou la surveillance
du bioterrorisme.

10
 VI. ETAPES D’UNE EXPERIENCE DE BIOPUCE

Lors d'une expérience de biopuce ADN visant à comparer l'expression des gènes entre
deux conditions (par exemple: cellule saine versus cellule malade), les ARN totaux des deux
populations de cellules sont extraits et marqués chacun avec un fluorochrome différent. Les
deux échantillons sont alors déposés simultanément sur la biopuce, on parle d'hybridation
compétitive. Pour un gène donné, si le nombre de molécules d'ADNc correspondant à ce gène
est plus important dans une condition que dans l'autre, l'hybridation entre ces ADNc et les
sondes associées sera favorisée. Ainsi, après avoir scanné la biopuce aux deux longueurs des
deux fluorochromes utilisés, il est possible de comparer l'intensité du signal vert et celle du
signal rouge et donc de savoir, pour chaque gène étudié, dans quelle condition il est le plus
exprimé.

Figure 3: Etapes d'une expérience de biopuces

11
 VII. APPLICATION DE LA PUCE A ADN
1) Domaine médical
 Diagnostiquer des maladies selon le profil d'expression du patient, étudier la
différence d'expression des gènes de cellules cancéreuses par rapport à des cellules
saines.
 Dans le domaine pharmaceutique, biotechnologique et cosmétologique, les puces à
ADN servent
essentiellement aux criblages moléculaires et cellulaires dans le but de découvrir par
exemple de nouveaux médicaments.
 L'utilisation des puces à ADN connaît un essor croissant notamment dans le domaine
de la cancérologie pour le typage tumoral d'après leur profil génétique. L'utilisation
des puces à ADN comme outil de diagnostic présente l'avantage de faire appel à de
nombreux marqueurs : plusieurs milliers de gènes peuvent être criblés simultanément
pour fournir une signature du type cellulaire étudié. Si l'on considère que chaque type
de tumeur présente une signature génétique unique, ce système permet virtuellement
de distinguer et classer tous les types de tumeurs.
 Les puces à ADN permettent donc de comparer l'expression des gènes de deux types
cellulaires différents, de faire de l'étude des gènes exprimés sur un grand nombre de
patients pour observer l'effet d'un médicament (anti-cancéreux par exemple), de
regarder
l'effet d'un traitement sur l'expression des gènes, de comparer tissus sains contre tissus
malades, traités contre non-traités

2) En Toxicogénomique
C’est l’étude génétique de l'influence des facteurs environnementaux : les cellules sont
soumises à un stress par une irradiation, un polluant ou un médicament, dont la nocivité est
analysé.

3) En Agronomie
Analyser des traits agronomiques de sélection

4) En Environnement
Les puces d’AND permet d’améliorer la traçabilité et la surveillance d’OGM (les sondes
correspondront à différentes séquences introduites dans les plantes OGM), de microorganisme
(analyses bactériennes d'eau potable), de pathogènes (détection d'agents infectieux dans l'air ou
dans l'eau), de toxines ou de pesticides lors du contrôle qualité des aliments.

12
 5) En microbiologie
Actuellement, l’utilisation la plus courante des puces à ADN concerne la quantification des
ARN messagers d’un échantillon (transcriptome) afin de comparer les profils de transcription
de deux échantillons obtenus dans des conditions de croissance différentes. Dans le cadre de
l’identification bactérienne et du typage, leur utilisation est différente : ces puces permettent la
détection d’une séquence d’ADN dans un mélange, d’identifier un polymorphisme de séquence
(SNP) et de re-séquencer un fragment d’ADN).
Les puces à ADN comme outils de détection

Des puces à ADN sont utilisées pour détecter un produit de PCR et remplacent ainsi la
migration sur gel en validant la spécificité de l’amplification par sa complémentarité avec la
sonde. Pour l’analyse d’un échantillon simple, cette procédure est peu compétitive par rapport
à la PCR en temps réel ou à l’électrophorèse capillaire. En revanche, dans le cas d’un
échantillon complexe, les puces à ADN permettent l’analyse simultanée d’un grand nombre de
fragments. Des puces permettant d’identifier les bactéries présentes dans un échantillon sur la
base de l’analyse des. Les applications peuvent êtres
a. Analyse d’une population bactérienne mixte.
Après extraction de l’ADN, les régions codant pour l’ARN ribosomique 16S sont
amplifiées pour toutes les bactéries de l’échantillon en utilisant des amorces universelles
correspondant à des régions conservées dans toutes les espèces. La puce porte des
oligonucléotides de séquence spécifique de chaque espèce. Après hybridation, la quantification
du signal permet de détecter la présence de bactéries des différentes espèces représentées sur la
puce et d’évaluer leurs quantités relatives.

b. Puce Affymetrix de re-séquençage

Ces puces portent plusieurs centaines de milliers d’oligonucléotides synthétisés in situ
par une technique de photolithographie. Pour chaque base, quatre oligonucléotides sont
synthétisés d’après une séquence de référence avec à la position centrale l’une des quatre bases,
A, C, G ou T. La comparaison des signaux de fluorescence pour ces quatre oligonucléotides
permet de déterminer la séquence à cette position.

13
 c. Détection de régions chromosomiques spécifiques d’un isolat.
L’ADN de la souche à analyser et un ADN de référence sont marqués par des
fluorophores ayant des propriétés spectrales différentes. La puce à ADN est hybridée avec un
mélange des deux ADN marqués. Après analyse aux deux longueurs d’onde d’émission de
fluorescence, les sondes absentes de la souche analysée n’émettront que pour la longueur d’onde
du fluorophore de l’ADN de référence.

Figure 4: Applications des puces à ADN dans l’analyse microbiologique

14
VIII. AVANTAGES, LIMITATION ET PERSPECTIVE DE LA
CONCEPTION D'UNE PUCE D'ADN.
1- Avantages

Les avantages de puces sont:

 la très grande spécificité des sondes et le gain de temps. En effet, des dizaines de milliers
de sondes peuvent être fixées sur une même puce. Cela permet de tester différentes
cultures cellulaires sur une même lame et de faire des réplicats permettant ainsi, en une
seule expérience qui dure environ 2 jours, d'avoir une estimation sur l'expression de plus
de 30000 gènes simultanément. Etude simultanée des profils d'expression de plusieurs
millier de gènes.
 Les données sont cumulables.
 La mesure de l'expression de gènes par puce à ADN s'applique à de nombreux domaines
de la biologie et de la médecine comme l'étude de traitements, de maladies ou de stades
de développement.
 Les groupes de gènes affichent des comportements identiques dans une situation
biologique donné robuste car couramment utilisée
2- Limitation techniques et coût associés

Les puces à ADN, également appelées microarray, sont utilisées pour analyser les
expressions génétiques et les variations génétiques dans les échantillons d'ADN. Les limitations
techniques associées à l'utilisation de puces à ADN comprennent :

 Des erreurs de mesure et des problèmes de fiabilité, ainsi que des limitations dans la
quantité d'ADN qui peut être analysée en même temps.
 En ce qui concerne les coûts, les puces à ADN peuvent être assez coûteuses, en fonction
de la complexité de l'analyse et de la quantité d'ADN à analyser. Cependant, les coûts
ont considérablement diminué ces dernières années, rendant cette technologie plus
accessible pour les laboratoires de recherche.
 La technique est assez lourde à mettre en place
 L'équipement de départ est d'un coût relativement élevé.
 Le grand nombre de résultats obtenu très rapidement nécessite un traitement
informatique et statistique non négligeable.
 analyse parallèle de l'expression différentielle de plusieurs gènes Un inconvénient
majeur: banques d'ADNc incomplètes, des gènes peuvent manqués sur les puces car: -

15
 soit ils n'ont pas pu être conservés dans les banques d'ADNc ou d'EST soit le génome
modèle qui a servi à l'élaboration de la banque ne possédait pas certains gènes
spécifiques appartenant à d'autres génotypes. ex: etude du génome d'un champignon
pathogène: la souche servant à l'élaboration de la banque ne possède pas tous les gènes
des différentes souches sauvages ou vice versa.
3- Avancées technologiques récentes et améliorations potentielles

Il y a eu de nombreuses avancées technologiques récentes dans de nombreux domaines,

tels que :

 L’intelligence artificielle,
 La biotechnologie,
 La médecine et les énergies renouvelables.

Exemple :

En biotechnologie, de nouvelles techniques de modification génétique, telles que

CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Shorts Palindromic Repeats) ou répétition
palindromiques, ont été développées pour améliorer la précision et l'efficacité de la
modification de l'ADN.

En médecine, de nouvelles thérapies géniques ont été développées pour traiter des
maladies génétiques rares, telles que la thérapie génique pour les patients atteints de déficit
immunitaire combiné sévère.

En énergie, de nouvelles technologies d'énergie renouvelable, telles que les panneaux

solaires à haut rendement, ont été développées pour réduire la dépendance aux combustibles
fossiles. Ces avancées technologiques ont le potentiel d'améliorer considérablement notre
qualité de vie et de résoudre certains des plus grands défis auxquels nous sommes confrontés
en tant que société.

16
 CONCLUSION

Le concept de puce à ADN repose sur une technologie multidisciplinaire intégrant la

biologie, la nanotechnologie, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et la
bioinformatique. Grâce à cet outil, il est possible de mesurer le niveau d'expression de plusieurs
milliers de gènes simultanément, de réaliser un saut quantique dans l’analyse biologique. Il est
maintenant possible d’analyser l’expression de milliers de gènes en parallèle et à haut débit.
Des développements similaires commencent à apparaître pour l’analyse massivement parallèle
des protéines ou d’autres composantes cellulaires.on peut également noter que Cette révolution
technologique, ce changement d’échelle de la recherche biologique, va de pair avec une
utilisation croissante de la robotique et de l’informatique. les applications (e.g. détermination
des familles de gènes co-régulés, recherche de systèmes de régulation,...) sont en plein essor
dans un grand nombre de domaines comme la pharmacologie, la médecine ou l'environnement.

17
 REFERENCES

1. Koch R. Die Aetiologie der Milzbrand-Krankheit, begründet auf die

Entwicklungsgeschichte des Bacillus anthracis. Beiträge zur Biologie der Pflanzen 1876; 1:
277-308.

2. Struelens M. Molecular typing: a key tool for the surveillance and control of nosocomial
infection. Curr Opin Infect Dis 2002; 15: 383-5.

3. Raoult D, Fournier PE, Drancourt M. What does the future hold for clinical microbiology?
Nat Rev Microbiol 2004; 2: 151-9.

4. Fleischmann RD, Adams MD, White O, et al. Whole-genome random sequencing and
assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 1995; 269: 496-512.

5. Lan R, Reeves PR. Intraspecies variation in bacterial genomes: the need for a species genome
concept. Trends Microbiol 2000; 8: 396-401.

6. Stackebrandt E, Goebel BM. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S
rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int J Syst Bacteriol
1994; 44: 846-9.

7. Van Belkum A. High-throughput epidemiologic typing in clinical microbiology. Clin

Microbiol Infect 2003; 9: 86-100.

8. https://www.em-consulte.com/article/131004/la-pcr-en-temps-reel%C2%A0-principe-et-
application-en-i

9. https://fr.m.wikipedia.org/wiki/Puce_%C3%A0_ADN#Utilisation_et_applications

10. https://microbiologynote.com/fr/dna-microarray/

18
11. http://www.affymetrix.com/.

12. Office québécois de la langue française « puce à ADN », novembre (consulté le 10

decembre 2023).

13. DNA Microarray- Definition, Principle, Procedure, Types – Microbe Notes

http://microbenotes.com/dna-microarray/

19
 CORRECTION DU TD
QUESTIONNAIRES

1-Définition, rôle et importance du génie génétique.

2- Définitions de gène et transgène.

3- Définition de mutagène.

4- Définition de séquençage.

5- Les techniques du génie génétique.

6- Comment à partir d’absorbance pouvez-vous contrôle la pureté d’un ADN extrait ?

7- Quel est intérêt de connaitre les sites uniques de restriction dans un vecteur de clonage ?

8-Quelles sont les raisons pour qu’un vecteur lambda soit un vecteur de clonage ?

9-Importance du polylinker et lacZ .

10- Après avoir définir enzyme de restriction, précisez les nomenclatures et citer leur
différentes types en précisant celui qui est valorisée en génie génétique.

11- Quelles sont les caractéristiques et différentes parties ou composantes d’un plasmide.

12-Quelles différentes faites-vous entre plasmide de première génération et seconde

génération.

13-Criteres de classification des vecteurs de clonage

14- Quelle différence faites-vous entre une banque génomique et une banque ADN
complémentaire.

15- A quoi consiste une construction dans une banque génomique.

16- Avantages des banques génomique.

17- Différence entre transformation et infection.

18. Différence entre ARNm dans le noyau et ARNm dans le cytoplasme.

19- Eléments nécessaires pour la réalisation de la PCR.

20- Citer 8 techniques d’analyses de ADN cloné et pour chaque technique donner son intérêt.

21- Citer les applications du génie génétique dans 4 domaines de votre choix.

20
22- Donner les types de banques en génie génétique et donnez-leur rôle.

23- Citer quelques exemples de techniques de l’étude du polymorphisme de ADN.

24- Differentes éléments effectuer lors d’une étude de ADN clone.

25- Citer 10 outils du génie génétique.

26- Citer les différentes étapes de Southem blot.

27- Avantages et importance du southem blot.

28- Etapes, intérêt et application de la PCR.

29- Intérêt de la transgénèse.

30- Quelles sont les risques qui peuvent être lié à la transgénèse.

31- Donnez une espèce procaryote et une espèce eucaryote.

32- Comment le génie génétique peut impacte sur le réchauffement climatique.

REPONSES

1-Définition, rôle et importance du génie génétique.

-Définition

Génie Génétique :est ensembles des méthodes et des techniques de biologie moléculaire
développées durant ces dernières décennies, pour séquencer, « recombiner », transférer et
analyser les produits de l’expression du matériel génétique des diverses espèces vivantes .

-Rôle

Le Génie Génétique a pour rôle de permet d’identifier un gène spécifique parmi les 30.000
gènes environ que compte l’être humain, de l’amplifier afin qu’il soit plus facile d’accès, de le
découper et de l’isoler ensuite des autres molécules d’ADN .

-Importance

Le génie génétique permet :

• d’identifier et d’isoler,

• de modifier et de transférer,
21
• de cloner et d’amplifier,

• de contrôler l’expression d’un gène ou d’un transgène dans le matériel biologique.

2- Définitions de gène et transgène.

-Gene : séquence d’ADN capable de code pour une protéine.

-Transgène : séquence isole d’un gène, transféré d’un organisme a un autre, lors de la mise
en œuvre de la transgénèse .

3- Définition de mutagène.

Mutagène : gène qui a été modifier pour produire une protéine modifier ou recombinante.

4- Définition de séquençage.

Séquençage est une technique qui permet de déterminer la succession des bases sur ensemble
du génome .

5- Les techniques du génie génétique.

- Technique d extraction et précipitation de l’ADN des eucaryotes et des procaryotes

-Technique contrôle de la pureté de l'ADN extrait

6- Comment à partir d’absorbance pouvez-vous contrôle la pureté d’un ADN extrait ?

Pour vérifier la pureté de l’ADN extrait à partir d’absorbance nous devons :

- calculer le rapport entre absorbance 260 et 280

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 260
𝑅=
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 280

NB : Absorbance en Nanomètre ( nm)

22
-ensuite vérifier que le rapport (R) appartient a lune des fourchettes suivante :

 Si R < 1,8 : il est contaminé par les protéine

 Si R > 2 : il est contaminé par ARN
 Si 1,8 < R < 2 : alors l’ADN est pure

7- Quel est intérêt de connaitre les sites uniques de restriction dans un vecteur de clonage ?

Intérêt de connaitre les sites uniques de restriction dans un vecteur de clonage est :

- Facilité identification : les sites unique de restrictions permettent d’identifier

facilement les vecteurs de clonage .
- Flexibilité dans le choix des enzymes de restriction
- Contrôle de l’orientation de l’insert : les sites uniques de restriction dans un vecteur de
clonage permettent de contrôler l’orientation de l’insert ADN
- libération de insert par digestion enzymatique

8-Quelles sont les raisons pour qu’un vecteur lambda soit un vecteur de clonage ?

Les raisons pour qu’un vecteur lambda soit un vecteur de clonage sont

-capacité d’insertion élevée

-réplication du vecteur

-faciliter de manipulation en laboratoire

9-Importance du polylinker et lacZ.

-Lac Z’ permet de reconnaître parmi les colonies transformées celles qui hébergent un
plasmide recombinant.

-polylinker (Un ou plusieurs sites de restriction) qui permettent la linéarisation du plasmide

préalable à l'insertion de l'ADN exogène.

23
10- Après avoir définir enzyme de restriction, précisez les nomenclatures et citer leur
différentes types en précisant celui qui est valorisée en génie génétique.

-Définition

Enzymes de restriction sont des endonucléases qui coupent d’une manière définie et
reproductible l’ADN double-brin quelle que soit son origine

- Les nomenclatures de enzyme de restriction

En 1973, Smith et Nathan ont proposé une nomenclature qui est définitivement adoptée.
Chaque endonucléase a un nom de code déterminé selon les principes suivants :

• La première lettre en majuscule est l'initiale du genre de la bactérie

. • Les deux lettres suivantes, en minuscule désignent l'espèces de la bactérie.

• La 4ème lettre en majuscule, (pas toujours présente) désigne la souche bactérienne.

• Un chiffre romain distingue les enzymes d'une même souche dans l'ordre de leur découverte

- différentes types d’enzymes de restriction en précisant celui qui est valorisée en génie
génétique.

Il existe 3 types d'enzymes de restriction qui diffèrent les unes des autres, par la localisation de
leur activité catalytique.

Enzyme de type I : Ayant reconnu la séquence cible, l'enzyme se déplace sur l'DNA et coupe
de manière aléatoire mille à quatre mille bases plus loin (Système de boucles d’ADN ?).

Enzyme de type II : L'enzyme coupe l'ADN au niveau de la séquence reconnue.

Enzyme de type III : L'enzyme reconnaît la séquence cible et coupe la molécule de ADN 20 à
25 bases plus loin.

Seul les enzymes de type II sont les plus valorise en génie génétique parcequils coupent au
niveau du site de reconnaissance et qu’on peut contrôler parfaitement le site de coupure et donc
les extrémités engendrées.

11- Quelles sont les caractéristiques et différentes parties ou composantes d’un plasmide.

-Les caractéristiques

24
• Une origine de réplication de type relâché

• Un gène de résistance à un antibiotique auquel la souche hôte est sensible, ce qui permet la
sélection des cellules résistantes qui survivent sur un milieu contenant l’antibiotique en
question.

• Un second gène marqueur phénotypique (soit un deuxième gène de résistance à un second

antibiotique ou le gène Lac Z' ) qui permet de reconnaître parmi les colonies transformées celles
qui hébergent un plasmide recombinant.

• Un ou plusieurs sites de restriction (polylinker) qui permettent la linéarisation du plasmide

préalable à l'insertion de l'ADN exogène.

-Différentes parties ou composantes d’un plasmide.

-Origine de replication

-Marqueur de selection

-Site de clonage

-Promoteur

-terminateur

12-Quelles différentes faites-vous entre plasmide de première génération et seconde

génération.

Les plasmides de première génération: Ceux sont les plasmides rencontrés dans la nature(
ColE1, RSF2124, pSC101) et n'ont pas les propriétés requises pour les manipulations
génétiques. Alors que Les plasmides de seconde génération: ceux sont les plasmides de la
famille pBR. (pBR312 à 328) obtenus par construction et pouvant etre utilise en genie genetique

13-Criteres de classification des vecteurs de clonage

-Origine ( viral , champignons…)

-La capacite ou la taille du fragment pouvant etre incomporer

25
14- Quelle différence faites-vous entre une banque génomique et une banque ADN
complémentaire.

Une banque génomique est ensemble de clone contenant divers fragments ADN .Alors
que ADN complémentaire est la collection des clones representant lensemble des ARNm
present a un moment donne dans un tissu ou dans un organe donne . et la banque genomique
est plus riche quune banque ADN complementaire

15- A quoi consiste une construction dans une banque génomique.

Elle consiste a fragmenter ADN tout entier dune cellule et a introduire chaque fragment
dans un vecteur puis dans une cellule approprier .

16- Avantages des banques génomique.

Les banques génomiques permettent de connaître:

- Les régions non transcrites des exons

- Les séquences de régulation

- Les gènes silencieux

- Les introns

17- Différence entre transformation et infection.

Une transformation est introduction du plasmide recombinant dans une cellule

bactérienne. Alors qu’une infection est introduction des phages recombinant dans un
organisme.

18. Différence entre ARNm dans le noyau et ARNm dans le cytoplasme.

ARNm dans le noyau nas pas de queue poly A contrairement à ARNm dans le
cytoplasme qui possède une queue poly A et a sa sortie elle vas subir plusieurs étapes post
transcriptionnelle .

26
19- Eléments nécessaires pour la réalisation de la PCR.

• l’ADN à amplifier

• 2 amorces : sens et antisens

• tampon de réaction (Buffer)

• MgCl2

• dNTP

• Taq polymérase

• L’appareil thermocycleur pour PCR

• H2O bidistillée et stérile

20-Citer 8 techniques d’analyses de ADN cloné et pour chaque technique donner son intérêt.

- Le criblage par des oligonucléotides de synthèse

Le principe consiste à utiliser, dans un criblage classique, une sonde oligonucléotidique

marquée synthétisée à partir des données de séquençage d’une fraction de la protéine

- Le criblage par des anticorps

Cette technique ne peut se réaliser que sur une banque d’expression puisqu’elle vise à révéler
le produit d’expression d’un gène cloné.

- Electrophorèse

C’est la méthode d’analyse de l’ADN imaginée par Southern en 1975 pour visualiser les gènes
ou toute séquence d’un ADN génomique, par une hybridation avec une sonde, marquée et
spécifique, avec des fragments de restriction d’ADN, préalablement séparés par électrophorèse,
dénaturés et transférés sur une membrane .

- Le séquençage

Il permet la détermination de la séquence nucléotidique de l’ADN isolé pour définir les introns,
les exons et les zones de régulation de l’ADN inséré dans le vecteur

- Analyse du génome et de ses modifications: Le Southern blot

27
 Le Southern blot permet de visualiser les gènes ou toute séquence d’un ADN
génomique, par une hybridation avec une sonde, marquée et spécifique, avec des fragments de
restriction d’ADN, préalablement séparés par électrophorèse, dénaturés et transférés sur une
membrane.

-PCR (Polymerase Chain Reaction)

La PCR (Polymerase Chain Reaction), la réaction de polymérisation en chaîne consiste

à amplifier sélectivement une séquence particulière d’ADN par l’action répétée d’une ADN
polymérase

- Puces à ADN (microarray) ou ADN chips

La technologie des puces ADN permet l’analyse de l’expression de milliers de gènes

simultanément

- Étude des polymorphismes : RFLP, VNTR, SSTR, SSCP

Le rôle des études des polymorphismes est de comprendre comment les variations
génétiques au sein d’une population peuvent influence différents aspects de la sante et la
maladie

21- Citer les applications du génie génétique dans 4 domaines de votre choix.

En biotechnologie : le génie génétique permet de faire produire par des micro-organismes

recombinants des protéines eucaryotes comme des hormones, des vaccins, des anticorps
monoclonaux et il offre des perspectives nouvelles dans l’industrie agroalimentaire, dans
l’amélioration génétique des espèces animales et végétales.

En médecine : le but du génie génétique est la prédiction, le diagnostic des maladies

héréditaires et leur soin à travers la thérapie génique et la pharmacogénétique.

En agriculture : le genie genetique , y compris l edition genomique , peut procurer de

nombreux avantages comme une selection plus rapide et precise , un meilleur rendement des
cultures , la mise au point daliments plus nutritifs et une dimunition du recours aux herbicides
et pesticides .

28
En environnement : le genie genetique peut etre utilise pour aider a resoudre des problemes
environnementaux. Par exemple, des microorganisme genetiquement modifies peuvent etre
utilises pour degrader les polluants dans environnements

22- Donner les types de banques en génie génétique et donnez-leur rôle.

-Banque génomique

Elles permettent de conserver et d’étudier l’ensemble des séquences génomique d’un

organisme, ce qui est essentiel pour comprendre sa structure génétique , ses variations et ses
fonctions

-banque ADNc (ADN complémentaire)

Elles permettent d’étudier les gènes exprimes dans un tissu ou une cellule spécifique, ce qui
est important pour comprendre les processus biologique , le développement , les maladies .

23-Citer quelques exemples de techniques de l’étude du polymorphisme de ADN.

-polymorphisme de longueur de fragment de restriction

-microsatellite

- polymorphisme de longueur de fragment a modifier

24-Differentes éléments effectuer lors d’une étude de ADN clone.

- Le criblage par des oligonucléotides de synthèse

- Le criblage par des anticorps

- Electrophorèse

- Le séquençage

- Analyse du génome et de ses modifications: Le Southern blot

- PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Puces à ADN (microarray) ou ADN chips

29
- Étude des polymorphismes : RFLP, VNTR, SSTR, SSCP

25-Citer 10 outils du génie génétique.

-PCR (Polymérase Chain Réaction)

-séquençage de ADN
- vecteurs de clonage
-enzymes de restriction
-électrophorèse
-transformation bactérienne
-Southern blot
-Northern blot
-western blot
-clonage moléculaire

26- Citer les différentes étapes de Southem blot.

• L’ADN génomique est d’abord fragmenté par une enzyme de restriction appropriée

• Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose,

• L’ADN est dénaturé in situ par une solution de soude,

• L’ADN dénaturé (simple brin) est transféré par capillarité sur un support solide (filtre de
nitrocellulose ou nylon). Les membranes de nylon sont les plus utilisées car par un traitement
au UV (254 nm), on forme des liaisons covalentes entre le DNA et le nylon de sorte que le
support peut être utilisé plusieurs fois avec d’autres sondes.

• Le support solide est hybridé avec une sonde monobrin marquée à faible stringence puis
lavé

• Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par la technique de

l’autoradiographie

27- Avantages et importance du southem blot.

30
Avantages

• L’établissement des cartes de restriction

• Les mutations par délétions

• La détection de mutation ponctuelle

• La détection des recombinaisons

Importance

le southem blot est important pour visualiser les genes ou toutes sequences dun ADN
genomique

28- Etapes, intérêt et application de la PCR.

Étapes :

Pour faire la PCR, on utilise l’ADN polymérase d’une bactérie : Thermus acquaticus qui
vit à 75°C dans les eaux thermales. Cette polymérase (Taq polymérase) est toujours active
à 94-96°C. La réaction de la PCR comporte trois étapes qui constituent un cycle au cours
duquel la quantité d’ADN à amplifier est doublée.

La dénaturation de l’ADN à amplifier à 94°C,

L’hybridation avec une amorce, appariement primer, annealing à 64°C

extension de l’amorce à 70 – 72°C par la Taq polymérase.

L’amplification : qui est effectuée par la répétition des cycles qui assure une
duplication exponentielle de chaque brin.

Intérêt :

La PCR permet de mettre en œuvre les techniques habituelles de génie génétique même si
l’on ne dispose au départ que d’une faible quantité d’ADN.

Application

Le clonage et le séquençage génétique

Le diagnostic de maladies génétiques

31
 La détection de mutations

Le dosage protéique

La détection des OGM

L’identification d’individus (science médico-légale)

La détermination de filiation

La mutagenèse dirigée (à l’aide d’amorces mutées)

Le marquage de l’ADN (notamment pour la recherche fondamentale)

29-Intéret de la transgénèse.

Sur le plan de la biotechnologie

- Au plan zootechnique : l’un des intérêts majeurs de la transgenèse est l’amélioration des
caractères phénotypiques des animaux de rente : amélioration de la croissance des animaux,
comme le porc, le saumon, l’acquisition de résistances aux maladies causes de mortalité dans
les élevages de lapins, de truites, de carpes

- Au niveau des plantes : La création de plantes résistantes aux insectes, au stress hydrique et
pour la production de protéines utiles comme les anticorps : (maïs résistant aux insectes,
tomates transgéniques à mûrissement lent, bananes vaccinantes….)

Sur le plan médical

Production de protéines d’intérêt pharmaceutique : Certaines protéines trop complexes

(glycosylées, carboxyméthylées…) ne peuvent être synthétisées complètement par les bactéries
in vitro. Il faut donc chercher à en obtenir par un animal transgénique (dans le lait, le sang, les
urines).

Xéno transplantation : Face à l’insuffisance des organes humains disponibles pour les greffes,
la recherche d’organes animaux peut représenter une solution palliative

Modification de la composition du lait : Elle a pour but de mieux adapter le lait des ruminants
à la consommation humaine et d’améliorer sa transformation par l’industrie laitière.

32
30-Quelles sont les risques qui peuvent être lié à la transgénèse.

1. L’utilisation de l’hormone de croissance humaine chez les animaux perturbe leur croissance
et leur reproduction.

2. Les risques liés à la consommation des produits OGM comme les protéines de la vache folle
qui provoque des troubles chez l’homme. Les maïs transgéniques possèdent aussi des gènes de
résistance aux ampicillines. Ces transgènes peuvent donc s’intégrer dans les bactéries du tube
digestif humain et conférer des résistances bactériennes aux antibiotiques que nous utilisons
pour nos traitements.

3. Les risques liés à l’environnement : Ces risques sont liés à la dissémination des organismes
transgéniques. Des bactéries et des souris transgéniques qui s’échappent d’un laboratoire de
recherche ou d’un centre de production, les déchets des produits transgéniques déversés dans
la nature constituent de grands dangers qui guettent sans cesse notre écosystème.

31- Donnez une espèce procaryote et une espèce eucaryote.

 Une espèce procaryote : Escherichia coli

 Une espèce eucaryote : Saccharomyces cerevisiae

32-Comment le génie génétique peut impacte sur le réchauffement climatique.

Le génie génétique peut avoir un impact sur le réchauffement climatique de plusieurs

manières :
 Cultures résistantes aux conditions climatiques : Le génie génétique peut être utilisé pour
développer des cultures résistantes aux conditions climatiques changeantes, telles que la
sécheresse, les températures élevées ou les conditions de sol difficiles. Cela permettrait aux
agriculteurs de continuer à produire des récoltes malgré les effets du réchauffement
climatique, réduisant ainsi la pression sur les terres agricoles.
 Plantes à haute efficacité photosynthétique : La photosynthèse est un processus essentiel
pour éliminer le dioxyde de carbone de l'atmosphère. En modifiant génétiquement les
plantes pour les rendre plus efficaces dans leur capacité à capture le CO2 et à le convertir
en biomasse, on pourrait potentiellement augmenter la capacité des plantes à absorber le
carbone de l'atmosphère, aidant ainsi à réduire les niveaux de CO2.
 Biocarburants de deuxième génération : Le génie génétique peut être utilisé pour développer
des cultures destinées spécifiquement à la production de biocarburants. Ces biocarburants

33
 de deuxième génération peuvent utiliser des cultures non alimentaires, comme les algues ou
les celluloses, qui offrent un potentiel de rendement plus élevé et une empreinte carbone
plus faible que les biocarburants de première génération. Cela pourrait réduire la
dépendance aux combustibles fossiles et atténuer les émissions de gaz à effet de serre.
 Réduction de l'empreinte carbone de l'agriculture : Le génie génétique peut également être
utilisé pour développer des techniques agricoles plus durables et respectueuses de
l'environnement, comme la réduction de l'utilisation d'engrais et de pesticides. Cela peut
aider à réduire les émissions de gaz à effet de serre associées à l'agriculture intensive et à
préserver la qualité de l'air et de l'eau.

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