Cytogénétique moléculaire

Pr H. HARDIZI
UPR Biologie Histologie
Embryologie Cytogénétique
h.hardizi@um5r.ac.ma 1
 Classement des chromosomes
• Fonction de leur taille
• de leur index centromérique
• de la reconnaissance après marquage de chaque
chromosome :
o nombre et
o répartition des bandes spécifiques à chaque paire
chromosomique

=> Nomenclature internationale définit pour

chaque chromosome
des régions chromosomiques qui comportent
des bandes et
des sous-bandes
2
3
4
DETERMINATION D’UN POINT DE CASSURE SUR UN CHROMOSOME
 21 q 22.3
N°chromosome région: 1 - 4
bras bande
sous-bande 6
 21 q 22.3
N°chromosome région: 1 - 4
bras bande
sous-bande 7
 21 q 22.3
N°chromosome région: 1 - 4
bras bande
sous-bande 8
 21 q 22.3
N°chromosome région: 1 - 4
bras bande
sous-bande 9
 21 q 22.3
N°chromosome région: 1 - 4
bras bande
sous-bande 10
 21 q 22.3
N°chromosome région: 1 - 4
bras bande
sous-bande 11
12
13
14
15
 Limites du caryotype
• Difficulté d ’obtention de métaphases pathologiques
en raison du faible indice de prolifération du clone
malin (cancérologie)

• Nombre important de métaphases normales

résiduelles (maladie résiduelle)(cancérologie)
 Limites du caryotype

• Problèmes de résolution :

– Anomalies parfois non visibles, de taille inférieure au

seuil de résolution de la cytogénétique

– Mauvaise qualité des métaphases obtenues

18
exemple1 exemple 2

19
Exemple 3 Exemple 4

20
 Difficultés d’interprétation des caryotypes
2/ complexité des caryotypes
Multiples anomalies numériques et structurales, polyploïdie

21
Cytogénétique - définitions

Cytogénétique : étude morphologique du matériel génétique

se présentant sous forme de chromosomes (corps colorés) dans
les cellules eucaryotes
– conventionnelle
• étude morphologique des chromosomes (nombre et
structure - ADN condensé)

– moléculaire
• métaphasique : organisation des gènes / chromosomes
• interphasique (ADN décondensé, domaines
chromosomiques
22
 Les échelles du génome
• Génome haploïde : 3x109 pb
• chromosome 1: 2,5 X 108 pb
Cytogénétique
• chromosome X : 1,5x 108 pb
• chromosome 21 : 5x107 pb Cytogénétique
• une bande : 1 -2 x107 pb moléculaire
• une sous-bande : 1 à 5x106 pb
• un centimorgan : 1x106 pb Génétique

• YAC : 1x106 à 5x104 pb

• fragment cloné dans un cosmide : 5x104 pb

• gène moyen : 2x104 pb Génétique
• exon : 0,5 - 1 x103 pb moléculaire
• nucléotide : 1pb
ADN - les différentes échelles

GENES CHROMOSOMES GENOME

HUMAIN
Hybridation
in situ
CGH
Clonage Cytogénétique
M-FISH
conventionnelle
PCR Champ pulsé
Southern blot
Cartographie
Séquence génique

103 104 105 106 107 108 109

Complémentarité
Principes de la cytogénétique
moléculaire

25
26
Hybridation In situ
▪ Appariement homologue des bases de l’ADN
- Identification spécifique d’un locus donné

▪ Hybridation in situ : cartographie possible d’une séquence dans

le génome

▪ Sondes de petite taille

-meilleure sensibilité d’analyse

▪ Facile à utiliser

▪ Plusieurs fluorochromes disponibles

- Mélange de sondes différentes

▪ Amélioration de la spécificité et de la sensibilité

- Identification de n’importe quel locus, même une simple bande
- Identification d’anomalies « cryptiques »
27
28
Intérêt FISH : défaut de résolution de la cytogénétique
conventionnelle

Cytogénétique conventionnelle : Cytogénétique moléculaire :

22 apparemment normaux Délétion interstitielle 22q11.2
Syndrome de Di George - microdélétion

22qter vert (contrôle)

DGCR2-Tuple rouge
 Intérêt FISH :
caractérisation précise d ’un remaniement identifié en
cytogénétique conventionnelle

DXZ1 vert
Les différentes classes de sondes
Hybridation in situ fluorescente

Chromosome Bras Centromère Subtélomère Gènes

Peinture interphase interphase

A connaître
FISH - les différentes sondes
 Hybridation in situ fluorescente

FISH

Sonde locus spécifique: centromère, télomère, interstitielle. 33

Peinture chromosomique

34
35
Territoires chromosomiques

36
FISH interphasique: analyse possible de
cellules non en division

▪ Pas de culture: résultats plus rapides

▪ Comptage d’un grand nombre de cellules

- Mosaïques

▪ Analyse de cellules tumorales

- Culture difficile
- Coupes tissulaires

▪ Analyse des cellules germinales

- Spermatozoïdes, ovocytes
- Globules polaires

37
FISH interphasique : étude de
l’architecture du génome

Territoires chromosomiques

Mouvements chromatiniens

38
 FISH 24
couleurs
Marquage
combinatoire

• Position stable d’un chromosome au sein du noyau

• Voisins variables
– En fonction des types cellulaires
– Variable pour un même type cellulaire
– Association préférentielle avec hétérologues 39
40
41
42
43
3ème révolution: dans les années 90 -2000 :
CGH array

44
Évolution d’une technique ciblée locus
spécifique

45
 Vers une analyse pan génome: CGH array
(ACPA: analyse chromosomique sur puces à
ADN)

46
CGH-array
▪ Hybridation génomique comparative (CGH):
▪ Permet de détecter les variations du nombre de copies dans
l’ADN.
▪ Mélange équimolaire d’ADN témoin et d’ADN patient.

47
 CGH-array
Principe :
▪ Technique d’analyse des déséquilibres chromosomiques
▪ Détection d’anomalies quantitatives:
- de chromosomes entiers (gains / pertes)
- de régions chromosomiques (amplifications / délétions)

48
Principe de la CGH

▪ Hybridation sur un support avec effet de compétitivité permettant de

49
détecter les excès ou défaut d’ADN patient par rapport au témoin.
CGH-array
▪ Hybridation sur un support avec effet de compétitivité permettant
de détecter les excès ou défaut d’ADN patient par rapport au
témoin.

50
CGH-array

▪ Également appelée ACPA (analyse chromosomique par puce à

ADN.

▪ Utilise en même temps de nombreuses sondes spécifiques du

génome.

▪ Sondes pouvant représenter tout ou une partie du génome,

résolution variable en fonction du nombre et position des sondes.

▪ Obtention de spots couleur pour chaque sonde.

51
Une nouvelle façon d’analyser les
chromosomes

52
 CGH-array
• La détection du désordre est réalisée à l’aide d’un automate car
l’analyse du marquage est difficile à l’oeil nu.
• Chaque sonde est reliée à une position chromosomique.

53
CGH-array
• Les résultats sont compilés sur un caryogramme, faisant apparaitre
les sondes ayant reconnu leur cible (patient ou témoin) autour
d’une ligne de base.

54
CGH-array
• La ligne de base est déterminée selon le ratio de fluorescence de
chacun des ADN marqués.
• Pour un résultat normal, il y a à la fois des sondes témoins et patients
autour de la ligne de base.

55
CGH-array
Pour une délétion:
• les sondes rouges sont en défaut, au
profit des sondes vertes.
• Il y a alors selon l’algorithme utilisé un
décalage par rapport à la ligne de
base vers la gauche.

56
CGH-array

Pour une duplication:

• compétitivement les sondes
rouges sont en excès et il y a un
décalage vers la droite de la
ligne de base.

57
58
59
 Principe de l’ACPA

Pas de culture, pas de chromosome

Hybridation
ADN ADN Sur des oligonucléotides
témoin patient
1 copie /
2 copies

+ →
3 copies /
2 copies
 Principe de l’ACPA

Pas de culture, pas de chromosome

Hybridation
ADN ADN Sur des oligonucléotides
témoin patient
Log2 -1
1 copie /
2 copies

+ →
3 copies /
2 copies Log2 +0,58
Variations du nombre de copie
CNV
 Principe de l’ACPA
Sur le chromosome X : calcul différent

Garçon contre Garçon

Hybridation
ADN ADN Sur des oligonucléotides
témoin patient
Log2 -infini
0 copie /
1 copie

+ →
2 copies /
1 copie Log2 +1
Variations du nombre de copie
CNV
 Principe de l’ACPA
Sur le chromosome X : calcul différent

Garçon contre Fille

Hybridation
ADN ADN Sur des oligonucléotides
témoin patient
Log2 -infini
0 copie /
2 copies

+ →
2 copies /
2 copies Log2 0
Variations du nombre de copie
CNV
64
La prochaine révolution est en route

65
La prochaine révolution est en route

66
La prochaine révolution est en route

67
La prochaine révolution est en route

68
69
Quel devenir pour le caryotype à l’heure du
séquençage massivement parallèle?

70
Ce que l’on sait faire:
détecter les aneuploïdies

71
Ce que l’on sait à peu près faire:
détecter les CNV

72
FIN

73