Les transposons

Définition
• Les éléments transposables ou transposons sont des fragments d’ADN qui sont insérés dans le génome d’un
organisme hôte et qui ont la propriété de se déplacer d’un point à un autre du génome (se transposer) à l’intérieur de
la même cellule. Les transposons ont été mis en évidence chez les bactéries (séquences IS, transposons de la série T),
les mammifères (rétroéléments, éléments LINE et SINE), la levure (transposon Ty), les végétaux (Ac,Ds du maïs,
série Tam chez la gueule-de-loup), les insectes (copia, éléments P chez la drosophile), les nématodes (Tc1), etc.

• Chez une espèce donnée il existe plusieurs sortes de transposons différents. Par exemple, chez la drosophile on
connaît une centaine de transposons différents.
Les séquences mobiles constituent une fraction importante des génomes :

• 17% du génome de Arabidopsis thaliana,

• 18% du génome de la drosophile

• 42% du génome humain

• plus de 50% du génome du maïs

• Les éléments transposables sont classés en 2 classes selon leur mode de
transposition (Figure 1) :
- La classe I : Transposons à ARN : leur réplication fait intervenir un
intermédiaire ARN qui est ensuite rétrotranscrit en ADN et inséré dans le
génome. Ces répétitions sont appelées rétrotransposons si elles sont
autonomes vis-à-vis de la transposition, et rétroposons si elles ne sont pas
autonomes (elles ont besoins d’enzymes codées par les rétrotransposons
pour se transposer).
• Les transposons à ARN sont divisés en deux groupes :
1. Les rétrotransposons à LTR dérivés des rétrovirus (Figure 1b). Ils
possèdent à leur extrémité de longues séquences répétées directes. Leur
séquences code pour les protéines nécessaires à leur transposition : reverse
transcriptase (pol), intégrase ainsi que des protéines structurales (gag). La
séquence 5’LTR contient un promoteur reconnu par l’ARN polymérase II
de l’hôte, qui produit un ARNm à partir du rétrotransposon. Cet ARNm
est rétrotranscrit par la transcriptase reverse en ADNdb. Ce dernier est
intégré au niveau de la séquence cible via l’intégrase conduisant à la
duplication du site d’intégration. Exemples de rétrotransposons à LTR:
séquences Ty de la levure, copia de la drosophile, et IAP de la souris).
• Les rétrotransposons sans LTR : (Figure 1c) Le
rétrotransposon sans LTR est d’abord transcrit
par l’ARNpol II de l’hôte en ARNm. Ce dernier
est rétrotranscrit en ADNdb selon le mécanisme
TPRT (Target site Primed Reverse Transcription).
Dans ce mécanisme une endonucléase codée
par le rétrotransposon engendre une coupure
simple brin au niveau de la séquence cible
libérant ainsi une extrémité 3’OH libre. Cette
dernière servira alors d’amorce à la
transcriptase réverse. Les rétrotransposons
sans LTR incluent chez l’Homme les séquences
LINEs (Long interspersed elements, 1 à 7 kb),
SINEs (short interspersed elements, 100 à 500
pb, dont notamment les séquences Alu) et SINE
composites. Ils incluent chez la drosophile les
séquences F et I.
Classe II : Transposons à ADN : leur
transposition se fait selon un mode conservatif
(couper-coller) ou réplicatif et fait intervenir un
intermédiaire ADN. Ils sont caractérisés par la
présence à leurs extrémités de séquences
terminales répétées inversées (TIR). Ils codent
pour une transposase qui reconnait les
séquences TIR et coupe le transposon de son
locus initial et le déplace vers un nouveau site
cible. La coupure double brin au niveau du site
cible forme des bouts cohésifs, conduisant à la
duplication du site d’intégration (Target site
duplication, TSD) dont la taille varie de 4 à 8 pb
selon le type de transposase (Figure 2a). Ils
sont de taille variable (100 à 20 000 pb).
(Exemples : Séquences IS, Série des Tn de E.
coli; Elément P chez la drosophile; Eléments Ac
et Ds du maïs).
Classification
Transposons chez les bactéries
 Comparaison structurale d’un
rétrovirus et des
rétrotransposons présents dans
les génomes eucaryotes.
 Rétrotransposons
Mécanisme de transposition
 Transposons et mutations
• Les éléments transposables peuvent induire des mutations lorsqu'ils s’insèrent dans un gène, ou à proximité,
ou bien engendrer des aberrations chromosomiques par recombinaison homologue non allélique intra- ou
interchromosomique. Les insertions d’un (retro)transposon peuvent interrompre une région codante, aboutir à
un épissage incorrect ou déréguler l'expression d'un gène (éloignement entre le promoteur et la région
codante, ou au contraire, en apportant un promoteur fort présent dans le transposon). Les séquences LINE et
Alu peuvent promouvoir des recombinaisons entraînant la délétion ou la duplication des séquences situées
entre les séquences répétées.

• En plus de contribuer au remaniement du génome, les éléments transposables façonnent activement les
génomes, en participant à l’inactivation de certains gènes et à l’émergence de gènes nouveaux.
 TD1 EX1 corrigé

Un élément transposable se duplique avec un taux relativement constant (bien que faible). Donc, au cours du
temps à l’échelle de l’évolution, on pourrait s’attendre à ce que les descendants d’une cellule bactérienne
contiennent des milliers de copies d’un tel transposon. Cependant le nombre de copies de transposons bactériens
est très bas (généralement une ou deux copies par cellule).
⁻ Proposez une explication à ce faible nombre de copies. Pourquoi la plupart des transposons bactériens ont été
isolés de plasmides plutôt que du chromosome bactérien ?

(a) La majorité de l’ADN des bactéries, à la différence de l'ADN des cellules eucaryote, est codant. Il
y a relativement peu d’ADN non fonctionnel. Si, le mouvement d'un transposon à un nouvel
emplacement inactiverait un ou plusieurs gènes essentiels, causant la mort de la cellule ou
l'affaiblissement de telle sorte qu'il ne puisse pas rivalisez avec les cellules normales.
(b) les plasmides comportent rarement d’éléments essentiels à leurs cellules hôtes et peuvent donc
tolérer l’intégration de transposons sans nuire à des fonctions de gènes essentiels.
 TD1 EX1 corrigé

• La transposition d’un élément transposable particulier dépend de l’activité de transcriptase réverse. Proposez
un mécanisme pour sa transposition.

L’élément transposable doit d’abord être copié en ARN. Cet ARN est alors copié par la
transcriptase réverse en ADNc. Ce double—brin d’ADNc est alors capable d’intégration dans le
génome à un site différent.

• Comment un événement de transposition pourrait aboutir à une oncogenèse ?

La transposition peut conduire à plusieurs types d’évènements de mutations par insertion et par
recombinaisons : insertion dans la région de codage d’un proto-oncogène, aboutissant à une perte de
fonction, insertion prés des régions de contrôle d’un gène et agissant comme un promoteur fortuit,
aboutissant à une altération du contrôle du gène. Divers types d’évènements de recombinaison ou de
délétion peuvent résulter de transposition ainsi en sautant un transposon peut prendre des séquences
de gènes voisins et avec cela, créant une délétion.
 TD1 EX1 corrigé
Qu’elle est la principale différence entre rétrotransposon à LTR et rétrovirus ?
Les rétrotransposons à LTR bien que d’origines rétrovirales ils ont
perdus les gènes codant pour la protéine de l’enveloppe. Ils peuvent se
multiplier mais sont incapables d’encapsider leur génome qui reste
confiner dans la cellule, contrairement aux retrovirus qui peuvent se
multiplier et infecter d’autres cellules grâce à leur enveloppe
notamment.
Décrivez brièvement une expérience permettant de démontrer que la transposition de l’élément
ty1 chez la levure se produit via un intermédiaire ARN.
On construit un plasmide contenant l’élèment Ty sous le contrôle d’un
promoteur qui peut être activé par le galactose et un intron inséré dans
sa region codante. On observe que la fréquence de transposition
augmente considérablement suite à l’addition du galactose indiquant
que l’augmentation de la transcription (et la production de RNA) est
corrélée avec le taux de transposition. On constate également qu’après
transposition, le nouveau élément ty DNA a perdu la sequence intron.
Puisque l’épissage des introns se produit seulement durant la
maturation de l’ARN, il doit y avoir un ARN intermédiaire au cours
du processus de transposition de l’èment Ty.
 TD1 EX2 corrigé
Vous étudiez le transposon procaryote Tn10, Et vous venez de mettre au point une méthode pour déterminer si Tn10 se
réplique au cours de la transposition, ou s'il se déplace directement, sans l’intervention de son ADN. Votre idée est fondée
sur la différence essentielle existant entre ces 2 mécanismes : les deux brins parentaux de Tn10 se déplacent si la
transposition n’est pas réplicative, alors que seul un brin parental se déplace si la transposition est réplicative (Figure 1).
Vous projetez de repérer les brins individuels en hybridant deux brins provenant de deux Tn10 différents. Pour introduire
de façon efficace ces Tn10 hétéroduplex dans les bactéries, vous utilisez un ADN du bactériophage λ contenant Tn10, qui
peut être manipulé in vitro, puis encapsidé pour donner un phage infectieux. Vous vous assurez que vous utilisez un
génome phagique inactif, à cause d’autres mutations, de sorte qu’il ne peut se répliquer, ni s’intégrer, et qu’il est
finalement détruit ; ainsi la contribution du génome phagique peut être ignorée.

Figure 1 : Transposition réplicative et non réplicative

d’un élément transposable. L’élément transposable est
présenté comme un hétéroduplex, composé de deux
brins génétiquement différents, un noir et un blanc. Au
cours de la transposition réplicative, l’un des brins reste
dans l’ADN donneur, l’autre est transféré à l’ADN
receveur. Au cours de la transposition non réplicative,
l’élément transposable est excisé de l’ADN donneur, et
transféré entièrement à l’ADN receveur.
 TD1 EX2 corrigé

Votre ADN phagique porte des versions différentes, intégrées au même site. Les deux Tn10 contiennent Un gène de
résistance aux tétracyclines, et un gène du métabolisme du lactose (lacZ), mais dans l’un des deux, le gène lac Z est inactivé
par mutation. Cette différence fournit un moyen commode pour suivre les 2 Tn10, étant donné que les colonies
bactériennes lac Z+ (quand elles sont incubées avec un substrat approprié ) deviennent bleues, alors que les colonies lac Z-,
restent blanches. Vous dénaturez puis renaturez un mélange de deux ADN de bactériophages, ce qui donne un mélange
d’hétéroduplex et d’homoduplex à parts égales (Figure 2). Puis vous empaquetez ce mélange dans des capsides de phages,
vous infectez des bactéries lacZ-, et vous étalez les bactéries infectées sur des boites de Petri contenant de la tétracycline et
le substrat chromogène.

Figure 2 : Réalisation d’un mélange d’hétéroduplex et d’homoduplex par

dénaturation et renaturation de génome du bactériophage λ contenant
deux Tn10. L’ADN du phage est représenté par un trait fin, Tn10 par un
rectangle. La différence, due à une mutation, entre les deux Tn10 est
indiquée par les segments noirs et blancs.
 TD1 EX2 corrigé
Une fois que l’ADN du phage est dans la bactérie, le transposon s’intègre (avec une fréquence très basse) dans le génome
bactérien, où il confère à la bactérie la résistance à la tétracycline. Les rares bactéries qui reçoivent un Tn10 survivent aux
conditions de sélection et forment une colonie. Quand vous analysez un grand nombre de ces colonies, vous trouvez
qu’approximativement 25% sont blanches, 25% sont bleues, et 50% sont mixtes, avec un secteur bleu et secteur blanc.

1. Expliquez l’origine de chaque type de colonie bactérienne, et déterminer si les résultats impliquent un mécanisme de
transposition de Tn10 réplicatif ou non réplicatif.
Toutes les colonies ont dû apparaître par la transposition de Tn10 dans le génome bactérien parce que la survie dépend
de la présence du gène de la résistance à la tétracycline porté par Tn10. La présence de colonies mixtes avec des
secteurs bleu et blanc est l’observation clé. Puisque la fréquence des colonies sectorisées est élevée mais la
transposition est rare, les colonies sectorisées doivent survenir couramment dans les événements de transposition
individuelle. Un mécanisme de transposition selon le mode réplicatif peut transférer un seul brin de l’hétéroduplex
parental et, par conséquent, ne peut générer que des colonies blanches ou bleues, selon le brin transféré. Un
mécanisme de couper-coller transfère les deux brins de l’hétéroduplex, qui lors de la réplication et de la ségrégation
dans des bactéries filles produira une colonie sectorisée. (Une fois que la bactérie se développe sur une boîte de Pétri,
tous les descendants de la cellule infectée originale sont confinés au voisinage immédiat et, par conséquent, se
développent ensemble pour former la colonie. Si deux filles différentes sont produites dans la première division, leurs
descendants se développeront ensemble pour produire une seule colonie avec des secteurs contenant les deux types
de bactéries.) Les colonies purement bleues et purement blanches résultent d’événements de transposition qui
impliquent les homoduplex. Les proportions de colonies bleues, blanches et sectorisées sont comme attendu à partir
du mélange équilibré d’hétéroduplex (qui donne lieu à des colonies sectorisés) et d’homoduplex (qui donne lieu aux
colonies pures).
 TD1 EX2 corrigé
2. Vous avez réalisé ces expériences avec une souche de bactéries receveuses qui étaient incapables de réparer les
mésappariements dans l’ADN. En quoi les résultats différeraient-ils si vous utilisiez une souche bactérienne qui peut réparer les
mésappariements ?
Chaque hétéroduplex contient une région mésappariée d’ADN correspondant à la position de la mutation dans le gène
LacZ. Si ces hétéroduplex ont été introduits dans des bactéries qui peuvent réparer ces mésappariements, la fréquence de
colonies sectorisées devrait diminuer sensiblement. En substance, chaque événement de réparation convertirait un
hétéroduplex en homoduplex. Si la réparation des mésappariements a été impartiale, les fréquences des colonies bleues
et des colonies blanches auraient chacune augmenté de la même façon. Ces expériences ont été réalisées chez les
bactéries défectueuses dans la réparation des mésappariements précisément pour éviter la distorsion des données.

3. L’intégration du bactériophage λ dans un génome bactérien, par recombinaison spécifique de site, se produit beaucoup
plus fréquemment que la transposition. En quoi les résultats différeraient-ils si vous utilisez un bactériophage λ mutant,
qui ne peut pas se répliquer mais peut s’intégrer ?
Si vous utilisiez une forme intégrable du génome phagique, les colonies survivantes résulteraient d’une recombinaison
spécifique de site, beaucoup plus fréquente que la transposition. La recombinaison spécifique de site se traduit par une
intégration de deux brins du génome phagique. Ainsi, les proportions de colonies bleu, blanches et mixtes seraient les
mêmes que celles produites par une transposition non réplicative. Dans les expériences réelles ayant pour but de définir
le mécanisme de transposition de Tn10, une forme intégrable (mais non réplicable) du bactériophage lambda a
effectivement été utilisé, en tant que témoins positifs auquel comparer les résultats de la transposition. Les 2 expériences
donnaient des résultats identiques.
 TD1 EX3 corrigé

Les éléments Ty de la levure Saccharomyces cerevisiae se déplacent vers de nouveaux sites dans le
génome par transposition en utilisant un intermédiaire ARN. Normalement, la transcriptase reverse codée
par Ty est exprimée à un si faible niveau que la transposition est très rare. Pour étudier le processus de
transposition vous modifiez une version clonée de l’élément Ty de manière à ce que le gène codant la
transcriptase inverse soit lié aux éléments de contrôle de l’opéron galactose. Vous marquez aussi l’élément
à l’aide d’un segment d’ADN bactérien de manière à pouvoir le distinguer des autres éléments Ty présents
dans le génome. Pour détecter la transposition vous choisissez comme gène cible un gène histidine muté
(his-) dont l’expression est dépendante de l’insertion d’un élément Ty à son extrémité 5’. Vous montrez que
toutes les levures portant un plasmide avec votre élément Ty modifié génèrent des colonies his+ à la
fréquence de 5 x 10-8 quand elles poussent sur du glucose. Cependant, quand les mêmes cellules poussent
sur du galactose la fréquence des colonies his+ est de 10-6 soit une augmentation d’un facteur 20.
TD1 EX3 corrigé
1. Pourquoi la transposition se produit-elle bien plus fréquemment dans les cellules poussant sur galactose que dans les
cellules poussant sur glucose ?
La transposition des éléments Ty dépend de la transcription inverse d’un ARN intermédiaire. Normalement, la
transcriptase inverse est exprimée à un très faible niveau. Toutefois, votre plasmide modifié place le gène sous le
contrôle des éléments de contrôle de l’opéron galactose. En présence de glucose (absence de galactose), les éléments
de contrôle du galactose éteignent le gène et, par conséquent, l’expression de la transcriptase inverse est très faible.
En présence de galactose, le gène codant la transcriptase inverse est exprimé à de très hauts niveaux. La fréquence
de la transposition augmente donc de manière considérable.
TD1 EX3 corrigé
Vous notez que les cultures de cellules dotées d’un plasmide porteur Ty croissent normalement sur
le glucose mais très lentement sur le galactose. Pour étudier ce phénomène, vous isolez trois
colonies ayant trois origines différentes : des colonies his- ayant poussé en présence du glucose, des
colonies his- ayant poussé en présence du galactose et des colonies his+ ayant poussé en présence
de galactose. Vous éliminer le plasmide de chaque colonie, isolez l’ADN de chaque culture l’analysez
par électrophorèse en gel et hybridation de blot, en utilisant comme sonde l’ADN marqueur
bactérien. Vos résultats sont présentés dans la figure1.

Figure1 : Analyse de cellules possédant un

plasmide portant un élément Ty modifié.
Initialement, les cellules ont été cultivées
sur du glucose ou du galactose comme
source de carbone. Les cellules his- ont
poussé en présence d’histidine ; les cellules
his+ ont poussé en absence d’histidine. Les
bandes représentent les fragments de
restriction qui hybrident à l’ADN marqueur
présent à l’origine dans l’élément Ty porté
par le plasmide.
TD1 EX3 corrigé

2. Comme le montre la figure 1, les cellules his- isolées après croissance sur galactose ont environ le même nombre
d’éléments Ty marqués dans leurs chromosomes que les cellules his+ qui ont été isolées après croissance sur galactose.
Si la transposition est indépendante de la séléction histidine, pourquoi la fréquence des colonies his+ induite par Ty est-
elle si basse (10-6) ?

La fréquence des colonies His+ induites par Ty est faible parce qu’un événement de transposition très spécifique est
nécessaire pour activer le gène histidine défectif : l’élément Ty doit se transposer en un site près de l’extrémité 5’
du gène. Par conséquent, bien que presque toutes les cellules présentent des preuves de transposition, l’insertion
près du gène histidine défectif est encore relativement rare.
TD1 EX3 corrigé

A votre avis pourquoi les cellules possédant un plasmide portant Ty poussent-elles si lentement sur
galactose ?

Les données dans la Figure 1 indiquent que presque toutes les cellules possédant un plasmide portant Ty ont
subi un ou plusieurs événements de transposition quand elles ont poussé sur galactose. Chaque transposition
de Ty est susceptible d’altérer la fonction ou l’expression de gènes près du site d’intégration. Si l’élément
s’intègre dans la portion codante d’un gène, il peut éliminer la fonction codée ; s’il s’intègre dans la région
non codante près d’un gène, il peut altérer l’expression du gène. Chez des organismes qui, comme la levure,
ont été finement adaptés à leur niche environnementale par la pression évolutive, il est peu probable que
l’insertion aléatoire d’un élément Ty puisse améliorer les caractéristiques de croissance. Il n’est donc pas
déraisonnable d’envisager qu’un fort taux de transposition nuise à la croissance cellulaire. Ces données ne
prouvent pas que les cellules poussent plus lentement à cause du fort taux de transposition bien que cette
explication ait de grandes chances d’être correcte. Comme les auteurs le font remarquer, le haut niveau
d’expression de la transcriptase inverse pourrait interférer directement avec le métabolisme de l’ARN. Par
exemple, les ARN pourraient être inactivés par transcription inverse. Ou bien les transcrits inverses des ARNm
cellulaires pourraient être mutagènes pour les gènes nucléaires. Des erreurs introduites au cours de la
transcription inverse en ADN pourraient être incorporées dans les gènes nucléaires par recombinaison.
 TD2
Les marqueurs moléculaires
Un marqueur n’est informatif et utilisable à des fins cartographiques
que s’il est polymorphe, c’est à dire s’il existe au moins sous deux
allèles différentiables sans aucune ambiguïté. Les marqueurs
génétiques incluent les marqueurs biochimiques (isoenzymes) et
moléculaires (RFLP, minisatellites, microsatellites et SNPs). Les
marqueurs moléculaires sont les plus utilisés actuellement. Ils
correspondent à des différences dans la séquence d’ADN.
 SNP
Les SNP (Single Nucleotide Polymorphism, simple substitution nucléotidique) constituent la forme la plus abondante de
variations génétiques : c’est un type de polymorphisme de l’ADN dans lequel deux chromosomes diffèrent sur un segment
donné par une seule paire de bases. Ces SNP sont stables, très abondants et distribués uniformément dans tout le génome.
Différentes techniques permettent de mettre en évidence des différences d’un nucléotide (RFLP, AFLP…) mais une des plus
performantes actuellement est l’usage des puces à ADN car elle présente un potentiel d’automatisation supérieur et peut être
réalisée à très haut débit.
Les microbilles sont recouvertes de centaines de milliers de molécules d’un oligonucléotide spécifique (caractéristique d’un
locus) et sont identifiables par un code barre.
Cette technique permet de visualiser et donc d’identifier quelques centaines de SNP par échantillon.

fréquence dans la population

• AGCTAGCCTG allèle 1 94% Snp
• AGCTGGCCTG allèle 2 6%
• AGCTCGCCTG allèle 3 < 1%
TD2 Ex1
Que sont les SNP et comment peuvent-ils être utilisés pour localiser un gène mutant par analyse de liaison ?

Les SNP sont des différences de nucléotides uniques entre les individus, qui se produisent environ une fois par
1000 nucléotides de séquence. Beaucoup ont été recueillies et cartographiées chez divers organismes, dont
plusieurs millions dans le génome humain. Les SNP, qui peuvent être détectés par hybridation oligonucléotidique,
servent de marqueurs physiques dont les localisations génomiques sont connues. En suivant un gène mutant par
différents croisements, et en corrélant la présence du gène avec la co-hérédité des SNP particuliers, on peut
affiner la localisation potentielle d’un gène à une région chromosomique qui peut contenir quelques gènes. Ces
gènes candidats peuvent alors être testés pour la présence d’une mutation qui pourrait servir de base pour le
phénotype mutant d’origine.
TD2 Ex2

Le pedigree suivant représente une famille atteinte de dysplasie valvulaire.

 1. Identifier le déterminisme génétique de la maladie moyennant les données pedigree et microsatellites .

C’est une maladie héréditaire récessive liée à X. elle est recessive parceque l’enfant atteint hérite la maladie de
parent sains. Si la maladie était autosomale le fils atteint doit recevoir un allèle de son père et un autre de sa mère
hors ce n’est pas le cas. La maladie est donc liée à X parce que l’allèle lié à la maladie chez la mère est transmis à son
fils atteint.

2. Interpréter le génotype de l’individu II-3.

L’individu II-3 est un garçon qui a reçu l’allèle microsatellite associé à la maladie de la part de sa mère mais les
données microsatellites montre qu’il également reçu un allèle non associé à l’allèle malade. Il a par conséquent
comme génotype XXY. L’individu II-3 est donc atteint du syndrome de Klinefelter. C’est la conséquence d’une non
disjonction des chromosomes sexuels chez le père au cours de la méiose I conduisant à une non séparation des
chromosomes homologue X et Y. La conséquence de cette non disjonction est l’obtention d’un spermatozoïde XY qui
en fécondant un ovule X aboutit à la formation du garçon II-3.
 TD2 Ex3
Le pedigree suivant représente la ségrégation d’un allèle morbide dominant. . Les 3 profils Southern sous le pedigree sont
obtenus chacun par hybridation avec une amorce différente.

La maladie est autosomale dominante.

 TD2 Ex3
1. Parmi les individus de la génération III qui sont ceux qui montrent une recombinaison entre RFLP1 et l’allèle morbide.

L’individu I-2 est homozygote pour l’allèle RFLP1(a) il semble alors lié à l’allèle morbide. Toutefois, on remarque que tous les
individus sains de la génération III (III-1, -3, -7, -8, -10 et -12) possèdent l’allèle a, ils sont donc recombinants. La fréquence
de recombinaison = 6/12= 0.5 donc l’allèle a ségrège indépendamment de l’allèle morbide. Donc le marqueur RFLP1 n’est
pas lié à la maladie.

2. Parmi les individus de la génération III qui sont ceux qui montrent une recombinaison entre RFLP2 et l’allèle morbide.
L’individu I-2 est homozygote pour l’allèle RFLP2(a) il semble alors lié à l’allèle morbide. Toutefois, on remarque que les
individus sains (III-3, -10 et -12) possèdent l’allèle a, donc il sont recombinants. En outre, les individus malades (III-2, -5, -
11) ne possèdent pas l’allèle a. La fréquence de recombinaison = 6/12= 0.5>=0.5 donc le marqueur RFLP2 n’est pas lié à
la maladie.

3. Parmi les individus de la génération III qui sont ceux qui montrent une recombinaison entre RFLP3 et l’allèle morbide.

L’individu I-1 est homozygote pour l’allèle RFLP3 (a). L’individu I-2 est hétérozygote et possède les allèles RFLP3(b1 et b2) il
semble alors que l’allèle b1 et b2 sont liés à la maladie. L’individu sains (III-7) possède l’allèle b, donc il est recombinant. La
fréquence de recombinaison = 1/12= 0.083<0.5 donc le marqueur RFLP3 est lié à la maladie.

4. Parmi les RFLP (1, 2, 3) étudiés quel est celui qui est lié à la maladie.
RFLP3.
TD2 Exercice 4

Les RFLP peuvent être utilisés pour suivre la ségrégation d’une région de chromosome spécifique. Dans certaines
circonstances, les RFLP situés à proximité d’un gène défectif peuvent servir à déterminer si le gène délétère est présent
chez un enfant qui n’est pas encore né. Un couple concerné par ce problème est venu vous voir pour un conseil génétique.
Leur deuxième enfant est décédé peu après la naissance d’une maladie génétique héréditaire et la femme est de nouveau
enceinte. Cet enfant est le deuxième individu atteint dans cette famille ; le premier était le frère de la grand-mère paternelle.
Ce couple souhaiterait savoir si leur enfant à naitre est atteint par cette maladie génétique. Vous avez étudié la génétique de
cette maladie et vous savez qu’elle est liée à un gène autosomique récessif. La région chromosomique dans laquelle le gène
de la maladie a été localisé possède plusieurs sites de restriction polymorphes au sein de la population, désignés par +/-,
comme indiqué dans la figure ci-dessous.

ind1 ind2
9kb
5kb
4kb
2kb
1kb
TD2 Exercice 4

Vous isolez des échantillons d’ADN des deux parents, de tous les grand-parents et de l’enfant non atteint et les
caractérisez en établissant leur carte de restriction comme décrit dans la figure ci-dessous.

Branche 5421 grand-mère homozygote

maternelle 5421 et 921 grand père hétérozygote
Maladie autosomale récessive :
Profils de restriction de différents membres de la
Branche 651 grand-père homozygote
famille. Dans la généalogie, les cercles présentent les
paternelle 651 et 921 grand mère hétérozygote
femelles, carrés les mâles, et les triangles représentent
Maladie autosomale récessive :
les enfants qui ne sont pas encore nés.
TD2 Exercice 4 corrigé

a. Quel profil de restriction vous indiquera que le fœtus a probablement hérité de la maladie ?
On commence par identifier les individus homozygotes pour un profil. Les individus homozygotes peuvent être
identifiés de deux façons : leur profil est composé de bandes d'intensité égale et la somme de leur taille mesure 12 kb (la
longueur de la région qui a été analysée). Selon ces critères, la grand-mère maternelle et le grand-père paternel sont
homozygotes. Ils ont nécessairement transmis un chromosome avec leur caractéristique à leurs descendants. Ainsi, la
mère doit posséder un chromosome présentant un profil identique à celui de son père. La connaissance d’un chromosome
simplifie la déduction du profil de coupure de l’autre chromosome.
Dans l’arbre généalogique, il y a trois profils de coupure différents : le profil I est + pour tous les sites A, B et C, ce qui
conduit aux bandes 1, 2, 4 et 5 kb ; le profil II est + pour les sites A et C ce qui conduit aux bandes 1, 5 et 6 kb ; le profil
III est + pour les sites A et B et – pour le site C ce qui conduit aux bandes 1, 2 et 9 kb. Comme le profil I est homozygote
chez le grand-père maternel et le profil II, chez le grand-père paternel, il est probable qu’aucun de ces profils n’est
associé à la maladie. Le père est hétérozygote pour les profils I et III, alors que la mère est hétérozygote pour les profils
II et III. L’enfant non atteint est hétérozygote pour les profils I et III. Seul le profil III homozygote n’est pas représenté
parmi les membres vivant de la famille. De plus, le profil III est présent dans l’ADN de la grand-mère paternelle dont le
frère est atteint par la maladie. L’ensemble de ces observations indiquent que le profil III (bandes 1, 2 et 9 kb) est celui
qui a la plus forte probabilité d’être associé à la maladie génétique.
Donc, le profil de restriction montrant que le fœtus a probablement hérité la maladie génétique est celui qui aura des
bandes uniquement à 1, 2 et 9 kb.
TD2 Exercice 4 corrigé

b. Schématiser l’emplacement de la sonde que vous utiliserez pour identifier les individus malades ainsi que le
profil obtenu par Southern blot.

Sonde*

autoradiogramme
Southern blot
Principe
 Enzyme de restriction

ATGTTGCTGCAGAATTCGTTACCGGTGTCAGTCGCATT
TCTTAAGCAA
Sonde marquée

Southern blot

ATGTTGCTGCAG AATTCGTTACCGGTGTCAGTCGCATT
TCTTAAGCAA TCTTAAGCAA

Southern blot
 TD2 Ex5

• Soit un microsatellite caractérisé par le motif dinucléotidique CA.

• 1) Donner la définition et les caractéristiques des marqueurs microsatellites.
• 2) En considérant l'exemple ci-dessous, décrire par des schémas clairs les étapes méthodologiques pour
différencier les individus d’une population.
• 3) Déterminer la séquence de deux amorces de 20 paires de bases utilisables pour amplifier de façon
spécifique le fragment contenant ce microsatellite.

1 TTTTAAGTTA CTGTGTGCTT GTTGCAGGAT CTGTAACTAA TTCCTATGCG ATTCTCTTGT

61 TTGTAGGGCG AAGATGAGGG AGATCCTGCA CATCCAGGGA GGGCAATGTG GCAACCAGAT
121 TGGCGCCAAG TTCTGGGAGG TGGTGTGCGA TGAACATGGC ATTGACCACA CACACACACA
181 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA
241 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA
301 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACAACCG CCTCGGCCAT
361 TGCTGGTAAC AATTGGGCTA AGGGCCACTA CACCGAGGGT GCTGAGCTCA TTGACTCTGT
421 TCTGGATGTT GTGAGGAAGG AAGCTGAGAA CTGTGACTGC TTGCAAGGAT TCCAAGTATG
481 CCACTCCCTT GGTGGTGGTA CTGGATCTGG TATGGGTACG CTGTTGATCT CAAAGATCAG
 TD2 Ex5

Un microsatellite est un marqueur neutre, codominant et dont les allèles au niveau d’un même locus
microsatellite peuvent être amplifiés par PCR. Les allèles sont alors séparés par PAGE. A un locus donné, les
allèles d’un microsatellite diffèrent entre par le nombre de répétition de son motif. Les microsatellites sont
utilisés pour quantifier la variation intra et inter-population au sein d’une même espèce. Les loci
microsatellites sont abondants distribués au sein des gènomes eucaryotes et chaque locus est caractérisé par
une sequence connue bien caractérisée. Ces séquences consistent en un motif répété en tendem de 2 ou 4
nucleotides telque (AC)n ou (GATA)n, n varie entre 5 et 50 . Chez les vertébrés, les motifs -GT et CA- sont les
plus communs.
TD2 Ex5

ASSESSMENT OF GENETIC VARIATION IN SOME COTTON VARIETIES

(Gossypium hirsutum L.) GROWN IN TURKEY USING MICROSATELLITE
 TD2 Ex5

• Soit un microsatellite caractérisé par le motif dinucléotidique CA.

• 2) En considérant l'exemple ci-dessous, décrire par des schémas clairs les étapes méthodologiques pour
différencier les individus d’une population.
• 3) Déterminer la séquence de deux amorces de 20 paires de bases utilisables pour amplifier de façon
spécifique le fragment contenant ce microsatellite.
1 TTTTAAGTTA CTGTGTGCTT GTTGCAGGAT CTGTAACTAA TTCCTATGCG ATTCTCTTGT
61 TTGTAGGGCG AAGATGAGGG AGATCCTGCA CATCCAGGGA GGGCAATGTG GCAACCAGAT
121 TGGCGCCAAG TTCTGGGAGG TGGTGTGCGA TGAACATGGC ATTGACCACA CACACACACA
181 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA
241 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA
301 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACAACCG CCTCGGCCAT
361 TGCTGGTAAC AATTGGGCTA AGGGCCACTA CACCGAGGGT GCTGAGCTCA TTGACTCTGT
421 TCTGGATGTT GTGAGGAAGG AAGCTGAGAA CTGTGACTGC TTGCAAGGAT TCCAAGTATG
481 CCACTCCCTT GGTGGTGGTA CTGGATCTGG TATGGGTACG CTGTTGATCT CAAAGATCAG

Amorce 1 : 5’ CATCCAGGGAGGGCAATGTG3’
Amorce 2 : 5’ TGAGCTCAGCACCCTCGGTG 3’
 TD 2 Exercice 6

Afin de réaliser un test de paternité, 15 SSR de type CA repeat sont étudiés ; pour chacun d’eux, le nombre de répétitions est
indiqué dans le tableau suivant.

1) Quels sont les marqueurs informatifs/non informatifs ?

2) Le père présumé est-il bien le père biologique ?
 TD3 Mutagenèse
• La mutagénèse est l’ensemble des techniques de laboratoires permettant de modifier la
séquence génique. On distingue selon la spécificité des mutations induites deux types de
mutagénèse : aléatoire et dirigée.
• Mutagénèse aléatoire : Elle fait appel à des agent chimiques (DMSO) ou physiques
(rayons UV ou X) qui induisent des mutations aléatoires au niveau du génome. Ces
agents vont provoquer dans le matériel génétique des lésions dont la réparation
imparfaite crée les mutations. Il n’y a ici aucun contrôle sur les mutations générées.
• Mutagénèse dirigée : Elle a pour objectif d’inactiver de modifier ou de remplacer une
séquence d’un gène d’intérêt et d’étudier les conséquences de cette mutation. Elle
consiste à provoquer une mutation dans le génome à un endroit particulier et d'une
nature particulière. Cette mutagenèse s'effectue en utilisant de petits segments d'ADN
contenant la mutation et introduit dans la cellule. Selon l’objectif recherché différentes
méthodes sont appliquées : Recombinaison homologue ; Mutagénèse dirigée par PCR ;
Mutagénèse conditionnelle via le système Cre/loxP ; les Tale nucléases ; le système
CRIPSR/Cas9…
 Localisation des différents types de mutations pouvant affecter l'expression d'un gène

Localisation des différents types de mutations pouvant affecter l'expression d'un gène. Les exons du gène sont
représentés par des rectangles jaunes, les introns positionnés entre les exons. Les séquences impliquées dans la
régulation de l'expression du gène sont représentées par des rectangles mauves. Les différents mécanismes
moléculaires à l'origine d'une altération de la transcription du gène, de sa maturation ou de sa stabilité figurent en
rouge, bleu et vert, respectivement. LCR : locus control region ; ESE : exonic splicing enhancers ; ESS : exonic
splicing silencers.
TD3 Mutagenèse via les enzymes de restriction
La mutagenèse dirigée a pour objet de muter une séquence d'ADN à un
endroit précis. Un exemple de mutagenèse dirigée simple consiste à
éliminer un site de restriction donnant des extrémités cohésives dans
un plasmide. On ouvre le plasmide au site de coupure et on ajoute une
polymérase (dépourvue d'activité 5’-3' exonucléase) et des dNTP. On
effectue ensuite une ligation des extrémités devenues franches. Dans
cette expérience, on ajoute ou on retire généralement soit 2 soit 4
nucléotides. Le cadre de lecture est donc modifié et doit être pris en
compte si l’expérimentation a pour but de produire une protéine.
Lorsqu'on veut changer une ou plusieurs bases dans un plasmide, on
peut partir soit d'un ADN simple brin soit d'un ADN double brin.
 Mutagenèse ciblée par PCR
• L’une des méthodes les plus employées consiste, en utilisant un
plasmide où l’ADNc du gène d’intérêt a été cloné, à amplifier un
fragment d’ADN en utilisant des amorces sens et anti-sens dans le
gène d’intérêt., amorces présentant une mutation ponctuelle très
précisément au site qu’on souhaite muter.
 Mutagenèse ciblée pour remplacer un triplet ATG par AGG

Une seule amorce

 Mutagenèse ciblée pour remplacer un triplet ATG par AGG

2 amorces

• Deux ou trois cycles de PCR à

une température permettant
l’amorçage illégitime avec un
mismatch
• 25 ou 30 cycles de PCR à une
température excluant
l’amorçage illégigitme
• Le triplet TAC est remplacé par
le triplet TCC
 Mutagenèse ciblée par PCR

Les portions en rouge représentent les régions apportant une mutation.

Cette mutation se retrouve, in fine, dans le produit d'amplification.
Mutagenèse ciblée par PCR
 Mutagenèse conditionnelle par Cre/loxP

Impossibilité d’invalidation d’un gène par knock-out à cause de la

Léthalité embryonnaire, fœtale ou périnatale (exp knock-out du gène
de l’insuline) → solution : mutagénèse conditionnelle.
Le système de mutagénèse conditionnelle le plus classique: Cre/loxP du
bactériophage P1.
La recombinase Cre reconnait une séquence spécifique de 34pb, appelée
loxP.
Mutagenèse conditionnelle par
Cre/loxP

B
TD3 ex1

D’après les travaux antérieurs vous suspectez la glutamine (Q) présente dans le segment protéique suivant de jouer un
rôle important au site actif.
L R D P Q G G V I
5’-CTT AGA GAC CCG CAG GGC GGC GTC ATC-3’
Votre responsable souhaite que vous modifiiez la protéine de trois façons : en changeant la glutamine en une lysine (K),
en changeant la glutamine en une glycine (G) et en délétant la glutamine de la protéine. Vous prévoyez d’accomplir ces
mutations sur une version de votre gène qui est clonée dans un ADN viral M13. Vous souhaitez hybrider un
oligonucléotide approprié à l’ADN viral M13, de façon que, quand l’ADN polymérase prolongera l’oligonucléotide autour
du cercle monocaténaire de M13, elle complétera un brin qui code le complément de la protéine mutante désirée.
Dessinez trois oligonucléotides de 20 nucléotides de long qui pourraient être hybridés au gène cloné dans l’ADN
monocaténaire viral M13 pour réaliser la première étape de la mutagenèse.

Trois oligonucléotides qui pourraient être utilisés pour effectuer les changements désirés dans la protéine sont illustrés
dans la Figure 8-66. En règle générale, il est préférable de se concentrer sur le mésappariement au sein de
l’oligonucléotide. Pour mener à bien la mutagenèse dirigée, les oligonucléotides seraient hybridés à l’ADN
monocaténaire circulaire à partir du vecteur recombinant (comme le montre la Figure 1), puis prolongés avec l’ADN
polymérase pour compléter le second brin. L’ADN bicaténaire serait transfecté dans des cellules bactériennes, où la
réplication générerait le mutant désiré.
TD3 ex1

Figure 1: Trois oligonucléotides pour la mutagénèse dirigée

TD3 ex2

La recombinase Cre est une enzyme spécifique de site qui catalyse La recombinaison entre 2 séquences de
reconnaissance LoxP. La recombinase Cre fait s’apparier deux sites LoxP dans la même orientation, casse les deux duplex
au m^me ponit dans les sites LoxP et unit les extrémités avec de nouveaux partenaires de manière à ce que chaque site
LoxP soit régénéré, comme le montre schématiquement la figure suivante :

D’après ce mécanisme, prédisez l’organisation des séquences après recombinaison spécifique de site promue par Cre pour
chacun des deux ADN montrés dans la figure suivante :
 TD3 ex2

La recombinaison promue par Cre entre des sites LoxP orientés

en sens inverse retourne les séquences situées entre ces sites,
alors que la recombinaison entre des sites LoxP dans la même
orientation supprime les séquences situées entre les sites
(Figure 5-67). Ces résultats sont similaires à 1a recombinaison
homologue entre des répétitions directes et des répétitions
inversées.
 TD3 ex3

Vous étudiez les propriétés de deux systèmes de recombinaison spécifique de site, Cre/LoxP et FLP/FRT pour déterminer
lequel des deux serait le mieux adapté au projet de manipulation chromosomique que vous avez en tête. Vous fabriquez
les ensembles de substrats présentés dans la figure 1.

Figure 1 : Comparaison des recombinaisons spécifiques de site Cre/LoxP et FLP/FRT. (A) Recombinaison spécifique de site
chromosomique entre sites répétés directs. (B) Intégration plasmidique spécifique de site dans un chromosome
TD3 ex3
Vous restez perplexe devant les résultats. Quand vous introduisez Cre dans les cellules, vous obtenez une très forte
fréquence de recombinaison chromosomique (10-1) mais une très faible fréquence d’intégration plasmidique (10-6).
Quand vous introduisez la recombinase FLP, vous obtenez une fréquence de recombinaison chromosomique plus faible
(10-2) mais une fréquence plus élevée d’intégration chromosomique (10-5). Vous aviez escompté que la recombinaison
chromosomique serait plus efficace que l’intégration plasmidique parce que les sites de recombinaison sont adjacents
sur le chromosome ; toutefois, cette considération ne peut pas à elle seule rendre compte de vos résultats. Pouvez-vous
proposer une explication aux résultats de vos expériences ?

La clé pour comprendre ces résultats est de réaliser que les produits de l’événement de recombinaison chromosomique
dans la Figure 1A sont les substrats de la figure 1B, et vice versa. Ainsi, les deux réactions peuvent se produire en partant
soit de l’un soit l’autre substrat, et le résultat final est un équilibre entre les deux réactions. Si la recombinaison
chromosomique est plus efficace que l’intégration, alors l’équilibre sera toujours en faveur de la molécule non intégrée.
Ainsi, lorsque la recombinase Cre catalyse l’intégration, la plupart du temps elle reconvertira le produit en matériel de
départ. Parce que la recombinase FLP est moins efficace pour promouvoir la recombinaison, une fraction plus élevée des
intégrants survivra (une fraction plus faible sera reconvertie en matériel de départ).
 Mutagenèse aléatoire
par Tilling (Targetting-Induced Local Lesions IN Genomes)

1. Construction des collections de mutants:

• Création de mutants par mutagenèse chimique de graines en utilisant un agent
chimique tel que l’EMS (méthanesulfonate d’éthyle) qui engendre des mutaions
ponctuelles. On peut également utiliser des agents mutagènes physique tel que
les rayons UV qui engendre des délétions ponctuelles ou le bombardement à
neutrons qui engendre des délétions de un ou plusieurs nucléotides.
• A la suite de la mutagenèse, les individus M1 (individus issus de la graine) sont
multipliés en une génération suivante afin de ne conserver que les mutations
transmissibles affectant les cellules reproductibles (cellules germinales). Chez les
plantes autogames, l’autofécondation des plantes M1 conduit à l’obtention d’un
mélange d’individus M2 homozygotes (sauvages ou mutants) ou hétérozygotes
pour la mutation appelés « lignée M2 » pour réaliser les criblages. Les mutations
ainsi présentes dans le génome sont stables et héréditaires.
 Mutagenèse aléatoire
par Tilling (Targetting-Induced Local Lesions IN Genomes)

2. Les criblages:
Les criblages sont réalisés par amplification de gènes cibles à partir des ADN de ces
individus. Afin de limiter le nombre de réactions nécessaires au criblage des populations
entières, les ADN des individus traités sont réarrangés en pools, de profondeur (nombre
d’individus) variable en fonction de la sensibilité des méthodes de détection choisies.
La détection des SNP/INDEL associée au TILLING repose sur l’utilisation de l’endonucléase
(Endo I) capables de reconnaitre spécifiquement les mésappariements de l’ADN dus dans
notre cas aux mutations générées.
Les étapes de dénaturation et renaturation permettent la formation d’homoduplexes ou
d’hétéroduplexes si une mutation est présente dans l’ADN génomique. Les
mésappariements sont alors reconnus par l’endonucléase qui coupe le produit PCR en
cette position. Les profils de digestions sont révélés sur un gel de polyacrylamide. La
différence de taille entre les fragments marqués issus du clivage des hétéroduplexes, ou du
non clivage des homoduplexes, permet d’identifier la présence d’une mutation et d’estimer
sa position. Le » séquençage du produit PCR obtenu à l’aide des amorces spécifiques
permet de confirmer et d’identifier la mutation.
 ENDO-1 est une
endonucléase,
spécifique des
« mésappariements »
.

Mutation de graines par

EMS (méthyl sulfate
d’éthyle)
 Mutagenèse par CRISPR Cas9

• Chez les végétaux, les cassettes d ’expression de l’ARN guide (ARNg) et Cas9
peuvent être administrées en seule construction génique ou en deux distinctes.
Un guide ARN typique contient 98 nucléotides (incluant les 20 nucléotides de la
séquence cible) et son expression est en général permise grâce à un promoteur
snRNA U3 ou U6 transcrit spécifiquement par l’ARN pol III.
• La séquence de la Cas9 est cloné en phase avec un signal de localisation nucléaire
(NLS). La proteine de fusion est placée en aval de promoteurs constitutifs , tels
que ceux des gènes ubiquitine ou le promoteur 35S du virus de la mosaïque du
chou-fleur CaMV.
• Ces constructions sont introduites dans les cellules végétales selon la technique
d’agro-infiltration de feuilles ou en coculture, de transformation des protoplastes
ou de biolistique.
• L’administration d’ARN CRISPR Cas9 préassemblées une alternative pour la
production rapide et efficiente de plantes sans l’intégration de transgène.
 Mutagénèse par CRISPR-Cas9
CRIPR chez la bactérie

Au cours de la phase d’acquisition l’ADN étranger est

incorporé dans le génome bactérien au niveau du locus
CRISPR ((Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats). Ce dernier est ensuite transcrit et coupé en crRNA
durant le processu de biosynthèse des crRNA.
Au cours de la phase interférence (réinfection par le phage),
l’endonucléase cas9, associée à crRNA et tracrRNA (trans-
activating crRNA), coupe l’ADN étrangé comprenant une
séquence complémentaire de 20 nt adjacente à la séquence
PAM.
Mutagénèse par CRISPR-Cas9
CRISPR chez la bactérie
 Mutagénèse par CRISPR-Cas9

A. Wild-type Cas9 nuclease site specifically cleaves double-stranded DNA activating double-strand break repair machinery. In the
absence of a homologous repair template non-homologous end joining can result in indels disrupting the target sequence.
Alternatively, precise mutations and knock-ins can be made by providing a homologous repair template and exploiting the
homology directed repair pathway.
B. Mutated Cas9 makes a site specific single-strand nick. Two sgRNA can be used to introduce a staggered double-stranded break
which can then undergo homology directed repair.
C. Nuclease-deficient Cas9 can be fused with various effector domains allowing specific localization. For example, transcriptional
activators, repressors, and fluorescent proteins.
 La mutagenèse dirigée chez la souris

On savait étudier le patron d'expression des gènes dans un organisme grâce à la technique d'hybridation in
situ des ARN et c'était à peu près tout. Un moyen d'étude qui faisait particulièrement défaut était la possibilité de
modifier sélectivement un gène donné afin d'analyser les phénotypes anormaux induits par la mutation et par là,
d'en déduire la fonction des gènes. C'est dans la mise en place de cette mutagénèse dirigée (chez la souris) que
prennent place Evans, Smithies et Cappecchi qui ont reçu le prix Nobel de médecine en 2007.
En 1985, Smithies parvenait à réaliser la première mutagénèse dirigée par recombinaison homologue atteignant
spécifiquement le gène de la bêta-globine dans une cellule de mammifère. La recombinaison homologue était un
événement déjà connu chez les procaryotes mais aussi chez les eucaryotes où elle est à l'œuvre durant les
phénomènes de crossing-over durant la méiose.
La nouveauté aura été de réussir à introduire le gène muté par génie génétique dans la cellule et à sélectionner les
cellules ayant vécu cet événement extrêmement rare de recombinaison homologue. Un peu plus tard, en 1987,
Capecchi parvenait à muter le locus Hprt dans les fameuses cellules souches de Evans par la technique de
mutagénèse par recombinaison homologue développée par Smithies. Il ne restait plus qu'à transférer ces cellules
dans un blastocyte. C'est ce que réalisa Koller en 1989 produisant finalement la première souris mutée par
recombinaison homologue (pour la petite histoire elle constitue un modèle pour la maladie de Lech-Nyhan). Donc,
au début des années 1990, on disposait de cet outil permettant d'étudier la fonction des gènes.
 La mutagenèse dirigée chez la souris

• Le principe de recombinaison homologue repose sur le fait que quand deux fragments d'ADN sont très
semblables, homologues sur au moins une vingtaine de bases, et si une cassure survient, la cellule la répare
mais peut se tromper» et ponter les deux morceaux, les recombiner. C'est ce que l'on appelle la
recombinaison homologue. L'événement est rare.
• Mais un événement encore plus rare peut survenir, c'est la double recombinaison homologue. C'est cet
événement qui nous intéresse pourtant ici car c'est lui qui permet d'introduire une nouveauté dans un gène.
A partir du moment où l'on dispose d'une séquence qui possède deux régions d'homologie, peu importe ce
qui se trouve entre les deux, si une double cassure survient, il peut y avoir une recombinaison. C'est cette
propriété qui a été utilisée par les scientifiques pour muter spécifiquement un gène de la manière dont ils le
désiraient. On savait que l'on pouvait injecter de façon transitoire un fragment d'ADN dans une cellule.
L'idée était d'utiliser comme fragment une version mutée du gène que l'on ciblait, on savait que
statistiquement se produirait dans l'une ou l'autre des cellules un événement de double recombinaison qui
introduirait la mutation dans le génome de la cellule. Toute la question était de savoir comment retrouver
ces cellules.

Remarque: Les cellules souches embryonnaires possèdent, pour des études in vitro, l’avantage d’être une
ressource biologique inépuisable du fait de leur immortalité, ce qui permet de s’appuyer sur le même
fond génétique dans des études successives.
 La mutagenèse dirigée chez la souris

La construction des fragments d'ADN injectés dans la cellule a alors été pensée
pour permettre une sélection en deux temps. En plus du gène muté, on ajoute un
gène de résistance à un antibiotique (appelé cassette NEO, il confère une
résistance à la néomycine), ainsi qu'une cassette TK (TK pour thymidine kinase,
confère une sensibilité au gancyclovir). Le gène de résistance sert à trouver les
cellules qui ont bien reçu le transgène : les cellules sans transgène meurent en
présence de néomycine (figure 1). Ainsi on pourra les laisser se multiplier et
augmenter les chances de survenue de la double recombinaison. La cassette TK
permet de tester si la recombinaison a eu lieu. On sait déjà que les cellules ont
intégré le transgène. La cassette TK n'étant homologue à aucun gène de la
cellule, elle n'est jamais intégrée au génome. Une fois que la recombinaison a eu
lieu, en principe, le transgène est dégradé. Les cellules perdent donc le gène de
sensibilité. Dès lors, seules les cellules n'ayant pas recombiné sont sensibles au
gancyclovir. On retrouve ainsi les cellules ayant intégré la mutation dans leur
génome.
 Lignée: C57BL/6
Lignée: 129/Sv
Couleur: noir
Couleur: agouti
Allèle de couleur a/a
Allèle de couleur A/A
Le croisement d’une souris mosaïque (dont les cellules sexuelles dérivent des cellules ES recombinées) avec une souris
sauvage ne possédant pas cette mutation permet d’obtenir, pour 50 % de la descendance, des souris hétérozygotes pour
cette mutation.
Le croisement des hétérozygotes obtenus précédemment entre eux permet l’obtention (dans
la proportion de 1/4 de la descendance) d’individus homozygotes : ce sont les individus KO,
chez qui le gène a été invalidé.
 knock-out et knock-in

Les principaux types de vecteurs de

recombinaison homologue.
(A)Inactivation d’un gène cible en
induisant la délétion de régions
importantes pour sa fonction,
(B) Introduction d’une modification de
séquence,
Les cassettes néo et TK permettent la
sélection des cellules recombinantes
 Invalidation de gene
knock-out

• L’invalidation conditionnelle chez la

souris repose sur la fabrication de deux
lignées. Les souris de la première lignée
portent deux sites loxP encadrant la cible à
déléter. La création de la première lignée
est basée sur les méthodes de
recombinaison homologue dans les cellules
ES.
• Il est souhaitable d’éliminer la cassette
Néor car son expression peut ne pas être
neutre sur le phénotype des animaux. Pour
se faire on l’encadre avec deux sites FRT
reconnues par la recombinase site-
spécifique de la levure Flp. Les cellules ES
recombinantes sont tranfectées avec un
vecteur exprimant de façon transitoire la
Flp afin d’éliminer la cassette.
 Mutagénèse chez la souris
• Une fois qu’on a obtenu les souris homozygotes pour l’allèle floxé, il
faut les croiser avec des souris exprimant la recombinase Cre dans le
tissu que l’on souhaite étudier. Elle sont obtenues selon la même
démarche que pour obtenir des souris transgéniques (par injection
d’ADN dans l’œuf). Par exemple si on décide d’invalider un gène
spécifiquement dans le foie, le pancréas ou les muscles striés, on
devra créer des souris respectivement « promoteur albumine-cre »,
« promoteur insuline-cre » ou promoteur « créatine kinase-cre), Pour
cibler l’expression de la recombinase Cre au bon endroit et au bon
moment, il est donc nécessaire de bien connaitre le promoteur
utilisé.
TD3 ex4

La mucoviscidose est la maladie récessive la plus souvent observée dans les populations européennes (entre un nouveau-
né sur 1500 et 1/5000). L’observation clinique des patients a montré une très grande variabilité avec ou sans atteinte
pancréatique et une atteinte pulmonaire systématique mais de progression plus ou moins rapide.
On peut associer une variabilité clinique à certains effets du milieu, notamment la précocité du diagnostic permettant
d’associer des thérapies prophylactiques et une antibiothérapie. Mais les analyses moléculaires du gènes CFTR et
l’identification des nombreuses mutations entrainant la mucoviscidose ont montré l’existence de mutations sévères ou
modérées, de sorte que la variabilité clinique soit aussi dépendante de la variabilité génétique.
Cependant , on a assez vite observé que des patients porteurs du même génotype (par exemple tous les atteints d’une
même fratrie) pouvaient présenter des différences cliniques trop importantes pour n’être dues qu’à des variations du
milieu. On en a conclu rapidement que d’autres facteurs génétiques pouvaient moduler l’expression phénotypique du gène
CFTR et quelques équipes se sont lancées dans la recherche de ces « gènes modulateurs ». Comme l’expérimentation est
impossible chez l’homme, les recherches ont été entreprises chez la souris en pensant que les gènes modulateurs qu’on
trouverait chez la souris auraient vraisemblablement des homologues faciles à identifier chez l’homme. C’est la raison pour
laquelle des «souris mucoviscidosiques KO pour l’homologue murin CFTR du gène humain CFTR » ont été construites et
étudiées sur le plan génotypique et phénotypique (atteinte exclusivement intestinale et non pulmonaire chez la souris).
TD3 ex4

1. Construction des cellules ES transformées et signature moléculaire

On transforme des cellules ES de la souche 129SV par un plasmide intégratif (ne pouvant se répliquer) porteur du
gène de résistance à la néomycine inséré au sein de la séquence de l’exon 1 du gène murin cftr (figure 1), seule
séquence murine du plasmide, puis on étale les cellules sur un milieu nutritif complet additionné de néomycine, un
antibiotique entrainant la mort des cellules non résistantes.

Figure 1: Schéma d’inactivation ciblée du gène murin cftr. Les flèches indiquent les sites de restriction BamHI de la zone
et leurs distances respectives. La sonde S est une séquence d’ADN homologue qui peut être marquée afin de reconnaitre
des fragments de restriction BamHI sur un Southern blot.
TD3 ex4
Les cellules ES transformées capables de croitre sur la boîte additionnée de néomycine ont obligatoirement intégré le
gène de résistance dans leur génome (le génome n’étant pas réplicatif) par le biais de deux crossing-over (voir figure 1)
qui n’ont pu se produire qu’entre des séquences homologues, soit au niveau de l’exon 1.
Si tel est le cas, quelle devrait être la taille des fragments BamHI reconnus sur le Southern blot par la sonde S marquée ?
Définissez alors la signature moléculaire du gène KO (cftr-) qui servira ensuite à identifier sa présence dans le génome
des souris (on extrait l’ADN d’un petit morceau de queue, on le digère par BamHI et on hybride par S marquée un
Southern blot correspondant) et précisez le génotype des cellules ES transformées.

1. L’insertion de la séquence inactivée de l’exon 1 conduit à la formation d’un fragment de restriction BamHI de 4,9 Kb
identifiable par hybridation de la sonde S marquée, entre le 1er site de l’exon 1 et le site du gène NEOR, alors que la
sonde S identifie des fragments de 6 Kb sur le gène sauvage non transformé.
La présence d’un fragment de 4.9 Kb identifiable par la sonde S marquée sur un Southern blot après clivage par BamHI
est donc la signature moléculaire de la présence du gène KO.
Les cellules ES transformées sont hétérozygotes cftr-//cftr+ car la transformation n’a concerné que l’un des deux
exemplaires, la probabilité d’avoir deux intégrations sur les deux copies homologues étant nulle.
TD3 ex4

2. Construction des souris KO

a. Un clone de cellules ES transformées et présentant la signature moléculaire adéquate est agrégé à une blastula
d’une souche CD1, génétiquement différente de la souche 129SV, qui après implantation utérine conduit à la
naissance d’un individu mâle G0. Précisez son génotype, le génotype de ses gamètes et leur fréquences
respectives.

Le mâle G0 est une mosaïque cellulaire formée de nombreuses cellules cftr+//cftr+ issues de la blastula à laquelle on a
agrégé les cellules ES transformée et de cellules cftr+//cftr- issues des cellules ES transformées.
Si dans le tissu germinal, il y a une proportion p de cellules transformées et une proportion (1-p) normales, la
gamétogenèse donnera une proportion p/2 de gamètes porteurs d’une copie mutée KO du gène cftr et une
proportion[(1-p) +p/2] = [1-(p/2)] avec une copie sauvage cftr+.
TD3 ex4

b. Ce mâle G0 est croisé avec une femelle de la souche CD1 et donne une portée de 9 souriceaux G1.
Proposez une méthode permettant d’identifier les hétérozygotes cftr+/cftr- puis d’obtenir des souris KO pour le
gène cftr et de les identifier.

Les souriceaux G1 hétérozygotes cftr+//cftr- sont identifiables par un Southern blot après clivage par BmHI où la
sonde S reconnaitra un fragment de 4,9 Kb issu du gène cftr Ko apporté par le gamète de G0 et un fragment de 6
Kb issu de l’exemplaire sauvage du gène cftr apporté par la femelle CD1.
En croisant entre eux deux individus G1 on obtiendra des descendants G2 dont 25% seront homozygotes cftr-//cftr-
, identifiables par la présence de fragments de 4,9 Kb et l’absence de fragments de 6 Kb sur un Southern blot après
clivage par BmHI.
TD3 ex4
1. Analyse phénotypique des souris KO
a. Comment interpréter les différences phénotypiques observées (figure 2) ?
Pour cela, vous définirez le contexte génétique dans lequel s’exprime le génotype des souris KO pour le gène cftr,
compte tenu du protocole de transformation des cellules ES (souche 129SV) et d’obtention des souris G1 par
croisement du mâle G0 avec une femelle de la souche CD1.

80

70

60
Figure 2 : Phénotype des souris KO. Les souris
Nombre de souris vivantes

KO obtenues se répartissent en trois classes

50
phénotypiques bien distinctes (atteintes
40
intestinales plus ou moins léthale) (figure 2) :
30
classeI : décès dès la naissance ; classe II :
20
décès au sevrage ; classe III : survie normale.
10
I II III
0
0 1 2 3 4 5 6 7
âge (semaines)
TD3 ex4

1.a ) Toutes les souris KO ont un même génotype cftr-//cftr- et aussi un génotype pour les gènes flanquant le locus cftr,
du fait de la liaison génétique, mais elles diffèrent pour le reste du génome, en raison du brassage génétique résultant du
croisement G1xG1. En effet les souris G1 ont 50% de leur génome issu de la souche 129SV via le gamète formé à partir
d’une cellule germinale transformée du mâle G0 et 50% de leur génome issu de la souche CD1 via le gamète de la
femelle. En conséquence les individus G2 sont porteurs de fractions très variées de gènes issus de CD1 ou de 129SV, aussi
bien sur le plan quantitatif que qualitatif, de sorte que ce contexte génétique très variable peut très bien apporter, chez
les G2 KO pour cftr ; des facteurs génétiques qui atténuent ou qui aggravent le phénotype clinique, allèles différents de
gène modulateurs ou suppresseurs pour laquelle les souches 129SV et CD1 seraient génétiquement différentes.
Remarque : un tel résultat conduit à relativiser le concept de maladie monogénique, et permet d’expliquer en partie les
observations de pénétrance incomplète.
 TD3 ex4

b. Quelle serait l’hypothèse génétique la plus simple pour rendre compte des 3 classes phénotypiques ? Proposez des
génotypes.

b. L’hypothèse la plus simple est de supposer un gène modificateur ou suppresseur avec deux allèles sui et sua ayant un
effet codominant de sorte que les KO de classe I seraient sui//sui, le KO de classe II seraient sui//sua et les KO de classe III
sua//sua.
4. Analyse génétique des souris KO
Afin de valider l’hypothèse formulée à la question précédente, on procède au croisement des souris KO survivantes de
classe III avec des souris G1.
Les souris de la génération suivante sont pour moitié cftr-/cftr-, identifiables par la signature moléculaire et se répartissent
pour moitié en classe II et pour moitié en classe III. Ce résultat est-il conforme à l’hypothèse formulée ?

4. Sous cette hypothèse, les croisements considérés donnent bien les proportions observées des différents phénotypes.
TD3 ex5

On souhaite étudier une maladie récessive monogénique chez l’homme. Pour ce faire, des «souris KO pour l’homologue
murin du gène humain ont été construites et étudiées sur le plan génotypique.
I. Construction des cellules ES transformées
On transforme des cellules ES de la souche 129SV par un plasmide intégratif porteur du gène de résistance à la
néomycine ainsi qu’un gène TK codant pour la timidine kinase du virus Herpes simplex humain (HSV) (figure 1), puis
on étale les cellules sur un milieu nutritif complet additionné de néomycine et de gancyclovir.
1. Quel est l’intérêt de l’utilisation d’un plasmide intégratif?
2. Pourquoi on utilise deux antibiotiques pour la sélection des souris recombinante
3. Compléter les cases vide de la figure 1 par les termes suivants: gène cible, TK , NéoR.
4. Représenter le résultat de l’intégration
5. Proposer un emplacement d’une sonde permettant d’identifier les cellules ES qui ont effectués une recombinaison
homologue.

1. Le plasmide ne pouvant se répliquer son rôle se résume à l’apport de la construction à intégrer.

TD3 ex5
2. On étale les cellules sur un milieu nutritif complet additionné de néomycine, un antibiotique entrainant la mort
des cellules non transformées sensibles à la néomycine (sélection positive). et de ganciclovir entrainant la mort
des cellules n’ayant pas subit de recombinaison homologue avec la région cible grâce à la présence du gène TK
(sélection négative). En effet le gène de la TK est capable de transformer le gancylovir, en un composé toxique qui
bloque la réplication de l’ADN. Une cellule ES qui aura effectué une recombinaison homologue survivra car elle
sera résistante à l’antibiotique mais n’exprimera pas la TK et donc pourra se développer en présence de
ganciclovir. Par contre, une cellule ES qui aura incorporé la construction entière (avec le gène TK) dans un locus au
hasard dans son génome, mourra en présence de ganciclovir dans le milieu de culture. Une cellule ES qui n’aura
rien intégrer mourra à cause de la présence de l’antibiotique (néomycine).

Plasmide intégratif

4,9 kb
Gène cible ADN génomique de souris 129/Sv

7 kb

Figure 1: Schéma d’inactivation du gène cible. Les flèches représentent le site de reconnaissance par l’enzyme de
restriction EcoR1.
TD3 ex5

Plasmide intégratif
Gène cible NeoR Gène cible TK

Gène cible ADN génomique de souris 129/Sv

Plasmide intégratif
Gène cible NeoR Gène cible TK

Gène NeoR cible ADN génomique de souris 129/Sv

TD3 ex5

2. Construction des souris KO

a. Un clone de cellules ES transformées est agrégé à une blastula d’une souche CD1, génétiquement différente de la
souche 129SV, qui après implantation utérine conduit à la naissance d’un individu mâle G0.
- Précisez le génotype du mâle G0. On notera a+ l’allèle sauvage et a- l’allèle KO.

Le mâle G0 est une mosaïque cellulaire formée de nombreuses cellules a+//a+ issues de la blastula à laquelle on a
agrégé les cellules ES transformée et de cellules a+//a- issues des cellules ES transformées.

b. Ce mâle G0 est croisé avec une femelle de la souche CD1 et donne une portée de souriceaux G1.
Proposez une méthode permettant d’identifier les hétérozygotes a+/a- puis d’obtenir des souris KO pour le gène
cible et de les identifier.

Les souriceaux G1 hétérozygotes a+//a- sont identifiables par prélèvement de cellules de queue et culture de ces
dernières dans un milieu complet additionné de néomycine. En croisant entre eux deux individus G1 on obtiendra
des descendants G2 dont 25% seront homozygotes a-//a-, identifiables par un southern blot moyennant une sonde
marquée et enzyme de restriction.
TD3 ex5

Plasmide intégratif
Gène cible NeoR Gène cible TK

Gène cible ADN génomique de souris 129/Sv

Site de restriction Sonde marquée

Plasmide intégratif
Gène cible NeoR Gène cible TK

Gène NeoR cible ADN génomique de souris 129/Sv

4,9 kb
 Plasmide intégratif
Gène cible NeoR Gène cible TK

Gène cible NeoR Gène cible ADN génomique de souris 129/Sv