La technique de la cytométrie en flux :

Comment mesurer la quantité d'ADN dans une cellule?

Le cytomètre en flux est un appareil qui permet de compter précisément le nombre de cellules présentes
dans un échantillon (population de cellules mélangées dans un liquide) tout en mesurant, pour chaque
cellule, un ou plusieurs paramètres.

Les cellules sont marquées par une ou plusieurs substances fluorescentes qui se fixent spécifiquement sur
certaines de leurs molécules. (Par exemple sur l'ADN en cours de réplication...etc)

Dans le cytomètre, les cellules passent en « file indienne » devant un faisceau lumineux qui « excite » le
marqueur fluorescent. Les cellules sont alors comptées par un détecteur en fonction de leur réponse au
faisceau lumineux.

Plusieurs paramètres peuvent alors être mesurés et enregistrés en fonction des marqueurs fluorescents
qui ont été utilisés : taille de la cellule, fluorescence émise...
Cette analyse permet de faire un tri des cellules. Elle est répétée à intervalle régulier. (par exemple toutes
les heures)

L'analyse statistique des données cytométriques ainsi réalisées à des intervalles de temps réguliers permet
de suivre l'évolution des caractéristiques de la population de cellules étudiée (par exemple ladurée de son
cycle cellulaire, durée de la réplication...)

Le logiciel "Cytométrie" permet de présenter graphiquement les données relevées par le cytomètre.
Ces dernières peuvent être représentées sous la forme d’un graphe bidimensionnel où l’on peut choisir les
paramètres affichés en ordonnée (Y) et en abscisse (X).
Chaque point (Events) du "graphique" correspond à une cellule.

Application à l'étude du cycle cellulaire :

Déroulement de l’expérience :
1°) marquage de cellules de hamster chinois pendant 30 minutes en présence de bromodésoxyuridine
(BrdUrd)
2°) mise en culture
3°) au bout d'une heure : Prélèvement et marquage des cellules en présence d’iodure de propidium (PI)
puis analyse au cytomètre.
4°) remise en culture puis répétition étape 3 et 4 pendant 10 heures

Propriétés des marqueurs utilisés:

- Le BrdUrd est utilisé comme précurseur (c’est un analogue de la thymine) par les cellules lors de la
synthèse de l’ADN. Il permet donc de marquer les cellules en cours de réplication.
- Le PI est un marqueur se fixant à l’ADN. La quantité de PI fixé est proportionnelle à la quantité d’ADN
dans la cellule

Rem. Chaque fichier à charger dans le logiciel "cytométrie" correspond aux mesures réalisées à chaque
heure de prélèvement.
Par exemple : Le fichier n°6,correspond à des cellules prélevées 6 heures après mise en culture.
 Ci-dessus : Exemple de fichier affiché par le logiciel « cytomètre »
Ci-dessous : la même image légendée, titrée

Pour aller plus loin dans la définition et l exploitation de la cytométrie en flux, vous pouvez consulter ces liens :
http://jean-jacques.auclair.pagesperso-orange.fr/cycle%20cellulaire/principe.htm
http://acces.ens-lyon.fr/biotic/morpho/html/cycle.htm#mat