Techniques de génétique et de

Biologie moléculaire en
Hématologie

Dr Thibaut OCKO
ORGANISATION DU GÉNOME
ORGANISATION DU GÉNOME
ANOMALIES CHROMOSOMIQUES
Démarche diagnostique

 Moelle
 Cytogénétique conventionnelle
 Cytogénétique moléculaire
 Génétique moléculaire et
biologie moléculaire ( ADN, ARN,
Épigénétique…)
Cytogénétique conventionnelle

 Culture cellulaire
 Marquage chromosomique
 Caryotype normal
 Anomalies chromosomiques
 CULTURE CELLULAIRE

Sang:
RPMI
PHA ou
phytohemmaglutinine
Penicilline-streptomycine
Glutamine
Serum de voeu foetal
Moelle:
RPMI
Penicilline-streptomycine
Glutamine
Serum de voeu foetal
CULTURE CELLULAIRE
CULTURE CELLULAIRE

colcémide Carnoy
KCl 0.075M
MARQUAGE CHROMOSOMIQUE

Marquage en bandes G

Trypsine CaCl2 H2O Giemsa

Marquage chromosomique en bande G, R, Q, T, C, NOR…

MARQUAGE CHROMOSOMIQUE
MARQUAGE CHROMOSOMIQUE
MARQUAGE CHROMOSOMIQUE
MARQUAGE CHROMOSOMIQUE
MARQUAGE CHROMOSOMIQUE
MARQUAGE CHROMOSOMIQUE
MARQUAGE CHROMOSOMIQUE
KARYOTYPE NORMAL

Bande G d’une MOELLE

 Phi

Science, 1960
Nowell and Hungerford

19
???????

20
KARYOTYPE ANORMAL
KARYOTYPE ANORMAL
KARYOTYPE ANORMAL
ANOMALIES CHROMOSOMIQUES

Marquage chromosomique en bande G, R, Q, T, C, NOR…

35
Cytogénétique moléculaire

FISH et dérives
Anomalies chromosomique
Applications FISH et dérives
FISH ET DÉRIVÉS
FISH ET DÉRIVÉS
FISH ET DÉRIVÉS
FISH ET DÉRIVÉS
FISH ET DÉRIVÉS
Anomalies chromosomiques
Anomalies chromosomiques
Translocations
Anomalies chromosomiques
Inversions
Anomalies chromosomiques
Duplications et insertions
Anomalies chromosomiques
Amplification
Applications de FISH et dérivés

 Diagnostic anténatal
- Indications: aneusomies, ATCD
d’avortement spontané
-Echographie: RCIU, LA,
malformation
- Dosage marqueurs sériques: AFP,
hCG
Chromosomes les plus concernés: 21, 13,
18, X et Y (95%)

Retard mental;
Dysmorphisme; Trisomie 18
Trisomie 21 Anomalies (Syndrome d'Edwards)
(syndrome de Down)
somatiques…

Trisomie 13
(Syndrome de Patau) Monosomie X
(Syndrome de Turner)
Applications de FISH et dérivés
Prélèvements

Liquide
Amniotique
(Amniocentèse)

Villosités
Choriales
(Choriocentèse)

Sang du
Cordon Méthodes invasives
(Cordocentèse) Pertes ou blessures fœtales de 0.5 à 2%
Diagnostic prénatal
Applications FISH: Two -Colour
 Cancers
FISH Analysis of Philadelphia Translocation

Normal Lymphocyte CML Positive

 FISH de la LMC

Bcr/Abl Bcr/Abl
42
 LYMPHOMES

LYMPHOMES NON
HODGKINIEN LAL3

48
Leucémies myéloides aigues

LAM3
LAM4eo

59
 Leucémies aigues lymphoblastique

AML1/ETO
21q22
Dans une LAL B
pédiatrique
Syndromes myélodysplasiques
Leucémie lymphoïde chronique
Myélome multiple
MBAND

mBand on Chromosome 1 Rearrangements

MBAND

mBAND Analysis of
8q24 amplification in
Osteosarcoma cell
lines
Avantages et inconvénients de la
FISH

Avantages
– Se élevée et Sp élevée
– cout abordable
– 1 à 2 jours
– visualisation (métaphase, interphase…)
– Nombreuses applications

Inconvénients
 métaphases: cellules vivantes
 microscope à fluorescence et fading des
fluorochromes 51
FISH À L’ÉCHELLE GÉNOMIQUE
 FISH À L’ÉCHELLE GÉNOMIQUE
M-FISH ET SKY

Caryotypes complexes avec

beaucoup de réarrangements
chromosomiques

M-FISH: multi-FISH

SKY: caryotype spectral

PREPARATION OF SOLID TUMOUR
METAPHASES AFTER 1-4 DAYS
OF CULTURE FOR SKY (SPECTRAL KARYOTYPING)

fix cells. Add 1-2 drops to

microscope slides.
Fragment viable tumor
Add colcemid to the
culture and incubate
for 2-4 hours at 37oC.

G-band-
capture images
Collect the cells
Resuspend in a Then do SKY hybridization
KCl hypotonic to and analysis
swell cells
“SKY” Analysis
Chr. 8 Aberrations in OS
MFISH

57
Comparative Genomic Hybridization:
CGH

32
CGH analysis of amplification
GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE ET
BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

ADN-ARN-PROTÉINE
 ADN

 Marquage sonde
NBT: 4-nitroblue tetrazolium chloride
radioactivité\

 Extraction d’ADN
phenol-chloroforme
SOUTHERN BLOT
POLYMERASE CHAIN REACTION PCR
Real time - POLYMERASE CHAIN
REACTION

 Quantitative – PCR
 Quantitative – Real Time PCR
 ARN

Extraction au Trizol
Reverse Transcriptase-PCR
Northern-Blot
Northern-Blot
LOH ou LOSS OF
HETEROZYGOSITY
LOH ou LOSS OF
HETEROZYGOSITY
GENOMIQUE
CGH- Array-CGH
Array-EXPRESSION
SEQUENÇAGE

73
AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS

Avantages
– Se élevée et Sp élevée
– cout abordable
– 1 à 2 jours
– visualisation (métaphase, interphase…)
– Nombreuses applications

Inconvénients
- métaphases: cellules vivantes
- microscope à fluorescence et fading des
fluorochromes 74
AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS
DE LA RT-PCR

Avantages
– Se élevée et Sp élevée
– cout abordable
– 1 à 2 jours
– visualisation (métaphase, interphase…)
– Nombreuses applications

Inconvénients
- métaphases: cellules vivantes
- microscope à fluorescence et fading des
fluorochromes 75