Rekik Hiba

II. Manipulation
MR1 BMC végétal
TP2 : Isolement des lymphocytes du sang

1. BUT :
Isolement et le comptage des lymphocytes du sang.

2. Principe :
La séparation en gradient de densité est basée sur les différences de densité existant entre
les lymphocytes et les autres cellules plus denses tels que les érythrocytes et les
polynucléaires.
Ce principe est appliqué pour isoler la majorité des lymphocytes du sang.
Ceci est fait par l’ajout d’un milieu Ficoll de haute densité.
3. Protocole :
1. Récupération du sang

2. Dilution au 1/3 dans du tampon PBS.

3. Déposition de 3ml de la suspension délicatement sur 1ml de Ficoll

4. Centrifugation à 2000 tours pendant 20 minutes

5. Récupération de l’anneau à l’aide d’une pipette pasteur.

6. Lavage dans un tampon PBS* (1000 tours pendant 10 minutes).

7. Numération des lymphocytes à l’aide de la cellule de Thoma.

C’est quoi un PBS ? Le milieu Ficoll ?

Le PBS (Phosphate Buffer Saline)
est une solution tampon
couramment utilisée en biologie. Ses
propriétés isotoniques et non-
toxiques permettent de maintenir les
cellules dans un état viable et sain
pendant de courtes périodes, en
Un milieu de centrifugation à gradient
de densité pour séparer des cellules
mononucléaires du sang périphérique,
de la moelle osseuse, et du sang de
cordon ombilical.
Les points d’attention :

Les paramètres pouvant altérer l’efficacité de l’isolement des cellules sont :

- Le dépôt du sang sur le Ficoll :

Celui-ci doit être le plus doux possible afin d’éviter les perturbations à L’interface
sang/Ficoll.
Une technique consiste, après avoir déposé le Ficoll dans le tube, à incliner celui-ci
quasiment à l’horizontale afin d’approcher le Ficoll du bord du tube puis d'amener
l'extrémité de la pipette contenant le sang au contact du Ficoll avant de déposer le sang
le plus doucement possible.
Le tube est progressivement et lentement relevé à la verticale durant ou après le dépôt
du sang.

- Le respect de la vitesse, de la durée et de la température de centrifugation :

L’utilisation d’une centrifugeuse calibrée et régulièrement contrôlée est essentielle

pour garantir le respect des paramètres de centrifugation.

- L’utilisation de Ficoll froid :

Le Ficoll peut être conservé à température ambiante tant que le flacon n’est pas
entamé mais doit être conservé à +4°C après ouverture, pour éviter tout risque de
contamination microbiologique.
Si le Ficoll est conservé à 4°C, il est indispensable de le ramener à température
ambiante avant utilisation.
En effet, le froid modifie sa densité, ce qui affecte la séparation des hématies.

-La récupération de l’anneau de CMN :

Mal réalisée, cette étape peut provoquer une perte d’échantillon.
Il est possible d’aspirer et d’éliminer une partie du plasma dans une première étape
afin de faciliter la récupération des cellules dans une seconde étape et maximiser la
quantité de cellules obtenues.
 - Un lavage insuffisant des cellules mononucléées :
Un contact prolongé du Ficoll avec les cellules s’avère toxique pour celles-ci.
Il est donc indispensable de laver rapidement et extensivement les cellules
mononucléées récupérées après la centrifugation afin d’éliminer les traces de Ficoll ainsi
que les plaquettes, qui peuvent avoir des effets inhibiteurs sur les fonctions
lymphocytaires.
4. Résultats :

N= n×v×d cellules /mm3

n : nombre de cellules comptées carreau de la cellule de Thoma = 23 cellules

v : inverse du volume d’un grand carreau qui est de 1/250 mm3

d : facteur de dilution = 1/3

N= 23*1/250*1/3

N= 0.0306 cellules /mm3