UNIVERSITÉ MOHAMMED V AGDAL

FACULTÉ DES SCIENCES

RABAT

N° d’ordre………..

THÈSE DE DOCTORAT

Présentée par

Amzal Hassane

Discipline : Biologie

Spécialité : Biochimie-Pharmacologie

Titre : Étude de l’activité antioxydante des saponines du tourteau

de l’arganier.

Soutenue le 24 /04/2010

Devant le jury,

Pr. ESSASSI El Mokhtar: Président :

Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR)
Pr. ALAOUI Katim
Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5s/FMP)
Pr. AMZAZI Saaid
Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR)
Pr. BAKRI Youssef Examinateurs
Professeur habilité (UM5a/FSR)
Pr. BENJOUAD Abdelaziz
Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR/CNRST)
Pr. TAGHZOUTI Khalid
Professeur de l’Enseignement supérieur (UM5a/FSR)

Faculté des Sciences, 4 Avenue Ibn Battouta B.P. 1014 RP, Rabat.
Tel : + 212 (0) 37 77 18 34/35/38, Fax : + 212 (0) 37 77 42 61, http://www.fsr.ac.ma
Avant propos :

Les travaux présentés dans cette thèse ont été effectués au laboratoire de biochimie immunologie
dans l’unité de formation et de recherche biochimie immunologie de la faculté des sciences de
rabat sous la direction du Professeur A. Benjouad.
En premier lieu, je remercie vivement, Monsieur le Professeur Benjouad A., directeur de ma
thèse, responsable de l’UFR "Biochimie-Immunologie", de l’attention et du soutien qu’il a portés
à mon travail de doctorant.
Je remercie vivement Madame la Professeure Alaoui K. du Laboratoire de Pharmacologie et
Toxicologie à la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat et DG de la Fondation
Mohammed VI pour la recherche et la sauvegarde de l’arganier, qui m’a fait l’honneur de me
proposé ce sujet.
Je remercie vivement Monsieur le Dr. Errachidi A. et Monsieur le Dr. Charof R du
Laboratoire de Biochimie et d’Hématologie à l’Institut National d’Hygiène.
Je remercie également Madame le Dr. Brahimi-Horn M. C. (CNRS UMR6543 Nice, France)
pour sa lecture critique des articles.
J’aimerais également remercier Monsieur le Pr. Bakri Y. qui a bien voulu accepter d’être le
rapporteur de cette thèse.
Les remerciements vont aussi aux membres du jury Messieurs le Pr. Essassi E., Pr. Amzazi S.
et Pr. Taghzouti K., qui donneront à mon travail une valeur ajoutée à travers leurs
recommandations et leurs remarques si importantes, dont je serai très reconnaissant.
Je remercie aussi ma mère, mes soeurs et mes frères de leur soutien.
Table des matières

Table des matières................................................................................................................. i

Abbréviations...................................................................................................................... iii
Liste des illustrations........................................................................................................... iv
Liste des tableaux................................................................................................................ vi
Remerciements................................................................................................................... vii
Glossaire............................................................................................................................ viii
Introduction ..........................................................................................................................1
Chapitre I. Revue bibliographique .......................................................................................5
1. Plante étudiée: ...................................................................................................................6
1.1 Présentation de la plante: ............................................................................................6
1.2 Distribution géographique: .........................................................................................8
1.3 Saponines:....................................................................................................................9
1.3.1 Distribution de saponines: .....................................................................................13
1.3.2. Propriétés biologiques et pharmacologiques des saponines: ...................................13
2. Radicaux libres et peroxydation lipidique: .....................................................................23
2.1. Définitions des radicaux libres: ................................................................................23
2.2. Les sources de radicaux libres:.................................................................................27
2.3 Les réactions radicalaires de l'oxygène: ...................................................................31
2.4 Peroxydation lipidique: .............................................................................................33
2.4.1 Peroxydation non-enzymatique: ............................................................................35
2.4.2 Peroxydation enzymatique: ...................................................................................37
2.5 Oxydation des protéines: ...........................................................................................38
2.6 Accumulation de protéines oxydées: .........................................................................40
2.7 Pathologies impliquant des métabolites réactifs d’oxygène: .....................................41
2.7.1 Les mécanismes de réactions des radicaux dans les cellules tumorales:...................42
2.7.2 Athérosclérose: .....................................................................................................43
2.7.3 Mécanismes de médiation des radicaux libres dans l’inflammation:........................44
2.7.4 Arthrite rhumatoïde:..............................................................................................45
2.7.5 Le vieillissement et les radicaux libres:..................................................................46
3. Les antioxydants: ............................................................................................................48

i
 3.1 Définition: ..................................................................................................................48
3.2 Antioxydants intracellulaires: ...................................................................................52
3.2.1 Systèmes enzymatiques:........................................................................................53
3.2.2 Antioxydants nonenzymatiques: ............................................................................56
4. Buts du travail:................................................................................................................61
Chapitre II. Matériel et méthodes.......................................................................................62
1. Produits chimiques et réactifs: ....................................................................................63
2. Matériel végétal:..........................................................................................................63
3. Mesure de la libération de l’hémoglobine par les globules rouges (GR): ...................64
4. Mesure de la perte en potassium par les GR:..............................................................65
5. Mesure de l’oxydation d'hémoglobine: .......................................................................65
6. Oxydation de la BSA: ..................................................................................................65
7. Oxydation d’une émulsion lipido-protéique: ..............................................................67
8. Hydroperoxydes de protéine: ......................................................................................67
9. Diènes Conjugués: .......................................................................................................68
10. Analyses statistiques:.................................................................................................68
Chapitre III. Résultats et discussions: ................................................................................69
1. Activité hémolytique des saponinnes d’Argania spinosa: ...........................................70
2. Oxydation de l’hémoglobine: ......................................................................................75
3. Oxydation de la BSA et de LnMe:...............................................................................78
4. Discussion: ...................................................................................................................85
7. Conclusions: ....................................................................................................................89
Bibliographie.......................................................................................................................91
Annexes: ........................................................................................................................109
Résumé:.............................................................................................................................111

ii
Abbréviations

AAPH 2,2' azo-bis-hydrochlorure (2-amidinopropane),

EDTA acide éthylène diamine tétra acétique

HbO2 oxyhémoglobine

iii
Liste des illustrations

1. Photographie d’Argania spinosa.

2. Photographie du fruit d’Argania spinosa.
3. Distribution d’Argania spinosa.
4. Structure chimique des saponines.
5. Structures chimiques des saponines d’Argania spinosa.
6. Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de l’oxygène impliqué en
biologie.
7. Lésions cellulaires induites par les radicaux libres.
8. Mécanisme en chaîne de la peroxydation des acides gras polyinsaturés et nature des produits
terminaux formés.
9. Les différentes étapes de la peroxydation des lipides.
10. Les espèces réactives, le dommage oxydatif et les réponses cellulaires au stress oxydatif.
11. Conséquences des effets des diverses espèces réactives sur le fonctionnent des protéines et
leur destin.
12. Structure de quelques antioxydants regroupés en fonction de leur caractère hydrophile ou
lipophile.
13. Les différents mécanismes d’actions possibles des antioxydants.
14. Antioxydants intracellulaires.
15. Mode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs cofacteurs
métalliques.
16. Effet hémolytique des saponines d'Argania spinosa évalué quantitativement par la libération
d'HbO2 (absorbance à 540 nm) en absence d'H2O2 avec un lissage par un modèle logistique à
quatre paramètres.
17. Effet des différents traitements sur l’absorbance à 540 nm induite par H2O2 à des temps
divers d’incubation (1 heure, 2 heures et 3 heures).
18. Effet des divers traitements sur la perte en potassium cellulaire induite par H2O2 après 1
heure.

iv
19. Spectre absorption d'oxyhémoglobine du contrôle après l'incubation de 7 heures à 37 °C
avec un lissage de Savitzky-Golay.
20. Effet des différents traitements sur l’absorption d’oxyhémoglobine à 540 nm après
incubation de 7 heures à 37 °C.
21. Effet de différents systèmes d’oxydant sur la solubilité BSA (quantifié avec la méthode de
folin-phénol) après incubation durant 6 heures.
22. Effet de différents agents incluant les saponines d'A. spinosa sur la solubilité BSA (quantifié
avec la méthode de folin-phénol) après 4 heures dans le système oxydant:.Cu2 +/H2O2
23. Effet des saponines d'A. spinosa et du trolox sur les hydroperoxydes protéine produite
(mM/mg BSA), (a ; 2,2' azo-bis-(2-amidinopropane) hydrochloride, i ; Fe2+ /H2O2, + ; plus
linolenic acid methyl ester, - ; absence of linolenic acid methyl ester) pendant une heure ou une
période d'incubation de quatre heures.
24. Effet des saponines d'A. spinosa et du trolox sur la formation de diènes conjugués par
l'émulsion de la BSA et du linoleate de méthyle ester après 1 et 6 h avec AAPH et Fe2+/H2O2
(a ; 2,2' azo-bis-(2-amidinopropane) hydrochloride (AAPH), i ; Fe2+ /H2O2).

v
Liste des tableaux

Tableau 1. Quelques propriétés biologiques et pharmacologiques des saponines (d’après

Pubmed).

Tableau 2. Les espèces réactives d'oxygène (ROS) et les espèces réactives d'azote (RNOS).

Table 3. Quelques pathologies associées aux dommages des radicaux libres.

vi
Remerciements

En premier lieu, je remercie vivement, Monsieur le Professeur Benjouad A., directeur de ma

thèse, responsable de l’UFR "Biochimie-Immunologie", de l’attention et du soutien qu’il a
portés à mon travail de doctorant.
Je remercie vivement Madame la Professeure Alaoui K. du Laboratoire de Pharmacologie et
Toxicologie à la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat et DG de la Fondation
Mohammed VI pour la recherche et la sauvegarde de l’arganier, qui m’a fait l’honneur de me
proposé ce sujet.
Je remercie vivement Monsieur le Dr. Errachidi A. et Monsieur le Dr. Charof R du
Laboratoire de Biochimie et d’Hématologie à l’Institut National d’Hygiène.
Je remercie également Madame le Dr. Brahimi-Horn M. C. (CNRS UMR6543 Nice, France)
pour sa lecture critique des articles.
J’aimerais également remercier Monsieur le Pr. Bakri Y. qui a bien voulu accepter d’être le
rapporteur de cette thèse.
Les remerciements vont aussi aux membres du jury Messieurs le Pr. Essassi E., Pr. Amzazi S.
et Pr. Taghzouti K., qui donneront à mon travail une valeur ajoutée à travers leurs
recommandations et leurs remarques si importantes, dont je serai très reconnaissant.
Je remercie aussi ma mère, mes soeurs et mes frères de leur soutien.

vii
Glossaire

Saponine. Glucoside qui mousse lorsqu’il est agité en solution aqueuse.

Antioxydant. Molécule qui ralentit ou empêche l’oxydation, la dégradation des aliments, de

certains composés organiques ou de certains matériaux.

Ischémie. Arrêt ou insuffisance localisée de la circulation sanguine.

Cardioplegique. Caractère d’une solution qui provoque la paralysie du myocarde.

Molluscicide. Caractère d’un produit létal pour les limaces et les escargots.

Organoleptique.Caractère d'un produit pouvant être apprécié par les sens humains.

viii
 Introduction

L’oxygène est essentiel pour la vie de tous les organismes eucaryotes. Cependant,
même dans les réactions métaboliques fondamentales se produisant dans les cellules,
les formes réactives de l’oxygène (ros : reactive oxygen species) sont capables
d'endommager diverses biomolécules telles que les protéines, les acides
désoxyribonucléiques (l'ADN) ou des acides gras polyinsaturés (Halliwell &
Gutteridge 1984a, Halliwell & Gutteridge 1984b, Halliwell & Gutteridge 1986,
Gutteridge & Halliwell 1990, Eze 1992, Gruber et al. 2008). En plus de la production
normale de radicaux libres dans la cellule durant la respiration et le métabolisme, les
quantités excessives de ros peuvent se former et leurs taux sont élevés durant le
stress oxydatif en raison de l’inflammation, l’activité physique intensive, l’ischémie
ou un traumatisme (Halliwell & Gutteridge 1984a). La carence en substances
nutritives protectrices nécessaires ou en d'autres substances antioxydantes dans le
régime alimentaire ou dans certaines conditions héréditaires pathologiques peuvent
aussi affecter négativement l’équilibre entre les prooxydants et les antioxydants dans
le corps. Si la quantité de radicaux libres et le stress oxydatif excèdent la capacité du
système de défense antioxydant du corps, des dégâts oxydatifs peuvent en résulter.
En effet, l’oxydation des lipides, des hydrates de carbone, des protéines et des acides
nucléiques a été associée à des maladies cardiovasculaires et neurologiques,
l’inflammation chronique et le cancer (Halliwell & Gutteridge 1984a, Halliwell &
Gutteridge 1984b, Butterfield et al. 2002, Butterfield 2002). Bien que la relation
entre le stress oxydatif et les maladies demeure imprécise (Gruber et al. 2008), les
radicaux libres sont produits en plus grandes quantités lors de certaines maladies
degeneratives.

1
Pour maintenir l'équilibre antioxydant-prooxydant, le corps humain est protégé
contre le stress oxydatif par un système d’antioxydant complexe (Buettner & Schafer
2000).
Des mécanismes protecteurs dans le corps humain bloquent la production de
radicaux libres, les dérivés réactifs, permettent la chélation des métaux de transition
nécessaires pour convertir les espèces peu réactives en d'autres, plus réactives,
réparent des dégâts des molécules cibles ou détruisent des molécules endommagées
(Halliwell & Cross 1994). Le système de défense antioxydant consiste en un réseau
enzymatique et non enzymatique aussi bien endogène qu'exogène, agissant
synergiquement (Masella et al. 2005). Des facteurs enzymatiques, par exemple, la
superoxyde dismutase (sod), la catalase et la glutathion peroxydase neutralisent les
résidus oxydant, tandis que des protéines comme l’albumine, la ceruloplasmine et la
transferrine participent à la défense antioxydante par la fixation des ions de cuivre et
de fer (Halliwell & Gutteridge 1984a). Un autre type de défense antioxydante est la
détoxification secondaire ou la neutralisation des produits des réactions des ros avec
les macromolécules (Halliwell & Gutteridge 1984a). L’antioxydant non
enzymatique, le tocophérol a une importance cruciale dans la protection de molécules
lipophiles (Halliwell 1993). En raison de son radical stable et de ses propriétés
moléculaires, il protège efficacement les membranes cellulaires contre l’oxydation.
L’ubiquinol-q10 et probablement les caroténoïdes ont aussi un rôle antioxydatif dans
l’organisme humain.
Dans le sérum humain et dans les liquides extra-cellulaires, les antioxydants
hydrophiles participent à la protection contre les dégâts oxydatifs. L’acide
ascorbique, aussi appelé vitamine C, agit comme un piégeur de radical libre et il est
souvent couplé au tocophérol. D’autres systèmes couplés existent tels que l’acide
urique/urate et la bilirubine contribuent à la capacité antioxydante du plasma. Les
vitamines C et E et les caroténoïdes ne peuvent pas être synthétisés dans le corps

2
humain, et doivent provenir du régime alimentaire. Les antioxydants sont très
variables de point de vue chimique et mécanismes d’actions.
L'arganier (Argania spinosa (L.) Skeels) est un arbre appartenant à la famille des
sapotacea. Il est endémique du Maroc (région du sud-ouest et en particulier la plaine
du Souss) et de l'Algérie (dans la région de Tindouf sud-ouest du pays). Son huile est
utilisée depuis des siècles par les femmes berbères pour ses propriétés cosmétiques et
alimentaires. Cette huile est riche en acides gras essentiels oméga-6 et en
tocophérols, antioxydants recommandés pour prévenir le dessèchement prématuré de
la peau. Elle ralentit le vieillissement cutané, et améliore l'hydratation. Son pouvoir
hydratant et antioxydant compense la dénutrition de la peau. Les qualités
organoleptiques font de l'huile d'argan une huile appréciée dans l'art culinaire.
L'huile d'argan contient 43% d’acide oléique (Oméga-9), 36% d’acide linoléique
(Oméga-6) et le reste étant leurs formes mono-glycérique respective (Khallouki et al.
2003). Elle contient, en plus de ces acides gras, des tocophérols (vitamine E), du
squalène, des stérols et des polyphénols. Même si l’huile (Drissi et al. 2004,
Berrougui et al. 2006) et les saponines extraites de l’arganier ont des propriétés
antioxydantes (Alaoui et al. 1998b), aucune étude ne s’est intéressée à la synergie
qui peut exister entre les antioxydants et les saponines, ni à leur effet sur la
peroxydation lipidique et l’oxydation des protéines.

3
 Buts

La majorité des médicaments actuels dans leur majorité proviennent à leur origine
des plantes médicinales.
Une meilleure valorisation des plantes médicinales marocaines passent par leurs
études scientifiques. La plante étudiée Argania spinosa est certes endémique du
Maroc, elle est généralement connue et elle est utilisée dans l’alimentation animale et
humaine, mais cela n’empêche pas sa régression. Or cette plante par ces multiples
vocations therapeutique et alimentaire permet une augmentation de la biodiversité et
le maintient du sol nécessaire pour la pérennité de cette espèce et de son utilisation.

4
Chapitre I. Revue bibliographique

5
1. Plante étudiée:

1.1 Présentation de la p lante:

L'arganier est un arbre aux rameaux épineux de 8 à 10 m de haut, aux feuilles

atténuées en un court pétiole, très résistant et ayant une longévité de 150 à 200 ans
(Figure 1).

Figure 1. Photographie d’Argania spinosa (Lieu : Maroc, Anti Atlas).

L'arganier est un arbre thermophile et xérophile, de bioclimat aride chaud et tempéré

(le long du littoral et dans les plaines), à semi-aride chaud et tempéré (flancs du

6
Haut-Atlas et de l'Anti-Atlas). Les fleurs blanches à jaune verdâtre sont
hermaphrodites, gamopétales à tube très court et sont réunies en glomérules. La
période de floraison se situe durant mai-juin. Le fruit, l’affiache, est une fausse drupe
ovale, fusiforme de 30 mm de long environ, jaune-brun à maturité contenant une
noix dure protégeant deux ou trois « amandons » (Figure 2). Un arbre en produit
approximativement 8 kg par an.

Plusieurs effets biologiques de cette plante ont été rapportées (Berrougui et al. 2003,
Berrougui et al. 2004, Drissi et al. 2004, Drissi et al. 2006, Samane et al. 2006,
Berrougui et al. 2006), elle possède une multitude de propriétés, parmi lesquelles,
• Anti-inflammatoire
• Analgésique et antiœdémateux
• Hypoglycémique
• Antiradicalaire et antioxydante
• Antitumorale et cytotoxique
• antiproliférative (cancer de la prostate humaine)
• hypolipémiante, réduit le LDL et améliore l’homéostasie du cholestérol.

7
 Figure 2. Photographie du fruit d’Argania spinosa (affiache)

Son système racinaire est particulièrement profond, mais dépourvu de poils

absorbants (racines « magniloïdes»). Il bénéficie d'une symbiose avec différents
champignons qui pallient les déficiences nutritives.

1.2 Dist ribution géographique:

Aujourd'hui, la plus grande concentration d'arganiers se trouve dans la région du

Souss où elle couvre près de 800 000 hectares, soit 14,25 % de la forêt du Maroc
(figure 3). Dans cette région, l'aire de l'arganier s'étend de l'oued Tensift au nord, à
Tiznit et Tafraout au sud, et aux abords du djebel Siroua à l'est. L'arganier pousse
depuis le niveau de la mer jusqu'aux environs de 1 500 m d'altitude.

8
 Figure 3. Distribution d’Argania spinosa (d’après Msanda et al., 2005).

1.3 Saponines:

Argania spinosa est riche en saponines (Charrouf et al. 1992a), un groupe important
de glycosides, largement distribué dans les plantes supérieure. Elles sont considérées
responsables de nombreuses propriétés pharmacologiques (Sparg et al. 2004).
Les saponines constituent une importante classe de métabolites secondaires d’origine
végétale et animale, de masse moléculaire entre 600 à 2000 Daltons et de structure
complexe. Ce n’est que dans les années 70 avec l’aide des techniques de dégradation
chimiques que leurs structures furent déterminées.
Les saponines sont des hétérosides complexes, appartenant aux terpènes cycliques
(nom générique donné aux hydrocarbures saturés cycliques ou acycliques ayant pour
motif de base le terpène) ou aux stéroïdes, se trouvant chez de nombreux végétaux
(salsepareille, saponaire, quinoa, etc.) sous forme d'hétérosides (saponosides). Les

9
Saponines ont été recherchées comme des détergents (Sparg et al. 2004) comme le
fut la Saponaire (Saponaria officinalis L.), qui a été largement employée pendant des
siècles. Les saponines ont aussi été recherchées par l’industrie pharmaceutique parce
qu’elles forment le point de départ de l’hémi-synthèse des médicaments stéroïdiens.
Elles présentent plusieurs propriétés pharmacologiques et sont employées dans la
phytothérapie et dans l'industrie cosmétique. Elles formeraient les principaux
constituants de plusieurs remèdes issus des plantes et elles sont considérées
responsables de nombreuses propriétés pharmacologiques (Estrada et al. 2000). Les
saponines et les polyphénols sont considérés des éléments clefs dans la pharmacopée
traditionnelle chinoise et sont responsables de la plupart des effets biologiques
observés (Liu et al. 2002b). Ainsi, la racine de ginseng (Panax ginseng, Araliaceae)
est l’un des plus importants remèdes traditionnel oriental, souvent utilisé dans les
asthénies fonctionnelles, elle est utilisée dans le monde entier (Fukuda et al. 2000).
Les saponines peuvent être classées en deux groupes en se basant sur la nature de
leur squelette aglycone. Le premier groupe est constitué par des saponines
stéroïdiennes, qui se rencontrent presque exclusivement dans les monocotylédones
angiospermes. Le deuxième groupe est les saponines triterpenoides, qui sont le plus
commun et on le rencontre chez les dicotylédones angiospermes (Sparg et al. 2004).
Quelques auteurs distinguent un troisième groupe appelé amines stéroïdiennes, qui
est classé par certains auteurs comme des alcaloïdes stéroïdiennes (Sparg et al. 2004).
Les saponines stéroïdiennes consistent en aglycone stéroïdien, un squelette C27
spirostane et généralement avec l'inclusion aussi d'une structure à six cycles (Figure
4, structure A). Dans quelques cas, dans les matériaux frais des plantes, le groupe
hydroxyle situe à la position 26 et s’engage dans une liaison glycosidique ainsi la
structure de l’aglycone reste pentacyclique. Cela a été mentionné comme un squelette
furostane (Figure 4, structure B). Les saponines triterpenoides consistent en un
aglycone triterpenoide, formé d’un squelette C30, et l'inclusion d'une structure
pentacyclique (Figure 4, structure C).

10
Figure 4. Structure chimique des saponines. Squelette aglycone (A), spirostane
stéroïdien, (B) furostane stéroïdien et saponines triterpenoides(C). R = sucre.

11
 Composé Nom R1 R2 R3
1 Arganine A Glc OH Rha
2 Arganine B Glc OH Api
3 Arganine C H OH Rha
4 Arganine D Glc H Rha
5 Arganine E Glc H Api
6 Misaponine A H H Rha
7 Arganine F H H Api

Figure 5. Structures chimiques des saponines d’Argania spinosa (d’après (Charrouf

et al. 1992b).

12
1.3.1 Distribution de saponines:

Les Saponines sont distribuées dans une large variété de produits alimentaires et dans
plusieurs familles de plantes différentes incluant l'asperge, les haricots, les mûres
sauvages, les pois, les pommes de terre, la betterave sucrière et le thé (Dini et al.
2001).

1.3.2. Propriétés biologiques et pharmacologiques des saponines:

Compte tenu de leur diversité chimique, les saponines présentent de multiples

propriétés biologiques et pharmacologiques (voir tableau 1)

Tableau 1. Quelques propriétés biologiques et pharmacologiques des saponines

(d’après Pubmed).

Effet sur le système de transport du glucose Diurétique

Effet sur le système adrénocorticotrope Cholérétique
Régulateur de la croissance des plantes Analgésique,Sédative
Effet sur la fragilité des capillaires Anti exsudatif, Expectorant
Spermicide et contraceptive Répulsif
Réduction du cholestérol Hémolytique
Réduction de l’alcoolisme Anti-inflammatoire, Antiœdémateux
Antileshmanien, Molluscicide Insecticide
Antivirale , Antifongique Anti protozoaire
Antiulcéreux, Immuno-modulateur Effet cardiovasculaire
Antitumoral et cytotoxique Antivieillissement
Hypoglycémique, Edulcorant Antimicrobien

13
1.3.2.1 Activité antioxydante et antiradicalaire:

Les saponines du ginseng vietnamien (Panax vietnamensis, Araliaceae) présentent

une action protectrice à la dose de 0.05-0.5 mg/ml contre les radicaux libres in vivo
et in vitro (Huong et al. 1998). Cependant, l'activité est attribuée aux composants
mineurs.
Certains ginsenosides utilisés comme des agents additifs dans des solutions
cardioplegiques, peuvent diminuer la toxicité des radicaux libres d'oxygène dans un
modèle expérimental d’ischémie-reperfusion, en augmentant la concentration de la
SOD dans le myocarde (Gulcin et al. 2004). L'acide arjunolique possède la capacité
de réduire la toxicité oxydative induite par l’arsenic dans le cerveau murin et cela
est en raison probablement de son activité antioxydante et de sa capacité de
normaliser les indices de stress oxydatif (superoxyde dismutase, catalase,
glutathion-S-transférase, glutathion peroxydase, glutathione réduit, thiols totaux,
glutathione oxyde,…) par un traitement avec l’acide arjunolique à la dose de 20
mg/kg par poids du corps durant 4 jours (Sinha et al. 2008).
L’alpha-hederin, l’hederasaponin-C, l’hederacolchisides-E et F présentent une forte
activité antioxydante totale (Gulcin et al. 2004). À la concentration de 75 pg/mL,
ces saponines ont montré respectivement 94, 86, 88 et 75% de l’inhibition de la
peroxydation de l’émulsion de l’acide linoléique.
Les saponines d'argania spinosa inhibent la dégradation du liquide synovial par les
radicaux hydroxyles (IC20 ≥ 6 microM), et ont une action antiradicalaire contre les
radicaux diphenylpicrylhydrazyles (DPPH) (IC25 = 85 mM) et contre les radicaux
.
OH (IC25 = 0.56 M) (Alaoui et al. 1998b).

14
1.3.2.2 Activité anti-inflammatoire :

Aux doses orales de 50 à 300 mg/kg, les saponines d'Argania spinosa ont une action
analgésique périphérique équivalente à celle de l’acide acétyle salicylique. La
protection maximale a été obtenue à la dose de 500 mg/kg per os. Une diminution de
l’œdème (œdème induit par la carragénine ou le trauma expérimental chez les rats) a
été observée aux doses de 10 mg/kg per os. Aux doses de 50 à 100 mg/kg per os,
l'effet antiinflammatoire était semblable à celui de l’indométacine aux doses de 10 à
20 mg/kg per os (Alaoui et al. 1998b).
Just et al. ont montré qu’une saponine bidesmosidique, la Fruticesaponine B isolée de
Bupleurum fruticescens L. (Apiaceae), avait l'activité anti-inflammatoire la plus
importante de toutes les saponines évaluées dans les essais d'œdème chez la souris
(Just et al. 1998). Ils ont suggéré que l'activité anti-inflammatoire des saponines
isolées de Bupleurum fruticescens est liée à leurs structures chimiques (Just et al.
1998). In vivo, les saponines isolées de Bupleurum rotundifolium L. (Apiaceae) ont
montré une activité anti-inflammatoire contre l'oedème d'oreille induit par 12-O-
tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) et l'inflammation chronique de la peau
(Navarro et al. 2001). Des sept saponines évaluées, cinq étaient assez actives dans la
réduction de l'œdème d'oreille induit par le TPA. Les saponines ont produit une
réduction dose dépendante de l’oedème. Seulement deux saponines étaient actives
dans la réduction de l’inflammation chronique de la peau et ont aussi causé une
diminution parallèle de l'infiltration des neutrophiles. Aescin, un mélange de
saponines triterpenoides qui forme le principal actif d'Aesculus hippocastanum L.
(pocastanaceae) responsable de l'activité anti-inflammatoire, possède des propriétés
anti-œdémateuses et veinotonique (Sirtori 2001).
Une saponine stéroïdienne isolée des feuilles d'Agave attenuata (Agavaceae) inhibe
l'augmentation de la perméabilité vasculaire causée par l'acide acétique (da Silva et
al. 2002). Cependant, elle n'a pas été accompagnée par un effet hémolytique

15
indésirable. La saponine triterpenoide loniceroside C isolée des parties aériennes de
Lonicera japonica (Caprifoliaceae), une plante médicinale connue comme agent anti-
inflammatoire pendant des siècles, a montré une activité anti-inflammatoire
lorsqu'elle est évaluée in vivo par le test de l'œdème d'oreille de la souris provoqué
par l’huile de croton (Kwak et al. 2003). Le Loniceroside C a inhibé l’oedème
d'oreille (15-31 %) à des concentrations de 50-200 mg/kg.
Ahn et al. ont examiné l'activité anticomplémentaire des saponines du ginseng
(Panax ginseng, Araliaceae) (Ahn et al. 1998). Parmi les saponines évaluées, Le
Ginsenoside Ro et l'acide oléanolique ont montré la plus importante activité
anticomplémentaire (Ahn et al. 1998). Kim et al. (Kim et al. 1998) ont suggéré que
l'activité anti-inflammatoire des saponines serait probablement liée à l'activité
anticomplémentaire de la voie classique d'inflammation.

1.3.2.3 Activité hémolytique:

Les saponines ont la capacité de lyser les érythrocytes (Ahn et al. 1998, Sindambiwe
et al. 1998, Estrada et al. 2000, Molgaard et al. 2000, Woldemichael & Wink 2001).
Cela a permis le développement d’essais hémolytiques pour détecter leur présence
dans des médicaments ou dans les extraits de plantes. Un mélange de saponines
oléanoliques a montré une activité hémolytique plus importante qu'un mélange
dialysé de saponines Merck (Voutquenne et al. 1998) , ce qui laisse suggérer la
diversité des mécanismes impliqués.
Quelques études de relations entre l’activité et la structure ont conclu que dans le cas
des maesa-saponines isolées de Maesa lanceolata (Apers et al. 2001), les
substitutions à la position C-22 semblent être une particularité structurelle essentielle
qui influe l’activité hémolytique.
Les propriétés hémolytiques sont généralement attribuées à l'interaction entre les
saponines et les stérols de la membrane érythrocytaire (Sparg et al. 2004). Les

16
recherches ont montré que les dégâts de saponines à la bicouche lipidique sont
irréversibles. Oda et al. ont indiqué que l’activité adjuvante n’est pas liée à l'activité
hémolytique (une molécule est dite adjuvante si elle augmente l'activité du composé
actif en sa présence) (Oda et al. 2000). Le niveau d’activité hémolytique a été
attribué au type d'aglycone et la présence de chaînes de sucre. Les Saponines avec un
résidu acyles ou un cycle oxyde ont montré une activité hémolytique, à part le
lablaboside D, qui en n'a pas montré malgré la possession d'un résidu acyle. L’Escin,
des saponines d’Aesculus hippocastanum L. (Hippocastanaceae) et jujuboside, une
saponine de Zizyphus jujuba (Rhamnaceae) ont une forte activité hémolytique (Oda
et al. 2000).
Ahn et al. ont examiné l'effet inhibiteur des saponines de Bupleurum falcatum L.
(Apiaceae) sur l'activité d'adhésion d'anti-cellulaire et sa relation avec l'effet
hémolytique (Ahn et al. 1998). Les Saikosaponines D et E isolées, présentent des
activités adhésives anticellulaires et hémolytiques très importantes. Ces résultats
laissent suggérer que le mécanisme d'activité adhésive anticellulaire est similaire à
l'effet hémolytique (Ahn et al. 1998).

1.3.2.4 Activité molluscicide:

Bien qu’elles soient toxiques vis-à-vis des espèces poïkilothermes, les saponines en
prise orale le sont faiblement pour les espèces homéothermes (Sparg et al. 2004), ce
qui est probablement lié à leurs faibles absorptions. Les saponines sont très toxiques
pour les mollusques (Sindambiwe et al. 1998, Molgaard et al. 2000, Treyvaud et al.
2000, Apers et al. 2001, Huang et al. 2003) et elles ont été testées comme des
molluscicides dans le contrôle des schistosomiases (Sindambiwe et al. 1998).
Molgaard et al. ont examiné la biodégradabilité des extraits aqueux des baies de
Phytolacca dodecandra et ont montré que les saponines de l'extrait aqueux de

17
Phytolacca dodecandra sont moluscicides et aisément biodégradables (période de
demi-vie de 15.8 h) (Molgaard et al. 2000).
Les saponines triterpenoides, hederagenin isolées de Sapindus mukorossi Gaertn
(Sapindaceae) ont des effets molluscicides contre l'escargot du pommier (Pomacea
canaliculata) qui est devenu l'un des principaux parasites du riz et d'autres récoltes
aquatiques partout dans le Taiwan et dans des parties de l'Asie (Huang et al. 2003).
Les sept saponines isolées, sont des hederagenines, incluant une nouvelle saponine
hederagenine, ont abouti à une mortalité de 70-100% à 10 ppm contre les escargots
parasitant les pommes (Huang et al. 2003). Les saponines Hederagenin comportant
trois fragments de sucre ont une activité molluscicide plus importante que les
saponines triterpènes avec un seul fragment de sucre (Huang et al. 2003).

1.3.2.5 Activité antimycotique:

Bader et al. ont montré que l'activité antimycotique de saponines contre Candida
albicans peut être sous l'influence de la variation des unités hétéroglycosidiques et les
acyles glycosidique liés au carbone C-28 de l'aglycone (Bader et al. 2000).
Une fraction des saponines, contenant principalement des saponines
monodesmosidiques, ont été évaluées l’effet contre la levure et l'activité
antimycotique. La fraction contenant des saponines a montré une activité inhibitrice
sur la croissance de plusieurs levures, aussi bien que sur quelques moisissures
dermatophytiques (la valeur de la CMI est comprise entre 31.3 et 125 ug/ml).
Certaines saponines monodesmosidiques ont été isolées de Hedera colchica
(Araliaceae), et ont été évaluées pour leur activité antimycotique et anti-protozoaire
(Mshvildadze et al. 2000). Bien que les composés aient montré une activité
antimycotique inférieure que ceux des agents antimycotiques de référence. Cette
activité serait liée à la structure de ces saponines. Les saponines triterpenoides des
graines de Chenopodium quinoa Willd (Chenopodiaceae) n'ont montré qu'une faible

18
activité antimycotique sinon aucune (Woldemichael & Wink 2001). Alors que le
mélange brut de saponines a empêché la croissance de Candida albicans à 50 ug/ml.
Les composés purs n’ont montré qu’une faible activité sinon aucune, ce qui suggère
un effet de synergie possible entre ces molécules.

1.3.2.6 Activité antimicrobienne et antiparasitaire:

Les Saponines peuvent avoir une activité antimicrobienne (Killeen et al. 1998). Trois
saponines 5-spirostan-3-ol ont montré une activité antimicrobienne, aussi bien sur
des organismes procaryotes qu’eucaryotes, mais seulement à des faibles densités
cellulaires. Trois nouvelles saponines triterpenoides, Nudicaucins A, B et C et une
saponine guaiacin D connue ont été isolées d'Hedyotis nudicaulis (Rubiaceae) et
évaluées contre Bacillus subtilis (Sparg et al. 2004). Les saponines isolées ont
présenté une faible activité antibactérienne. Les résultats ont indiqué que la saponine
tetraglycoside a une activité plus importante que la saponine triglycoside. Une
saponine, jujubogenin, isolée de Colubrina retusa L. (Rhamnaceae), a montré une
activité antimycobacterienne avec une CMI de 10 ug/ml (ElSohly et al. 1999).
Trois saponines isolées de Hedera helix L. (Araliaceae), l’hederin et hedeacolchiside
A1, ont montré une activité antileishmaniale (Delmas et al. 2000). Les résultats ont
montré que ces saponines présentent une forte action antiproliférative à toutes les
étapes de développement du parasite Leishmania infantum. L'action des saponines
était due aux changements dans l'intégrité de la membrane et du potentiel
membranaire. L’hederacolchiside A1 avait l'activité la plus forte, contre la forme
promastigote (IC50 de 1.2 ± 0.1 uM) et amastigote du parasite (IC50 de 0.053 ± 0.002
uM). Ces observations suggèrent que ces saponines peuvent être considérées comme
des médicaments potentiels anti-leishmanial.

19
1.3.2.7 Activité antitumorale et cytotoxicité:

De nombreuses études mettent en évidence le caractère fortement cytotoxique de

plusieurs saponines. Cependant, elles n'ont pas toujours des propriétés anti-
tumorales.
Mimaki et al. ont évalué l’activité cytotoxique de neuf saponines triterpènes isolées
des racines de Pulsatilla chinensis (Bunge) (Ranunculaceae) (Mimaki et al. 1999).
Toutes les saponines évaluées présentent une activité cytotoxique modérée avec des
valeurs de IC50 de 2.3 à 7.8 ug/ml, à l'exception d’une saponine qui n'avait aucun
substituant au C-2 du fragment arabinosyle attachée à l'aglycone. Les résultats
suggèrent que le fragment glycoside attaché au C-3 de l'aglycone serait essentiel pour
l'activité cytotoxique des saponines testées.
Des saponines triterpenoides cytotoxiques ont été isolées d'un extrait méthanolique
des parties aériennes de Trevesia palmata (Araliaceae) (De Tommasi et al. 2000).
Six nouvelles saponines bisdemosidiques, et deux saponines triterpenoides connus,
ont été évaluées pour leurs activités antiproliférative contre trois lignées de cellule
(J774, HEK-293 et WEHI-164). Les résultats de cette étude ont montré que le groupe
hydroxyle et le saccharide estérifié liés à C-28 jouent un rôle important dans l'activité
antiproliférative.
Mimaki et al. (Mimaki et al. 2001) ont systématiquement examiné les activités
cytotoxiques de quelques saponines stéroïdiennes isolées des plantes de la famille des
Liliaceae. Quelques saponines ont montré une activité cytotoxique importanate
contre les cellules cancereuses HL-60. L'activité cytotoxique semble être liée, aussi
bien à la présence, l’ordre des fragments mono-saccharidiques, qu'à la structure de
l'aglycone.
Les saponines triterpènes isolées de Silene fortunei (Caryophyllaceae) augmentent
l'accumulation cellulaire et l'activité cytotoxique de l'anticancéreux la cisplatine
(Gaidi et al. 2002). Seules, les saponines n'ont pas d’activités cytotoxiques

20
significatives. Quatre nouvelles saponines stéroïdiennes ont été isolées des rhizomes
de Tacca chantrieri (Taccaceae) (Yokosuka et al. 2002). Les composés isolés ont été
évalués pour leur activité cytotoxique contre les cellules cancéreuses HL-60. Un de
ces composés a montré une cytotoxicité considérable (IC50 de 1.8 uM). Deux autres
saponines, qui ont été structurellement proches de la saponine active, n'ont pas
montré d'activité inhibitrice de la croissance cellulaire à 10 ug/ml. Ces données
suggèrent que la structure de l'aglycone et les fragments de sucre contribuent à
l'activité cytotoxique des saponines, et des différences structurelles même légères
peuvent affecter cette activité.
Trois nouvelles saponines, isolées des fruits d'Acacia concinna (Leguminosae), ont
été évaluées pour l'activité cytotoxique contre des cellules HT-1080 de fibrosarcome
humain (Tezuka et al. 2000). Toutes les trois saponines, kinmoonosides A, B et C ont
montré une cytotoxicité significative avec les valeurs d'ED50 de 0.7, 0.91 et 2.83 uM,
respectivement. Il a été suggéré que le fragment ester liée au carbone 21 de
l'aglycone n'est pas crucial pour la cytotoxicité, mais peut plutôt l’augmenter
(Tezuka et al. 2000).
Les saponines d’Argania spinosa ont une activite antiproliferative contre la lignée
celullaire PC3 (cancer de la prostate) avec une GI50 de 18 microg/ml (Drissi et al.
2006).

1.3.2.8 Activité antivirale:

Les saponines triterpenoides isolées de plantes brésiliennes et chinoises présentent

des activités antivirales différentes (Simoes et al. 1999). Les saponines de type
oleanane empêchent la synthèse de l’ADN du virus de l’herpès du type 1, tandis que
saponine de type ursane empeche la synthèse de protéines capsidaires. Les saponines
triterpenoides de la famille des Fabaceae ont montré une activité anti-herpètique
(Kinjo et al. 2000) et leur structure influerait sur cette activité. Ainsi, les Saponines

21
contenant un sucre montrent une plus grande activité anti-herpètique. Les saponines
triterpenoides isolées des feuilles de Maesa lanceolata (Myrsinaceae) ont été
évaluées pour des études de la relation activité et structure moléculaire contre HSV-1
(pour l'activité virucide extra-cellulaire) et des virus HIV (Apers et al. 2001). Ils ont
conclu que l’hydroxyle situé au carbone 16 et l’acylation de l’hydroxyle situé au
carbone 22 semblent être essentiels pour l'activité antivirale (Apers et al. 2001).
Arganine C, une saponine isolée des fruits de Tieghemella heckelii (Sapotaceae)
qu’on retrouve auusi dans Argania spinosa présente une activité antivirale (Gosse et
al. 2002). Cette saponine, a fortement empêché l'entrée du virus HIV dans des
cellules dans un essai de fusion de cellule et n'a montré aucune cytotoxicité
significative contre des cellules HeLa-CD4+ .

22
2. Radicaux libres et peroxydation lipidique:

2.1. Définitions des radi cau x lib res:

Un radical est une molécule possédant un ou plusieurs électrons non appariés sur ses
orbitales électroniques externes. La présence d'un électron célibataire confère
souvent à ces molécules, une grande instabilité, elles ont la possibilité de réagir avec
de nombreux composés dans des processus le plus souvent non spécifiques, et que,
donc, leur durée de vie en solution est très courte (Halliwell 1993). Ce caractère
chimique rend les radicaux libres fortement réactifs. La réactivité varie d'un radical
libre à un autre et dépend de l’environnement où ils sont présents. Les dérivés
réactifs de l'oxygène (dro) (reactive oxygen species, ros) (Tableau 2 et figure 6) sont
pour la plupart des radicaux chimiques dérivés de l'oxygène.

23
Figure 6. Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de
l’oxygène impliquées en biologie.

24
 Tableau 2. Les espèces réactives d'oxygène (ROS) et les espèces réactives d'azote
(RNOS)
Espèces réactives Propriétés
O2• Produit par la chaine de transport d’électrons et d’autres sites. Ne peut
anion Superoxyde pas diffuser du site d’origine. Génère les ROS.
H2O2 N’est pas un radical libre, mais peut en générer en réagissant avec des
Peroxyde d’hydrogène métaux de transitons, peut diffuser à travers les membranes.
•
OH L’espèce la plus réactive dans l’attaque des molécules biologique, produit
Radical Hydroxyles à partir de H2O2 dans la réaction de fenton en présence de Fe2+ or Cu2+.
RO•, R•, R-S• Radical organique libre (R correspond au substituant) Produit à partir de
Radicaux organiques ROH, RH (e.g. au carbone d’une double liaison dans un acide gras) ou
de RSH par une attaque de •OH
RCOO• Un radical organique peroxyle, produit durant la dégradation lipidique
Radical peroxyle (nommé aussi LOO•)
HOCl Produit dans les neutrophiles durant le sursaut respiratoire pour détruire
acide Hypochloreux les organismes invasifs. La toxicité s’effectue à travers des réactions
d’halogénations et d’oxydations. L’espèce réactive est OCl
1
O2 Oxygène avec des spins antiparallèles. Produit à des pressions
oxygène Singulet importantes en oxygène sous l’effet de l’absorption des rayons UV. Il
disparait trop vite pour être toxique in vivo.
NO RNOS. Un radical libre endogène produit par l’oxyde nitrique synthétase.
Nitrique oxyde Se lie aux ions métalliques, se combine avec O2 ou aux autres radicaux
contenant l’oxygène pour produire RNOS
ONOO- RNOS. Un agent oxydant puissant qui n’est pas un radical libre. Il peut
Peroxynitrite générer NO2 (dioxyde de nitrogène), qui est un radical.

25
Certains dérivés réactifs de l'oxygène (dro), comme le peroxyde d'hydrogène (H2O2)
n’est pas un radical au sens chimique. En effet, cette molécule, bien que réactive et
toxique, n'a pas de caractère radicalaire. Les dro sont des espèces chimiques à très
forte réactivité capables d'oxyder les protéines, l'ADN et les membranes des cellules
(attaque des lipides constitutifs) (peroxydation lipidique): c'est une des théories
actuelles du vieillissement (sénescence). Ils sont associés à plusieurs pathologies
(tableau 3).
Tableau 3. Quelques pathologies associées aux dommages des radicaux libres

Athérogenèses Bronchite et emphysème

Dystrophie musculaire du type Maladies neurodégénératives

Duchenne Maladie d’Alzheimer
Vieillissement Syndrome de down
Maladie d'Alzheimer Sclérose amyotrophique latérale (Maladie de
Fibroplasie rétrolentale Lou Gehrig’)

Hémodialyse Sclérose en plaques multiple

Grossesse/ pré-éclampsie Maladies du foie induit par d'alcool

Echec rénal aigu Dommages d'ischémie/reperfusion

Désordres cérébrovasculaires Maladie d’Oxphos (mutation de l’ADN

Cancer cervical mitochondrial et/ou nucléaire affectant la

phosphorylation oxydative)

26
2.2. Les sou rces de radicau x lib res:

Le métabolisme aérobique de chaque organisme produit des ros. Ils sont

principalement formés d’une manière endogène, comme des sous-produits des
chaînes de transport des électrons de la respiration cellulaire dans les mitochondries
(Halliwell 1993). Les ros sont aussi produites dans différentes réactions
enzymatiques par la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), les
oxydases et d'autres enzymes d'oxydation localisées dans les phagocytes, les
fibroblastes, les cellules musculaire lisse et les cellules endothéliales (Halliwell &
Cross 1994). La NADPH oxydase des phagocytes source de la production du radical
superoxyde est la production la plus significative des dro dans le système vasculaire;
la xanthine oxydase, la myeloperoxidase et l'oxyde nitrique synthétase entre autres
produisent des dro et les dra (dérivées d’oxygène réactif et dérivées d’azote réactif
respectivement) dans le corps humain. Les réactions d’auto-oxydation de molécules
comme les catécholamines, tétrahydrofolates, quinones, thiols ou les flavines
produisent aussi des radicaux libres capables d’initier des réactions oxydatives
(Halliwell & Cross 1994). La lipoxygénase et la cyclooxygénase sont impliquées
dans la synthèse des leucotriènes et des prostaglandines, qui ont des fonctions par
exemple dans la médiation de l’inflammation et la régulation de la tonicité vasculaire
et l’accumulation de plaquettes sanguines ; certains d'entre eux sont capables
d'oxyder les LDL (low density lipoproteins) (Stocker et al. 1991). Les métaux de
transition comme le fer et le cuivre catalysent des réactions oxydatives dans
l’organisme humain même si le les quantités d'ions de métal de transition libres dans
le corps sont faibles, ils sont stockés dans l’hème, de plus l'hémoglobine ou la
myoglobine peuvent amorcer des réactions oxydatives (Halliwell 1993, Halliwell &
Cross 1994).

27
L’exposition à l’ischémie, aux infections et l'exercice excessif peuvent provoquer
une production accrue de ros. La production exogène des ros résultent de l’exposition
, aux rayons ionisants (ultra-violet [uv], visible, thermal, gamma, x), aux métaux de
transition ou a l’oxygène en quantité excessive, a certaines médicaments (par
exemple le paracétamol), aux produits chimiques toxiques (Freeman & O'Neil 1984,
Bus & Gibson 1984, Burdon et al. 1990, Mason et al. 1994, Fukushima et al. 1995).
La production endogène des radicaux est considérée significativement plus
importante en comparaison à celle d’origines exogènes. L’espèce réactive la plus
fréquente dans l’organisme est le radical superoxyde, O2·- . La source primaire de
ros, dans sa forme superoxyde, est le complexe NADPH oxydase qui catalyse la
réduction à un électron de l’oxygène moléculaire (équation 1). Les électrons
nécessaires pour la production d'o2-· sont fournis par le NADPH (équation. 2) :

O2 + e- → O2•- (1)

2 O2 + NADPH → 2 O2•- + NADP+ + H+ (2)

O2•- lui-même a une réactivité plutôt faible, mais il est capable de réagir plus loin en
dismutant en H2O2 (équation 3) :

2O2•- + 2 H+ → H2O2 + O2 (3)

Bien que H2O2 lui-même ne soit pas fortement réactif, il peut diffuser, provoquer la
formation de radicaux en présence des métaux de transition (cuivre ou le fer) dans
des tissus ou dans des liquides et former les radicaux hydroxyles (OH·), selon la
réaction fenton (équation 4):

28
 Fe2+ + H2O2 + H+ → Fe3+ + OH• + H2O (4)

La formation d'OH• dépend ainsi de la disponibilité d’ions Fe2+. Il est possible que
les produits de cette réaction réagissent plus loin (équation 5), aboutissant à la
formation d'ion ferryl réactif:

Fe3+ + OH• → Fe2+-O + H+ (5)

Une autre réaction aboutissant à la formation de radical hydroxyle a lieu entre le

peroxyde superoxyde et l’hydrogène en présence de catalyseurs de métal de
transition (cuivre, fer,…) (réaction de haber-weiss, équation 6) :

O2•- + H2O2 + H+ → O2 + OH• + H2O (6)

Les ions de métal de transition oxydés (fe3 +, cu2 +) peuvent aussi réagir avec O2•-
et être réduit (équations 7 et 8) :

Fe3+ + O2•- → Fe2+ + O2 (7)

Cu2+ + O2•- → Cu+ + O2 (8)

Cette capacité d’O2•- de réduire le fer et le cuivre aux formes qui catalysent les

réactions oxydatives sont la cause principale de son effet délétère. Le radical OH•
est extrêmement réactif et il est capable de réagir avec pratiquement n'importe quelle
biomolécule, et il est extrêmement toxique (Halliwell & Gutteridge 1995). Il oxyde

29
les lipides dans les membranes de la cellule affectant leurs caractères de perméabilité
et les lipoprotéines, aboutissant à des changements de la structure et modifiant ainsi
leur métabolisme dans le corps.
L’action radicale est souvent perçue seulement comme l'oxydation, transfert d'un
électron simple d'une molécule non radicalaire. Les radicaux peuvent, cependant,
aussi agir comme des agents de réduction, en cédant un électron simple à un non-
radical (Stocker & Keaney, Jr. 2005). Un des paramètres principaux régissant l'action
des radicaux est leur potentiel de réduction, la facilité d'une molécule de réduire
chimiquement un autre composé.
Les potentiels de réduction ont été quantifiés pour quelques composés biologiques
appropriés pour prévoir la direction de réactions d’oxydation (Buettner 1993). Les
différences de valeurs de ce paramètre thermodynamique expliquent sommairement
la réutilisation du radical tocopheryl et la régénération de sa forme active par
l’ascorbate (équation 9) :

H+ + ascorbate- + α-TO• → ascorbyl radical + α-TOH (9)

Initialement, on a considéré que les radicaux libres et d'autres espèces réactives ont
un rôle clef dans la défense contre les microbes. Cependant, on sait maintenant qu'ils
sont aussi produits dans le corps dans d'autres contextes liés à des processus
cellulaires physiologiques normaux et en particulier comme facteur de signalisation
cellulaire.

Le rôle de ses ros dépend de la molécule en question ; les radicaux OH· sont

extrêmement nocifs aux biomolécules tandis qu'au moins H2O2 et O2•- agissent
comme des facteurs de signalisation cellulaire. La NADPH oxydase a été d'abord

30
isolée des neutrophiles produisant des radicaux superoxydes O2·- comme une réponse
à une attaque microbienne. Mais plus récemment, ces ros ont été isolés dans des
cellules sans aucun rôle dans la défense de l’hôte (Hancock et al. 2001), comme les
cellules endothéliales (Jones et al. 2000), les cellules mésangiales (Jones et al. 1995)
et les ostéoclastes (Steinbeck et al. 1994). Dans des cellules restantes, aucune activité
NADPH n'est détectée et l'activité est étroitement contrôlée par plusieurs mécanismes
(Jones et al. 2000). Cela renforce l'hypothèse que les ros ont un rôle clef dans la
cascade de signalisation (Hancock et al. 2001).

2.3 Les réaction s radicalai res de l' oxygène:

Les radicaux hydroxyles sont abondants dans des conditions physiologiques et

réagissent aisément avec pratiquement tous les types de molécules composant les
cellules vivantes, telles que les sucres, les acides aminés, les phospholipides et les
nucléotides (Wolff & Dean 1986, Davies & Goldberg 1987, Hunt et al. 1988,
Kirkland 1991, Dean et al. 1991a, Sandhu et al. 1992, Nakamura et al. 1993, Minetti
et al. 1993, Akagawa & Suyama 2002). (figure 7).
Des preuves des dommages des radicaux libres ont été décrites dans plusieurs états
pathologiques. Dans certains d'entre eux, le dommage des radicaux libres est la cause
primaire de la maladie; dans d’autres, cela aggrave les complications de la
pathologie. L’oxydation disproportionnée des membranes cellulaires peut contribuer
à l’initiation et la progression de plusieurs maladies dégénératives, incluant aussi bien
certains cancers, les maladies cardiovasculaires que le vieillissement (Matteucci &
Giampietro 2000, Lyons et al. 2003, Tam et al. 2003, Klaunig & Kamendulis 2004,
Mobley & Brueggemeier 2004, Stefek et al. 2005, Bowman et al. 2005).
Les formes réactives d'oxygène peuvent induire la péroxydation des lipides des
organes biologiques contenant des acides gras polyinsaturés (PUFA), comme les
acides, linoléique et arachidonique. Ils causent le mauvais fonctionnement des

31
membranes en modifiant sa fluidité et en perturbant la structure et la fonction des
enzymes et des récepteurs membranaires. Une telle oxydation peut être interrompue
par des antioxydants (Gutteridge & Halliwell 2000).
Il a été montré que les protéines modifiées oxydées s’accumulent pendant le
vieillissement et dans certaines conditions pathologiques (Squier 2001, Sayre et al.
2005). L’exposition des protéines à .OH et a l’O2 entraine des modifications
structurelles. Ces protéines modifiées peuvent subir une fragmentation spontanée et
des trans-liaisons ou montrer une augmentation substantielle dans la proteolyse
(Squier 2001). les Dommages oxydatifs entrainent un dysfonctionnement de
protéines comme les enzymes, les protéines transport et les récepteurs (Gutierrez-
Correa & Stoppani 1995, Hashimoto et al. 2000, Khan & Khan 2004). La
modification de protéine par les espèces d'oxygène réactives (ROS) est un
phénomène bien établi comme sont les produits de réaction caractérisés d'actions
réciproques de protéine avec la formation de .OH et O2. Cela cause finalement la
production d’alkyle, d’alkoxyle et les intermédiaires radicaux alkylperoxyl, qui
préparent la rupture des liaisons peptides. Une large variété de réactions entre les
ROS et les chaînes d'aminoacide se produit et tous les aminoacides dans les protéines
sont susceptibles à des changements (Amici et al. 1989, Villiere et al. 2005, Baron et
al. 2006).
L'albumine du sérum humain (HSA) est la principale protéine dans le sang et est
largement distribuée dans le corps. À part le maintien de l’osmolarité, l'albumine est
aussi impliquée dans la fixation et le transport de plusieurs ligands incluant de
métaux (12 à 18 % du cuivre dans le plasma sanguin humain), les acides gras et les
médicaments (Quinlan et al. 2005).

32
2.4 Pero xydation lipid ique:

Les réactions radicalaires en chaine forment les radicaux lipidiques, libèrent les
peroxydes lipidiques dans les membranes et causent d’importants dommages et
modifications (Figure7).

Figure 7. Lésions cellulaires induites par les radicaux libres.

Les radicaux superoxydes et les radicaux hydroxyles initient la peroxydation lipidique dans les
membranes cellulaires, mitochondriales, nucléaires, et du réticulum endoplasmique. L’augmentation
de la perméabilité cellulaire entraine un influx des ions calcium qui cause plus de lésions
mitochondriales. Les groupes cystéine sulfhydryle et d’autres acides amines sont oxydés et dégradés.
L’ADN mitochondrial et nucléaire peuvent être oxydés aboutissant à une rupture des doubles brins et a
d’autres types de dommages. Les RNOS (NO, NO2, et peroxynitrite) ont des effets similaires.

Un initiateur (comme le radical hydroxyle produit localement durant la réaction de

fenton) amorce une réaction en chaine. Il capte un atome hydrogène, de préférence
une liaison double d'un acide gras polyinsaturé dans une membrane lipidique. Ces

33
réactions en chaine sont propagées quand l’O2 est ajouté et forment les radicaux
lipides peroxyles et les lipides peroxydes. Finalement, la dégradation de lipide se
produit, et entraine la formation de produits tels que le malondialdéhyde (des acides
gras avec au moins trois liaisons doubles) et l'éthane et le pentane. Le
malondialdéhyde apparaît dans le sang et l'urine et est utilisé comme un indicateur de
dommages des radicaux libres (figure 8).

Figure 8. Mécanisme en chaîne de la peroxydation des acides gras polyinsaturés et

nature des produits terminaux formés.

34
La peroxydation de molécules lipidique change inévitablement les structures
moléculaires. En plus de la nature autodestructrice de la peroxydation des lipides des
membranes, les aldéhydes formés peuvent polymériser des protéines. Quand les
lipides modifiés sont des constituants de membranes biologiques, l'arrangement et
l'organisation structurelle des bicouches est perturbée (Figure 11). En plus, la
perturbation de l'intégrité membranaire mitochondriale peut entrainer une production
supplémentaire de radicaux libres.

La peroxydation lipidique est une importante réaction des acides gras insaturés. Une
des réactions caractéristique des lipides ; est la formation de peroxydes, induite par
les radicaux d'oxygène.
La peroxydation lipidique peut procéder tant par des voies enzymatiques que par des
voies non-enzymatiques. Les initiateurs de cette oxydation sont des radicaux libres
physiologiques en particulier les radicaux superoxydes et nitrique oxyde.

L'oxydation des lipides peut se dérouler suivant deux voies différentes,

2.4.1 Peroxydation non-enzymatique:

La peroxydation lipidique est un processus complexe qui se produit en présence

d'oxygène et des ions de métal de transition ou des enzymes. Il y a d'habitude trois
stades dans le processus d'oxydation, comme décrit ci-dessous (voir figure 9).

35
 Figure 9. Les différentes étapes de la peroxydation des lipides.

1. Stade d'amorce

Un atome d’hydrogène est arraché d'un groupe méthylène (-CH2-) d’un PUFA
(polyunsaturated fatty acids) par une espèce réactive comme le radical hydroxyle
(•OH) en laissant un électron non apparié sur le carbone (-CH- ou le radical lipide).
Le radical de carbone est stabilisé par un réarrangement moléculaire pour former un
diène conjugué qui peut se combiner avec l'oxygène pour former un radical peroxy
ROO• ou RO2•.

RH→ R• H• (1)

2. Stade de propagation

36
Le radical peroxy peut arracher un autre hydrogène d'une autre molécule lipidique et
cela cause une réaction en chaine autocatalytique par laquelle l'oxydation lipidique
procède. Les radicaux peroxy peuvent se combiner avec l'hydrogène qu’ils captent
pour former des hydro-peroxydes lipidiques et des peroxydes cycliques. Vu que
l’hydrogène transféré peut se produire à différents points de la chaine carbonée, la
peroxydation de l’acide arachidonique par exemple produit six hydro-peroxydes
lipidiques.

R• O2 →RO2• (2)
RO2• + RH →ROOH + R• (3)

3. Stade de terminaison

Les radicaux libres produits peuvent se combiner les uns aux autres ou aux protéines
et arrêter les réactions en chaine. La dernière réaction qui cause la polymérisation et
des dommages sévères aux protéines est représentée ci-dessous.
R• R• →R-R (4)
nRO2• →(RO2)n (5)
RO2• + R• →RO2R (6)

2.4.2 Peroxydation enzymatique:

À la différence de la peroxydation non enzymatique, les enzymes suivantes, la

lipooxygenase, la cyclooxygénase et la peroxydase catalyse une peroxydation
contrôlée des acides gras et aboutit à des hydroperoxydes et des endoperoxydes qui
sont stéréospécifiques. La lipooxygénase est communément rencontrée dans les

37
aliments, catalyse la peroxydation des PUFA en produits primaires et secondaires
(Kanner et al. 1987).
La lipoxygénase contient un atome de fer par molécule et arrache un atome
d’hydrogène d’un acide gras insaturé pour former des hydroperoxydes. Les réactions
sont complexes, et les hydroperoxydes produits peuvent interagir avec l’enzyme en
question. L’action de la lipoxygénase peut produire une cooxydation d’autres
matériaux (caroténoïdes et protéines)

2.5 Oxydation des p rotéines:

Les protéines sont extrêmement sensibles aux modifications oxydatives causées par
les espèces réactives d'oxygène (ROS) et les espèces d'azote réactives (RNS). Ceux-
ci incluent un certain nombre de radicaux primaires (•OH, O2•−, CO2•−, NO •),
plusieurs espèces non radicalaires (H2O2,HOCl, O3, ONO2−, ONOCO2−, CO, N2O2,
NO2,1O2) et libèrent aussi des radicaux (•C, RS •, RSO •, RSOO • , RSSR • −, R •,
RO •, ROO •) produits par les réactions secondaires de ces espèces réactives
d'oxygène avec les protéines, les lipides et les acides nucléiques. En plus, les
protéines natives peuvent être modifiées par les aldéhydes extrêmement réactifs et les
cétones produits pendant l'oxydation des lipides par les ROS (Uchida & Stadtman
2000) et les protéines glyquées (Uchida & Stadtman 2000, Boldyrev 2005). Les
mécanismes chimiques fondamentaux impliqués dans l'oxydation provoquée par de
radical libre de protéines ont été élucidés par Garrison (Garrison 1989) qui a exposé
des solutions aqueuses de protéines au rayonnement ionisant (rayons X, rayons
gamma) dans les conditions où seuls les radicaux •OH et/ou O2• − sont capables de se
former. Ils ont démontré que ceux-ci, dans ces conditions, causent l'oxydation des
chaînes latérales de résidus d'aminoacides, la fragmentation de la chaîne protéinique
et entrainent la réticulation des protéines. Bien que la plupart des protéines ne
subissent pas l’effet des ionisations. Les effets des rayonnements ionisants sont

38
similaires aux situations physiologiques où les réactions sont catalysées par des ions
métalliques de transitions (Hensley et al. 1996).

Figure 10. Les espèces réactives, le dommage oxydatif et les réponses cellulaires au
stress oxydatif.
Les oxydants sont produits par le métabolisme intracellulaire normal dans les mitochondries et les
peroxysomes, aussi bien que d'une variété de systèmes d'enzymes cytosoliques. En plus, un certain
nombre d'agents externes peut déclencher la production des ROS/RNS. Un système de défense
antioxydant enzymatique et non enzymatique sophistiqué contrent et régulent les niveaux des
ROS/RNS pour maintenir l’homéostasie physiologique. La surproduction de ROS/RNS et/ou les
niveaux faible et/ou l'activité faible des antioxydants entraine un stress oxydatif. La tension oxydative
importante peut être préjudiciable et causer la mort des cellules ou une accélération du vieillissement et
des maladies en relation avec l'âge. On pense que l'affaiblissement important provoqué par les
ROS/RNS provient des dommages causés aux protéines, aux lipides et à l'ADN (Halliwell &
Gutteridge 1984a).

39
2.6 Accumu lation de p rotéines oxydées:

Il est bien établi que le niveau de protéines oxydées augmente avec l'âge et dans le
développement d'un certain nombre de maladies (Halliwell & Cross 1994). Les
niveaux cellulaires de protéines oxydées dépendent de plusieurs facteurs, et donc les
mécanismes responsables de l'accumulation de protéines oxydées sont extrêmement
variables.
La génération des ROS et RNS varie selon la nature et la durée de l’exposition à
différentes conditions de stress oxydatif incluant , les radiations (X, gamma et UV),
l’inflammation initié par l’activation des neutrophiles et/ou macrophages, l’altération
des voies de régulations impliquées dans la conversion de l’arginine en NO,
l’autooxydation des transporteurs d’électrons, la variation du niveau des polluants
toxiques, l’activation des oxydases et la mobilisation d’ions de métal impliqués dans
les processus d’oxydation catalysée par des métaux.
Mais les niveaux cellulaires des ROS et RNS sont contrôlés par plusieurs enzymes
antioxydantes (SOD catalase, peroxydase,…), métabolites (bilirubine, acide
uriques,…), et les vitamines (vitamine C, E et A) qui sont capables directement ou
indirectement de neutraliser leurs effets délétères. De plus, l’oxydation des protéines
les prédispose à une plus grande dégradation protéolytique. Le niveau des protéines
oxydées est dépendant de l’activité de plusieurs protéases (lysosomales,
cathepsine,…). Et donc, l’accumulation des protéines reflète l’équilibre entre tous ces
processus (Figure 11).

40
Figure 11. Conséquences des effets des diverses espèces réactives sur le
fonctionnent des protéines et leur destin.
Les ROS/RNS peuvent provoquer des modifications oxydatives des protéines sensibles. Les
modifications réversibles, d'habitude des Cys et les résidus rencontrés, peuvent avoir un rôle double de
modulation de la fonction de protéine et de protection contre des modifications irréversibles. Les
modifications irréversibles sont d'habitude associées à la perte permanente de la fonction des protéines
et peut mener à la dégradation des protéines endommagées par le système proteasome et d’autres
protéases ou à leur accumulation progressive (Amici et al. 1989).

2.7 Patho logies imp liqu ant des métaboli tes réactifs d’oxygèn e:

Pendant longtemps, la formation des radicaux libres et le développement du stress

oxydatif dans la vie des organismes ont été considérés comme des événements
exclusivement destructeurs, menant à divers effets pathophysiologiques. En effet, de

41
nombreuses études ont montré que le développement de plusieurs maladies est
associé à la surproduction de radicaux libres. Bien que ce fait, souligné par ces
pathologies, puisse ne pas être une preuve indéniable du rôle prédominant des
radicaux libres, un excès dans la formation de radicaux libres et des DRO et DRA
intervient au moins occasionnellement dans le développement de diverses maladies.

2.7.1 Les mécanismes de réactions des radicaux dans les cellules tumorales:

La participation de radicaux libres a été premièrement suggérée à cause des effets des
peroxydes, qui activent le développement du cancer (Floyd 1990), la réaction des
radicaux d'oxygène avec l’ADN aboutit à la formation d'adduits spécifiques
cancérigènes comme le 8-ohdg. Ogawa et al. (Ogawa et al. 1995) ont suggéré que les
radicaux d'oxygène sont des intermédiaires à la formation de 8-ohdg pendant
l'induction par l’œstrogène synthétique de la formation de carcinomes
hépatocellulaires chez les rats.
Un niveau important les lésions typiques causées par les radicaux hydroxyles et un
taux faible d'enzymes antioxydantes a été aussi observé dans les lymphocytes
provenant d’enfants leucémiques et non-lymphocytique aigues (ALL) (Senturker et
al. 1997). De même que les niveaux de MDA (malondialdehyde) et des 8-
hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), un nucléoside oxydé de l’ADN, sont élevés
alors que la SOD et l’activité de la catalase sont faibles dans les cellules provenant de
patients ayant une leucémie lymphocytique chronique (CLL) (Oltra et al. 2001).
il a été constaté que les thymocytes tumoraux sont plus sensibles au stress oxydatif
que les thymocytes normaux (Palozza et al. 1994).
De nombreuses études ont démontré que la peroxydation lipidique diminuait de
façon significative dans les cellules et les tissus cancéreux. Cela, pourrait être la
conséquence d'une diminution dans la teneur en acides gras insaturés, la
concentration en cytochrome p-450 et la teneur en NADPH, en SOD et en catalase

42
dans les tumeurs. Cheeseman et al. (Cheeseman et al. 1986, Cheeseman et al. 1988)
ont suggéré que la réduction de la peroxydation lipidique dans les tumeurs peut
dépendre de l'expression de transformation maligne et de la division de cellulaire.
Boyd et McGuire ont démontré qu'il y a une corrélation entre la peroxydation
lipidique et le risque du cancer chez les femmes en préménopause (Boyd & McGuire
1991).

2.7.2 Athérosclérose:

Un des facteurs importants dans le développement de l’athérosclérose est le

dysfonctionnement de l’endothélium vasculaire causé par la réaction des radicaux
superoxydes avec l'oxyde nitrique. La formation d'excès d'oxygène réactif et
d'espèces d'azote est associée à la formation de lésion vasculaire et à des défauts
fonctionnels. Il a été montré que le radical superoxyde inactive le facteur relaxant
libéré par l'endothélium (EDRF) (Rubanyi & Vanhoutte 1986), identifié par la suite
comme étant l'oxyde nitrique.
L’angiotensine II (ang II) cause un stress oxydatif pro-atherosclerotique dans les
cellules endothéliales humaines par l'expression de la NADPH oxydase
(Rueckschloss et al. 2002).
Ushio-fukai et al. (Ushio-Fukai et al. 1996) ont montré que l’ang II stimule la
production intracellulaire de l’oxygène radicalaire, en entrainant l'hypertrophie des
muscles lisses vasculaires. Récemment, barry-lane et al. (Barry-Lane et al. 2001) ont
démontré que les souris dépourvues du gène p47phox avait des niveaux production
aortique superoxyde plus faible en comparaison aux souris de type sauvage.
Hathaway et al. (Hathaway et al. 2002) ont aussi constaté que le développement avec
modération de l’athérosclérose sévère et la régression de l’athérosclérose dans les
singes dépendent du niveau de la production des superoxydes et de l'activité de la

43
NADPH oxydase. Chatterjee a proposé que le glycosphingolopide lactosylceramide
contribue à l’athérosclérose par l'activation de NADPH oxydase (Chatterjee 1998).
La 15-lipoxygenase est impliquée dans l'oxydation des LDL dans les premiers stades
de l’athérogénèse (Kuhn et al. 1994), alors que l'oxydation non enzymatique de
l’arachidonate devient plus importante dans les derniers stades (Kuhn et al. 1994).
Une augmentation des produits d'oxydation de l’acide linoléique a été observée dans
les LDL des patients athérosclérotiques (Jira et al. 1998).

2.7.3 Mécanismes de médiation des radicaux libres dans l’inflammation:

Dès 1976, oyanagui (Oyanagui 1976) a suggéré que les radicaux superoxydes sont
produits par les macrophages dans un modèle d’inflammation chez le rat induit par la
caragénine. Des études ultérieures ont mis en évidence les différentes voies de la
participation des radicaux libres dans les processus inflammatoires. Il a été démontré
que le radical superoxyde (mais pas l'eau oxygénée) est capable de stimuler la
production des facteurs semblables à l’interleukine 1 par des monocytes sanguins
périphériques humains (Kasama et al. 1989).
Le stade critique d'inflammation est le début de la peroxydation lipidique et la
formation d’eicosanoides bioactifs. Il est maintenant reconnu que les lipoxygenases,
cyclooxygenases, cytochrome p450, les monooxygenases et peroxydases sont des
catalyseurs enzymatiques de ces processus.
En utilisant un modèle de péritonite chez les souris knock-out MPO
(myeloperoxydase), Zhang et al. (Zhang et al. 2002) ont montré que la
myeloperoxidase pourrait être un catalyseur enzymatique important de la
peroxydation lipidique dans les sites inflammatoires.
Ainsi, Farivar et al. (Farivar et al. 1996) ont suggéré que les NO produits par les
fibroblastes cardiaques pourrait être impliqués dans les maladies cardiaques
inflammatoires. Zhang et al. (Zhang et al. 2002) ont montré que la formation de la

44
MPO dépendante d'espèces d'azote réactives pourrait être une voie favorable pour
l'amorce de la peroxydation lipidique dans les sites inflammatoires. Liu et al. (Liu et
al. 2002a) a suggéré que la production excessive de NO comme conséquence de
l’induction de la NO synthétase par les cellules gliales est responsable de
l'inflammation du cerveau et de la neurodégénération. Parmi ces désordres
inflammatoires du cerveau, on peut citer : la sclérose en plaques, la sclérose latérale
amyotrophique, la maladie d'Alzheimer, la maladie de parkinson…etc.

2.7.4 Arthrite rhumatoïde:

L’arthrite rhumatoïde (RA) est un état inflammatoire chronique qui existe dans la
synovie. Il est caractérisé par la présence de monocytes et de PMNS dans le pannus
et le liquide synovial. La production de radical d'oxygène par les PMNS et les
produits de la peroxydation lipidique seraient responsables de la destruction de tissus
synoviaux dans l’arthrite rhumatoïde (Lunec et al. 1981).
Le traitement de patients RA avec différents médicaments, affecte la production de
radicaux libres par les cellules phagocytaires. Il a été constaté que le traitement avec
les composés d'or (Davis & Johnston 1986) et piroxicam (Van Epps et al. 1987)
reduit la production superoxyde chez les patients atteints de RA. Mur et al. ont
démontré que les traitements anti-rhumatisants des patients atteints de RA ont
provoqué la réduction de cytokines qui amorcent la génération de radicaux
superoxydes (Mur et al. 1997). Harper et al. ont démontré que le traitement de
patients atteints de vascularite avec les vitamines E et C a réduit la génération du
superoxyde par les neutrophiles et peut avoir un rôle important comme adjuvant de
thérapie (Harper et al. 2002). Le traitement de patients RA avec une combinaison
d'enzyme orale phlogenzym contenant la trypsine, le bromelain, et des flavonoïdes
rutines pourrait être encore plus adéquate qu'avec des antiinflammatoires non-
stéroïdiens (Wittenborg et al. 2000).

45
La SOD et la rutine ont montré de forts effets inhibiteurs pendant que la catalase, le
mannitol et le desferrioxamine étaient inefficaces pour le traitement de patients RA
(Ostrakhovitch & Afanas'ev 2001).
Ces résultats démontrent que les leucocytes du système sanguin produisent surtout
des superoxydes et que la formation des radicaux hydroxyles, catalysé par le fer ou le
cuivre seraient de peu d'importance chez les patients atteints de RA.
Szabo et al. ont montré que l’inhibition de l’enzyme nucléaire poly(adp-ribose)
synthase (PARS) par le traitement oral avec l'inhibiteur lipophile, 5-iodo-6-amino-
1,2-benzopyrone retarde l’apparition de l’arthrite chez les rats (Szabo et al. 1998).

2.7.5 Le vieillissement et les radicaux libres:

Des différences existent dans la production des radicaux de l'oxygène dans les
cellules et les organismes jeunes et âgés (Allen et al. 1997). Martins et al. ont observé
une augmentation significative de la formation d'espèces réactives d'oxygène par les
granulocytes chez des personnes en bonne santé de 40 à 69 ans (Martins et al. 2002).
Les dommages provoqués augmentent avec l’âge (Phillips et al. 2003). Les tbars
(substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique) plasmatique et les niveaux de 8-
iso-pgf2a urinaires étaient plus élevés chez les jeunes hommes en bonne santé
comparés à des femmes en préménopause (Ide et al. 2002).
Une corrélation positive probablement existe entre la durée de vie mammifère et la
résistance cellulaire au stress oxydatif (Kapahi et al. 1999). Par contre, aucune
différence n'a été trouvée entre les effets d'ubiquinone sur la production des radicaux
superoxydes et sur la longévité chez différents mammifères (Lass et al. 1997).
Pourtant, il devrait être noté que le vieillissement ne s'ensuit pas toujours une
augmentation dans la formation des espèces d'oxygène réactives surtout si d'autres
dysfonctionnements pathophysiologiques se produisent.

46
L’effet du trauma et l'âge sur le fonctionnement des neutrophiles provoquent une
diminution dans la production des radicaux superoxydes et la réponse immune contre
les bactéries chez les personnes âgées (Butcher et al. 2003). Csiszar et al. (Csiszar et
al. 2002) ont démontré que le vieillissement change radicalement le rapport entre les
prooxydant et les antioxydants chez les rats. Il a été constaté que les artérioles
coronaires des rats âgés sont caractérisées par la formation importante de radicaux
superoxyde et de 3-nitrotyrosine, l'expression accrue des iNOS de l’ARNm et la
diminution des eNOS et l’expression des COX1. L’addition d'un supplément
alimentaire et des antioxydants entraine une l'augmentation significative dans la
durée de vie moyenne d'animaux de laboratoire et réduit le risque de l’artériosclérose
(Miquel 2002). Van der Loo et al. ont observé l'accumulation de la vitamine E et D
dans d’importants organes et dans le plasma chez des rats non susceptibles à
l’athérosclérose (van der et al. 2002). Et donc, l'accumulation de vitamine E dans des
rats âgés pourrait être un mécanisme compensateur d'adaptation protectrice de
contrôle contre le vieillissement cardiovasculaire. Cherubini et al. ont aussi suggéré
qu'un niveau approprié de vitamine E et d'un niveau bas d'oxydation des LDL chez
les personnes âgées pourrait empêcher le développement de l’athérosclérose
(Cherubini et al. 2001).

47
3. Les antioxydants:

3.1 Définition:

En conditions normales, le métabolisme aérobique chez les mammifères génère des

substances réactives de l’oxygène, lesquelles sont susceptibles de créer d’importants
préjudices à l’organisme. Le stress oxydatif est impliqué dans un large spectre de
maladies qui ont un impact énorme sur la santé des populations. Il est souvent initié
et propagé par une surproduction d’O2- et de H2O2 et par leur conversion en de
puissants oxydants qui sont très dommageables pour les cellules. Cependant, en guise
de protection, les cellules possèdent des mécanismes de défense endogènes
enzymatiques et non-enzymatiques qui, de manière générale, suffisent à renverser le
stress oxydant résultant du métabolisme aérobique et que l’on appelle antioxydants.
Les antioxydants ont comme principal rôle de neutraliser et de dégrader les radicaux
libres toxiques pour les tissus (Solzbach et al. 1997, Ostrakhovitch & Afanas'ev
2001, Miquel 2002, Boldyrev 2005).
La neutralisation des produits des réactions radicalaires de °OH est considéré une
réaction importante et serait à la base de l’effet des antioxydants contenus dans
alimentation sur l’incidence de certaines maladies (Tedesco et al. 2000, Youdim et
al. 2000, Sandoval et al. 2002, Benedetti et al. 2004, Kitagawa et al. 2004,
Balasundram et al. 2004, Grabmann et al. 2005, Colado Simao et al. 2006).
Un antioxydant est n'importe quelle substance, qui quand elle est présente en des
concentrations faibles, comparées à ceux d'un substrat oxydable, retarde de façon
significative, ou empêche, l'oxydation de ce substrat (Halliwell & Gutteridge 1995,
Gutteridge & Halliwell 2000). Les antioxydants biologiques sont des substances qui
protègent les systèmes biologiques contre les effets délétères possibles des processus
ou réactions engendrant une oxydation excessive (Solzbach et al. 1997,

48
Ostrakhovitch & Afanas'ev 2001, Miquel 2002, Boldyrev 2005). Les antioxydants
sont donc des molécules qui peuvent prévenir la formation des ROS, ou qui peuvent
réagir avec ces derniers pour les neutraliser.

Figure 12. Structure de quelques antioxydants regroupés en fonction de leur

caractère hydrophile ou lipophile.

Pour assurer sa défense contre les attaques de radicaux libres, l'organisme possède
deux grands systèmes de protection : les enzymes détoxicantes et des antioxydants
non enzymatiques intra et extracellulaires qui interviennent selon un ordre
hiérarchique (Buettner 1993). Les enzymes antioxydantes, telles la superoxyde
dismutase, la catalase et la glutathion (GSH) peroxydase, sont préventives parce
qu'elles agissent sur les espèces impliquées dans l'initiation de la chaîne de réactions
des radicaux libres. Alors que les molécules antioxydantes plus petites, tels

49
l'ascorbate, le tocophérol, l'ubiquinone, l'urée et le GSH, sont capables de piéger
directement les radicaux oxydants et sont ainsi des antioxydants «briseurs» de la
chaîne radicalaire (Buettner 1993). De façon générale, les actions respectives des
diverses enzymes antioxydantes ne sont pas du même ordre d'importance (Mates &
Sanchez-Jimenez 1999). Les antioxydants peuvent agir à différents stades dans une
séquence oxydative (voir figure 13):

• retirer ou diminuer les concentrations locales en oxygène

• débarrasser des ions des métaux catalytiques (cuivre, fer,…)
• retirer les ROS/RNS clés
• neutraliser des radicaux initiateurs
• provoquer la rupture de l’ordre de la chaîne d’oxydation.

Figure 13. Les différents mécanismes d’actions possibles des antioxydants.

Plusieurs antioxydants ont plus qu'un mécanisme d'action. Par exemple, le propyl-
gallate, un antioxydant phénolique partiellement soluble dans l’eau, utilisé par

50
l'industrie alimentaire, est un agent qui provoque la rupture de la chaine oxydative,
neutralise les radicaux OH et se lie aux ions de fer. Les cellules présentent des
défenses variées contre le dommage oxydatif, dont certaines peuvent à première vue
agir comme des antioxydants. La protection antioxydante peut opérer à différents
niveaux cellulaires, comme :

• Prévenir la formation des radicaux

• Intercepter des radicaux formés
• Réparer les dommages oxydatifs.
• Faciliter l’élimination de molécules oxydées
• Promouvoir la mort des cellules dont l'ADN est excessivement endommagé pour
prévenir leur transformation.

Les inhibiteurs des radicaux libres inhibent la formation de radicaux libres en

réagissant avec les radicaux libres et forment de nouveaux radicaux inactifs (les
réactions (1) et (2)) ou chélatent des métaux de transition pour former des complexes
inactifs:

HO• AntH → H2O + Ant• (1)

ROO• + AntH →ROOH + Ant• (2)

Récemment, le Kirsch et De Groot ont montré un autre mode possible de l'activité

antioxydante, à savoir, "la réparation" de biomolécules par l'action réciproque des
radicaux libres se formant avec les antioxydants (Kirsch & De 2001) (voir les
réactions (3) et (4)).

ROO• or HO• RH → ROOH or H2O + R• (3)

R• + AntH →RH+ Ant• (4)

51
Ces auteurs ont supposé que la fonction "de réparation" des antioxydants peut être
importante. Pourtant, bien que les réactions (3) et (4) puissent se produire dans les
systèmes biologiques, il est très difficile d'estimer leur importance. Il y a toujours une
compétition entre la réaction "de réparation" (4) et la réaction des biomolécules
libèrant le radical R avec le dioxygène (réaction (5)) :

R• O2 → ROO • (5)

Comme la constante d’activité de la réaction (5) est de plusieurs ordres de grandeur

plus importante que la réaction (4), les possibilités « de réparation » semblent être
très réduites.
Les antioxydants les plus connus sont naturels sans doute les plus importants sont
l’alpha-tocopherol (la vitamine E) et l'acide ascorbique (la vitamine C), qui sont des
antioxydants biologiques importants dans les lipides.
Des centaines de composées chimiques peuvent agir comme des antioxydants. On
dénombre plus de 300 molécules antioxydantes dans la base de données
phytochimiques et ethnobotanique de Dr. Duke (http://sun.ars-grin.gov/cgi-
bin/duke/chemical_activity.pl).

3.2 Antioxydant s int racellu lai res:

Parmi les sites d'action des antioxydants intracellulaires, nous retrouvons les
principaux dans la figure suivante (Figure 14) :

52
 Figure14 . Antioxydants intracellulaires (d'après Bankson et al., 1993)

3.2.1 Systèmes enzymatiques:

Superoxydes dismutases : elles catalysent la dismutation du superoxyde : 2O2•- +

2H+ → O2 + H2O2 (Krinsky 1992). Elles constituent une première ligne de défense
très efficace en empêchant l'accumulation cellulaire de superoxyde. Il y a trois iso-
enzymes, deux cytosoliques (une cupro-zincique et une ferrique) et l'autre
mitochondriale (manganèse).
Catalase : cette enzyme est présente principalement dans les peroxysomes [riches en
oxydases génératrices de peroxyde d'hydrogène (H2O2)] et les hématies. Son rôle
dans l'élimination de l'H2O2 peut être limité dans certaines conditions; elle sert
d'appoint à l'action de la glutathion peroxydase (GSH-Px) et catalyse la dismutation
de H2O2 en oxygène et en eau : 2 H2O2 → 2H2O + O2. Ces catalases permettent de
soustraire l'H2O2 à la réaction d'Haber-Weiss et d'éviter ainsi la genèse du radical

53
hydroxyle. L'activité de la catalase est très faible dans le myocarde (Scholz et al,
1997).
Systèmes enzymatiques liés au GSH : les superoxydes engendrent du peroxyde
d'hydrogène (H2O2), composé non radicalaire et diffusable dont la toxicité semble
liée à sa conversion en HO• au contact d'ions métalliques. Les systèmes
enzymatiques liés au GSH s'avèrent une ligne de défense qui complémente les
catalases pour éliminer H2O2. De plus, ils permettent l'élimination des lipoperoxydes.
Au cours de ces réactions, le GSH est oxydé en glutathion oxydé (GSSG). La GSH
réductase régénère le GSH, une action qui nécessite la présence d'équivalents réduits
(NADPH) (GSSG + NADPH/H+ (GSH réductase) 2 GSH + NADP+). En outre, il y a
plusieurs peroxydases liées au GSH autant cytosolique, mitochondriale que
membranaire :
a) GSH peroxydase sélénium-dépendante (Se-GSH-Px) :
Les GSH-Px sont impliquées dans la défense de l'organisme contre les espèces
réactives de l'oxygène. Elles constituent la voie majeure de dégradation des
hydroperoxydes (peroxyde d'hydrogène H2O2, hydroperoxydes organiques ROOH)
dans la plupart des cellules et des compartiments subcellulaires. Elles inhibent donc
la production de radicaux libres très oxydants tels que le radical hydroxyle OH*
dérivé de H2O2 et les radicaux alkoxyle RO* dérivés des hydroperoxydes organiques.
La fonction anti-oxydante des GSH-Px est donc importante, et ce d'autant plus
qu'elles peuvent être considérées comme des partenaires essentiels des superoxyde
dismutases (dont le fonctionnement normal aboutit à la production
d'hydroperoxydes) et de la vitamine E. La Se-GSH-Px serait l'enzyme la plus
importante dans le myocarde (Scholz et al. 1997).
b) Phospholipide-hydroxyperoxyde-GSH peroxydase (PLOOH-GSHPx) (Krinsky
1992). Cette enzyme agit directement sur les hydroxyperoxydes phospholipidiques,
sans hydrolyser les hydroxyperoxydes d'acides gras à partir des phospholipides
(PLOOH + 2GSH (PLOOH-GSH-Px) phospholipide LOH + GSSG + H2O). Ainsi

54
l'atteinte des membranes par les phospholipides-LOOH est éliminée sans avoir à
activer la PLase A2, qui pourrait libérer des quantités excessives de substrats pour la
synthèse des prostanoïdes. Les Phospholipide-hydroperpxyde-glatathion peroxydase
(PLOOH-GSH-Px) peuvent également réduire les hydroxyperoxydes, liés aux
membranes, et par ce fait, diminuent davantage la quantité d'hydroxyperoxydes
lipidiques potentiellement nocifs.
c) GSH transférases : certains dérivés des hydroxyperoxydes ne sont pas des
substrats pour la GSH-Px. Ces dérivés, ainsi que les «aldéhydes de coupure»
provenant de la peroxydation lipidique, dont le HNE, sont détoxiqués sous forme
d'acides mercapturiques issus de l'action successive d'une GSH-S-transférase (Chen
et al. 1998), de l alpha-glutamyl transpeptidase puis d'une peptidase (Figure 15).

55
Figure 15. Mode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de
leurs cofacteurs métalliques.

3.2.2 Antioxydants nonenzymatiques:

L'action protectrice enzymatique est renforcée par celle de différents composés

réducteurs se comportant comme des piégeurs stoechiométriques (Kikugawa &
Beppu 1987). Ils protègent les biomolécules (acides nucléiques, les protéines, les

56
lipides…). Leur action peut être paradoxale, car selon la composition de leur
environnement, sous certaines conditions (présence de métaux de transitions), ils
peuvent se comporter comme des pro-oxydants (l'acide ascorbique ne peut exercer
son action antioxydante qu'en l'absence d'ions de métaux de transition) (Halliwell &
Gutteridge 1990).
Les molécules et les macromolécules pouvant agir comme piégeurs sont présentes
dans les compartiments extra et intracellulaires. Les plus importantes sont présentées
ci-dessous selon leurs lipophilicités.

3.2.2.1- Antioxydants liposolubles:

Du fait de leur lipophilicité, ils sont incorporés dans les structures lipoprotéiques
membraneuses ou circulantes.

- Tocophérols (incluant la vitamine E) : ils inhibent la propagation de la peroxydation

lipidique (Burton & Ingold 1984). Ce sont d'excellents piégeurs de radicaux
lipidiques, tout particulièrement LO• et LOO•. Chaque molécule d'alpha-tocophérol
peut réagir avec deux radicaux peroxyles : [(TOH• + LOO• → TO• + LOOH)] [(TO•
+ LOO• → LOO - TO)].
L'alpha-tocophérol agit en se convertissant en radical alpha-tocophéroxyle, peu
réactif. Ensuite, le radical migre à la surface de la membrane où il est reconverti en
alpha-tocophérol via l'ascorbate (Wefers & Sies 1988). Cependant, s'il y a des
quantités excessives d'alpha-tocophérol, celui-ci peut fonctionner comme pro-
oxydant (TOH + LOOH → T-O• + LO• + H2O) (Kontush et al. 1996).

- Caroténoïdes (Krinsky 1992) : les caroténoïdes, dont la vitamine A, sont

d'excellents piégeurs d'espèces radicalaires grâce à leur système conjugué de doubles
liaisons (Packer et al. 1981). La beta carotène (CAR) réagirait directement avec le
radical peroxyle (LOO•) (Burton & Ingold 1984) neutralisant au moins deux

57
radicaux peroxyles : [LOO-CAR-OOL + LOO• → (LOO)2 - CAR-OOL•] [(LOO)2-
CAR-OOL• + LOO•→ (LOO)2-CAR-(OOL)2]] (Handelman et al. 1991).

- Bilirubine : C'est le produit final du métabolisme de l'hème. La bilirubine peut

inhiber efficacement la peroxydation lipidique via un mécanisme qui s'apparenterait à
celui de l'alpha-tocophérol (Stocker et al. 1987).

3.2.2.2-Antioxydants hydrosolubles:

Les antioxydants hydrosolubles mentionnés ci-dessous sont connus pour leurs

activités extracellulaires sauf l'acide ascorbique qui exerce une activité intra- et
extracellulaire.

A. Acide ascorbique (C-OH) : joue un rôle très important en assurant la

régénération de l'alpha-tocophérol en se transformant en un radical très peu
réactif (C-O•) (Bielski et al. 1975) à partir duquel l'acide ascorbique est
régénéré grâce à une NADH réductase. Il est peu probable que l'acide
ascorbique piège directement les radicaux hydroxyles. Comme dans le cas de
plusieurs autres antioxydants, un surplus d'acide ascorbique peut s'avérer
néfaste (c'est-à-dire avoir un effet oxydant), surtout lorsque les membranes
sont pauvres en alpha-tocophérol ou en présence d'une concentration élevée
de métaux de transition.

B. GSH (glutathion): un tripeptide qui joue un rôle important comme

antioxydant endogène et dans le maintien de l'équilibre d'oxydo-réduction. En
fait, le GSH participe à l'élimination du H2O2 et des LOOH, en servant de
cosubstrat à l'enzyme GSH-Px (Ferrari et al. 1991). Le GSSG formé par cette
première réaction est à nouveau réduit en GSH par la GSH réductase, une
enzyme qui utilise le NADPH comme cofacteur. Le GSH peut inhiber la

58
 peroxydation des lipides et s'avère efficace comme piégeur direct de certains
ERO, tels les radicaux OH• et l’oxygène singulet 1O2 (Halliwell 1996).

C. Acide urique : A des concentrations physiologiques, il présente une

activité antioxydante soutenue vis-à-vis des radicaux hydrosolubles tel
l'hydroxyle (Ames et al. 1981). Cependant, il est inefficace contre les
générateurs de radicaux liposolubles.

D. Protéines de fixation des métaux : elles diminuent la concentration des

métaux de transition capables de réagir avec les hydroxyperoxydes. On
retrouve :

1) la transferrine, qui ne transporte que de 20 à 30 % de sa capacité totale de fixation

de fer, maintenant ainsi le fer libre plasmatique à des niveaux très faibles (Gutteridge
et al. 1982);

2) la lactoferrine, qui est produite par les neutrophiles et qui est similaire à la
transferrine;

3) la céruloplasmine, qui a deux mécanismes antioxydants : la fixation des ions

cuivre et l'oxydation du Fe2++

4) l'albumine par fixation des ions cuivre (Gutteridge & Wilkins 1983).

E. Protéines liant l'hème libre et protéines liant les protéines hémiques :

l'hème libre et les protéines hémiques (ex. : hémoglobine et myoglobine) sont
des pro-oxydants. Ils peuvent réagir avec le peroxyde d'hydrogène et
entretenir la peroxydation lipidique. La protection contre ces événements est
assurée par deux protéines : l'haptoglobine qui se lie fortement à

59
l'hémoglobine, et l'hémopexine, qui se lie à l'hème libre, formant des
complexes éliminés rapidement par l'organisme (Oshiro & Nakajima 1988).

F. Éléments-traces dans l'homéostasie radicalaire : les éléments-traces (zinc,

sélénium, cuivre, manganèse et chrome) jouent un rôle important dans les
mécanismes de défense antioxydants. Une déficience d'un ou de plusieurs de
ces éléments diminue la protection cellulaire et contribue au développement
des pathologies radicalaires (Tato Rocha et al. 1994).

60
4. Buts du travail:

De nombreuses études biologiques et pharmacologiques concernant l’arganier

existent, mais ne se sont intéressées qu’à l’effet thérapeutique des molécules isolées,
alors, que dans le corps humain les molécules interagissent entre elles. D’autre part,
l’activité antioxydante implique plusieurs types de compartiment cellulaire et de
biomolécules et leur interaction.
Nous avons donc étudié l'activité antiradicalaire de saponines hydrosolubles extrait
d'Argania spinosa et deux anti-inflammatoires lipophiles (l'aspirine et
l’acétaminophène) sur un model de toxicité cellulaire induit par les radicaux libres.
Mais aussi l'interaction entre la vitamine E, l'aspirine, acétaminophène et les
saponines en utilisant deux indicateurs, la libération de l’Hb et la perte en potassium
cellulaire.
Nous avons aussi exploré si les différents systèmes d’oxydant affectent l'activité
antioxydante des saponines d'A. spinosa, le trolox, la mélatonine, mannitol, l'acide
ascorbique, l’etodolac et l’acétaminophène. Il est souvent supposé que l'oxydation de
protéine se produit ultérieurement à l'oxydation lipidique, pourtant, l'action
réciproque entre les lipides et les protéines pendant l'oxydation n'est pas bien
comprise. Une l'émulsion lipido-protéique a été étudiée pour caractériser et comparer
l'activité antioxydante des saponines d'A. spinosa avec un analogue de la vitamine E,
le trolox.

61
Chapitre II. Matériel et méthodes

62
1. Produits chi miques et réactifs:

Le peroxyde d’hydrogène (H2O2, 30 % v/v, 8.9 M) et sulfate pentahydrate

(CuSO4,5H2O) du cuivre provient de Merck, l’acétaminophène, l'aspirine et la
vitamine E (l'alpha D-tocopherol l'acétate) sont obtenus de Sigma Chemical Inc.
L’albumine bovine sérique (BSA), la melatonine, le peroxide d’hydrogene, l’acide
linolénique methylester (LnMe), l’acetaminophene, l’aspirine provient de Sigma (St
Louis, MO, USA), l’acide Ascorbic, le xylenol orange, le 2,4-
dinitrophenylhydrazine, 2,2 Azo-bis-(2-amidinopropane) hydrochloride (AAPH) et le
trolox, un analogue de la vitamine E sont obtenus d’Aldrich (Milwaukee, WI, USA).

2. Matériel végétal:

Les amandes de l’arganier sont collectées au sud-ouest du Maroc dans la région

d'Essaouira en juillet-août.
Les saponines du tourteau de l’amande d'Argania spinosa sont obtenues comme
décrites précédemment (Alaoui et al. 1998a, Alaoui et al. 1998b). 500 g de tourteau
d’amande d’arganier sont mis à macérer à froid dans un mélange hydro-alcoolique.
L’extrait est par la suite filtré puis délipidé par l’hexane. Il est ultérieurement extrait
en 3 fois à l’éther puis 2 fois au n-butanol pour épuiser la phase aqueuse. La phase
butanolique est décantée et le butanol est évaporé à sec. Le résidu sec est repris par
un minimum de mélange méthanol-eau distillé puis lyophilisé. Il est constitué de 10g
d’un mélange de saponines. Le rendement est de 2%.

63
3. Mesure de la libération de l’hémoglobine par les globu les
rouges (GR):

Le sang de volontaires sains est collecté dans des tubes contenant de l’héparine. Les
GR sont séparées du plasma par centrifugation à 3000 g pendant 15 minutes et ils
sont lavés trois fois avec 5 volumes de tampon phosphate (PBS sans potassium, pH
7.4). Pendant le dernier lavage, les érythrocytes sont centrifugés à 3000 g pendant 10
minutes pour obtenir une préparation de cellule empaquetée. Ils sont alors suspendus
dans 4 volumes de solution de PBS (sans potassium) (hématocrite 10 % qui équivaut
à 109 cellules/ml).
CuSO4 est utilisé pour amorcer l’hémolyse, en entraînant l'oxydation de lipides
membranaires et des protéines. Deux millilitres de la suspension d’érythrocytes sont
mélangés avec 2 ml de solution de PBS contenant les quantités diverses de saponine
d'Argania spinosa ou d’anti-inflammatoires (l'acide acétylsalicylique et
l’acétaminophène) (1mg/L pour saponines et 2 mM pour les anti-inflammatoires).
Deux millilitres de CuSO4 (100 µM dans PBS) sont alors ajoutés aux divers
mélanges. Dans ces conditions, des radicaux hydroxyles sont produits par les
réactions suivantes :
Cu 2+ + H 2 O 2  Cu + +·O 2- + 2H +

Cu + + H 2 O 2  Cu 2+ +·OH +OH -

Les diverses combinaisons de mélanges de réaction sont incubées à 37°C pendant 3

heures avec une agitation légère et continue. Après l'incubation, le mélange
réactionnel est dilué avec 8 volumes de PBS et ensuite il est centrifugé à 3000 g
pendant 5 min. L'absorbance à 540 nm du surnageant est déterminé par un
spectrophotomètre (RA-50 Bayer, Allemagne) avec ou sans vitamine E (0,3 µM)
après 1, 2, 3 heures d'incubation.

64
4. Mesure de la perte en potassiu m par les GR:

Comme décrit ci-dessus, les GR sont suspendues dans 3 ml de PBS sans potassium et
avec les quantités diverses de produits évalués et du CuSO4 pour donner un
hématocrite de 0.5 %. Après centrifugation à 1500 g pendant 10 minutes, la
+
concentration en K du surnageant est mesurée par photométrie de flamme (Evans
electroselenium, Essex, U.K.). Toutes les expériences sont reproduites cinq fois.

5. Mesure de l’oxydation d'hémoglobine:

L'oxydation d'hémoglobine à l'intérieur des GR en présence des anti-inflammatoires

et des saponines est évaluée en mesurant les spectres absorption d'hémoglobine. La
suspension GR (10 % hématocrite) décrite ci-dessus est incubée à l’air libre en
présence de molécules évaluées sans H2O2. Une aliquote (100 µl) de la suspension de
GR est prélevée périodiquement, lavée avec PBS glacé et lysée dans 4 ml de tampon
phosphate hypotonique (5 mM de phosphate de sodium, pH= 8). L'absorption
d'oxyhémoglobine est alors mesurée avec un spectrophotomètre (RA-50 Bayer) à
540 nm.

6. Oxydation de la BSA:

La BSA, une protéine hydrosoluble, qui lorsqu’elle est polymérisée par les radicaux
OH libres, perd sa solubilité. Les radicaux OH libres sont produits par la réaction

65
Fenton et si un piégeur radical OH libre est ajouté au système, une diminution de
polymérisation est facile à évaluer par la fraction de protéine soluble dans l’eau.

La BSA a été préparée dans l'eau avant l'adjonction d'agents oxydants différents dans
des proportions de 1:1 (v/v), avec la concentration de BSA finale de 2 mg/millilitres.
Les Oxydants inclus sont 2,2-azobis l'hydrochlorure (2-amidinopropane) (AAPH);
acide hypochlorique (HOCl); et l'eau oxygénée ( H2O2, 30 % v/v, 8.9 M) en présence
des métaux de transition. Les ions métalliques Fe (sulfate heptahydrate de fer
(FeSO4, 7H2O, Merck)), le Cu (sulfate pentahydrate de cuivre, (CuSO4, 5H2O;
Merck)) ont été ajoutés dans une solution de EDTA de 2 ml (l'acide éthylène diamine
tetra acétique, Sigma) ou l'eau juste avant l'utilisation de l'azote pour réduire l’auto
oxydation.
Les tests d'oxydation induits par le radical Hydroxyl sont baseés sur une réaction
catalysée par les métaux de transition. La BSA a été dissoute dans une solution de
tampon phosphate de 150 mM saturé par l’air (pH =7.3), à une concentration finale
de 0.5 mg/millilitres. La BSA a été incubé avec les ions Cu2+ ou Fe2+(100 μM) et
H2O2 (2.5 mM), pour les durées indiquées en présence ou absence d'antioxydants.
Les réactions ont été réalisées dans des tubes exposés à l’air et incubés dans un bain-
marie à 37°C. L'aspirine et l’acetaminophene (2 mM), le mélatonine (1 mM), trolox,
l'analogue (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic l'acide) (300μM) ont
été dissouts dans l'éthanol de 100 % et additionnés d'une solution de stock de 500
mM afin de minimiser la concentration finale d'éthanol. Le solvant (l'éthanol, 0.2 %
v/v) était toujours inclus dans le groupe traité au Cu2 +/H2O2. Les Saponines d'A.
spinosa (1 mg/l), ascorbate (1 mM) et le D-mannitol (100 mM) ont été directement
dissouts dans le tampon phosphate (150 mM).

En présence de différents antioxydants les degrés différents de précipitation de la

BSA se produisent en raison de l'effet de polymérisation par des radicaux OH libres.

66
La protéine restante dans le surnageant a été quantifiée en utilisant la méthode de
folin-phénol et en mesurant l'absorbance à 600 nm.

7. Oxydation d’une ému lsion lipido-p rotéique:

Une émulsion lipido-protéique a été mise en combinant 9 millilitres de BSA (10

mg/ml) avec LnMe (10 mM) par centrifugation durant 1.5 minutes à 13500 tr-min.
La BSA (9 mg/ml) seule ou l’émulsion BSA/LnMe ont été incubées dans un bain-
marie d'eau à 37°C dans le tampon phosphate de 50 mM au pH de 7.4. Après
l'incubation, un échantillon de 2.5 millilitres était élué sur une colonne pré-équilibré
avec le tampon phosphate (50 millimètres, pH=7.4) pour enlever des agents
initiateurs et les lipides. Les fractions de protéine obtenues ont été analysées pour
déterminer les hydroperoxydes liés aux protéines.

8. Hydrop eroxyd es de p rot éine:

La fraction de protéine (50 μl) a été incubée avec 950 μl d'ammonium ferreux
sulfate/xylenol l'agent orange (2.5 mM) et a été mise en incubation à la température
de pièce pendant 30 minutes. L'absorbance a été lue à 560 nm utilisant le xylenol
orange comme un témoin blanc. Une courbe standard a été préparée en utilisant de
l'eau oxygénée.

67
9. Diènes Conjugués:

Les diènes conjugués ont été déterminés en mélangeant 1 millilitre de la mixture de

réaction (BSA/LnMe et les molécules ou les extraits évalués) avec 2.5 millilitres de
tampon phosphate (50 mM, pH 7.4) refroidie par la glace et avec 3.5 millilitres
d’heptane. Après agitation énergique les échantillons sont centrifugés à 58°C (2000 g
durant 3 minutes) et la phase organique a été lue à 210 et 234 nm. Les Diènes
conjugués ont été quantifiés comme le rapport entre l'absorbance à 234 et 210 nm.

10. Analy ses stati stiques:

L'analyse statistique effectuée est soit une analyse de la variance suivie d’une
analyse post-hoc, soit une analyse par des méthodes non paramétriques (Sigmastat
3.11, Systat Software Inc. et en utilisant la version 4.03 de Prisme de GraphPad
www.graphpad.com). La signification statistique est définie comme p=0.05 pour
rejeter une hypothèse nulle. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ±
l'erreur standard.

68
Chapitre III. Résultats et discussions:

69
1. Activité hémolytique des saponinnes d’Argania spinosa:

Dans le but d’évaluer les propriétés antioxydantes des saponines d’Agrania spinosa,
nous avons évalué dans un premier temps leur activité hémolytique vis-à-vis des
globules rouges. Les GR ont été ainsi exposées à ces saponines pendant 3 heures
comme décrit dans le protocole expérimental (sans initiateurs de radicaux libres
Cu2+/H2O2). Le suivi de l’absorbance à 540 nm qui reflète la concentration de HbO2
permet d’évaluer aisément le pouvoir hémolytique de ces saponines. Comme indiqué
dans la figure 16, les saponines d'Argania spinosa induisent l’hémolyse des GR
d’une manière dose dépendante. Cet effet n'est pas linéaire mais plutôt sigmoïde. La
concentration entraînant 50 % l'effet hémolytique maximal (EC50) a été évaluée
quantitativement en utilisant un modèle logistique à quatre paramètres est environ
10,38 ± 0,79 mg/L (Figure 16). Dans ces conditions, la concentration de 1 mg/ml de
saponines n'induit pas d’activité hémolytique significative lorsqu’on la compare avec
le contrôle négatif (sans saponines). Ainsi, la concentration de 1mg/L est retenue
pour les expériences suivantes visant à évaluer l'effet antioxydant de saponines
évalué aux concentration non hémolytique.
Nous avons ensuite analysé l’effet hémolytique des saponines aux concentrations non
hémolytique (1mg/ml) en présence d’initiateurs de radicaux libres. Comme le montre
les figures 17 et 18, Le traitement des GRs avec le peroxyde hydrogène en présence
de CuSO4 (Cu2+, H2O2) augmente significativement la libération d'hémoglobine ou la
perte du potassium cellulaire comparé au contrôle négatif (CuSO4 seul), en facilitant
la peroxydation des membranes.

70
 1,5
Absorbance

1,0

0,5

0,0
0 10 20 30 40 50

Concentration (mg/l)

Figure 16. Effet hémolytique des saponines d'Argania spinosa évalué

quantitativement par la libération d'HbO2 (absorbance à 540 nm) en absence d'H2O2
avec un lissage par un modèle logistique à quatre paramètres.

71
 1,8

Absorbance (540nm,1h)
Absorbance (540nm,2h)
1,6
Absorbance (540nm,3h)

1,4

1,2
Absorbance

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
saponin

CuSO4

CuSO4+H2O2
+saponin

+H2O2

+vitE,Asp
+Asp

+vitE
+Acm,Asp

+vitE,Acm
+Acm

+vitE,sap
control

Figure 17. Effet des différents traitements sur l’absorbance à 540 nm induite par
H2O2 à des temps divers d’incubation (1 heure, 2 heures et 3 heures). ( + : CuSO4 et
H2O2, Asp : Aspirine, Acm : Acétaminophène, sap : saponines d'Argania spinosa,
VitE : vitamine E)

72
 100

80
perte en potassium

60

40

20

0
saponin

CuSO4

+vitE
+Asp

+H2O2

+Acm,Asp
control

CuSO4+H2O2
+Acm

+saponin

+vitE,Asp
+vitE,sap

+vitE,Acm

Figure 18. Effet des divers traitements sur la perte en potassium cellulaire induite par
H2O2 après 1 heure (légende identique à celle de la figure 16).

73
Cette cytotoxicité vis-à-vis des globules rouges induite par la combinaison de CuSO4
et H2O2 , est provoquée par le peroxyde d’hydrogène.

Pour déterminer si les saponines d'Argania spinosa peuvent empêcher une telle
toxicité induite par ses radicaux, les GR ont été incubés avec les saponines d'Argania
spinosa (1mg/L) avant leur exposition aux initiateurs de radicaux (CuSO4 et H2O2).
Comme indiqué dans les figures 17 et 18, les saponines (1mg/L) empêchent 53.2 %,
de la cytotoxicité des GR causée par le peroxyde hydrogène après une incubation
d’une heure. Certes, cette prévention de la cytotixicté par les faibles concentrations
des saponines est relative plus faibles que les anti-inflammatoires, classique l'aspirine
et l’acétaminophène à 2mM, qui empêchent respectivement de 75 % et 68.5% la
cytotoxicité dépendante des radicaux libres (Figure 17), mais l’effet observé est
intéressant.

A fin de potentialiser l’effet protecteur des saponines, celles-ci ont été testées à 1
mg/L en combinaison avec la vitamine E à la concentration non-protectrice (0.3 M).
Les résultats de la figure 17 montrent que cette combinaison réduit la cytotoxicité
cette fois-ci de 68% , un effet comparable à celui observé avec l’acétaminophène. En
revanche, l’acétaminophène ne potentialise pas l'effet antiradicalaire de la vitamine
E. Ce résultat suggère que les saponines potentialisent l'effet protecteur de la
vitamine E. De meme, l'aspirine (2mM) et la vitamine E réduisent la cytotoxicité des
radicaux libres de 92.3 %, tandis que l’acétaminophène est inactif à ce niveau-là.
La combinaison de l'aspirine et de l’acétaminophène entraîne une diminution de la
libération de l’hémoglobine de 89.13 %. Elle cause aussi une faible perte de
potassium (Figure 18) par les GR après 1 heure d’incubation. En général, la perte de
potassium est significativement corrélée à la libération d'Hb. En outre, l'activité
antihémolytique diminue avec le temps pour tous les produits évalués (Figure 17). Il

74
ressort de cette étude que les produits antihémolytiques les plus puissants sont
l'aspirine et l’acétaminophène suivis par les saponines d'Argania spinosa.

2. Oxydation de l’hémoglobin e:

Compte tenu des résultats susmentionés obtenus avec les saponines d'Argania
spinosa, l'aspirine et l’acétaminophène, nous avons examiné leurs effets sur l'état
oxydatif des protéines, en l’occurrence l’hémoglobine. Pour ce faire, nous avons
examiné l'oxydation de l'hémoglobine, à l'intérieur de l’érythrocyte, induite par des
molécules en absence d'H2O2 et ce après 7 heures.
La figure 19, montre le profil d’absorption, de l’oxyhémoglobine (HbO2), en absence
d'H2O2. Le profil de l’oxyhémogobine présente deux principaux pics près de 540 nm
et 575 nm. On peut ainsi, suivre l’état d’oxydtion de l’hémoglobine en suivant la
variation de la densité optique à 540 nm. En effet, la formation de méthémoglobine
s’accompagne par la diminution de l'absorbance à 540 nm.
Ainsi, l'activité pro-oxydante des produits pourrait être quantifiée en suivant la
modification de l'absorbance à 540 nm. Comme indiqué dans la figure 20,
l’acétaminophène et l'aspirine ont entrainé une réduction de l’absorbance à 540 nm
de 9% et 12% respectivement alors que les saponines d’Argania spinosa, n'ont pas
entraîné de réduction significative. L’effet de l’acétaminophène et l'aspirine étant
statistiquement significatif (p < 0.05) et différent du contrôle et des saponines
d’Argania spinosa (Figure 20). Ainsi, seules les molécules lipophiles
(l’acétaminophène et l'aspirine) seraient capables d'induire l'oxydation de HbO2.
L’absence d’effet des saponines pourrait être expliquée au moins en partie par
l’inaccessibilité de l’hémoglobine intracellulaire aux saponines.

75
 0.7 0.7

0.6 0.6

0.5 0.5
Absorbance

0.4 0.4

0.3 0.3

0.2 0.2

0.1 0.1

0 0
450 490 530 570 610 650
Wavelength (nm)

Figure 19. Spectre absorption d'oxyhémoglobine du contrôle après l'incubation de

7 heures à 37 °C avec un lissage de Savitzky-Golay.

76
 1,2

1,0

0,8
Absorbance

0,6

0,4

0,2

0,0
aspirin acetaminophen saponin Control

Figure 20. Effet des différents traitements sur l’absorption d’oxyhémoglobine à 540
nm après incubation de 7 heures à 37 °C.

77
3. Oxydation de la BSA et de LnMe:

A fin d’élargir les données antérieures et de comparer les différents systèmes

d’oxydants, nous avons évalué dans un premier temps l’effet aussi bien du chélateur
l’EDTA, que des différents métaux de transition, comme le cuivre et le fer, sur la
solubilité de la BSA.
Il s’agit donc d’utiliser un modèle de polymérisation d’une protéine, en l’occurence
la BSA comme indicateur du degré de solubilité des protéines dans différents
systèmes d’oxydants. .
Il faut rappeler que la BSA, qui est une protéine hydrosoluble, perd sa solubilité
lorsqu’elle est polymérisée par les radicaux OH libres. La fraction soluble est
quantifiée en utilisant la méthode de folin-phénol et en mesurant l'absorbance à 600
nm.
Comme le montre la figure 21, les oxydants tels le 2,2-azobis l'hydrochlorure (2-
amidinopropane) (AAPH); l’acide hypochlorique (HOCl); et l'eau oxygénée (H2O2)
et les des métaux de transition entrainent la polymérastion de la BSA qui se traduit
par la diminution de la fraction soluble. Les résultats de cette figure montrent
également que le système le plus oxydant est le système Cu2+, H2O2 et que le moins
oxydant est le système OHCl.
Les résultats montrent que le Cu2 + cause une plus grande solubilité de la BSA dans
l'eau comparée au Fe2 + (Figure 21).

78
Figure 21. L'effet de différents systèmes d’oxydant sur la solubilité BSA (quantifié
avec la méthode de folin-phénol) après incubation durant 6 heures. (AAPH; 2,2' azo-
bis-l'hydrochlorure (2-amidinopropane), EDTA (acide éthylène diamine tetra
acétique). Le contrôle correspond au contrôle negatif (absence de polymérisation de
la BSA).

79
Quand l’EDTA est ajouté au cuivre ou au fer, l'effet des oxydants est réduit
significativement (p <0.05) (Figue 21). Seul le cuivre avec H2O2, quand complexé à
l’EDTA, a de façon significative une activité oxydante plus faible que le cuivre seul,
mais pas le fer avec H2O2 ni l’AAPH.

Les simulations avec le programme winmaxc32

(www.stanford.edu/~cpatton/maxc.html ), avec un pH physiologique et la correction
de la force ionique, montrent que Cu2+ se lie à différents chélateurs et
particulièrement à l’EDTA avec une plus haute affinité que le fer. Cet effet est
probablement associé à la formation de complexes de métal de transition. Les
facteurs qui peuvent influencer leur formation sont le rayon ionique et le caractère
électronégatif des atomes des métaux. Ainsi probablement le cuivre attaché à la BSA
provoque des dommages spécifiques de site en présence de l'eau oxygénée.

Les saponines d'A. spinosa, la mélatonine plus efficacement que l'aspirine sont
capables d’inhiber la polymersation de la BSA relativement au contrôle (Figure 22).
Le mannitol et l’acétaminophène n'exercent aucun effet significatif sur la
polymérisation de la BSA alors que l'acide ascorbique entraine une diminution de la
solubilité de la BSA probablement par une réaction fenton avec les ions de cuivre et
il a ainsi une activité pro-oxydante (Figure 22).

Les produits d'oxydation de lipides semblent capables d'induire des dommages des
protéines et les hydro-peroxydes de protéine augmentent quelque soit l'agent (Figure
23). Les saponines d’A. spinosa sont capables de réduire les hydroperoxydes protéine
(après une heure et quatre heures) seulement en absence de lipides (LnMe) (Figure
23). Mais le Trolox, un analogue de la vitamine E, a la capacité de réduire la

80
production d'hydroperoxyde de protéine, que ce soit en présence de l’initiateur
AAPH (lipophile) ou Fe2 +/H2O2 (en présence ou absence de lipides) (p <0.005)
(Figure 23). Ces résultats peuvent être appuyés par les constatations de Sivonová et
al., qui ont remarqué que le trolox a significativement augmenté l’inhibition de la
peroxydation des lipides initiée par l’acétate de cuivre et le ter-butylhydroperoxyde
en fonction de la concentration et du temps comparativement avec liposomes
unilamellaires non traités (Sivonová et al., 2006).
Les saponines d’A. spinosa peuvent diminuer les diènes conjugués formés par une
émulsion de méthyle linolate ester seulement après un délai de six heures (Figure.
24) cela est probablement en rapport avec la taille des saponines de l’arganier, de
leurs caractére hydrophyles et de la localisation du lieu de formation des radicaux .
Par contre, le trolox peut réduire les diènes conjugués produits par une une émulsion
de méthyle linolate ester et leur vitesse de formation, en présence de l'initiateur
AAPH (lipophyle) ou du Fe2+/H2O2 (en présence ou absence de lipides) (p <0.005)
(Figure 24). Ces résultats peuvent être corroborés par les observations de Wu et al.
qui ont observé que le trolox réduit significativement la quantité de diènes
conjugués (un marqueur chimique des dommages des oxyradicaux) provenant des
phospholipides des hépatocytes (Wu et al., 1990).

81
 Figure 22. Effet de différents agents incluant les saponines d'A. spinosa sur la
solubilité de la BSA (quantifié avec la méthode de folin-phénol) après 4 heures dans
le system oxydant: Cu2 +/H2O2 . Le contrôle correspond au contrôle positif
(polymérisation de la BSA).

82
Figure 23. Effet des saponines d'A. spinosa et du trolox sur l’hydroperoxydation des
protéines (mM/mg BSA). (a) : 2,2' azo-bis-(2-amidinopropane) hydrochloride, (i) ;
Fe2+ /H2O2, (+) ; plus méthyle linolate ester , (-) ; absence du méthyle linolate ester )
pendant une heure ou une période d'incubation de quatre heures.

83
Figure 24. Effet des saponines d'A. spinosa et du trolox sur la formation de diènes
conjugués par l'émulsion BSA et linolate le méthyle ester après 1 et 6 h avec AAPH
et Fe2+/H2O2 (a ) : 2,2' azo-bis-(2-amidinopropane) hydrochloride (AAPH), (i): Fe2+
/H2O2)

84
4. Discussion:

L'activité antioxydante semble être liée à plusieurs paramètres physico-chimiques.

Elle est dépendante de la structure moléculaire, en particulier la lipophilicité des
molécules (Teixeira et al. 2005, Brenda et al. 2005, Trouillas et al. 2006, Mendoza-
Wilson & Glossman-Mitnik 2006, Wei et al. 2006). La lipophilicité corrélée au
nombre d'atomes polarisés (OH et NH2) capables de former des liaisons hydrogènes
avec des molécules d'eau augmente leur solubilité dans les solvants polaires (l’eau
dans notre cas). Les études précédentes de la partition de molécules relativement
petites dans les GR en particulier les molécules organiques cationiques, anioniques et
non-électrolytiques ont montré que la lipophilicité, la taille moléculaire et les
caractéristiques chirales de molécules influencent leur pénétration dans les GR
(Sha'afi et al. 1971). Ainsi, les composés lipophiles pénètrent dans les GR en se
dissolvant dans les bicouches lipidiques membranaires tandis que les composés de
petite taille hydrophiles entrent dans les GR par des canaux aqueux. Cela laisse
suggérer que, l’acétaminophène et l'aspirine, qui sont lipophiles, pourraient pénétrer
dans la membrane des GR, expliquant ainsi leur importante propriété antioxydante.
Cela peut expliquer, au moins partiellement, l'activité antiradicalaire des anti-
inflammatoires étudiés (l’acétaminophène et l'aspirine). Le coefficient de partition
octanol-eau (LogP) de l’aspirine est inférieur à celui de l’acétaminophène (1.460
contre 0.310 à pH = 7.4 avec PBS, CS ChemProp 2003), qui indique que l'aspirine
peut avoir une affinité plus grande pour des lipides des GR comparée à
l’acétaminophène. Nous avons observé que l'aspirine, dont le logP est plus grand que
1.0, réduit significativement hémolyse des GR induite par H2O2.
Seules les molécules avec logP relativement élevée (la mélatonine; 1.536, l’aspirine;
1.426, (drugbank: www.redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank) peut prévenir la
polymérisation de la BSA. Mais les molécules avec des valeurs de logP relativement
faible (acetaminophen; 0.917, acide ascorbique;-1.305, mannitol;-3.506, sont

85
inefficientes pour protéger la BSA de la polymérisation, ou faciliter les radicaux à
induire des dommages plus importants (l'acide ascorbique). Les molécules
volumineuses avec relativement une haute refractivité moléculaire (le volume d'une
molécule) (la mélatonine; 66.98, aspirine; 43.29 cm3/mol, (Chemdraw Hyper 8.0.3,
CambridgeSoft)) peuvent inhiber la polymérisation de la BSA. Des molécules avec
une réfractivité moléculaire basse (acétaminophène; 40.25, acide ascorbique; 36.61,
mannitol; 38.44 cm3/mol) n’inhibent pas ou augmentent la polymérisation de la
BSA.
Effectivement, Yang. Et al. ont constaté que l'effet inhibant de la peroxydation les
lipides par des flavonoïdes est corrélé aussi bien au logP qu'à leur potentiel
d’oxydation (Yang et al. 2001).
En conséquence, vu que les saponines d'A. spinosa sont riches en OH leur logP serait
faible, dans ce modèle d’étude.
D’autres part les saponines d'Argania spinosa sont riches en OH (hydrophile), cela
peut suggérer une valeur de LogP faible, expliquant ainsi l'absence d'activité
d'oxydation HBO2 significative de ces molécules. De plus, nos résultats indiquent
l’effet protecteur de saponines d'Argania spinosa des hématies contre l’effet nocif des
radicaux libres. Cette observation est en accord avec d'autres études qui affirment que
les saponines de Ginseng panax (ginsenosides) protègent les érythrocytes contre
l’hémolyse induite par les radicaux libres (Liu et al. 2002b). De plus, les saponines
augmentent la perméabilité des membranes cellulaires aux différentes molécules
(Launikonis & Stephenson 1999, Bachran et al. 2006). On peut suggérer que les
saponines d'Argania spinosa pourraient faciliter la pénétration de la vitamine E dans
les membranes des GR ce qui peut expliquer leur effet synergique.
D'autre part, cela n'exclue pas qu’aussi bien les saponines d'Argania spinosa, que
l'aspirine puissent agir comme des chélateurs de métaux de transition (Cu2+). Elles
préviennent probablement les dommages de la BSA induits par les radicaux par un
mécanisme similaire au mécanisme de l’EDTA. De plus, le cuivre libre ou le fer est

86
un catalyseur crucial des réactions radicalaires impliquant les formes réactives
d'oxygène dans des systèmes biologiques, leur déplacement et/ou leur séquestration
intracellulaire entraîneraient une sensibilité cellulaire diminuée aux dégâts des
oxydants (Einsele et al. 1987, Asaumi et al. 1996).
Nos résultats montrent que la polymérisation de la BSA varie suivant le métal utilisé.
L’EDTA prévient la polymérisation de la BSA par une réaction de type Fenton-
catalysée par les ions de cuivre, mais augmente en présence des ions de Fe.
L'effet inhibiteur du complexe Fe-EDTA observé dans notre étude peut être expliqué
partiellement par la structure ouverte de complexe ferrique-EDTA, qui permettent à
plus de radicaux hydroxyle d'être libérés dans le milieu (Amici et al. 1989, Deraeve
et al. 2006).
Par conséquent, la polymérisation des protéines peut survenir particulièrement dans
les liquides contenant les ions cuivre (le plasma et les liquides synoviaux) et peut
contribuer au changement de structure de biomolécules et de leur fonction.

D'autres études ont aussi montré que la mélatonine est un antioxydant puissant des
lipides et un piégeur efficace des radicaux alkoxyle et peroxyle produits tant dans les
cellules traitées par les oxydants que dans les modèles sans cellules (Zavodnik et al.
2006). L’inhibition forte de la polymérisation de la BSA par le mélatonine dans notre
étude peut être expliquée par sa capacité à libérer son électron, une importante
surface moléculaire et un moment dipolaire élevé (Zavodnik et al. 2006).
Le Trolox est beaucoup plus efficace, comparée aux saponines d'A. spinosa, contre
de l'oxydation de protéines même en présence de lipides quel que soit le système
oxydant (AAPH et Fe2+/ H2O2) probablement à cause de sa lipohylicité élevée (logP
de 3.91 (Chemdraw Hyper 8.0.3, CambridgeSoft)). Il peut être conclu que les
saponines d'A. spinosa ne sont pas capables d'agir comme des antioxydants
«briseurs» de la chaîne radicalaire dans ce système étudié et leur potentiel
antioxydant peut être en rapport à un mécanisme de chélation des métaux. Les

87
saponines d'A. spinosa étant hydrophiles se trouvent essentiellement dans la phase
aqueuse de l'émulsion, se trouvant ainsi situé favorablement pour l'action
antioxydante vis a vis des groupes d'aminoacides exposés au solvant.

88
7. Conclusions:

Malgré que les saponines d’argania spinosa montrent à forte concentration une
activité hémolytique, elles présentent à faible concentration une activité
antioxydante et empêchent l’hémolyse des hématies, induites par les radicaux
hydroxyles. Elle est relativement faible par rapport à certains antiinflammatoires
(aspirine, acétaminophène). L’activité antioxydante des saponines semble
intimement liée à sa structure moléculaire. Sa forte hydrophilie laisse supposer
qu’elles se localiseraient dans le milieu extracellulaire et/ou le milieu
intracellulaire. Les saponines d’argania spinosa présentent une activité
antioxydante susceptible d’agir en synergie avec la vitamine E et réduire
l’hémolyse induite par les radicaux libres. Probablement, en facilitant la pénétration
de la vitamine E dans les membranes des hématies. La synergie des saponines
serait due à leurs caractères hydrophiles et elles se localiseraient dans un
environnement polaire, séparées des molécules lipophiles (aspirine,
acétaminophène, vitamine E).

Les saponines d’Argania spinosa sont tout aussi capables d’empêcher la

polymérisation de l’albumine causée par les systèmes oxydants hydrophiles avec
Cu2+/H2O2. Mais à la différence de l’analogue de la vitamine E le trolox ces
saponines sont efficaces dans la prévention de la formation des protéines
hydroperoxydes uniquement en absence du LnMe et en présence du Fe2+/H2O2.
Elles réduisent aussi la production des diènes conjugués à partir de l’oxydation des
lipides après un délai de 6 heures. Cette activité antioxydante est probablement liée
à divers mécanismes d’actions et à la structure de ces saponines. Elles agiraient
soit directement par neutralisation des radicaux libres localisés dans les poches
hydrophiles de l’albumine bovine, soit indirectement par captation des ions de
métaux de transition, par un mécanisme proche de celui des chélateurs.

89
Il reste toutefois plusieurs zones d'ombres à savoir:
 L’éclaircissement des synergies des saponines entre elles, avec les
antioxydants classiques et les molécules thérapeutiques.
 l'étude de la relation entre la structure et l'activité antioxydante des
saponines isolées à partir d'argania spinosa.
 La quantification de l'effet chélateur des saponines vis-à-vis des métaux de
transitions.
 La précision du niveau d'action des saponines d'argania spinosa au niveau
des membranes et des protéines.

90
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Annexes:

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FITOTE-01692; No of Pages 8

Fitoterapia xx (2008) xxx – xxx

www.elsevier.com/locate/fitote

Protective effect of saponins from Argania spinosa against free

radical-induced oxidative haemolysis
H. Amzal a , K. Alaoui b , S. Tok c , A. Errachidi c , R. Charof c ,
Y. Cherrah b , A. Benjouad a,⁎
a
Laboratoire de Biochimie et Immunologie, Faculté des Sciences, Avenue Ibn Batouta, BP 1014 Rabat, Morocco
b
Laboratoire de Pharmacologie et de Toxicologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, BP 6203, Rabat Instituts, Agdal, Rabat, Morocco
c
Laboratoire de Biochimie et d'Hématologie, Institut National d'Hygiène, 27, Avenue Ibn Batouta, BP 769 Rabat, Morocco

Received 13 December 2006; accepted 26 March 2008

Abstract

Saponins from Argania spinosa at a non-haemolytic concentration diminish by 53.2% erythrocyte haemolysis induced by free
radicals. 2 mM aspirin and acetaminophen diminish by 75% and 68% , respectively, erythrocyte haemolysis induced by free
radicals, while 0.3 μM vitamin E shows no significant antioxidant activity. Interestingly, a combination of 1 mg/l of A. spinosa
saponins and vitamin E at 0.3 μM resulted in a 68% level of protection against free radical-induced erythrocyte haemolysis, which
may suggest that A. spinosa saponins enhance the antioxidant effect of vitamin E. In contrast, no synergic effect was observed for
acetaminophen (2 mM) when in combination with vitamin E (0.3 μM). These results demonstrate the antioxidant properties of
saponins from A. spinosa and their ability to potentate the antioxidant effect of vitamin E.
© 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Keywords: Argania spinosa: Saponins; Antioxidant activity

1. Introduction

Oxidative damage to cellular membranes may contribute to the initiation and progression of several degenerative
diseases [1–7]. The hydroxyl radical (.OH), quite abundant under physiological conditions, reacts readily with practically
any type of biological molecules in living cells, such as sugars, amino acids, phospholipids, and DNA bases [8–16].
Therefore, scavenging of .OH is considered an important reaction underlying the many health benefits of food antioxidants
[17–24].
A. spinosa is an endemic Moroccan plant commonly used in folk medicine and several biological effects of this
plant have been reported [25–30].

⁎ Corresponding author. Tel.: +212 37 77 80 12; fax: +212 37 77 42 61.

E-mail address: benjouad@fsr.ac.ma (A. Benjouad).

0367-326X/$ - see front matter © 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.fitote.2008.03.003

Please cite this article as: Amzal H, et al, Protective effect of saponins from Argania spinosa against free radical-induced oxidative haemolysis,
Fitoterapia (2008), doi:10.1016/j.fitote.2008.03.003
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Saponins from this plant have been shown to possess anti-inflammatory and antiradical activity against
diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) and OH radicals [31–33].
To understand the possible mechanisms of the antioxidant activity, we explored the antiradical activity of A. spinosa
saponins compared to two lipophilic anti-inflammatory drugs (aspirin and acetaminophen) on a model of free radical-
induced membrane damage. We examined the action of vitamin E, aspirin, acetaminophen and saponins using two
indicators, haemoglobin (Hb) release and cellular potassium loss.

2. Experimental

2.1. General

Abbreviations: OD, optical density; RBC, red blood cells; Hb, haemoglobin; HbO2, oxyhaemoglobin; NSAIDs, non
steroidal anti-inflammatory drugs.
Hydrogen peroxide (H2O2, 30% v/v, 8.9 M) and copper(II) sulphate pentahydrate (CuSO4,5H2O) were purchased
from Merck (Darmstadt), acetaminophen, aspirin and vitamin E (alpha D-tocopherol acetate) were obtained from
Sigma Chemical Inc. (St. Louis, MO,U.S.A.).

2.2. Plant

A. spinosa (Sapotaceae), collected from the Essaouira region (Southwestern Morocco) during the period of July–
August was identified by D. Petit. A voucher specimen (No. 63971 RAB) was deposited in the Herbarium of Scientific
Institute of Rabat.

2.3. Extraction

Saponins from A. spinosa were obtained as previously described [33]. Briefly, a cake of the A. spinosa almond was
macerated in a cold hydro-ethyl mixture, filtered and concentrated in vacuo. Lipids were then removed by hexane and
ether extraction. Saponins were extracted with n-BuOH and evaporated to dryness. The dry residue constituting a
mixture of saponins was recovered in MeOH–water (80/20; v/v) and then lyophilized to give a final 2% dry weight yield.

2.4. Measurement of Hb release from red blood cells (RBC)

Blood from healthy volunteers was collected into heparinized tubes. RBC were separated from plasma by
centrifugation at 3000 g for 15 min and washed three times with 5 volumes of phosphate-buffered saline (PBS without
potassium), pH 7.4. During the last wash, the erythrocytes were centrifuged at 3000 g for 10 min to obtain a packed cell
preparation. The packed erythrocytes were then suspended in 4 volumes of PBS (without potassium) (haematocrit 10%
or 108 cells/ml).
CuSO4 was used to initiate erythrocyte haemolysis. The addition of CuSO4 to the suspension of erythrocytes
induces the oxidation of membrane lipids and proteins, resulting in haemolysis. Two ml of the erythrocyte suspension
was mixed with 2 ml of PBS containing various amounts of A. spinosa saponin or NSAIDs (acetylsalicylic acid and
acetaminophen) (1 mg/l for saponins and 2 mM for NSAIDs). Two ml of CuSO4 (100 μM in PBS) was then added to
the various mixtures. Under these conditions, hydroxyl radicals were generated from the H2O2–Cu2+ mixture through
the following reactions:

Cu2þ þ H2 O2 →Cuþ þ O−2 þ 2Hþ

U
Cu2þ þ H2 O2 →Cu2þ þ OH þ OH−

The different combinations of reaction mixtures were incubated at 37 °C for 3 h with continuous shaking. After
incubation, the reaction mixture was diluted with 8 volumes of PBS and then centrifuged at 3000 g for 5 min. The
optical density of the supernatant fraction at 540 nm was recorded in a spectrophotometer (RA-50 Bayer, Germany)
with or without vitamin E (0.3 μM) after 1, 2, or 3 h of incubation.

Please cite this article as: Amzal H, et al, Protective effect of saponins from Argania spinosa against free radical-induced oxidative haemolysis,
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2.5. Measurement of potassium loss by RBC

As described above, packed RBC were suspended in 3 ml of PBS without potassium and with various amounts of
the products to be tested and CuSO4 to give a 0.5% haematocrit. After centrifugation at 1500 g for 10 min, the
concentration of K+ was measured in the supernatant using flame photometry (Evans electroselenium, Essex, U.K.).
Results are of five replicates.

2.6. Measurement of haemoglobin oxidation

Oxidation of the haemoglobin of RBC in the presence of the NSAIDs and saponins was assessed by measuring the
absorption spectra of haemoglobin. The RBC suspension (10% haematocrit) described above was incubated in air in
the presence of the tested molecules without addition of H2O2. An aliquot (100 μl) of the RBC suspension was removed
periodically, washed with ice-cold PBS and lysed in 4 ml hypotonic phosphate buffer (5 mM sodium phosphate,
pH = 8). The optical density of oxyhaemoglobin was then measured with a spectrophotometer (RA-50 Bayer) at
540 nm.

2.7. Statistical analysis

Statistical analysis was done using one-way ANOVA followed by post-hoc analysis or nonparametric methods
(Sigmastat 3.11, Systat Software Inc.). Statistical significance was defined as P = 0.05 to reject a null hypothesis. Data
are expressed as means ± standard error for replicate experiments.

3. Results and discussion

3.1. Anti-haemolytic activity

To assess the haemolytic activity of saponins from A. spinosa, RBC were exposed to saponins without Cu2+ for
3 h as described in the Experimental section. Saponins induce haemolysis of human RBC in a dose dependant-
manner (Fig. 1). The dose effect is non linear and the EC50 (concentration giving 50% of the maximum haemolytic
effect) quantified with a four logistic fitting model is 10.38 ± 0.79 mg/l. It can be deduced from Fig. 2 that saponins at

Fig. 1. Effect of A. spinosa saponins (concentration range between 0 and 50 mg/l) on red blood cell haemolysis quantified by HbO2 release (optical
density at 540 nm) in the absence of H2O2. Results showing four parameter logistic smoothing.

Please cite this article as: Amzal H, et al, Protective effect of saponins from Argania spinosa against free radical-induced oxidative haemolysis,
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Fig. 2. Effect of various treatments on haemolysis (optical density at 540 nm) for different times (1, 2 and 3 h) (the plus sign indicates that CuSO4 and
H2O2 were added to the red blood cell suspension) [Asp, Aspirin (2 mM); Acm, Acetaminophen (2 mM); Sap, saponins from A. spinosa (1 mg/l);
VitE, vitamin E (0.3 μM)].

1 mg/l have no significant haemolytic activity as compared to the negative control (without saponins). Thus, the
concentration of 1 mg/l was used in the following experiments to assess the antioxidant effect of saponins.
Treatment of RBC with hydrogen peroxide in the presence of CuSO4 (Cu2+, H2O2) markedly increases release of
haemoglobin (Fig. 2) and potassium loss (Fig. 3) compared to the negative control (CuSO4 alone). Thus, a combination
of CuSO4 and H2O2 induces RBC cytotoxicity mediated by hydrogen peroxide.
To investigate whether saponins from A. spinosa can prevent cytotoxicity, RBC were incubated with saponins from
A. spinosa (1 mg/l) before incubation with CuSO4 and H2O2. As indicated in Figs. 2 and 3 saponins (1 mg/l) diminish by
53.2%, hydrogen peroxide-mediated cytotoxicity of RBC after a 1-h incubation. In the same experiments, 2 mM NSAIDs
(aspirin or acetaminophen) diminished by 75% and 68.5% respectively, hydrogen peroxide-mediated cytotoxicity of RBC
(Fig. 2).
A combination of A. spinosa saponins (1 mg/l) with vitamin E at a non-protective concentration (0.3 μM) reduced
RBC cytotoxicity by 68% (Fig. 2). This result may suggest that vitamin E potentiates the protective effect of
saponins. Under similar conditions, we have used two anti-inflammatory molecules as internal controls. Aspirin
(2 mM) and vitamin E reduce RBC cytotoxicity by 92.3 %, while vitamin E did not potentiate the effect of
acetaminophen.
When used in combination, aspirin and acetaminophen decrease the release of Hb from RBC by 89.13%. This
combination also causes a low level of potassium loss after 1 h (Fig. 4), which correlates with the level of Hb release.
Of note, the antihaemolytic activity decreases with time for all the tested products (Fig. 2). The most potent
antihaemolytic products were aspirin and acetaminophen followed by saponins from A. spinosa.

Please cite this article as: Amzal H, et al, Protective effect of saponins from Argania spinosa against free radical-induced oxidative haemolysis,
Fitoterapia (2008), doi:10.1016/j.fitote.2008.03.003
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Fig. 3. Effect of various treatments on red blood cell (RBC) potassium loss after 1 h (potassium loss was expressed as a percentage of the intracellular
K+ considered as 100%, a sample of RBC was haemolysed in distilled water and the K+ concentration determined in the supernatant after
centrifugation as described above (the plus sign indicates that CuSO4 and H2O2 were added to the red blood cell suspension) [Asp, Aspirin (2 mM);
Acm, Acetaminophen (2 mM); Sap, saponins from A. spinosa (1 mg/l); VitE, vitamin E (0.3 μM)].

3.2. Haemoglobin oxidation

We then investigated the effects of A. spinosa saponins, aspirin and acetaminophen on the oxidative state of haeme
proteins. We examined the oxidation of haemoglobin, in erythrocytes, induced by tested molecules in the absence of
H2O2 after 7 h.

Fig. 4. Scatter plot of potassium loss against absorbance (optical density at 540 nm). Results show a linear regression [potassium loss was expressed
as a percentage of intracellular K+ (100%), a sample of RBC was haemolysed in distilled water and the K+ concentration determined in the
supernatant after centrifugation as described above].

Please cite this article as: Amzal H, et al, Protective effect of saponins from Argania spinosa against free radical-induced oxidative haemolysis,
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Fig. 5. Control absorption spectrum of oxyhemoglobin after a 7-h incubation at 37 °C. Results obtained using Savitzky–Golay smoothing.

As indicated in Fig. 5 and as described previously [24], in the absence of H2O2, oxyhaemoglobin (HbO2) shows two
major peaks near 540 nm and 575 nm. The formation of methaemoglobulin is accompanied by a decrease in the
absorbance at 540 nm. Thus the prooxidant activity of products could be measured by modification of the absorbance at
540 nm. As shown in Fig. 6, in contrast to acetaminophen and aspirin, the A. spinosa saponin extract did not induce
oxidation of HbO2. Thus only lipophilic molecules (acetaminophen and aspirin) were able to induce oxidation of HbO2
as shown by the decrease in absorbance at 540 nm. Their effect was statistically significant (P b 0.05) and different from
the control and A. spinosa saponin (Fig. 6).
Antioxidant activity seems to be related to many physicochemical parameters, in particular the lipophilicity,
depending on the molecular structure [34–38]. Previous studies on RBC partitioning of relatively small organic cationic,
anionic, and non-electrolytic molecules have shown that lipophilicity, molecular size, and chiral characteristics of

Fig. 6. Effect of the different treatments on oxyhemoglobin oxidation evaluated as the absorption at 540 nm after 7 h of incubation at 37 °C.

Please cite this article as: Amzal H, et al, Protective effect of saponins from Argania spinosa against free radical-induced oxidative haemolysis,
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molecules influence their penetration into RBC [39]. Thus, lipophilic compounds penetrate the RBC by being dissolved
in lipid bilayer membranes while small size hydrophilic compounds enter the RBC through aqueous channels. Taking
into account, these data, one may suggest that acetaminophen and aspirin, which are lipophilic, may dissolve in RBC
membranes, thus explaining their high antioxidant property. This may explain, at least partially, the antiradical activity of
the studied NSAIDs (acetaminophen and aspirin). The coefficient of octanol–water partition (LogP) of aspirin is lower
than that of acetaminophen (1.460 against 0.310 at pH = 7.4 in PBS) (CS ChemProp 2003, Cambridge Software), which
indicates that aspirin could have a greater affinity for RBC lipids compared to acetaminophen. We have observed that
aspirin, for which the LogP is greater than 1.0, significantly reduces RBC haemolysis induced by H2O2.
Since saponins from A. spinosa are rich in OH (hydrophilic) moieties this may suggest a lower LogP value for
saponins, explaining thus the absence of significant HbO2 oxidative activity of this product. In addition, our results
report the antioxidant activity of saponins from A. spinosa. This observation is in agreement with other studies
reporting that saponins of Panax ginseng (ginsenosides) protect human erythrocytes from free radical-induced
haemolysis [40]. Since saponins are known to increase cell membrane permeability [41,42], one may suggest that
saponins of A. spinosa may facilitate penetration of vitamin E into RBC membranes which may explain the synergistic
effect.
On the other hand, it cannot be excluded that saponins of A. spinosa as well as aspirin may act as chelators of
transition metals (Cu2+). Since free copper or iron are a crucial catalyst of oxygen centred radical formation in
biological systems, their removal or their intracellular sequestration may result in diminished cellular sensitivity to
oxidant damage [43,44].

Acknowledgements

We thank Dr M.C. Brahimi-Horn for critical reading of the manuscript. Financial support was obtained from Pôle de
Compétences “Pharmacochimie”, Région de Rabat-Salé-Zemmour-Zaers, Agence Universitaire de la Francophonie.

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Please cite this article as: Amzal H, et al, Protective effect of saponins from Argania spinosa against free radical-induced oxidative haemolysis,
Fitoterapia (2008), doi:10.1016/j.fitote.2008.03.003
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Please cite this article as: Amzal H, et al, Protective effect of saponins from Argania spinosa against free radical-induced oxidative haemolysis,
Fitoterapia (2008), doi:10.1016/j.fitote.2008.03.003
Comparison of Argania spinosa saponins with known antioxidants on oxidative cross
linking of albumin in aqueous solution or in a lipid emulsion.

H. Amzala, *, K Alaouib, S. Tokc, A. Errachidi c, R. Charofc, Y. Cherrahb and A. Benjouada

a
Laboratoire de Biochimie-Immunologie, Faculté des Sciences, Avenue Ibn Batouta, BP 1014 Rabat ,
Maroc.

b
Laboratoire de Pharmacologie et de Toxicologie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, BP
6203, Rabat Instituts, Agdal, Rabat, Maroc.

c
Laboratoire de Biochimie et d'Hématologie, Institut National d'Hygiène, 27, Avenue Ibn
Batouta, BP 769, Rabat, Maroc.

Corresponding author. Tel : + 212 (0) 37 77 18 34/35/38, Fax : + 212 (0) 37 77 42 61.
E-mail address: benjouad@fsr.ac.ma (A. Benjouad).

Abstract:

Free radicals are linked to many diseases and could damage proteins and unsaturated lipids
directly or indirectly via free radical processes. Prevention of radical induced protein oxidation
by Argania spinosa saponins (1 mg/l) and studied molecules (melatonin (1mM), trolox (300µM),
aspirin (2mM), acetaminophen (2mM), mannitol (100mM), ascorbate (1 mM)) in a biochemical
model using bovine serum albumin (BSA) in solution alone, or in an emulsion with linolenic acid
methyl ester (LnMe) was found to dependant on the radical generators and the examined
experimental test (BSA solubility, protein hydroperoxides formed, conjugated dienes produced).
Argania spinosa saponins, melatonin, trolox, aspirin, acetaminophen, mannitol, ascorbate were
incubated with BSA alone or BSA/LnMe and oxidation was induced either with the water-soluble
azo-initiator 2,2' azo-bis-(2-amidinopropane) hydrochloride (AAPH), or the system using
Cu2+/H2O2 or Fe2+/H2O2. The results show that only Argania spinosa saponins, melatonin and
aspirin were efficient in the system with Cu2+/H2O2 on preventing BSA cross linking . However,
with initiating agents Fe2+/H2O2, A. spinosa saponins oppositely to the vitamin E analogue,
trolox, was effective in preventing protein hydroperoxides formation only in the absence of
LnMe and in the presence of Fe2+/H2O2 as initiator agent and reduce conjugated dienes
production from lipid oxidation after 6 hours of delay. In conclusion, this study show that A.
spinosa saponins extract, may prevent protein or lipid-protein emulsion oxidation .
Introduction:

Free radicals damage to biological molecules (Dean et al. 1991; Mayo et al. 2003; Reeder et al.
2004; Valko et al. 2007) is associated to a variety of pathological processes related to aging and
to several neuro-degenerative diseases (Halliwell 2001; Fang et al. 2002; Bonnefoy et al. 2002;
Devasagayam et al. 2004; Crouser 2004). It has been shown that oxidized modified proteins
accumulate during aging and in some pathological conditions (Squier 2001; Sayre et al. 2005).
Exposure of proteins to .OH and O-2 or both leads to gross structural modifications. These
modified proteins may undergo spontaneous protein fragmentation and cross-linking or exhibit a
substantial increase in proteolysis (Squier 2001). Oxidative damage to proteins results in
dysfunction of proteins such as enzymes, transport proteins, and receptors (Gutierrez-Correa and
Stoppani 1995; Hashimoto et al. 2000; Khan and Khan 2004). Protein modification by reactive
oxygen species (ROS) is a well established phenomenon as are the characterized reaction
products of protein interactions with formation of .OH and O-2 . This eventually leads to the
production of alkyl, alkoxyl and alkylperoxyl radical intermediates, which set the stage for
cleavage of peptide bonds. A wide variety of reactions between ROS and amino acid chains
occur and all amino acids in proteins are susceptible to modification (Amici et al. 1989; Villiere
et al. 2005; Baron et al. 2006).
Human serum albumin (HSA) is the main protein in blood and is widely distributed throughout
the body. Apart from maintaining osmolarity, albumin is also involved in the binding and
transport of many ligands including metals (12 to 18% of copper in human blood plasma), fatty
acids, and small drugs (Quinlan et al. 2005).
A. spinosa an endemic Moroccan medicinal plant, with various biological effects (Alaoui et al.
1998a; Alaoui et al. 1998b; Drissi et al. 2006; Samane et al. 2006; Berrougui et al. 2006), is rich
in saponins, a group of glycosides, widely distributed in higher plants; and have numerous
pharmacological properties (Sparg et al. 2004). A. spinosa saponins have anti-inflammatory and
antiradical activities against diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) and OH radicals (Alaoui et al.
1998a; Alaoui et al. 1998b). However, the effects of A. spinosa saponins on protein and lipid-
protein emulsion oxidation has not been studied.
Copper and iron, can initiate the production of radicals, responsible for lipid peroxidation in
membranes, direct oxidation of proteins, and cleavage of DNA and RNA molecules (Crichton
2001; Tapiero et al. 2003).
In this study we examined the sensitivity of bovine serum albumin (BSA) to different oxidizing
systems and to two transition metals (copper and iron), in absence and in presence of a chelator,
since in excess, these essential trace elements can be cytotoxic (Crichton 2001; Tapiero et al.
2003) . We also explored if different oxidizing systems affect the antioxidant activity of A.
spinosa saponins, trolox, melatonin, mannitol, ascorbic acid, etodolac and acetaminophen. It is
often assumed that protein oxidation occurs subsequent to lipid oxidation, however, the
interaction between lipids and proteins during oxidation is not well understood. A protein lipid
emulsion was studied to characterize and compare the antioxidant activity of A. spinosa
saponins with an analogue of vitamin E, trolox.

2. Experimental

2.1. Plant material

A. spinosa was collected from the Essaouira region (southwestern Morocco) during July-August.
Saponins from A. spinosa were obtained as previously described (Alaoui et al. 1998a; Alaoui et
al. 1998b). Briefly, a cake of the A. spinosa almond was extracted by maceration in a cold hydro-
alcoholic mixture. This extract was filtered and concentrated under reduced pressure. Lipids were
then removed by triple hexane extraction, followed by ether extraction (3 times), and then
extracted twice in n-butanol to deplete the aqueous phase. The butanol phase was allowed to
settle and was evaporated to dryness. The dry residue constituting a mixture of saponins was
recovered in a minimum of methanol/water (80/20; v/v) and then lyophilized to give a final 2 %
dry weight yield.

2.2. Chemicals and reagents

Bovine serum albumin (BSA), melatonin, hydrogen peroxide, linolenic acid methylester (LnMe),
acetaminophen, aspirin were from Sigma (St Louis, MO, USA). Ascorbic acid, xylenol orange,
2,4-dinitrophenylhydrazine, 2,2 Azo-bis-(2-amidinopropane) hydrochloride (AAPH) and trolox
were from Aldrich (Milwaukee, WI, USA).

2.3. Oxidation of BSA

BSA, a water-soluble protein, is polymerized by the OH free radical, which results in loss of
solubility. The OH free radicals are generated by the Fenton reaction, and if an OH free radical
scavenger is added to the system, a decrease of polymerisation results in a quantifiable increase
in the water soluble protein fraction.

BSA was prepared in water prior to addition of various oxidizing agents at a 1:1 (v/v) ratio, with
the final BSA concentration 2 mg/ml. Oxidants included 2,2V-azobis (2-amidinopropane)
hydrochloride (AAPH); hypochlorous acid (HOCl); and hydrogen peroxide (H2O2, 30% v/v, 8.9
M) in the presence of transition metals. The metal ions Fe (iron(II) sulfate heptahydrate,
(FeSO4,7H2O, ACS Reagent grade, Merck) and Cu (copper(II) sulfate pentahydrate,
(CuSO4,5H2O; ACS Reagent grade, Merck) were made up in either 2 mM EDTA (ethylene
diamine tetra-acetic acid disodium salt dihydrate; Sigma) or water just prior to use and bubbled
with nitrogen to reduce autoxidation.
The Hydroxyl radical-mediated oxidation tests was based on a metal-catalyzed reaction. BSA
was dissolved in air-saturated 150 mM phosphate buffer (pH =7.3) at a final concentration of 0.5
mg/ml. BSA was incubated with Cu2+ or Fe2+(100 μM) and H2O2 (2.5 mM), for the indicated
durations in the presence or absence of antioxidants. Reactions were carried out in air exposed
tubes incubated in a shaking water bath at 37 °C. Aspirin and acetaminophen (2 mM), melatonin
(1mM), trolox a vitamin E analogue (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)
(300μM) were dissolved in 100% ethanol and added from a 500 mM stock solution to minimize
the final concentration of ethanol. Vehicle (ethanol, 0.2% v/v) was always included in the
Cu2+/H2O2 treated group. Saponins from A. spinosa (1 mg/l), ascorbate (1 mM) and D-mannitol
(100 mM) were directly dissolved in 150 mM phosphate buffer.
In the presence of different antioxidants various degrees of BSA precipitation occur due to the
polymerizing effect of the OH free radicals. The remaining protein in the supernatant was
measured using the folin-phenol method by reading the absorbance at 600 nm

2.4. Protein/lipid emulsion oxidation

A protein/lipid emulsion was set by combining 9ml BSA (10mg/ml) with LnMe (10mM) by
centrifugation for 1.5 minutes using at 13500 rpm. BSA (9mg/ml) alone or BSA/LnMe emulsions
were incubated in a shaking water bath at 37°C in 50 mM phosphate buffer pH 7.4. After
incubation, a 2.5ml sample was eluted on a column pre-equilibrated with phosphate buffer
(50mM, pH=7.4) in order to remove initiating agents and lipids. The obtained protein fractions
were analyzed for protein bound hydroperoxides.

2.5. Protein hydroperoxides

The protein fraction (50 μl) was incubated with 950 μl of ferrous ammonium sulfate/xylenol
orange reagent (2.5 mM) and incubated at room temperature for 30 min. The absorbance was
read at 560 nm using xylenol orange reagent as a blank. A standard curve was prepared using
hydrogen peroxide.

2.6. Conjugated dienes

Conjugated dienes were determined by mixing 1 ml of the reaction mixture (BSA/LnMe and
molecules or extracts tested) with 2.5ml of ice-cold phosphate buffer (50mM , pH 7.4) and with
3.5 ml heptane. After energetic shaking the samples were centrifuged at 58°C (2000g for 3 min)
and the organic phase was read at 210 and 234 nm. Conjugated dienes was quantified as a ratio
between the absorbance at 234 and 210 nm.

2.7. Statistical analysis

All data shown are means ± standard errors of at least five different experiments. One-way
ANOVA with post test was performed using GraphPad Prism version 4.03 for Windows
(GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com). Statistical significance
was accepted when p < 0.05.

3.Results:

In order to compare different oxidizing system we have tested both effect of chelator EDTA and
different metal transtion, copper and iron on BSA solubility.
Using the model of protein cross-linking (BSA solubility), the results show that Cu2+ leads to
greater BSA water solubility than does iron Fe2+ (Fig.1).
When EDTA is added to copper or iron the oxidizing effect is significantly decreased (p<0.05)
(Fig.1). The most oxidizing system is Cu2+, H2O2 and the least is OHCl. Only copper with H2O2,
when complexed to EDTA, has significantly lower oxidant activity than copper alone but not the
iron with H2O2. AAPH
Simulations using the winmaxc32 program (www.stanford.edu/~cpatton/maxc.html), with pH
and ionic strength correction, show that Cu2+ binds to different chelators and particularly to
EDTA with a higher affinity than iron . This effect is probably related to formation of transition
metal complexes. The factors that thought to influence their formation are the ionic radius and the
electro-negativity of the metal atoms. So, probably copper bound to BSA cause site-specific
damage in the presence of hydrogen peroxide .

Saponins from A. spinosa, melatonin and aspirin are able to prevent BSA insolubility relatively
to the control (Fig.2), but melatonin is the most efficient. Mannitol and acetaminophen exert no
significant effect on BSA polymerization relatively to control while ascorbic acid increase BSA
insolubility probably through a fenton reaction with copper ions and so has a pro-oxidant activity
(Fig.2).
Lipid oxidation products appear able to induce protein damage and increase protein hydro-
peroxides whatever the agent (fig.3). Hydrophilic A. spinosa saponins are able to reduce protein
hydroperoxydes (after one hour and four hours) only when it is produced in the absence of lipids
(LnMe) (Fig.3). But Trolox, a vitamin E analogue, have the ability to reduce the protein
hydroperoxide production, whether the radical is formed by AAPH or Fe2+/H2O2 initiator (in the
presence or absence of lipids) (p<0.005) (Fig.3).
A. spinosa saponins can decrease the conjugated dienes formed by a linolate methyl ester
emulsion only after six hours delay (Fig.4). However, trolox can reduce the conjugated dienes
produced by the linolate methyl ester emulsion and their velocity of formation, whether in the
presence of AAPH or the Fe2+/H2O2 initiator (in the presence or absence of lipids) (p<0.005)
(Fig.4).

5.Discussion:

Our results show that BSA cross-linking vary following the metal used . EDTA prevents the BSA
cross linking in a Cu-catalyzed Fenton-type reaction , but enhances these phenomena in a Fe
catalyzed Fenton-type reaction.
The enhancing effect of the Fe-EDTA complex observed in our study may be explained partially
by the open structure of ferric-EDTA complex, which allow much more hydroxyl radicals to be
released in the medium (Amici et al. 1989; Deraeve et al. 2006).
Consequently, protein cross linking may arise particularly in copper containing fluids (plasma
and synovial fluids) and may contribute to oxygen radical change of molecular structure and
function of bio-molecules.

Only molecules with a relatively high logP (logarithm of the octanol water partition coefficient
i.e. lipophilicity), (melatonin; 1.536, aspirin; 1.426, (drugbank:
www.redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank ) can prevent cross linking of BSA . But molecules
with a relatively low values of logP (acetaminophen; 0.917, ascorbic acid; -1.305, mannitol; -
3.506,(drugbank: www.redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank) are inefficient to protect BSA
from protein cross linking or facilitate BSA radicals induced damage (ascorbic acid). Bulky
Molecules with a relatively high molecular refractivity (volume of a molecule) (melatonin; 66.98,
aspirin; 43.29 cm3/mol, (Chemdraw Ultra 8.0.3,CambridgeSoft Corporation)) can inihibit BSA
cross linking. However compact molecules with low molecular refractivity (acetaminophen;
40.25, ascorbic acid; 36.61, mannitol; 38.44 cm3/mol) do not suppress or increase cross linking of
BSA. Accordingly, since the saponins of A. spinosa is rich of OH a low logP is expected and
probably the extract of saponins prevent radical induced protein damages in the tested model by a
EDTA like mechanism.
Indeed, Yang et al. have found that the lipid peroxidation inhibiting effect of some flavonoids
were related to both logP and to the half wave potential of the first oxidation wave (Yang et al.
2001).
Other studies have also shown that melatonin is a potent lipid antioxidant and an effective
scavenger of alkoxyl and peroxyl radicals produced both in cells treated by oxidants and in cell-
free systems (Zavodnik et al. 2006). The high BSA cross linking prevention by melatonin found
in our study may be explained by its electron donating ability, the high surface area value and
high dipole moment (Zavodnik et al. 2006).
Trolox was much more efficient (relatively to saponins of A. spinosa) in preventing protein
oxidation even in the presence of lipids whatever oxidizing system (AAPH and Fe2+/H2O2)
probably because of its relatively high lipohylicity (logP of 3.91 (Chemdraw Ultra 8.0.3,
CambridgeSoft Corporation)). However, it may be concluded that the saponins of A. spinosa are
not able to act as chain breaking antioxidants in the present system and their antioxidant potential
may be related to a metal chelating mechanism. Saponins of A. spinosa partitioned into the
aqueous phase of the emulsion, thus being located favorably for antioxidant action toward
exposed amino acids groups of protein to solvent.

Acknowledgments

We thank Dr. M C Brahimi-Horn (CNRS UMR6543 Nice, France) for critical reading of the
manuscript.
Fig.1 Effect of different oxidizing systems on BSA solubility (quantified with the folin-phenol
method) after incubation for 6 hours. (AAPH; 2,2' azo-bis-(2-amidinopropane) hydrochloride,
EDTA; ethylene diamine tetra-acetic acid disodium salt dihydrate )
Fig.2 Effect of different agents including saponins from A. spinosa on BSA solubility (quantified
with the folin-phenol method) after 4 hours in a Cu2+/H2O2 oxidizing system:.
Fig.3 Effect of A. spinosa saponins and trolox on produced protein hydroperoxydes (M/mg
BSA), (a ; 2,2' azo-bis-(2-amidinopropane) hydrochloride, i ; Fe2+ /H2O2, + ; plus linolenic acid
methyl ester, - ; absence of linolenic acid methyl ester) during a one hour or four hours
incubation period.
Fig.4 Effect of A. spinosa saponins and trolox on the formation of conjugated dienes by BSA
linolate methyl ester emulsion after 1 and 6 h with AAPH and Fe2+/H2O2 (a ; 2,2' azo-bis-(2-
amidinopropane) hydrochloride (AAPH), i ; Fe2+ /H2O2)
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Journal of Medicinal Plants Research Vol. 2(5), pp. 111-114, May 2008
Available online at http://www.academicjournals.org/JMPR
ISSN 1996-0875© 2008 Academic Journals

Full Length Research Paper

The essentials oils and antimicrobial activity of four

nepeta species from Morocco
Laila Zenasni1, Houssine Bouidida2, Amina Hancali3, Amina Boudhane3, Hassan Amzal1
Abdelkader Il Idrissi2, Rajae El Aouad3, Youssef Bakri1 and Abdelaziz Benjouad1*
1
Laboratoire de Biochimie et Immunologie, Faculté des Sciences, Rabat, Morocco.
2
Laboratoire de chimie des plantes et de synthèse organique et Bio-organique, Faculté des Sciences, Rabat, Morocco.
3
Laboratoire de Microbiologie, Institut National d’Hygiène, Rabat, Morocco.
Accepted 29 April 2008

The chemical composition of essential oils (EO) isolated from four Nepeta species (Nepeta atlantica
Ball, Nepeta tuberosa L. subsp reticulata (Desf.) Maire, Nepeta cataria L., Nepeta granatensis Boiss)
were characterized and the antibacterial activity tested. Chemical analyses indicated that the major
component of these EO was the sterioisomere 4a-α, 7-α, 7a-β β -nepetalactone which represented more
than 70% of oils from N. atlantica, N. tuberosa, N. cataria and 39.4% of oils from N. granatensis. The EO
from N. atlantica, N. tuberosa, and N. cataria presented comparable antibacterial activity against tested
bacteria. Statistical analysis indicated that S. aureus (ATCC 25923) and E. coli (ATCC 25922) strains
were the most sensitive to the EO (MICs ranged from 4.37 to 16.25 µL/mL), these strains were more
sensitive than clinically isolated E. coli, S. aureus and S. enteritidis and P. aeruginosa (ATCC 27853)
strains. The EO from N. granatensis contained low nepetalactone concentrations and showed relatively
poor antibacterial activity against tested bacteria (MICs ranged from 22.50 to 80.00 µL/mL). These
results indicate that the antibacterial activity of EO from the Nepeta genus depends on their chemical
composition and suggests that nepetalactone plays an important role in antibacterial activity against E.
coli and S. aureus strains, two microorganisms which cause morbidity and mortality worldwide.

Key words: Nepeta atlantica, Nepeta tuberosa, Nepeta granatensis, Nepeta cataria , Lamiaceae, essential oil
composition, 4a-α, 7-α,7a-β-nepetalactone, antibacterial activity.

INTRODUCTION

Nepeta is a genus of annual or perennial herbs; it
belongs to the Lamiaceae family, which includes approxi-
mately 250 species. These plants are localized to central
and southern Europe, Asia, the Middle East, northern
Africa, and to tropical mountains in Africa (Ghannadi et
al., 2003; Gkinis et al., 2003).
Nepeta species are used in the traditional medicine of
many countries and have a large ethnobotanical effect:
diuretic, diaphoretic, vulnerary, antitussive, antispasmo-
dic, antiasthmatic, tonic, febrifuge, emmenagogue and
carminative (Ghannadi et al., 2003; Nostro et al., 2001).
However, neither the antimicrobial activity of EO of Ne-
peta species growing spontaneously in Morocco nor the
composition of the essential oils has been published. In
*Corresponding author. Email. benjouad@fsr.ac.ma. Tel: +212
37 77 80 12. Fax : +212 37 77 54 61.
fact antibacterial properties of Lamiaceae oils compounds
such as borneol and pinene has been reported (Dorman
and Deans, 2000; Tabanca et al., 2001; Vardar-Unlü et
al., 2003). It has also been reported that plant oils rich in
phellandrene and limonene show high antimicrobial acti-
vity (Gonzalez et al., 2004). In addition, plants rich in car-
yophyllene and sesquiterpenoid hydrocarbons exhibited a
broad spectrum of antibacterial activities against Gram-
positive and Gram-negative bacteria (Oyedeji &
Afolayani, 2005). In this context we were interested in
analyzing the composition and the antibacterial activity of
EO from Nepeta species. In this report we studied the
composition of the oils from four Nepeta species growing
in the wild in Morocco (Fennane and Ibn Tattou, 1998)
i.e. N. tuberosa L. subsp reticulata (Desf.) Maire, N.
cataria L., N. granatensis Boiss, and N. atlantica Ball and
we evaluated the antibacterial activity of their EO against
Gram-positive and Gram-negative bacteria.
112 J. Med. Plant. Res.
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Whole plants of N. cataria, N. granatensis, N. tuberosa and N.
atlantica were collected from Moroccan regions with agreement
from the authorities and respecting the United Nations Convention
on Biodiversity. N. cataria was collected in the region of Kenitra, N.
granatensis and N. tuberosa were collected in the region of Ifran,
and N. atlantica was collected in Boumia-Tounfit.
Essential oil extraction
Plant material (100 g) was submitted to steam distillation and the
distillate was subject to successive ethyl acetate extractions (3 x
100 mL), dried over anhydrous Na2SO4, and concentrated under
reduced pressure. The yield of extraction (percentage of weight of
oil/weight of dry plant) was: 0.96% for N. granatensis, 1.04% for N.
atlantica, 1.02% for N. cataria, and 1.2% for N. tuberosa.
Analytical techniques
GC-MS analysis of the EO was performed on a TRACE GC ULTRA
equipped with non-polar VB5 (5% phenyl; 95% methylpolisyloxane)
capillary column (30 m x 0.25 mm x 0.25 m film thickness), directly
coupled to a mass spectrometer (Polaris Q) (EI 70 eV). The
temperature of the injector and detector was set at 250°C and
300°C, respectively. The oven temperature was programmed from
60°C to 200°C at 2°C/min, and then from 200°C at 300°C at
20°C/min. The components of the oil were identified by comparison
of their mass spectra with those in the Wiley-NIST 7th edition library
of mass spectral data. The percentage composition of the oil
sample was calculated from GC-MS peak areas.
Microorganisms and inoculum preparation
The bacteria Escherichia coli (E. coli), Staphylococcus aureus (S.
aureus), Salmonella enteritidis (S. enteritidis) isolated from patients
were obtained from the culture collection of the microbiology
department (Microthec Unity) at the National Institute of Health
(Rabat, Morocco). Bacteria were identified based on the colony
morphology, gram stain, API enterobacteria and biochemical
gallery. Reference strains were obtained from the American Type
Culture Collection: Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli ATCC
25922), Staphylococcus aureus ATCC 25923 (S. aureus ATCC
25923), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (P. aeruginosa
ATCC 27853).
Each isolate was inoculated into Muller Hinton Agar with a
scraping from a glycerol stock frozen at –20°C and incubated
during 18 - 20 h at 37°C. For the inoculum, colonies were selected
from 18 - 20 h old cultures. Turbidity was adjusted to that of a 0.5
MacFarland standard (1.5 x 108 CFU/mL) using sterile NaCl
solution (0.9%).
Determination of minimum inhibitory concentration (MIC)
The viability indicator MTT (3-(4, 5 dimethylthiazol-2-yl)-2, 5
diphenyltetrazolium bromide) and the quick microplate method
(Eloff, 1998) were used for the determination of the minimum
inhibitory concentration (MIC) as we described previously (Oumzil
et al., 2002). A range of doubling dilutions of Nepeta EO was
prepared in Muller Hinton Broth (BMH) in a 96-well microplate.
Tween-80 was included in all assays at a final concentration of
0.001% (v/v) to enhance oil solubility. Each well was inoculated with
25 µl of a bacterial suspension. The covered microplates were
incubated overnight at 37°C.
The bacterial suspension changed to blue when bacterial growth
occurred. To verify that there was no abiotic reduction of MTT,
tested products were incubated directly with the viability indicator
without any bacterial suspension (negative control). The MIC is
defined as the lowest concentration of antibiotic or extract at which
there is no visible growth. The stock solution and the dilutions of
antibiotic were prepared as described (Andrews, 2001; EUCAST,
2003). As an internal control, we determined the MIC for chloram-
phenicol against E. coli ATCC 25922; the value obtained was in
agreement with the NCCLS standards (NCCLS, 1990).
Statistical analysis
Statistical analysis was performed using a regression qualitative
model, ANOVA and least differences analysis was carried out with
J.M.P. version 5.1: SAS Institute. Inc, 2003.
RESULTS
The chemical composition of EO from tested Nepeta
species was determined by GC-MS analysis. Table 1
shows that the EO of each plant species has a specific
quantitative and qualitative composition. The major com-
ponent was neptalactone (the sterioisomere 4a-α, 7-α, 7a-
β-nepetalactone and the dihydronepetalactone) which
represents about 74% for N. atlantica, 82% for both N.
tuberosa and N. cataria but only 42% in N. granatensis.
This result is comparable to that obtained for others
Nepeta species (Ghannadi et al., 2003; Gkinis et al.,
2003). Of note N. atlantica is characterized by its rela-
tively high -caryophyllene (8.2%) and farnesol (2.5%)
content while N. granatensis was relatively rich in other
components (eucalyptol 24%, -pinene 6.3 %, -phel-
landrene 5.8%). In addition, N. cataria is characterized by
its relative content in terpinene (4.2%) and limonene
(4.1%).
The screening for antibacterial activity indicates that
the oils from N. atlantica, N. tuberosa, and N. cataria
present comparable activity against all strains of tested
bacteria (MICs ranged from 4.37 to 53.33µL/mL) (Table
2). The oils from N. granatensis, was found to possess a
relatively low antibacterial activity (MICs ranged from
22.5 to 80µL/mL). For example the MICs of EO from N.
tuberosa, N. atlantica, and N. cataria against S. aureus
(ATCC 25923) were 4.37, 7.50 and 5.00 µL/mL
respectively, while the MIC of EO from N. granatensis
was of 22.50µL/mL (Table 2).
Of interest, S. aureus (ATCC 25923) and E. coli (ATCC
25922) were more sensitive to the oils of N. atlantica, N.
tuberosa, and N. cataria (MICs ranged from 4.37 to 16.25
µL/mL). For isolated E. coli and S. aureus the MICs
ranged from 7.96 to 30 µL/mL. S. enteritidis and P.
aeruginosa (ATCC 27853) were less sensitive to EO, with
MICs below 53.33 µL/mL (Table 2). Interestingly, the oil
of N. granatensis, which is poor in nepetalactone, has a
relatively low antibacterial activity against tested micro-
organisms (MICs ranged from 22.5 to 80 µL/mL).
 Zenasni et al. 113

Table 1. Chemical composition (%) of four oils of Nepeta species

Compounds * N. atlantica N. tuberosa N. cataria N. granatensis

- pinene 1.1 1.3 0.4 6.3
- pinene 1.1 0.9 0.9 2.3
camphene 1.1 0.3 0.9 1.1
eucalyptol 1.1 1.2 0.5 24.0
– phellandrene 1.1 0.6 0.2 5.8
terpinene 1.1 0.9 4.2 0.5
sabinene 0.2 0.6 0.2 0.5
-Cymene 0.3 0.9 0.2 3.8
limonene 0.2 0.5 4.1 0.3
menthone 0.2 0.4 0.2 0.7
thujone 0.1 0.4 0.4 0.6
borneol 0.1 0.6 0.3 0.6
linalyl acetate 0.5 0.4 0.2 1.4
menthol 0.6 1.6 0.2 0.4
linalool 0.6 0.5 0.4 1.4
pulegone 0.4 0.9 0.2 1.6
thymol 0.8 0.6 1.3 0.9
-terpineol 0.6 0.5 0.3 0.5
citronellol 0.8 0.6 0.2 0.6
4a-α, 7-α, 7a-β-nepetalactone 71.4 76.8 77.4 39.4
dihydronepetalactone 3.1 5.9 5.0 2.8
methyleugenol 0.9 0.8 0.1 0.9
methylisoeugenol 0.5 0.6 0.4 0.6
-caryophyllene 8.2 0.7 0.2 1.5
– curcumene 1.3 0.7 0.6 0.9
farnesol 2.5 0.8 0.9 0.5
*Compounds are listed in order of their elution from a VB-5 column.

Table 2. Minimal inhibitory concentration (MIC) of Nepeta species oils against different bacteria.

Strains MIC ± Std Err Means

N. tuberosa N. atlantica N. cataria N. granatensis
E. coli ATCC 25922 6.25 ± 1.25 13.13 ± 4.25 16.25 ± 3.75 35.00 ± 15.00
E. coli 30.0 ± 5.77 7.96 ± 4.07 16.60 ± 3.33 70.00 ± 10.00
P. aeruginosa ATCC 27853 40.0 ± 0.00 22.50 ± 6.29 37.50 ± 15.47 40.00 ± 0.00
S. aureus ATCC 25923 4.37 ± 0.62 7.50 ± 1.44 5.00 ± 0.00 22.50 ± 6.29
S. aureus 23.33 ± 8.81 18.43 ± 7.92 10.00 ± 3.53 68.00 ± 12.00
S. enteritidis 20.00 ± 0.00 20.00 ± 0.00 53.33 ± 13.33 80.00 ± 0.00
Data represent the MICs (µL/mL) ± standard error of the means for 4 experiments.

In summary, our results indicate that E. coli. and S.
aureus are more sensitive than P. aeruginosa to EO from
the Nepeta genus (p < 0.001).
DISCUSSION
The results suggest that the antibacterial activity of the
oils of Nepeta species may be related to their major
monoterpenoid component i.e. nepetalactone, however
this does not exclude the possibility that the other mono-
terpenes may account for the antibacterial property of the
oils. This may be supported at least in part by the differ-
rences observed in the sensitivity of tested bacteria to EO
from Nepeta species that have similar levels of nepeta-
lactone (Table 1). In fact we found that nepetalactone
represents 42% and eucalyptol represents 24% of the oil
from N. granatensis and other reports showed that euca-
lyptol has antibacterial activity towards S. vaureus
114 J. Med. Plant. Res.
(Karlovic et al., 2000). Thus, one may take into
consideration that the antibacterial effect of the oils could
result from a synergistic or antagonistic action of different
oils components.
The antibacterial effect of the oils could be explained
by disturbance of the permeability barrier of the bacterial
membrane structure (Cowan, 1999). Indeed, recent
findings revealed that tea tree oil damages the cell
membrane structure of E. coli, S. aureus and Candida
albicans (Cox et al., 2000). Such a phenomenon is due to
the penetration of monoterpenes through the cell wall and
cell membrane. In fact, monoterpenes are lipophilic, and
may induce the expansion of cell membranes, increases
fluidity, destroy the membrane structure and inhibit
membrane embedded enzymes (Cox et al., 2000; Cox et
al., 2001). In the case of E. coli, tea tree oil also caused a
leakage of cellular potassium and inhibits glucose depen-
dent respiration (Cox et al., 1998). Thus, further invest-
gations should be made to explore the mechanisms of
action of the oils of Nepeta species showing high activity
against bacteria.
In summary, our data indicate that the EO from the
Nepeta genus efficaciously inhibit E. coli and S. aureus
strains, two resistant microorganisms which make serious
sanitary problems worldwide. This indicates that this plant
may be useful for developing alternative compounds to
treat infections caused by these antibiotic resistant patho-
gens. As suggested in a recent report (Betoni et al.,
2006), these compounds of plant origin may be used
together with known drugs in the development of pharma-
cological agents against pathogens.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by the Région Rabat Salé-
Zemour-Zaers, Pôle de compétences PHARCHIM. We
thank Dr. MC Brahimi-Horn (CNRS UMR 6543) for critical
reading of the manuscript.
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67.
Résumé:

Le stress oxydatif est un facteur essentiel dans la genèse de plusieurs pathologies,

comme le cancer, des maladies cardiovasculaires et dégénératives. Les membranes
cellulaires sont généralement des cibles des radicaux et de leurs effets nocifs. Les
radicaux libres sont associés à plusieurs maladies et peuvent endommager les
protéines et les acides gras insaturés, directement ou indirectement via des processus
radicalaires. Aujourd'hui, des composés naturels paraissent comme des alternatives
thérapeutiques possibles pour des maladies provoquées par les radicaux libres.
Dans cette étude, nous avons évalué l'effet antihémolytique et antioxydant des
saponines d'Argania spinosa et leur effet préventif contre l’oxydation des protéines et
d’une émulsion lipoprotéique. Nous avons observé que les saponines d’Argania
spinosa à la concentration non hémolytique (1mg/l) empêchent 53.2 % d’hémolyse
induite par les radicaux libres. Dans des conditions semblables, 2 mM d'aspirine ou
2mM d’acétaminophène employé comme des antioxydants de références empêchent
respectivement 75 % et 68 % de l’hémolyse des érythrocytes provoquée par les
radicaux libres, tandis que la vitamine E à 0.3 M ne présente aucune activité
antioxydante significative.
D’autre part, la combinaison de 1mg/l Argania spinosa saponines et la vitamine E à
0,3 M a abouti à protection de 68 % d’hémolyse des érythrocytes induite par les
radicaux libres. Cela suggère, que les saponines d'Argania spinosa augmentent l'effet
antioxydant de vitamine E. Par contre, aucun effet de ce type n’a été observé entre
l’acétaminophène (2mM) et la vitamine E (0.3 M). Des résultats comparables ont
été obtenus en employant la perte de potassium comme un indicateur de l’activité
antioxydante au lieu de la libération de l’hémoglobine par les globules rouges (GR).
Les résultats montrent aussi que les saponines d’Argania spinosa, la mélatonine et
l’aspirine étaient efficaces dans le système oxydant Cu2 +/H2O2 en prévenant la

111
réticulation de la l’albumine sérique bovine (BSA). Pourtant, avec des agents
Fe2 +/H2O2, les saponines d’A. spinosa contrairement à l'analogue de la vitamine E,
trolox, était efficace dans la prévention de la formation d'hydroperoxydes de protéine
seulement en absence de linolate methylester (LnMe) et en présence uniquement de
Fe2 +/H2O2 comme agent initiateur et réduisent après 6 heures de délai la production
de diènes conjugués provenant de l'oxydation des lipides
En conclusion, ces résultats montrent l’effet protecteur des saponines d'Argania
spinosa vis-à-vis de l’hémolyse induite par les radicaux et de leur capacité à
potentialiser l'effet antioxydant de la vitamine E. d’autre part, les extraits de
saponines d’A. spinosa peuvent prévenir l'oxydation des protéines ou celle d’une
émulsion lipido-protéique.

112