ECOLE DOCTORALE SCIENCE ET INGENIERIE

Université de Cergy-Pontoise

THESE

Présentée pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université de Cergy-Pontoise

Spécialité : Sciences de la vie et de la santé

Application de la cytométrie en flux pour le contrôle

microbiologique de l’efficacité de traitements de l’eau

Karim HELMI

Date de soutenance : 24 novembre 2016

Le jury est composé de :

Dr. Laurence MATHIEU (EPHE, Université de Lorraine) : rapporteur

Dr. Thierry JOUENNE (CNRS, Université de Rouen) : rapporteur

Pr. Olivier GALLET (Université de Cergy-Pontoise) : examinateur

Dr. Damien SEYER (Université de Cergy-Pontoise) : examinateur

Dr. Henry-Michel CAUCHIE (Luxembourg Institute of Science & Technology) : examinateur

Pr. Patrick DI MARTINO (Université de Cergy-Pontoise) : directeur de thèse

La simplicité est la sophistication suprême

- Léonard de Vinci -
 Remerciements

L’ensemble de ces travaux a été réalisé au sein de Veolia Recherche & Innovation, et la
rédaction de cette thèse a été encadrée par l’école doctorale de l’Université de Cergy-
Pontoise.

Je tiens en premier lieu à présenter ma profonde gratitude à mon directeur de thèse, Patrick Di
Martino, qui a su me donner la bonne direction pour structurer la rédaction de ce travail. Ce
fut un réel plaisir de profiter de ta vision scientifique, m’encourageant ainsi à voir les choses
sous un autre angle et à les approfondir.

Je remercie également Véronique Larreta-Garde, directrice de l’école doctorale d’avoir

approuvé ma candidature pour pouvoir effectuer ce doctorat à l’Université de Cergy-Pontoise.

J’adresse mes sincères remerciements à Laurence Mathieu, Maître de Conférences à

l’Université de Lorraine, et Thierry Jouenne, Directeur de Recherche CNRS à l’Université de
Rouen, qui ont accepté d’évaluer et juger cette thèse en tant que rapporteurs. Je remercie de
même Henry-Michel Cauchie, Responsable du pôle département Environmental Research &
Innovation au LIST, Damien Seyer, Maître de Conférences au laboratoire ERRMECe-
EA1391 et Olivier Gallet, directeur du laboratoire ERRMECe de l’Université de Cergy-
Pontoise de participer au jury en qualité d’examinateurs.

Merci à François Enguehard, Directeur des Centres de Veolia Recherche et Innovation,

d’avoir accepté que je puisse diffuser les résultats de ces travaux.

Je remercie également Valérie Ingrand, Nadine Charni-Ben-Tabassi, Karine Delabre et

Sandrine Sourisseau pour leur soutien dans cette aventure.

J’exprime mes remerciements spécialement à Jean-Michel Brossard et Thierry Poujol qui

m’ont fait bénéficier de leur expérience et de leurs précieux conseils.

Je souhaite exprimer ma reconnaissance à toute l’équipe de R&D « Solutions d’Analyses pour

l’Environnement », pour cette ambiance hors du commun, et plus particulièrement à Pauline
Jacob, Ibtissam-Ben-Hadj-Salah et Fabienne David pour votre enthousiasme et votre
importante contribution à la réalisation de ces travaux. De même, un grand merci à Arona
Watt et Fabien Barthod, pour la motivation et l’autonomie dont vous avez fait preuve au cours
de vos stages respectifs, qui ont permis l’aboutissement de ces études. Aussi, une pensée
particulière pour Charlotte Arnal, pour m’avoir supporté toutes ces années entre les 4 murs de
notre bureau.

Je remercie vivement l’ensemble de l’équipe du Laboratoire Central pour votre aide au

quotidien et votre bonne humeur.

Merci également à Caroline Lecarpentier et Cédric Féliers, pour votre confiance et l’intérêt
porté aux méthodes mises en place, dans le cadre d’une collaboration agréable et fructueuse.
Un grand merci également à Gérald Grégori, pour tes conseils avisés sur l’utilisation de la
cytométrie en flux et dont les travaux précurseurs dans ce domaine ont largement inspiré cette
thèse.

Un merci à tous les co-auteurs des articles issus de ces travaux, dont entre autres, Annabelle
Henry, Gaëlle Méheut, Florence Poty et Franck Laurent pour les précieux échanges ayant
permis leur publication.

Un grand merci évidemment à tous mes amis, malheureusement, ou plutôt heureusement trop
nombreux à citer mais ils se reconnaitront ; merci pour les bons moments eux aussi trop
nombreux à se rappeler.

Enfin, cette thèse est dédiée à ma famille.

A mes 3 étoiles, Isabelle, Lucie et Clara.

A la mémoire de mon père, au courage de ma mère et au talent de mon frère.

 Résumé

Le contrôle de la qualité microbiologique de l’eau constitue une problématique majeure en

termes sanitaire et économique. L’efficacité des traitements appliqués est actuellement
vérifiée par des méthodes standards basées sur la mise en culture des microorganismes.
Cependant, leur mise en œuvre ne permet d’obtenir des résultats ne présentant qu’une vision
partielle de la population microbienne présente dans un échantillon et ce dans un délai qui
n’est pas compatible avec le niveau de réactivité requis dans le domaine de la gestion de l’eau.

Les présents travaux visaient à démontrer que l’application de la cytométrie en flux pour le
suivi microbiologique au sein de filières de production d’eau potable et de circuits de tours
aéroréfrigérantes représente une approche alternative aux méthodes réglementaires et
classiques utilisées dans ce domaine. Une attention particulière a été portée sur le fait d’être
en mesure de quantifier les cellules totales et viables et d’être capable d’identifier l’impact de
différents traitements chimiques et/ou physiques (ozone, UV, biocides oxydants) au niveau de
la cellule microbienne. La démarche de calibration et l’utilisation conjointe de différents
marqueurs fluorescents incluant le SYBR Green II, l’iodure de propidium et le Chemchrome
V6 a permis d’atteindre ce double objectif. Par ailleurs, 3 systèmes de cytométrie en flux
différents ont été utilisés selon les études, comprenant le FACSCaliburTM, le FACSCantoTM et
l’ACCURITM C6.

Au regard des résultats obtenus, il apparait que la cytométrie en flux représenterait un atout
dans le domaine du diagnostic rapide d’installations de par sa simplicité, son délai de résultat
court (1 heure) et le niveau d’information apporté sur la population microbienne (impact sur
la membrane, le matériel génétique ou le métabolisme).

Mots-clés : qualité de l’eau, microorganismes, cytométrie en flux, culture, viabilité

 Abstract

The water microbiological quality control is a major issue in health and economic terms. The
effectiveness of treatments applied is currently tested using culture-based standard methods.
However, their application leads to a partial view of the microbial population present in a
sample and within a period that is not compatible with the required responsiveness concerning
water management.

The present work aims to demonstrate that the application of flow cytometry for
microbiological monitoring of drinking water treatment plants and cooling tower circuits
represents an alternative approach to regulatory and conventional methods used in this field.
Particular attention was paid to being able to quantify total and viable cells and be able to
identify the impact of different chemical and/or physical treatment (ozone, UV, oxidizing
biocides) on a microbial cell. The calibration process and the joint use of various fluorescent
dyes including SYBR Green II, propidium iodide and ChemChrome V6 have achieved this
double objective. Furthermore, three different flow cytometric systems have been used
according to the studies comprising the FACSCaliburTM, FACSCantoTM and ACCURITM C6.

Given the results, flow cytometry appears as an asset in the field of rapid diagnostic for
treatment efficiency due to its ease of use, short time to result (1 hour) and the information
provided related to the microbial population (impact on membrane, genetic material or
metabolism).

Keywords: water quality, microorganisms, flow cytometry, culture, viability

 Introduction

“Too much, too little, too dirty” (UNICEF). Cette citation résume la situation mondiale
relative à l’eau en soulignant l’impact des inondations, de la rareté et de la pollution,
respectivement. Pour illustrer ce constat, la dissémination de pathogènes par des inondations
répétées et le manque d’eau potable pour la réhydratation des personnes contaminées a des
conséquences sanitaires dramatiques dans certains pays. En effet, l’évolution démographique
exponentielle couplée au réchauffement climatique expose la population mondiale à des
menaces directement liées aux modifications des écosystèmes et des phénomènes
météorologiques. Si les pays en voie de développement sont particulièrement touchés par les
problématiques précitées, les pays industrialisés sont également impactés du fait de la
croissance exponentielle de l’activité humaine pour faire face à l’augmentation de la
population et des besoins associés, engendrant ainsi une augmentation drastique de la
pollution.

Le traitement et le contrôle de la qualité de l’eau sont soumis à de nombreuses contraintes,

reposant sur l’efficacité des différents procédés employés. Cela s’étend aux eaux usées qui
doivent être traitées avant rejet dans l’environnement, l’eau potable avant distribution et l’eau
utilisée à des fins industrielles.

Plus spécifiquement, la production d’eau potable est soumise à une réglementation stipulant
que l’eau distribuée doit être dépourvue de toute substance nocive à la consommation
humaine. Le contrôle régulier de la ressource à l’eau distribuée est donc un des aspects
critiques pour le maintien des seuils témoignant de la qualité visée.

Concernant les aspects microbiologiques, la réglementation repose sur la détection spécifique

de marqueurs de pollution fécale et l’estimation de la flore totale. Les analyses imposées sont
basées sur des méthodes culturales et la fréquence de ces contrôles est définie en fonction de
la dimension de la collectivité desservie. Une première limite de ce contrôle réglementaire est
liée au délai de résultat, 24 à 72 heures, qui ne permet d’obtenir une réponse qu’après
distribution de l’eau analysée. Une seconde limite est relative au fait que seule une fraction de
la population microbienne n’est visible par culture, occultant donc les microorganismes
viables mais non-cultivables dans les conditions prescrites par les méthodes réglementées.
Ainsi, en cas de contamination avérée, les mesures correctives au niveau de la filière sont
effectuées de manière rétroactive en vue de rétablir une qualité d’eau basée uniquement sur un
seuil de cellules cultivables.

Parallèlement aux analyses réglementaires, les producteurs d’eau appliquent également un

autocontrôle afin de s’assurer de la qualité de l’eau produite. L’autocontrôle permet d’une part
d’augmenter la fréquence des analyses, indépendamment de celle préconisée par la législation
et d’autre part d’utiliser des méthodes alternatives aux méthodes réglementaires, jugées
pertinentes en termes d’information et de délai de résultat.

1
La diversité des techniques alternatives aux méthodes réglementaires actuellement disponibles
pour le contrôle de la qualité microbiologique de l’eau et plus particulièrement de l’efficacité
de traitement conduit à un éventail conséquent de possibilités. En conséquence, la difficulté
réside dans le fait de sélectionner la ou les méthodes les mieux adaptées à un objectif donné.

L’objectif premier est de pouvoir obtenir un résultat représentatif de la quantité et de la qualité

de la population bactérienne selon le type d’eau analysé. Pour ce faire, la sensibilité de la
méthode employée en termes de seuil de détection et de niveau d’information est essentielle.

Certaines méthodes offrent la possibilité de détecter spécifiquement des microorganismes

d’intérêt ; cette approche est utile lors d’une volonté de mise en évidence d’un genre ou
espèce donné, que ce soit un indicateur ou un agent pathogène. D’autres méthodes permettent
de quantifier la population totale de manière non-spécifique, mais en distinguant différentes
fractions sur l’ensemble des cellules. Parmi ces sous-parties peuvent être inclues les cellules
viables non-cultivables et les cellules viables cultivables.

Le second aspect, non-négligeable, concerne la propension de la méthode à être déployée pour

une application en conditions réelles. Cela comprend la complexité de mise en œuvre, le coût
des consommables et/ou de l’appareillage et le temps nécessaire à l’opérateur pour effectuer
la manipulation. Concernant la gestion active du contrôle de la qualité microbiologique de
l’eau, en particulier de l’eau produite et distribuée, la réactivité s’avère primordiale. Cet
aspect est directement lié au délai d’obtention du résultat. De plus, la possibilité d’appliquer la
méthode directement sur les lieux de l’intervention sans passer par un transport de
l’échantillon vers un laboratoire d’analyse peut également présenter un atout important.

Par ailleurs, les étapes préalables à l’analyse peuvent également avoir un impact au niveau du
délai de résultat et/ou de la complexité de la manipulation. En effet, ce volet peut par exemple
inclure une étape de concentration de l’eau à analyser et/ou de préparation de l’échantillon
(ex : extraction d’ADN).

Cette sélection dépend donc de plusieurs facteurs intrinsèques à chaque méthode. En résumé,
une technique pour le contrôle de l’efficacité d’un traitement devrait idéalement comprendre
les caractéristiques suivantes en vue de pouvoir:

 Bénéficier d’une vision réaliste de l’ensemble de la population microbienne

 Mettre en évidence la viabilité cellulaire au niveau métabolique et/ou structurel
 Fournir un résultat dans un délai compatible avec une gestion active
 Etre utilisable directement sur le site nécessitant une intervention
 Nécessiter le moins possible de préparation préalable à l’analyse
 S’adapter à différents types de matrices
 Détecter différents types de microorganismes
Au regard de l’ensemble de critères précités, il apparait que la cytométrie en flux dispose d’un
certain nombre d’atouts répertoriés ci-dessus. Cependant, si l’utilisation de la cytométrie en
flux pour le contrôle qualité microbiologique de l’eau est en expansion, elle demeure encore
peu répandue. Par ailleurs, la majeure partie des études effectuées pour l’optimisation de cette
approche tend vers une détection spécifique d’agents pathogènes, impliquant l’utilisation de

2
souches bactériennes pures issues de collections et de matrices non-représentatives. De plus,
les moyens employés pour la détection spécifique de microorganismes tiennent rarement
compte des aspects de viabilité.

De ce fait, une transposition en conditions réelles est difficilement réalisable du fait d’une part
des interférences particulaires et d’autre part des faibles quantités d’agents pathogènes ciblés
naturellement rencontrées dans l’eau analysée. Ces observations soulèvent alors la question
du choix quant à une détection spécifique ou non-spécifique des microorganismes par
cytométrie en flux pour déterminer l’efficacité de la désinfection de l’eau.

L’objet de ces travaux était de comparer et confronter les performances de différentes

méthodes usuelles, dont la méthode réglementaire basée sur la culture, avec la cytométrie en
flux, pour la mesure de l’efficacité de traitement de l’eau sur la population globale à partir
d’échantillons d’eau et/ou microbiologiques représentatifs de conditions réelles.

Les résultats sont issus de 3 études différentes, ayant fait l’objet de 3 articles :

 “Bacterial physiological states assessment using flow cytometry for drinking water
treatment plant monitoring.” K. Helmi, A. Watt, P. Jacob, I. Ben-Hadj-Salah, A.
Henry, G. Méheut, N. Charni-Ben-Tabassi. Water Science and Technology: Water
Supply 14.5: 850-856 (2014)

 “Methods for microbiological quality assessment in drinking water: a comparative

study”. K. Helmi, F. Barthod, G. Méheut, A. Henry, F. Poty, F. Laurent, N. Charni-
Ben-Tabassi. Journal of Water & Health 13.1: 34-41 (2015)

 “Application of flow cytometry for biocide treatment control in cooling towers”. K.

Helmi, F. David, P. Di Martino, V. Ingrand. (en cours de finalisation).

Le présent manuscrit est divisé en quatre grandes parties. Une première partie bibliographique
est consacrée d’une part aux différents usages liés à la consommation d’eau en France et
d’autre part à un état des lieux des méthodes analytiques pour la détection des
microorganismes d’origine hydrique. La seconde partie expose la démarche expérimentale et
les méthodes mises en œuvre pour la réalisation des différentes études. Une troisième partie
présente les résultats obtenus au cours des études portant sur l’efficacité d’abattement de la
population microbienne en fonction du mode de traitement.

L’ensemble des résultats expérimentaux est suivi d’une discussion générale, constituant la
quatrième partie, à l’issue de laquelle des perspectives inspirées de ces travaux seront
proposées en tenant compte de l’ensemble des contraintes existantes et futures, telles que
l’anticipation d’une évolution de la réglementation ou le besoin croissant de réactivité pour
juguler les crises sanitaires.

3
PARTIE I - BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................13

I. LA PRODUCTION ET LA DISTRIBUTION D’EAU POTABLE 15

I.1. LES DIFFERENTES RESSOURCES .............................................................................................................16
I.2. LE FONCTIONNEMENT D’UNE USINE DE POTABILISATION ....................................................................17
I.2.1. Les étapes d’une filière de traitement ...............................................................................................18
I.2.1.1 Le dégrillage/tamisage..............................................................................................................18
I.2.1.2 La coagulation/floculation/décantation ....................................................................................18
I.2.1.3 La filtration sur sable ................................................................................................................18
I.2.1.4 L’ozonation ..............................................................................................................................18
I.2.1.5 L’adsorption sur charbon actif..................................................................................................19
I.2.1.6 L’irradiation par rayons Ultra-Violet .......................................................................................19
I.2.1.7 L’ultrafiltration/nanofiltration ..................................................................................................19
I.2.1.8 La chloration.............................................................................................................................20
I.2.2. Les niveaux de traitement .................................................................................................................20
I.3. LE RESEAU DE DISTRIBUTION .................................................................................................................21
I.4. LE MARCHE DE L’EAU POTABLE .............................................................................................................22
I.4.1. L’accès à l’eau potable......................................................................................................................22
I.4.2. Les acteurs de la distribution d’eau potable en France .....................................................................23
I.4.3. Les différents usages de l’eau ...........................................................................................................24
I.4.3.1 Les usages de l’eau douce ........................................................................................................24
I.4.3.2 Les usages de l’eau potable ......................................................................................................26

II. LA QUALITE MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU 29

II.1. LA MICROBIOLOGIE LIEE A L’EAU POTABLE .........................................................................................29
II.1.1. Les bactéries......................................................................................................................................31
II.1.1.1 Les différents états physiologiques...........................................................................................31
II.1.1.2 Les bactéries pathogènes ..........................................................................................................33
II.1.1.2.1 Les bactéries responsables de maladies nosocomiales .............................................................33
II.1.1.2.2 Les bactéries responsables de gastro-entérites .........................................................................35
II.1.1.3 Les bactéries indicatrices ..........................................................................................................35
II.1.1.3.1 Les coliformes thermotolérants ................................................................................................35
II.1.1.3.2 Les entérocoques intestinaux ....................................................................................................36
II.1.1.4 Les spores de Clostridium perfringens .....................................................................................36
II.1.2. Les virus ............................................................................................................................................37
II.1.2.1 Les virus entériques ..................................................................................................................37
II.1.2.2 Les bactériophages ...................................................................................................................38
II.1.3. Les protozoaires ................................................................................................................................39
II.1.3.1 Les protozoaires entériques ......................................................................................................39
II.1.3.2 Les amibes ................................................................................................................................40
II.1.4. Les microalgues ................................................................................................................................40
II.1.4.1 Les microalgues eucaryotes ......................................................................................................40
II.1.4.2 Les microalgues procaryotes ....................................................................................................41
II.1.5. Le biofilm .........................................................................................................................................41

4
 II.1.5.1 La formation du biofilm ...........................................................................................................42
II.1.5.2 Le rôle du biofilm dans l’écologie des bactéries pathogènes ...................................................43
II.2. LES MOYENS DE CONTROLE DE LA QUALITE DE L’EAU ........................................................................43
II.2.1. La réglementation & les méthodes d’autosurveillance .....................................................................44
II.2.1.1 Le cadre réglementaire européen & français ............................................................................44
II.2.1.2 Les méthodes normées de détection des paramètres microbiologiques ...................................44
II.2.2. Les techniques alternatives de prélèvement & de détection quantitative..........................................45
II.2.2.1 Les méthodes de concentration d’eau.......................................................................................45
II.2.2.1.1 Les membranes de microfiltration ............................................................................................47
II.2.2.1.2 Systèmes d’ultrafiltration .........................................................................................................50
II.2.2.1.3 Concentration par force centrifuge ...........................................................................................51
II.2.2.2 Les méthodes de détection des microorganismes viables.........................................................52
II.2.2.2.1 Les méthodes de culture ...........................................................................................................53
II.2.2.2.2 Les méthodes de biologie moléculaire .....................................................................................55
II.2.2.2.3 Les marqueurs de l’activité métabolique et de l’intégrité cellulaire .........................................57

III. ETAT DES LIEUX ET AVANT-PROPOS 63

PARTIE II - MATERIEL & METHODES ...........................................................................................65

I. VUE D’ENSEMBLE: ECHANTILLONS ET METHODES ANALYTIQUES 66

II. METHODES ANALYTIQUES UTILISEES 68

II.1. LA CYTOMETRIE EN FLUX .......................................................................................................................68
II.1.1. Appareillage ......................................................................................................................................69
II.1.1.1 FACSCantoTM II .......................................................................................................................69
II.1.1.2 ACCURI C6 .............................................................................................................................69
II.1.1.3 FACSCaliburTM ........................................................................................................................70
II.1.2. Marquage ..........................................................................................................................................70
II.1.2.1 Méthode de marquage pour l'estimation de l'intégrité membranaire des bactéries ..................70
II.1.2.2 Méthode de marquage pour la détection de l'activité enzymatique cellulaire ..........................71
II.2. LA CYTOMETRIE EN PHASE SOLIDE A BALAYAGE LASER .....................................................................71
II.2.1. Appareillage ......................................................................................................................................71
II.2.2. Marquage ..........................................................................................................................................72
II.3. LA MICROSCOPIE A EPIFLUORESCENCE ................................................................................................72
II.3.1. Appareillage ......................................................................................................................................72
II.3.2. Marquage ..........................................................................................................................................72
II.4. LA MESURE DE L’ATP ............................................................................................................................73
II.4.1. Appareillage ......................................................................................................................................73
II.4.2. Marquage ..........................................................................................................................................74
II.5. LE DENOMBREMENT DES CELLULES BACTERIENNES............................................................................74
II.5.1. Appareillage ......................................................................................................................................74
II.5.2. Mise en culture..................................................................................................................................75
II.6. LES MESURES PHYSICO-CHIMIQUES.......................................................................................................75

5
III. MATERIEL BIOLOGIQUE & ECHANTILLONNAGE 76
III.1. ETUDE N°1 : APPLICATION SUR UNE EAU PRODUITE...................................................................77
III.1.1. Souches pures et isolées ....................................................................................................................77
III.1.2. Echantillons réels ..............................................................................................................................77
III.2. ETUDE N°2 : APPLICATION SUR 3 FILIERES DE PRODUCTION D’EAU POTABLE .........................78
III.2.1. Souches pures et isolées ....................................................................................................................78
III.2.2. Echantillons réels ..............................................................................................................................78
III.3. ETUDE N°3 : APPLICATION SUR DES EAUX DE TOURS AEROREFRIGERANTES ...........................79
III.3.1. Souches pures et isolées ....................................................................................................................79
III.3.2. Echantillons réels ..............................................................................................................................80

IV. TRAITEMENT STATISTIQUES DES DONNEES 80

IV.1. LE TEST DE SPEARMAN .................................................................................................................80
IV.2. LE TEST DE WILCOXON ................................................................................................................80
IV.3. L’ANALYSE EN COMPOSANTES PRINCIPALES .............................................................................80
IV.4. LA REGRESSION LINEAIRE............................................................................................................80

PARTIE III - RESULTATS .....................................................................................................................81

I. OPTIMISATION EN LABORATOIRE DE LA METHODE DE QUANTIFICATION ET DE MISE EN

EVIDENCE DE LA VIABILITE 82
I.1. OPTIMISATION DE LA METHODE DE MARQUAGE POUR UNE APPLICATION A LA CYTOMETRIE
EN FLUX ............................................................................................................................................................82

I.1.1. Intégrité membranaire .......................................................................................................................82

I.1.1.1 Validation du marquage des cellules intègres sur souches pures .............................................82
I.1.1.2 Validation du marquage des cellules intègres sur matrice réelle ..............................................86
I.1.2. Activité enzymatique ........................................................................................................................89
I.1.2.1 Validation du marquage des cellules actives avec des souches pures ......................................89
I.1.2.2 Validation du marquage des cellules actives avec des échantillons réels.................................90
I.2. EVALUATION DES PERFORMANCES DE LA METHODE............................................................................90
I.2.1. Linéarité liée à la viabilité.................................................................................................................90
I.2.2. Exemple avec Escherichia coli .........................................................................................................91
I.2.3. Linéarité liée aux bactéries totales ....................................................................................................93

II. APPLICATIONS & CAMPAGNES SUR LE TERRAIN 94

II.1. APPLICATION AU CONTROLE QUALITE DE LA PRODUCTION D’EAU POTABLE ....................................94
II.1.1. Campagne n°1, usine de potabilisation .............................................................................................94
II.1.1.1 Comparaison des performances de la cytométrie en flux, de la cytométrie en phase
solide, de la microscopie à épifluorescence et de la culture .....................................................................94
II.1.1.2 Traitement statistique des données ...........................................................................................96
II.1.2. Campagne n°2 au niveau de 3 usines de potabilisation ....................................................................97

6
 II.1.2.1 Comparaison de différentes techniques d’analyse des flores bactériennes pour le suivi
des filières de production d’eau potable ...................................................................................................97
II.1.2.2 Suivi de la population bactérienne par cytométrie en flux en fonction de données
physico-chimiques de l’eau ....................................................................................................................102
II.2. APPLICATION A LA QUALITE DES EAUX DE TOURS AEROREFRIGERANTES .......................................104
II.2.1. Evaluation de l’impact des biocides oxydants en laboratoire .........................................................105
II.2.1.1 Impact des biocides oxydants sur l’ADN et l’intégrité membranaire des bactéries ...............106
II.2.1.2 Impact des biocides oxydants sur l’activité et la cultivabilité des bactéries ...........................109
II.2.2. Suivi de tours aéroréfrigérantes par cytométrie en flux ..................................................................110

PARTIE IV - DISCUSSION...................................................................................................................116

I. UTILISATION DE LA CYTOMETRIE EN FLUX POUR L’ANALYSE DE LA QUALITE DE L’EAU 117

I.1. APPLICATION A L’EAU POTABLE ..........................................................................................................117
I.2. APPLICATION SUR EAU DE TOURS AEROREFRIGERANTES ..................................................................122

II. AVANTAGES ET LIMITES OPERATIONNELLES DE LA CYTOMETRIE EN FLUX 127

III. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES QUANT A L’UTILITE DE LA CYTOMETRIE EN FLUX POUR

LE CONTROLE DE L’EFFICACITE DE TRAITEMENT DE L’EAU 130

PARTIE V - REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ..........................................................................135

PARTIE VI - ANNEXES ........................................................................................................................155

7
 LISTE DES FIGURES

Figure 1 Déplacement de volumes d’eau en milliards de m3 par année, lié au grand cycle de l’eau
en France (Bureau d’Informations et de Prévisions Economiques – BIPE/FP2E, 2008) ..........14
Figure 2 Représentation schématique du cycle domestique de l’eau (SIAEPA) .....................................15
Figure 3 Origine des ressources en eau pour la production d’eau potable en France, situation en
2012 (La qualité de l’eau du robinet en France, Ministère chargé de la santé, 2014) ...............16
Figure 4 Nombre d’usines de potabilisation en France (situation en 2007).
Source : La qualité de l’eau du robinet en France, Ministère chargé de la santé, 2014.............21
Figure 5 Accès à l’eau potable via un réseau d’adduction dans le monde en 2011 (OMS Progrès
en matière d’assainissement et d’alimentation en eau – Rapport 2013) ....................................22
Figure 6 Organisation de la gestion de l’eau potable en France (Bureau d’Informations et de
Prévisions Economiques - BIPE/FP2E, 2008)...........................................................................23
Figure 7 Volumes de prise d’eau selon usage en France, situation en 2009) avec (a) production
d’eau potable, (b) usage industriel, (c) production d’énergie et (d) irrigation
(Commissariat général au développement durable, chiffres& statistiques n°290, 2012) ..........25
Figure 8 Consommation domestique en eau potable en France, situation en 2008
(Commissariat général au développement durable, SOeS-SSP, enquête eau 2008)..................26
Figure 9 Répartition de la consommation domestique basée sur une consommation moyenne
quotidienne de 150 litres (situation en 2005). Source : Direction générale de la santé, la
qualité de l’eau potable en France, 2005 ...................................................................................27
Figure 10 Densité de la variété d’agents pathogènes par pays. Plus la variété est importante, plus la
zone est sombre (Dunn, 2010). ..................................................................................................29
Figure 11 Les différents états physiologiques des bactéries dans l’environnement...................................32
Figure 12 Observations microscopique de différentes souches de C. perfringens.....................................36
Figure 13 Les différentes étapes de formation et de maturation du biofilm (Monroe, 2007). ...................42
Figure 14 Rétention des différents groupes de microorganismes, particules et molécules en
fonction du seuil de coupure du système de filtration utilisé. ...................................................46
Figure 15 Principe de concentration par ultrafiltration en fibres creuses en mode (a) tangentiel et
(b) « impasse »...........................................................................................................................50
Figure 16 Colonies de (a) Legionella pneumophila sur milieu BCYE (Biomérieux) et (b) flore
totale hétérotrophe gélose PCA (Sound microbiology laboratory) ..........................................54
Figure 17 Principe de la mesure de l’ATP par production de bioluminescence (Protocole
Aquatools). ................................................................................................................................57
Figure 18 Principe du marquage cellulaire par le biais de la molécule de 5(6)-CFDA et exemple de
mise en évidence de l’activité estérase (microscope à épifluorescence) (Zotta, 2012). ............59
Figure 19 Structure du CTC et exemple de marquage sur des bactéries (Bartscht, 1999).........................59
Figure 20 Molécule de DIOC6(3) et exemple de marquage sur bactéries (Herskovits, 2002). .................60
Figure 21 Structure du DAPI et exemple de marquage sur des bactéries (Kikot, 2010). ..........................61
Figure 22 Structure du PI (a) et exemple de marquage sur des cellules (Mei, 2013). ...............................62
Figure 23 Principe du transfert d’énergie par résonance (FRET) et exemple de marquage au SYBR
Green II et au PI sur des bactéries (Présentation Gérald Grégori).............................................63
Figure 24 Représentation type d’un cytogramme suite au marquage d’un échantillon d’eau par
SYBR Green II et iodure de propidium .....................................................................................68
Figure 25 Cytomètre en flux FACSCantoTM II utilisé au laboratoire ........................................................69
Figure 26 Cytomètre en flux ACCURITM C6 utilisé au laboratoire ...........................................................69
Figure 27 Cytomètre en flux FACSCaliburTM utilisé au laboratoire..........................................................70
Figure 28 Cytomètre en phase solide à balayage laser ChemScan® RDI utilisé au laboratoire ................71
Figure 29 Microscope à épifluorescence LEITZ DMRB utilisé au laboratoire ........................................72
Figure 30 Luminomètre LB 9509 utilisé au laboratoire.............................................................................73
Figure 31 Compteur de colonies Scan® 1200 utilisé au laboratoire ...........................................................75

8
Figure 32 Localisation des points de prélèvement au niveau de la filière de production d’eau
potable avec eau (1) brute, (2) filtrée sable, (3) après ozonation, (4) après filtration sur
charbon actif granulaire et (5) produite .....................................................................................78
Figure 33 Cinétique d’exposition de bactéries (a) sans biocide, (b) HOBr, (c) NaOCl et (d)
NaOCl+NaBr .............................................................................................................................79
Figure 34 Comparaison des cytogrammes obtenus après marquage au SYBR Green I et SYBR
Green II combinés avec l’iodure de propidium (NADS) sur FACSCantoTM, (a)
marquage au SYBR Green I dilué au 1/10ième , (b) marquage au SYBR Green I dilué au
1/100ième , (c) marquage au SYBR Green II dilué au 1/10ième , (d) marquage au SYBR
Green II dilué au 1/100ième .........................................................................................................83
Figure 35 Distinction des fractions intègre et non-intègre sur FACSCaliburTM (marquage SYBR
Green II et PI) pour E. faecalis a= 100%, b= 50%, c=0% et E. coli d= 100%, e= 50%,
f=0% ..........................................................................................................................................84
Figure 36 Distinction des fractions 50% intègre et 50% non-intègre sur FACSCaliburTM
(marquage SYBR Green II et EthD-2) pour a, E. coli et b, E. faecalis .....................................84
Figure 37 Distinction des fractions intègres et non-intègres d’une souche Escherichia coli en eau
physiologique sur FACSCantoTM suite à l’application de la stratégie de « Gating » et
après (a) 0 minutes d’exposition aux UV, (b) 5 minutes d’exposition aux UV, (c) 15
minutes d’exposition aux UV, (d) 25 minutes d’exposition aux UV (200 µJ/cm2, la
partie haute représentant les cytogrammes SSC/FSC et la partie basse représentant les
cytogrammes SGII/PI ................................................................................................................85
Figure 38 Comparaison de la fluorescence des particules et d’Escherichia coli avec et sans
marquage au SYBR Green II et à l’iodure de propidium analysé sur FACSCanto II dans
(a) de l’eau physiologique, (b) de l’eau potable et (c) de l’eau filtrée sable .............................86
Figure 39 Apport des modifications de paramétrage sur la détection de bactéries dans un
échantillon réel d’eau filtrée sable, (a) avant modification, (b) après modification soit
FSC= 513 mV et SSC= 613 mV sur FACSCantoTM .................................................................88
Figure 40 Essais de détermination sur FACSCantoTM des paramètres température et temps de
marquage par le ChemChrome V6. (a) (b) et (c) : à Température ambiante, pour
respectivement un marquage de 5, 15 et 30 min. (d) (e) et (f) : Température de 37°C,
pour respectivement un marquage de 5, 15 et 30 min. ..............................................................89
Figure 41 Corrélation des ratios expérimentaux en fonction des ratios théoriques pour la souche E.
faecalis (a) et E. coli (b) sur FACSCaliburTM au niveau des bactéries intactes (intègres),
actives (métabolisme actif) et cultivables (capable de former des colonies sur gélose) ............91
Figure 42 Estimation de l’impact d’un traitement par irradiation UV sur une suspension
d’Escherichia coli par FACSCantoTM avec marquage au SGII et CV6 et par culture, (a)
0 minutes d’exposition aux UV, (b) 5 minutes d’exposition aux UV, (c) 15 minutes
d’exposition aux UV, (d) 25 minutes d’exposition aux UV (200 µJ/cm2)................................92
Figure 43 Détermination de la linéarité de la méthode de détection par cytométrie en flux sur
FACSCaliburTM via application avec une souche pure d’Escherichia coli ................................93
Figure 44 Comparaison de la réponse de différentes techniques au niveau de la quantification des
bactéries totales et viable provenant d’échantillons issus d’une usine de production
d’eau potable. FCM= cytométrie en flux, MSP= microscopie à épifluorescence, SPC=
cytométrie en phase solide, PCA= plate count agar ..................................................................95
Figure 45 Suivi des différents états physiologiques de la population bactérienne au sein des les
usines A (a), B (b) et C (c) avec détection des bactéries totales, viables et actives par
cytométrie en flux et des bactéries cultivables par culture sur milieu PCA et R2A ..................98
Figure 46 Estimation de l’impact des UV sur la viabilité des bactéries au niveau de l’usine A (a)
après une exposition UV de 400 J/m2 et C (b) après une exposition UV de 250 J/m2,
avec détection des bactéries totales, intègres et actives par cytométrie en flux et des
bactéries cultivables par culture sur milieu PCA et R2A ........................................................101
Figure 47 Courbes de suivi sur 2 mois de la population bactérienne totale par cytométrie en flux
en fonction des données physico-chimiques pour les usines A (a), B (b) et C (c) ..................103
Figure 48 Analyse en Composante Principale pour la mise en évidence de corrélation entre les
paramètres physico-chimiques, météorologiques et la concentration bactérienne ..................104

9
Figure 49 Suivi de la quantité de bactéries totales et évolution de l’intégrité membranaire d’une
population bactérienne issue (a) d’une TAR tertiaire et (b) d’une TAR industrielle en
fonction du temps de contact avec HOBr, NaOCl et le mélange NaOCl +NaBr ....................107
Figure 50 Suivi de la perte d’intégrité membranaire d’une population bactérienne issue d’une TAR
tertiaire en fonction du temps de contact et du biocide oxydant testé avec (a) HOBr, (b)
NaOCl, (c)NaBr+ NaOCl (d) témoin sans biocide ..................................................................108
Figure 51 Suivi de la quantité de bactéries actives et cultivables d’une population bactérienne issue
(a) d’une TAR tertiaire et (b) d’une TAR industrielle en fonction du temps de contact
avec HOBr, NaOCl et le mélange NaOCl +NaBr ...................................................................109
Figure 52 Exemple de variation de la concentration en bactéries actives et cultivables pour des
échantillons prélevés à 3 dates différentes au niveau d’une même TAR ................................112
Figure 53 Régression linéaire des données obtenues par cytomètre labo et cytomètre portable
(n=27) ......................................................................................................................................113
Figure 54 Comparaison de la quantification des bactéries par cytométrie en flux (CV6),
ATPmétrie et culture en eau de TAR tertiaire .........................................................................114
Figure 55 Comparaison entre les présents travaux et ceux menés par Hammes et al. (2008)
concernant les concentrations bactériennes obtenues au niveau des différentes étapes de
traitement de l’eau potable ......................................................................................................118
Figure 56 Comparaison OPEX/CAPEX entre la cytométrie en flux, la cytométrie en phase solide,
la mesure de l’ATP, la microscopie à épifluorescence et la culture sur gélose pour 10
analyses quotidiennes durant une année ..................................................................................129
Figure 57 Positionnement de la cytométrie en flux, la cytométrie en phase solide, la mesure de
l’ATP, la microscopie à épifluorescence et la culture sur gélose en fonction de leurs
performances et de leur déploiement .......................................................................................130
Figure 58 Détection des parasites protozoaires pathogènes Giardia duodenalis et Cryptosporidium
parvum par cytométrie en flux après marquage par des anticorps spécifiques
fluorescents ..............................................................................................................................132

10
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 Niveau de traitement nécessaire de l’eau de ressource en fonction de sa qualité ......................20

Tableau 2 Principaux paramètres biologiques relatifs à l’eau potable et à la santé humaine
(Ashbolt, 2015 ; Hunter, 2003) ..................................................................................................30
Tableau 3 Principes et méthodes usuelles de détection et de discrimination des microorganismes
viables dans l’eau. .....................................................................................................................53
Tableau 4 Les marqueurs majeurs utilisés pour la détection des microorganismes et la mise en
évidence de leur état physiologique ou structural......................................................................58
Tableau 5 Origine des souches bactériennes et type de traitement biocide appliqué .................................66
Tableau 6 Type d’information obtenue sur l’état physiologique de cellules en fonction de la
méthode analytique ....................................................................................................................67
Tableau 7 Origine des souches bactériennes et type de traitement biocide appliqué .................................76
Tableau 8 Proportion de cellules bactériennes intègres et non-intègres estimée par microscopie à
épifluorescence et par cytométrie en flux avant et après paramétrage du laser .........................88
Tableau 9 Comparaison de l’évolution des l’intégrité membranaire de 3 genres bactériens en
fonction d’une exposition aux UV (200 µJ/cm2) après 15 min. et 25 min. sur
FACSCantoTM ............................................................................................................................91
Tableau 10 Concentration moyenne (n=4) en équivalent chlore par type de biocide oxydant ..................105
Tableau 11 Evolution de la concentration de cellules bactériennes actives ou cultivables (par mL) en
fonction du temps de contact avec 3 biocides oxydants, mesuré par FACSCantoTM ..............106
Tableau 12 Suivi des bactéries par cytométrie en flux (CV6), ATPmétrie et culture (PCA) et
mesures physico-chimiques (pH, turbidité, conductivité) de 27 échantillons de TARs ..........111
Tableau 13 Matrice de corrélation de Spearman pour les mesures microbiologiques et physico-
chimiques (n=27) .....................................................................................................................113
Tableau 14 Estimation des coefficients de variation liés à la cytométrie en flux, l’ATPmétrie et la
culture sur milieu PCA pour la quantification des bactéries en eau de TAR ..........................115
Tableau 15 Impact de l’ozonation, des UV et de la chloration sur les bactéries ........................................121
Tableau 16 Impact du brome complexé, de l’hypochlorite de sodium et du couple bromure de
sodium et hypochlorite de sodium sur les bactéries sur les bactéries ......................................125

11
 LISTE DES ABREVIATIONS

ADN Acide Désoxyribonucléique

ARN Acide Ribonucléique
ARS Agence Régionale de Santé
AFNOR Association Française de NORmalisation
COFRAC COmité FRançais d’Accréditation
CAG Charbon actif en grain
CTC 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride
CV6 Chemchrome V6
DAPI 4',6'-diamidino-2-phénylindole
DGS Direction Générale de la Santé
DiOC6(3) Dihexylaxacarbocyanine iodide
DMSO Diméthyl Sulfoxyde
EthD-2 Ethidium Homodimère – 2
FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
FSC Forward Scatter
FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
FS Forward Scatter
ISO International Organization for Standardization
λem longueur d’onde d’émission
λex longueur d’onde d’excitation
NADS Nucleic Acid Double Staining
NFU Nephelometric Formazine Unit
NTU Nephelometric Turbidity Unit
OMS Organisation Mondiale de la Santé
PBS Phosphate Buffer Saline
PCA Plate Count Agar
PI Iodure de propidium
PMT photomultiplicateurs
rpm rotation par minute
SG SYBR Green
SSC Side Scatter
Rh123 Rhodamine 123
SG II SYBR Green II
SS Side Scatter
UFC Unité Formant Colonie
UV Ultra-Violet
VBNC Viable Non-Cultivable

12
Partie I - BIBLIOGRAPHIE

13
La qualité et la quantité de l’eau sont devenues critiques face aux activités humaines et aux
besoins associés. Dans les pays industrialisés, une pollution majoritairement d’origine
agricole, reste problématique avec pour exemple environ 5 et 12% de contamination des eaux
souterraines et des plans d’eau par les pesticides (Onema/OIEau 2015). Les moyens mis en
œuvre afin d’adapter les procédés de traitement et de contrôle de l’eau ont permis de limiter
significativement le risque sanitaire. Concernant les pays en voie de développement et
émergeants, les populations sont confrontées à de graves problèmes de contamination restant
la première cause de mortalité avec plus de 500000 décès par an liés à la dysenterie, la
typhoïde et la poliomyélite (OMS 2015). Le réchauffement climatique représentant un facteur
aggravant de cette situation déjà critique augmentant la pollution et les dynamiques de
transmission des maladies (OMS 2015). Les inondations de plus en plus fréquentes, qui sont
passées d’environ 50 à 250 événements entre 1973 et 2008 (Doocy et al. 2013), favorisent la
contamination des sources d’eau douce, accroissent le risque de maladies hydriques et
transmises par des insectes vecteurs. Inversement, le changement climatique peut entrainer
une réduction de la dilution des rejets, pouvant alors dégrader la qualité de l’eau de ressource
pour la production d’eau à des fins domestiques (Ministère de l'écologie du développement
durable et du logement 2015).

En vue de faire face à l’ensemble de ces difficultés, une gestion drastique de l’eau au niveau
mondial s’impose. Cette approche, s’inscrivant dans une démarche de développement durable
avec un suivi tout au long du cycle de l’eau, doit permettre un accès à l’eau potable allant de
la protection des ressources en limitant l’impact humain sur l’environnement, à la maîtrise des
procédés de production et de distribution de l’eau potable, incluant le contrôle de l’eau à
chaque étape de son traitement jusqu’au robinet de l’utilisateur. Les eaux superficielles,
souterraines, l’atmosphère et la biosphère peuvent être considérés comme des compartiments
entre lesquels ont lieu les échanges et où l’eau passe par différents états, incluant l’état
liquide, solide et gazeux. La quantité d’eau circulant lors de ce parcours dynamique est
inchangée depuis plusieurs milliards d’années et est équivalente à 1400 milliards de km3 (De
Marsily 2013). Il existe deux types de cycles de l’eau : le cycle naturel (ou grand cycle) et le
cycle domestique (ou petit cycle). Le grand cycle de l’eau peut s’apparenter à un mouvement
perpétuel qui passe par plusieurs états (figure 1).

Figure 1 Déplacement de volumes d’eau en milliards de m3 par année, lié au grand cycle de l’eau en France
(Bureau d’Informations et de Prévisions Economiques – BIPE/FP2E, 2008)

14
L’évapotranspiration constitue la première étape du cycle liée à l’évaporation directe de la
surface de plans d’eau et à la transpiration végétale avec environ 300 milliards de m3 par
années (BIPE/FP2E 2008). Suite à la condensation de la vapeur d’eau atmosphérique sous
l’action simultanée de la température et de la pression, l’eau est ensuite restituée sous forme
de précipitations (480 milliards de m3/an) assurant sa redistribution à la surface de la terre.
L’eau s’infiltre dans le sol et alimente les nappes souterraines (100 milliards de m3/an) mais
une grande partie ruisselle (80 milliards de m3/an) sur les surfaces imperméables telles que la
végétation (canopée) ou le réseau routier pour rejoindre les eaux de surface telles que les
rivières, lacs et mer (Préfet Ile-de-France 2012). Le cycle domestique de l’eau est quant à lui
schématisé sur la figure 2.

Figure 2 Représentation schématique du cycle domestique de l’eau (SIAEPA)

Contrairement au cycle naturel, le cycle domestique est artificiel, car mis en place par
l’homme (cycle anthropique) via un système visant à prélever l’eau dans le milieu naturel
(eau de surface et souterraine), la traiter en vue de la rendre potable et pouvoir la consommer
puis la récupérer sous forme d’eau usée, la traiter à nouveau afin de la restituer au milieu
naturel avec un impact écologique le plus faible possible.

I. LA PRODUCTION ET LA DISTRIBUTION D’EAU POTABLE

La directive 98/83/CE du 3 novembre 1998 relative à la qualité des eaux destinées à la
consommation humaine constitue le cadre réglementaire européen en matière d’eau potable.
Cette directive a été transposée en droit français, au niveau législatif et réglementaire par le
décret 2001-1220 (2001) puis codifié par les articles L. 1321-1 à L. 1321-66 du code de la
santé publique (2003).

15
Une eau dite potable se définit en fonction de différents paramètres et leur seuil relatif, tels
que les paramètres microbiologiques, chimiques ou organoleptiques. Les eaux brutes issues
du milieu naturel sont prélevées (captage) en vue de subir une série de traitements plus ou
moins complexes selon leur qualité (détaillé plus bas), destinés à éliminer les éventuels
polluants et à garantir la qualité de l’eau potable dans les réseaux, jusqu’au point d’usage du
consommateur.

I.1. LES DIFFERENTES RESSOURCES

Il existe deux types de captages (prise d’eau avant traitement) : les eaux souterraines (ou de
forage) et les eaux superficielles (ou de surface). La carte présentée figure 3 donne un aperçu
concernant les origines des ressources sur le territoire français.

Figure 3 Origine des ressources en eau pour la production d’eau potable en France, situation en 2012 (La qualité de
l’eau du robinet en France, Ministère chargé de la santé, 2014)

Les deux tiers (65,6%) de l’eau produite provient d’eau issue des nappes souterraines,
résultant de l’infiltration de l’eau de ruissellement dans le sol, suite à des précipitations
(Ministère chargé de la santé 2014). La percolation au travers de la roche permet d’une part de
bénéficier d’une protection naturelle contre les potentielles pollutions, à l’exception des
métaux lourds (ex : cadmium, mercure, chrome) et du radon pour les roches granitiques, et
d’obtenir une eau déjà naturellement épurée au niveau microbiologique et riche en éléments
minéraux. Les produits phytosanitaires tels que les pesticides sont des substances chimiques
initialement destinées à la protection des plantations mais peuvent d’une part passer dans le
sol contaminant ainsi les eaux souterraines et d’autre part se déverser directement dans les
cours d’eau.

16
Pour les eaux destinées à la consommation humaine, la directive 98/83/CE fixe à 0,1 µg/L et à
0,5 µg/L les limites de qualité pour chaque type de pesticide et pour la concentration totale en
pesticides, respectivement. Les eaux superficielles, concernant un tiers du volume d’eau
potable produit, présentent l’avantage d’être directement accessibles pour le captage mais sont
de ce fait vulnérables aux pollutions liées à l’activité humaine (industrie, agriculture,
urbanisme) et tributaires des changements climatiques. Cependant, la vie sauvage a également
un impact non-négligeable sur la qualité de l’eau du fait de la présence de matière organique
suite à la décomposition végétale et animale.

Environ 33500 captages sont répartis sur l’ensemble du territoire dont la plus grande majorité
(96 %) ne permet qu’une production inférieure à 2000 m3/jour à partir d’eau provenant des
nappes souterraines, ce qui représente 2% de l’ensemble de la production (Ministère chargé
de la santé 2014). La plus grande partie de la production est donc effectuée via des captages
de grande capacité (plus de 50000 m3/jour) mais moins représentés (4%) pompant des eaux
superficielles provenant de lacs ou rivières. Pour exemple, l'usine de Méry-sur-Oise fournit
chaque jour 158000 m3 d'eau à 800000 habitants en Ile-de France. Il existe également des
captages d’eau de mer, d’une capacité totale de près de 25000 m3/jour, utilisés exclusivement
pour l’alimentation en eau potable des îles (Guadeloupe, Ile de Sein, Belle-Ile) en tant que
ressource unique ou complémentaire (Ministère chargé de la santé 2014).

L’un des points les plus importants relatif aux points de captage concerne la mise en place de
périmètres de protection en vue de réduire les risques de pollution chimiques et/ou
microbiologique de la ressource. Ces derniers correspondent à des zones bien délimitées
autour d’un captage et sont définis d’une part au regard de l’occupation du territoire du bassin
versant (ex : activité agricole ou industrielle) et sur la base de critères permettant de calculer
les zones à délimiter (ex : hydrogéologie). Cette approche est sectorisée en trois parties
incluant un périmètre (1) de protection immédiate interdisant toute acticité et ayant pour but
d’éviter les déversements de substances nocives à proximité du captage, (2) de protection
rapprochée à l’intérieur de laquelle les activités sont particulièrement contrôlées (3) de
protection éloignée correspondant à la zone d’alimentation du point de captage d’eau,
généralement la totalité du bassin versant.

A ce jour, 66% des captages (soit 22500) bénéficient de la mise en œuvre d’une telle
approche et de nouvelles procédures sont menées à terme annuellement ce qui augmente
régulièrement ce chiffre. Malgré les mesures de sécurité instaurées avec les périmètres de
protection, certaines eaux brutes présentent des pollutions trop importantes et nécessitent un
traitement particulier et onéreux, engendrant l’exclusion du captage concerné (Ministère
chargé de la santé 2014; Ministère de la Sante 2008).

I.2. LE FONCTIONNEMENT D’UNE USINE DE POTABILISATION

La production quotidienne d’eau potable à l’échelle nationale est de 19 millions de mètres
cubes, assurée par plus de 16300 usines de traitement (DGS 2012a). Les procédés de
traitement les plus complets sont dispensés par les stations ayant les plus grandes capacités de
production ; cela est expliqué par le fait que l’eau de ressource provient d’eaux superficielles
donc qui nécessite un niveau de traitement plus élevé. La complexité des procédés de

17
traitements nécessaires (détaillé plus bas) en vue d’obtenir une eau potable dépendent
directement de la qualité de l’eau brute utilisée en tant que ressource du fait que cette
dernière se charge en éléments naturels (ex : matière organique, minéraux) et non-naturels
(ex : pesticides, médicaments).

I.2.1. Les étapes d’une filière de traitement

Les variations au niveau de la filière sont directement liées à la qualité de l’eau prélevée, et
font appel à des traitements physiques, chimiques, et/ou biologiques. L’ensemble de ces
procédés constituent une stratégie multi-barrières où au moins chaque étape a un impact
concernant l’élimination d’un microorganisme ou d’un micropolluant.

I.2.1.1 Le dégrillage/tamisage
Cette première étape vise prioritairement à protéger les installations et est principalement
utilisée lors de captage d’eaux superficielles pouvant être chargées en débris et matière
organique. Le dégrillage permet de retenir les débris flottants tels que des (ex : branches, sacs
plastiques…) par le biais de barreaux métalliques suivi du tamisage pour retenir les éléments
de taille plus faible (ex : mégots de cigarette, insectes, algues…) via une série de tamis
présentant un maillage de plus en plus fin.

I.2.1.2 La coagulation/floculation/décantation
L’étape de coagulation permet ensuite de réduire la masse des particules, qui sédimentent au
fond d’un bassin suite à l’addition d’un produit coagulant engendrant la formation de flocs.
Son principe repose sur la suppression des charges négatives caractérisant les colloïdes
(particules en suspension ne décantant pas naturellement) qui engendre une répulsion entre les
particules. L’ajout de sels métalliques électropositifs (sulfate d’alumine, chlorure ferrique) ou
de polymères (polyacrylamide, polyéthylène-amides) permet par liaison de neutraliser ces
particules colloïdales (coagulation) et de les agglomérer entre elles (floculation). Le poids
ainsi généré par le biais de ces flocs va ensuite permettre une décantation des particules.

I.2.1.3 La filtration sur sable

L’eau circule ensuite au-travers de filtres à sable (ou membranes), permettant d’éliminer les
particules et impuretés restant en suspension après décantation. Cette étape permet notamment
de retenir une partie des microorganismes dont certaines formes résistantes (ex : endospores et
oocystes de parasites protozoaires) et également d’éliminer certains micropolluants, tels que
l’ammoniaque, via une action biologique de la population bactérienne sessile se trouvant à la
surface des grains de sable, permettant leur dégradation par assimilation (nitritation et
nitratation).

I.2.1.4 L’ozonation
La diffusion d’ozone (gaz, O3) dans l’eau à la sortie des filtres à sable présente une action
incluant l’oxydation et la fragmentation de la matière organique et la précipitation du fer et du
manganèse. Parallèlement, cette étape engendre une inactivation des particules biologiques les
plus résistantes telles que les virus ou les parasites. Du fait de son instabilité, l’ozone doit être
produite sur site à partir d’air ambiant, filtré et asséché puis soumis à un fort courant
électrique. Sous cette puissante impulsion, l’O2 est transformé en O3. Cependant, ce type de

18
traitement peut entrainer la formation de sous-produits potentiellement cancérigènes tes que
les dérivés bromés et d’aldéhydes (Boorman 1999).

I.2.1.5 L’adsorption sur charbon actif

Après un nouveau pompage, l’eau traverse une seconde série de filtres en vue d’atteindre une
stabilité biologique de l’eau. Ces filtres sont constitués de charbon actif en grain piégeant les
micropolluants par adsorption tels que les pesticides et qui servent de support au
développement d’une biomasse bactérienne sessile capable d’éliminer par voie biologique les
composés organiques biodégradables (Marconnet et al. 2009). A l’issue de cette étape, l’eau
offre une qualité et une stabilité biologique satisfaisantes.

I.2.1.6 L’irradiation par rayons Ultra-Violet

Le traitement par les UV est un complément pour l’inactivation des microorganismes dont
certaines formes sont résistantes (ex : oocystes de parasites protozoaires). Son action est
principalement basée sur un agissement sur les acides nucléiques de microorganismes (lésion
au niveau de l’ADN). Un autre avantage est qu’il n’y a pas de risque de création de sous-
produits toxiques suite à une dégradation de la matière organique.

I.2.1.7 L’ultrafiltration/nanofiltration
L’ultrafiltration est basée sur une surface filtrante (organique ou céramique) constituée de
plusieurs milliers de fibres présentant une porosité de l’ordre de 0,01 µm (seuil de coupure),
réunies à l’intérieur d’une gaine rigide. L’eau à circule sous pression à l’intérieur et passe au
travers des pores (filtration interne/externe), les substances et éléments indésirables étant
retenus dans les fibres. Les membranes d’ultrafiltration permettent de retenir la quasi-totalité
des colloïdes en suspension incluant les particules virales et certaines macromolécules
organiques présentant un poids moléculaire important.

La nanofiltration permet d’éliminer les polluants dissous (organiques ou minéraux) dont la

plupart des métaux lourds. Ce procédé est moins représenté au niveau des usines de traitement
et en France, seule l’usine de production d’eau potable de Méry-sur-Oise en est équipée. Le
principe est semblable à l’ultrafiltration mais avec un seuil de coupure dix fois inférieur
(0,001 µm), ce qui nécessite une pressions élevée en vue de faire circuler l’eau. Cependant, si
les fibres utilisées en ultrafiltration sont linéaires, celles employées pour la nanofiltration sont
enroulées autour d’un tube central par lequel ressort l’eau filtrée. Un avantage d’une telle
étape de filtration réside dans le fait qu’il permet également de diminuer significativement la
concentration en chlore, à l’exception des cas particulier nécessitant une augmentation de la
dose pour maintenir une concentration minimale en chlore libre de 0,3 mg/L en sortie des
réservoirs et viser une concentration de 0,1 mg/L en tout point du réseau de distribution
(DGS/SD7A 2003). Cependant, l’une des principales limites à l’utilisation des procédés de
filtration membranaire en production d’eau potable est le colmatage lié à l’accumulation de
matière organique et inorganique. Des études rapportent également la complexité concernant
le nettoyage de telles membranes qui ne permet pas l’élimination totale du dépôt organique
(Di Martino et al. 2007; Houari et al. 2010).

19
I.2.1.8 La chloration
L’action oxydante du chlore a un impact direct sur les aspects biologiques, chimiques et
organoleptiques incluant la croissance bactérienne et algale, le niveau de fer et manganèse, le
goût et l’odeur de l’eau. Cependant, l’objectif essentiel de la chloration chlore reste la
désinfection de l’eau et sa stabilité biologique. Cette stabilité nécessite d’atteindre et de
conserver un niveau de chlore résiduel dans le réseau de distribution. La combinaison de la
concentration en chlore et du temps de contact (CT) permet de doser le taux de traitement lié à
ce rapport en diminuant ou augmentant l’un des deux paramètres de manière inverse.
Cependant, au même titre que l’étape d’ozonation, la chloration peut générer des sous-
produits nocifs tels que les trihalométhanes, l’acide haloacétique et les haloacétonitriles
(Boorman 1999).

I.2.2. Les niveaux de traitement

Il existe trois niveaux de traitement à mettre en œuvre selon la qualité de la ressource, basés
sur le classement de la directive européenne 75/440/CEE (16 juin 1975) concernant la qualité
requise des eaux superficielles destinées à la production d’eau alimentaire dans les états
membres. La qualité de l’eau est définie selon une liste de valeurs guide et impérative pour
chaque paramètre : catégorie A1, A2 et A3 (tableau 1). La catégorie A1 ne nécessite qu’un
traitement physique simple accompagné par une désinfection (83% des installations), la
catégorie A2 nécessite un traitement physique complémentaire, un traitement chimique et une
étape de désinfection et la catégorie A3 nécessite un traitement physique complet, un
traitement chimique poussé, une étape d’affinage et une étape de désinfection. Le tableau
suivant illustre les traitements à appliquer en fonction de la catégorie de qualité d’eau sur la
base d’un même procédé:
Tableau 1 Niveau de traitement nécessaire de l’eau de ressource en fonction de sa qualité
Catégorie A1 A2 A3
Qualité Bonne Moyenne Médiocre
Dégrillage/ tamisage - + +
Coagulation/décantation - + +
Filtration sur sable + + +
Ozonation - - +
Charbon actif - - +
Désinfection + + +

L’adaptation du processus de traitement en fonction de la qualité de l’eau superficielle utilisée

permet de faire face à aux limites fixées par la réglementation suite à l’enrichissement naturel
par certaines substances.

20
I.3. LE RESEAU DE DISTRIBUTION
L’eau produite par les usines de traitement est acheminée jusqu’au consommateur via un
réseau de distribution ou unités de distribution (UDI), constitué de canalisation et réservoirs.
Il existe près de 25000 UDI en France (figure 4), représentant en termes de distance, le réseau
de distribution d’eau potable français compte près de 906000 kilomètres de conduites et
augmente d’environ 3000 kilomètres par an.

Figure 4 Nombre d’usines de potabilisation en France (situation en 2007).

Source : La qualité de l’eau du robinet en France, Ministère chargé de la santé, 2014

Cependant, les canalisations en sénescence engendrent d’importantes pertes d’eau au niveau

de ce réseau. En effet, le volume lié aux pertes est estimé à plus d’un milliard de mètres
cubes, représentant environ 20% de la production annuelle. Celles-ci représentaient plus de
3,5 m3 par jour et par km de canalisation (DGS/ARS 2008). Un renouvellement constant des
canalisations associé à des systèmes de détection des fuites ont permis de réduire
considérablement les pertes en moins de 10 ans (DGS/ARS 2008).

Concernant le rapport entre la population desservie en fonction du nombre d’UDI, il est

reporté que 80 % des UDI desservent 12% de la population française, soit moins de 2000
habitants, signifiant que la majorité des UDI produisent localement de faibles volumes d’eau
potable.

21
I.4. LE MARCHE DE L’EAU POTABLE
Le marché de l’eau en France, incluant l’eau potable et l’assainissement, représente un chiffre
d’affaires de plus de 15 milliards d’euros, pour 250 milliards au niveau mondial, et plus de
100000 emplois (DIRECCTE 2012). La croissance annuelle en France est de l’ordre de 2 à
3% en grande partie liée à la mise aux normes des installations de production et de
distribution d’eau potable et d’assainissement. Le secteur de l’éco-industrie (industrie ayant
pour objet de réduire la pollution et de protéger l'environnement) en France est dominé par de
grands groupes tels que Veolia, Suez et Saur par le principe de délégation de service public
(DIRECCTE 2012). L’alternative à la délégation est la régie, où la commune ou le
groupement intercommunal assument directement la gestion de leurs services d’eau.

I.4.1. L’accès à l’eau potable

En 2011, il a été recensé par l’OMS que 89 % de la population mondiale disposait de points
d’eau améliorés (branchement domestique ou robinet public protégé contre la contamination
extérieure) et 55 % bénéficiait de branchements domestiques à un réseau d’adduction d’eau
potable (Figure 5). De ce fait, près de 4 milliards de personnes bénéficient désormais de l’eau
courante et 2,3 milliards ont accès à un point d’eau amélioré (robinets publics ou des puits
protégés). A l’inverse, 768 millions de personnes n’utilisant pas des points d’eau améliorés en
2011, dont 185 millions utilisaient directement des eaux de surface pour la consommation
quotidienne (OMS 2013).

Figure 5 Accès à l’eau potable via un réseau d’adduction dans le monde en 2011 (OMS Progrès en matière
d’assainissement et d’alimentation en eau – Rapport 2013)

Cependant, la figure 5 montre que la majorité du continent africain soit entre 1 et 4 personnes
sur 10 n’ont pas d’accès à l’eau potable. Ces disparités au niveau de l’accès à l’eau sont
expliquées par d’importantes inégalités géographiques, socioculturelles et économiques. Les
risques de transmission de maladies (ex : choléra, dysenterie) auxquels est exposée la
population sont directement liés à une mauvaise gestion locale des rejets eaux usées dans
l’environnement et au traitement inadapté de la pollution engendrée. En effet, d’après l’OMS,
près d’un milliard de personnes sont dépourvues d’installations d’assainissement, exposant
ces populations à un risque élevé de maladies diarrhéiques.

22
I.4.2. Les acteurs de la distribution d’eau potable en France
En France, l’application d’une réglementation pour le domaine de l’eau potable est constituée
de différentes étapes (DGS 2005a). L’OMS donne des recommandations basées sur des
valeurs guides pour la sécurité sanitaire de l’eau. A partir de ce cadre, l’union européenne
(parlement, conseil et commission) élabore des directives et veille à leur application.

En France, la politique de l’eau est ensuite orientée par l’Etat, qui participe à la mise en place
des directives européennes et les transpose à la réglementation nationale avec le support des
ministères concernés (ministères de l’Ecologie, de l’Energie et du Développement Durable, de
l’Agriculture et de la Pêche, de la Santé et de l’Intérieur et des Collectivités Territoriales) et
d’agences nationales (ex : ANSES, INVS). Cette organisation permet de programmer les
actions en matière de qualité et de traitement de l'eau potable ainsi que les contrôles sanitaires
(Figure 6).

Figure 6 Organisation de la gestion de l’eau potable en France (Bureau d’Informations et de Prévisions

Economiques - BIPE/FP2E, 2008)

D’autres organismes sont également consultés afin d’optimiser la mise en œuvre du cadre
réglementaire, incluant l'Office National de l'Eau et des Milieux Aquatiques (ONEMA), le
Bureau de Recherches Géologique et Minières (BRGM), l'Institut français de Recherche pour
l'Exploitation de la Mer (IFREMER) ou l'Institut national de l'Environnement industriel et des
Risques (INERIS). Parallèlement, le SDAGE (Schémas directeurs d’aménagement et de
gestion des eaux) a pour objectif de planifier et d’orienter une gestion équilibrée de la
ressource en eau pour chaque bassin hydrographique. Il prend les mesures et dispositions
concernant les aménagements pour lutter contre la détérioration des milieux aquatiques.

23
Une gestion est ensuite instaurée localement concernant la production de l’eau avec une
surveillance de la qualité via des distributeurs d’eau, des bureaux d’étude, des laboratoires
agréés, les agences régionales de santé (ARS). L’ARS assure le contrôle sanitaire de l’eau en
mettant en œuvre des mesures de gestion et d’inspection et élabore les bilans périodiques sur
pour l’information publique. Les principaux acteurs de cette gestion locale sont les
collectivités, les opérateurs sélectionnés par les collectivités et les consommateurs.

La collectivité étant propriétaire des installations, celle-ci décide du mode d’exploitation et

fixe les objectifs à l’opérateur qui peut être soit (1) public si le service est assuré par une régie
(moyens et personnel de la collectivité) représentant 67% des UDI alimentant 34% de la
population, soit (2) privé si le service est délégué à une entreprise (ex : Veolia, Suez, Saur),
aussi appelé délégation de service public dans le cadre d’un contrat pluriannuel, alimentant
65% de la population.

Quel que soit le type d’exploitation de l’UDI (public ou privé), une personne est désignée
comme responsable direct de la qualité de l’eau distribuée (Personne Responsable de la
Production ou de la Distribution de l’Eau, PRPDE). Cette personne est chargée du contrôle
qualité, de prendre des mesures correctives en cas d’anomalies avérées et de l’information
(mairie, usagers, ARS).

I.4.3. Les différents usages de l’eau

L’utilisation de l’eau apparait à tous les niveaux de l’activité humaine, que ce soit pour les
besoins quotidiens de consommation (boisson, sanitaires), les loisirs (baignade et autres
activités aquatiques) ou l’économie (production industrielle, production d’électricité).

I.4.3.1 Les usages de l’eau douce

L'eau douce prélevée dans l’environnement est utilisée, après traitement ou non,
essentiellement dans les domaines agricole (irrigation), industriel (refroidissement) et
domestique (consommation). Près de 30 milliards de m3 d'eau douce sont prélevés chaque
année en France métropolitaine en vue de répondre aux besoins de ces différents usages.

24
La figure 7 ci-dessous présente la répartition des volumes de prélèvement en fonction des
usages :

Figure 7 Volumes de prise d’eau selon usage en France, situation en 2009) avec (a) production d’eau potable, (b)
usage industriel, (c) production d’énergie et (d) irrigation (Commissariat général au développement durable, chiffres&
statistiques n°290, 2012)

D’après ces données, le volume d’eau douce utilisée pour le refroidissement d’installation
pour la production d’énergie est 10 fois plus élevé par rapport aux trois autres secteurs
majeurs concernés. Cependant, la quasi-totalité de l’eau prélevée pour cette utilisation (90%)
est restituée dans le milieu naturel. Les proportions de prélèvement d’eau douce concernant la
production d’eau potable, l’irrigation et l’industrie (incluant le secteur tertiaire) s’élèvent à
20%, 11% et 10%, respectivement (Commissariat général au développement durable 2012).

25
I.4.3.2 Les usages de l’eau potable
Les usages de l’eau potable peuvent se diviser en 3 catégories majeures (Préfet des Yvelines
2009), comprenant les usages domestiques (boisson, sanitaires), les usages dits sensibles (en
milieu hospitalier par exemple) et les usages particuliers comme le secteur tertiaire
(chauffage, nettoyage). Ainsi, près de 25 milliards de m3 d’eau potable sont consommés par
an, dont 4 milliards de m3 pour l’usage domestique.

I.1.1.1.1 Les usages domestiques

La consommation domestique d’eau potable couvre les besoins d’un foyer classique
englobant plusieurs aspects tels que l’alimentation, la toilette ou l’entretien. La figure 8 ci-
dessous présente la consommation moyenne quotidienne en France par département :

Figure 8 Consommation domestique en eau potable en France, situation en 2008

(Commissariat général au développement durable, SOeS-SSP, enquête eau 2008)

Les importantes disparités au niveau de la consommation en fonction des régions peuvent

s’expliquer par différents facteurs tels que le climat qui peut influencer le tourisme ou encore
le type d’habitation (habitat individuel avec piscine et/ou jardins). En moyenne, 150 litres
d’eau sont consommés chaque jour en France par habitant.

26
La figure 9 montre les proportions, en termes de pourcentage et de volume, pour différentes
catégories d’usages domestiques :

Figure 9 Répartition de la consommation domestique basée sur une consommation moyenne quotidienne de 150
litres (situation en 2005). Source : Direction générale de la santé, la qualité de l’eau potable en France, 2005

Il s’avère que la partie la plus faible d’eau potable est utilisée au niveau de la boisson ou de la
préparation d’aliments (7%) contre près de dix fois plus (60%) pour la toilette ou les sanitaires
(DGS 2005b).

I.1.1.1.2 Les usages sensibles

Cette partie de l’utilisation de l’eau potable est liée à des domaines où la qualité de l’eau
potable est primordiale. Les secteurs majoritairement concernés sont l’industrie
agroalimentaire, l’industrie pharmaceutique et le milieu hospitalier. L’industrie alimentaire
utilise majoritairement l’eau potable d’origine publique avec un contrôle régulier de sa qualité
afin de s’assurer qu’elle est propre à la consommation avant d’être utilisée au niveau du
processus de production. Le nettoyage des équipements et le conditionnement des aliments
font également appel à l’utilisation d’eau potable. Les volumes d’eau utilisés peuvent varier
d’un facteur 1 à 100, selon la transformation de l’aliment.

L’eau potable intervient également à tous les niveaux, directement ou indirectement, de

l’industrie pharmaceutique. Elle fait partie des composants essentiels pour la synthèse d’un
principe actif et pour la formulation du produit fini. Le nettoyage des équipements, la
stérilisation du matériel et le conditionnement des médicaments font également appel à
l’utilisation d’eau potable. Cependant, un contrôle qualité poussé, voire un traitement
complémentaire de l’eau issue du réseau public (par irradiation UV ou osmose inverse par
exemple), est préconisé par la Pharmacopée Européenne. D’autres organismes ont un rôle de
recommandation concernant les eaux à usage pharmaceutique tels que les guides BPF de

27
l’organisation mondiale de la santé, la « Parenteral Drug Association » ou la norme ISO
13408-1 « Traitement aseptique des produits de santé -- Partie 1: Exigences générales »
(Boudier 2008). Dans le domaine hospitalier, les risques liés à l’eau sont d’ordre infectieux ou
toxique liés à une contamination microbiologique ou chimique. Ces pollutions peuvent avoir
une origine externe, provenant du réseau public, ou interne suite à une contamination
accidentelle à l’intérieur de l’établissement. L’eau peut donc être vectrice d’agents pathogènes
(Anaissie et al. 2002; Baghal et al. 2013), responsables de maladies nosocomiales
(Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Mycobactéries atypiques) ou toxiques,
pouvant représenter un danger important concernant certains soins tels que la dialyse. Ainsi, à
partir d’une eau potable, trois niveaux de qualité microbiologiquement maîtrisée ont été
définis en vue d’usages spécifiques. L’eau propre concernant le nettoyage des instruments et
lavage des mains à des fins de chirurgie (niveau 1), l’eau ultrapure pour les secteurs protégés,
comme par exemple les unités pour greffés et grands brulés (niveau 2) et l’eau stérile pour le
rinçage de certains appareillages tels que ceux utilisé en endoscopie (niveau 3) (Comité
Technique Régional de l'Environnement Hospitalier 2005).

I.1.1.1.3 Les usages particuliers

Ce type d’usage est principalement lié à une application publique, telle que l’arrosage, le
nettoyage des voies ou autres lieux publics, la lutte contre les incendies, le refroidissement de
procédés mais concerne également ce qui a trait aux loisirs comme les piscines ou centres
sportifs. Concernant les loisirs, 94,4% des établissements avec piscine sont alimentés par de
l’eau potable du réseau public, soit 16643 sur 16570 établissements. Les piscines non
alimentées par l’eau du réseau public le sont par de l’eau souterraine à partir de prélèvements
propres à l’établissement (73%), de l’eau de mer (10%), de l’eau superficielle (8%), de l’eau
minérale naturelle (4%) ou par une autre eau (5%). Par ailleurs, l’ARS stipule qu’un
minimum de 50% de reprise en continu au niveau de la couche d’eau de surface doit être
recyclée pour l’alimentation du bassin avec une surveillance en accord avec le code de la
santé publique D1332-1 à D1332-13 (DGS 2012b).

Les tours aéroréfrigérantes (TAR) sont destinées à refroidir des eaux qui ont été réchauffées
par une source d'énergie telles que la chaleur issue de systèmes climatisation et/ou procédés
industriels. Les TAR tertiaires utilisent majoritairement de l’eau potable comme eau
d’appoint, ne nécessitant pas de traitement avant entrée dans le circuit. Cependant, l’eau
prélevée doit respecter des critères microbiologiques incluant les concentrations en légionelles
et en germes totaux (Ministère de l'écologie et du développement durable 2004). De plus, les
installations raccordées au réseau d'eau potable doivent répondre aux exigences de sécurité
sanitaire prévues pour éviter les risques de pollutions par retours d'eau (Ministère des
Finances 2001).

Une autre partie de l’eau potable est utilisée par les municipalités pour le nettoyage de la
voirie, l’arrosage public, ou lors d’opérations de lutte contre les incendies. La proportion
englobant ces activités en termes de volume utilisé représente environ 3% de l’eau potable
produite (Ministère de l'Ecologie 2008).

28
II. LA QUALITE MICROBIOLOGIQUE DE L’EAU
Le contenu microbiologique de l’eau est extrêmement riche en termes de diversité et de
concentration. Cette qualité dépend directement du climat et de l’environnement spécifiques à
un pays ou une région. Ainsi, comme présenté dans la figure 10, il y a une grande disparité de
la prévalence des agents pathogènes humains dans le monde selon les pays (Dunn et al. 2010).

Figure 10 Densité de la variété d’agents pathogènes par pays. Plus la variété est importante, plus la zone est sombre
(Dunn, 2010).

Le lessivage des sols, l’agriculture, la vie sauvage, l’urbanisation, l’industrialisation et les

rejets de station d’épuration sont des facteurs influençant l'eau superficielle ou souterraine
utilisée pour a production d’eau potable. Malgré les technologies mises en œuvre dans les
usines de potabilisation, certains microorganismes, pathogènes ou non, peuvent se retrouver
au niveau du réseau de distribution et circuler en suspension dans la phase eau (forme
planctonique) et potentiellement former des biofilms c’est-à-dire des communautés complexes
colonisant les surfaces des canalisations et des réservoirs. Concernant la surveillance de l’eau
distribuée, la complexité réside en premier lieu au niveau de la sélection des microorganismes
pertinents, qui doivent être représentatifs du risque sanitaire pour le consommateur. En second
lieu, le choix de la méthode de détection de ces microorganismes présente une difficulté
supplémentaire, car elle doit présenter les performances compatibles avec la matrice eau et le
caractère d’urgence lié à un agent pathogène donné (comme Legionella par exemple).

II.1. LA MICROBIOLOGIE LIEE A L’EAU POTABLE

La qualité microbiologique de la ressource, c’est-à-dire de l’eau naturelle utilisée comme
matière première, présente un enjeu majeur pour la production d’eau potable. En effet, les
microorganismes présents dans l’eau brute peuvent d’une part présenter un risque sanitaire de
par leur caractère pathogène et d’autre part engendrer des dysfonctionnements au niveau
d’une usine de traitement suite à un développement potentiel au sein de la filière. Le
traitement appliqué, le délai de stockage avant distribution et l’état du réseau de distribution
ont également un impact déterminant sur la qualité finale de l’eau délivrée au consommateur.
Par ailleurs, d’autres sources peuvent participer à l’apport de microorganismes, tels que des
accidents ou des interventions de maintenance sur le réseau, voire des actions malveillantes. Il
est important de souligner qu’au regard de la large gamme de microorganismes constituant la
flore liée à l’eau potable, l’impact du traitement au sein d’une filière et la survie dans les
canalisations, seront très différentes selon les types de microorganismes et les espèces

29
Groupe Genre/espèce Catégorie Pathologie
Bactéries Legionella pneumophila Pathogène Infections respiratoires
Pseudomonas aeruginosa Pathogène Infections respiratoires, urinaires et cutanées

2003)
Mycobacteria (complexe) Pathogène Infections respiratoires

Tableau 2
Helicobacter pylori Pathogène Gastrite, ulcère, cancer
Campylobacter Pathogène Diarrhée, gastro-entérite
Yersinia Pathogène Diarrhée, arthrite
Salmonella typhimurium Pathogène Typhoïde, parathyphoïde
Vibrio cholerae Pathogène Cholera, gastro-entérite
Shigella Pathogène Dysentrie
Escherichia coli Pathogène/Indicateur na
Enterocoques Pathogène/Indicateur na
(Ashbolt 2015; Hunter 2003).

Clostridium perfringens Pathogène/Indicateur na

Virus Adenovirus Pathogène Gastro-entérite
Enterovirus Pathogène Gastro-entérite
Virus de l'hépatite A Pathogène Hépatite
Virus de l'hépatite E Pathogène Hépatite
Rotavirus Pathogène Gastro-entérite
Sapovirus Pathogène Gastro-entérite
Astrovirus Pathogène Gastro-entérite
Norovirus Pathogène Gastro-entérite
Phages ARN-F spécifiques Indicateur na
Coliphages somatiques Indicateur na
Bacteroides Indicateur na
Protozoaires Giardia duodenalis Pathogène Gastro-entérite
Cryptosporidium parvum Pathogène Gastro-entérite
Toxoplasma gondii Pathogène Fausse-couche, rétinites, encéphalites
Entamoeba histolitica Pathogène Dysentrie
Naegleria fowleri Pathogène Méningo-encéphalites
Acanthamoeba Pathogène/vecteur Encéphalites, kératites
Hartmannella Pathogène/vecteur Encéphalites, kératites
Cyanotoxines Microcystines Toxine Gastro-entérite, hépatite, dermatite, pneumonie, cancer
Nodularines Toxine Gastro-entérite, hépatite, dermatite, pneumonie, cancer
Cylindrospermopsines Toxine Gastro-entérite, hépatite, dermatite, pneumonie, anorexie
Saxitoxines Toxine Démangeaisons, engourdissement, somnolence, paralysie respiratoire
Anatoxines Toxine Démangeaisons, engourdissement, somnolence, paralysie respiratoire, arythmie cardiaque
d’efficacité de traitement et les cyanobactéries et microalgues productrices de toxines
de l’eau potable, incluant les agents pathogènes, les indicateurs de pollution fécale ou
présents. Le tableau 2 présente les principaux paramètres biologiques d’intérêt liés à la qualité

Principaux paramètres biologiques relatifs à l’eau potable et à la santé humaine (Ashbolt, 2015 ; Hunter,

30
II.1.1. Les bactéries

Les bactéries sont des microorganismes unicellulaires procaryotes qui constituent la majorité
de la biomasse trouvée au sein des réseaux de distribution d'eau potable, estimée à 108 cellules
bactériennes par litre (Sibille et al. 1998). Certaines espèces bactériennes retrouvées dans
l’eau peuvent présenter une pathogénicité pour l’Homme et d’autres dites saprophytes sont
inoffensives et consomment les déchets organiques mais n’ont pas la capacité de se
développer ni de provoquer une infection.

II.1.1.1 Les différents états physiologiques

Les résultats de quantification de la biomasse bactérienne de l’eau sont très variables selon la
technique utilisée. Ces variations sont liées à l’existence de différents états physiologiques des
bactéries présentes dans l’eau. Ainsi, il y a plus de cellules microbiennes dans l’eau que ce
qu’il est possible de faire croître via un ensemencement sur milieu de culture in vitro (nombre
de bactéries viables cultivables). Le nombre de bactéries viables cultivables est estimé entre
0,1% et 10%, en comparaison du nombre de bactéries totales mesurées par microscopie
(Vives-Rego et al. 2000). En effet, la culture quantifie les cellules bactériennes hétérotrophes,
c’est-à-dire qui peuvent se multiplier et former des colonies et ce, dans les conditions qui leur
sont imposées en termes de nutriments et/ou de température. Or, une partie des bactéries
hétérotrophes peuvent être viables mais ne pas donner naissance à des colonies lors
d’ensemencements sur milieu gélosé et une forte proportion des bactéries de l’environnement
sont oligotrophes ou autotrophes et ne peuvent pas cultiver sur les milieux usuels (Wang et al.
2010a).

Les bactéries n’étant pas capables de former des colonies dans de telles conditions, sont
appelées bactéries viables non-cultivables (VNC). Ces dernières peuvent néanmoins avoir une
machinerie cellulaire toujours active, ce qui rend possible leur éventuelle pathogénicité pour
l’homme. Par ailleurs, en plus de ne pouvoir quantifier les VNC, la culture requiert un délai
d’un à deux jours minimum voir de bien plus pour certaines espèces avant de livrer le résultat.
Ce délai n’est pas compatible avec une gestion active des risques sanitaires. Dans
l’environnement, trois principaux états physiologiques peuvent être distingués au sein des
populations microbiennes :

 les bactéries viables et actives, qui ont un rôle fonctionnel et participent à la

production de biomasse

 les bactéries viables mais inactives, qui ne participent pas à la production de biomasse
mais qui peuvent potentiellement le faire

 les bactéries mortes, n’ayant plus d’intégrité membranaire ni d’activité métabolique

31
La figure 11 schématise les différentes fractions d’une population bactérienne en terme d’état
physiologique lié à a viabilité :

Figure 11 Les différents états physiologiques des bactéries dans l’environnement

Cependant, le fait que les bactéries VNC possèdent encore un potentiel infectieux est
controversé (Barer et al. 2000; Oliver 2010). Des études ont montré que des salmonelles VNC
pouvaient infecter des souris alors que d'autres études, réalisées sur des légionnelles, ont
apporté des conclusions mitigées (Alleron et al. 2013; Steinert et al. 1997). Par ailleurs, l’état
VNC peut être transitoire et les bactéries peuvent revenir à un statut de bactéries cultivables
après un délai plus ou moins long (Tamburini et al. 2014).

Parmi les bactéries viables mais inactives, on peut également distinguer le cas des spores.
Celles-ci se forment au sein même de la cellule bactérienne végétative (endospore) dans des
conditions défavorables telles qu’une carence en nutriments, suite à un processus de
différenciation. Ce phénomène complexe conduit à la formation d'endospores dormantes, qui
sont en mesure de survivre pendant de longues durées (Cano and Borucki 1995). Ce
phénomène est réversible car les spores peuvent revenir à la forme végétative lorsqu’elles se
trouvent dans des conditions favorables et ainsi donner naissance à des colonies après
ensemencement sur milieu gélosé adéquat.

La résistance globale des spores est liée à de multiples facteurs et propriétés telles que
l’épaisseur de leur paroi qui procure une résistance à de nombreux biocides, l’état de
déshydratation du cytoplasme permettant de résister à la chaleur, la saturation de l’ADN par
des protéines SASP protégeant des UV, la faible perméabilité de la membrane interne aux
molécules hydrophiles et la capacité de réparation de l’ADN lorsque la spore retourne à l’état
végétatif (Setlow 2006; Young and Setlow 2003).

32
II.1.1.2 Les bactéries pathogènes
La flore bactérienne présente au niveau des réseaux de distribution peut inclure des bactéries
pathogènes, sous forme végétative ou sporulée. Le risque de contamination est possible soit
par ingestion, soit par exposition cutanée ou par inhalation, selon le mode d’action de l’espèce
incriminée.

II.1.1.2.1 Les bactéries responsables de maladies nosocomiales

Les infections nosocomiales restent à ce jour un problème majeur de santé publique. L’eau
potable peut jouer un rôle de réservoir et de vecteur de ces infections car plusieurs bactéries
agents majeurs d’infections nosocomiales ont en commun la capacité à se multiplier et
survivre dans les réseaux intérieurs de distribution d’eau et ce malgré les procédés de
désinfection et dans certains cas les températures élevées. Les trois genres prépondérants en
cause sont Pseudomonas, Legionella et Mycobacterium (Falkinham, III et al. 2015;
Falkinham et al. 2015; Lu et al. 2015).

Les Pseudomonas sont des bactéries de l’environnement (sols, eaux) aérobies Gram négatif
oxydase positive, de 2 à 4 μm de longueur, mobiles par flagellation polaire qui se développe
in vitro sur milieu usuel (Falkinham et al. 2015). Pseudomonas aeruginosa est un pathogène
opportuniste causant des infections principalement chez les personnes aux défenses
immunitaires déficientes (patients en soins intensifs, grands brûlés, patients en chirurgie, etc.)
et des infections respiratoires chez les patients atteints de mucoviscidose. P. aeruginosa peut
coloniser les voies respiratoires inférieures et causer des infections pulmonaires de gravité
variable mais peut aussi coloniser facilement les brûlures et les plaies ouvertes, causant des
infections cutanées, des abcès et une septicémie (Di Martino et al. 2002; Fromantin et al.
2013). P. aeruginosa est une bactérie présentant fréquemment une multirésistance aux
antibiotiques et parfois aux antiseptiques, ce qui complique la prise en charge des patients
infectés. Cette bactérie peut être présente et survivre sur des appareils et équipements
médicaux, augmentant le risque d’infections nosocomiales. D’ailleurs, des espèces du genre
Pseudomonas sont omniprésentes dans l’environnement et peuvent survivre durant des mois
sur des surfaces sèches et des objets divers, l’humidité pouvant accroître leur persistance. P.
aeruginosa peut également survivre dans des microgouttelettes isolées et en suspension dans
des aérosols, d’où le risque de transmission par voie aérienne.

Une des principales voies de transmission est le contact avec de l’eau contaminée voire des
solutions antiseptiques contaminées, les voies de transmission présentant les plus grands
risques pour la santé étant l’exposition cutanée et l’exposition pulmonaire à des aérosols
inhalés après projection par des personnes infectées hors de leurs voies respiratoires. P.
aeruginosa peut produire de nombreuses toxines et enzymes extracellulaires et exprime
plusieurs protéines ou hétéropolymères protéiques de surface impliqués dans son adhérence
aux surfaces biologiques et inertes et sa formation de biofilm. P. aeruginosa est
particulièrement efficace pour former des biofilms sur différents types de surfaces, ces
biofilms étant en lien avec le développement d’infections à Pseudomonas (Mace et al. 2008).

33
Legionella pneumophila est une bactérie hydrotellurique Gram négatif aérobie stricte de 0,3 à
0,9 µm de large et de 2 à 20 µm de long qui présente des exigences nutritives et requiert
l’usage de gélose spécialisées additionnées de cystéine, fer, et charbon. L. pneumophila peut
entraîner une forme grave de pneumonie dont les symptômes comprennent céphalées,
diarrhée, douleurs abdominales, fièvre, frissons, myalgie et toux sèche. Le taux de mortalité
signalé est de 15 à 25 %. L. pneumophila présente peu de résistance aux antibiotiques. Au sein
des différentes espèces de légionelles, 85 à 90 % des cas peuvent être attribués à Legionella
pneumophila et particulièrement le sérogroupe 1 (61 à 88% des cas signalés). L’infection peut
être transmise principalement par des aérosols et par aspiration d'eau contaminée mais il n’y a
pas de contamination interhumaine et la période d'incubation est de 2 à 14 jours. L.
pneumophila se trouve naturellement dans la plupart des sources d'eau douce, y compris les
lacs, les étangs et les rivières. On trouve cette bactérie au niveau des tours aéroréfrigérantes,
les systèmes de production et de distribution d’eau chaude sanitaire (plomberie, chauffe-eau,
pommeau de douche), des piscines, fontaines, eaux thermales. L. pneumophila peut survivre
plusieurs mois dans l'eau de réseau et les biofilms sur les parois des réseaux. La formation de
biofilm est un des éléments centraux de cette persistance des légionelles dans les
environnements artificiels (tours aéroréfrigérentes, systèmes de distribution d’eau potable,
etc.). Des protozoaires (amibes, ciliés) sont le siège d’une réplication intracellulaire de
Legionella et constituent donc des amplificateurs et des systèmes naturels de protection pour
ces bactéries.

Les mycobactéries sont des bactéries acido-alcoolo-résistantes qui ne se colorent pas au

Gram, immobiles, de 2 à 5 microns de long sur 0,2 à 0,3 microns de large. Les mycobactéries
sont des germes exigeants à croissance lente qui nécessitent l’usage de milieux de culture
spécialisés. On distingue les mycobactéries tuberculeuses capables de provoquer des
infections pulmonaires, via une contamination orale ou respiratoire des mycobactéries non
tuberculeuses également qualifiées d’atypiques capables de causer des infections respiratoires,
cutanées, ostéo-articulaires, des ganglions lymphatiques et systémiques (Falkinham et al.
2015). Le groupe de mycobactéries lié à l’eau potable correspond aux « mycobactéries non-
tuberculeuses » en excluant l’espèce Mycobacterium leprae responsable de la lèpre. Il a été
démontré que des mycobactéries peuvent survivre et surtout proliférer dans les réseaux
(Falkinham, III et al. 2001; Feazel et al. 2009) du fait d’une plus forte concentration dans les
réseaux de distribution par rapport à celle estimée au niveau des filières de potabilisation. La
présence de ces bactéries a été mise en évidence au niveau d’établissements de santé
(Falkinham, III 2010; von Reyn et al. 1993) mais également dans les circuits de tours
aéroréfrigérantes (Torvinen et al. 2014). Des mycobactéries ont été détectées dans 92% des
échantillons d’eau de tours aéroréfrigérantes, démontrant que, à l’instar des légionelles, cette
matrice est propice au développement des mycobactéries. Les mycobactéries atypiques sont
particulièrement résistantes aux traitements de désinfection classiques (UV et chlore) grâce à
leur paroi particulière et forment des biofilms dans les réseaux d’eau.

34
II.1.1.2.2 Les bactéries responsables de gastro-entérites
Les genres Shigella et Salmonella sont à l’origine de nombreuses épidémies de maladies
gastro-intestinales, allant de la simple diarrhée à la dysenterie (Hsu et al. 2007). Présentes
dans les matières fécales animales (Salmonella non typhiques) ou humaines (Shigella et
Salmonella typhiques et non typhiques) selon les espèces, ces bactéries sont drainées par les
événements pluvieux directement au niveau des eaux de ressources à partir de zones
d’élevage ou d’une contamination fécale d’origine humaine. De même, les genres
Campylobacter et Yersinia proviennent également du tractus intestinal d’animaux
domestiques et sauvages et ont été responsables d’épidémies notables. En effet, d’après deux
études, au Canada et en Grande-Bretagne, il a été montré que, sur près de 300 événements,
Campylobacter est le second agent pathogène (après les parasites Giardia et
Cryptosporidium) à l’origine d’épidémies de gastro-entérites (Hunter 2003; Schuster et al.
2005).

II.1.1.3 Les bactéries indicatrices

Plusieurs critères doivent être respectés pour pouvoir utiliser un indicateur biologique en vue
de prédire la présence ou l’absence de pathogènes. Le comportement (y compris la résistance
aux traitements physiques et chimiques) de l’indicateur et du microorganisme pathogène cible
doivent être similaires ou bien l’indicateur doit être au moins plus difficile à traiter.
L'organisme indicateur doit également être facile à mesurer et doit toujours être présent à des
concentrations suffisamment élevées pour permettre de calculer un abattement. De ce fait, les
exploitants pourront veiller à ce que l’abattement d’un tel indicateur soit supérieur à celui
nécessaire pour le pathogène d’intérêt (Verhille et al. 2003). La présence de certaines
bactéries peut être associée à un événement de pollution fécale suggérant la présence possible
de certains agents pathogènes, cependant, son absence n'indique pas qu'il n'y a pas présence
de pathogènes. Leur présence dans l’eau produite en sortie d’usine indique un
dysfonctionnement important au sein du processus de traitement.

II.1.1.3.1 Les coliformes thermotolérants

Les coliformes totaux appartiennent à la famille des entérobactéries incluant entre autres les
genres Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter et Serratia (Leclerc et al. 2001)
dont l’une des caractéristiques principale commune est l’activité de l’enzyme ß-galactosidase
(hydrolyse du lactose). Ce sont donc des bacilles Gram négatif, oxydase négative, mobiles par
flagellation péritriche (à part Klebsiella), qui cultivent sur gélose ordinaire. Un sous-groupe
des coliformes totaux est constitué de bactéries capables de se multiplier et d’hydrolyser le
lactose à une température de 44 à 45°C, appelé coliformes thermotolérants, considérés comme
indicateurs de pollution fécale. Les représentants de ce groupe ne sont pas pathogènes, à
l’exception de certaines souches d’Escherichia coli capables de produire des toxines,
d’adhérer ou d’envahir l’épithélium gastrointestinal et d’entrainer des pathologies telles que
des gastro-entérites, et le syndrome hémolytique urémique (Kaper et al. 2004). Une étude
basée sur la présence ou l’absence de coliformes et d’Escherichia coli a permis de modéliser
l’exposition des consommateurs à une contamination fécale au niveau mondial et ont montré
que 10% des sources présentait un risque avec une prépondérance en milieu urbain (Bain et
al. 2014).

35
II.1.1.3.2 Les entérocoques intestinaux
Les entérocoques sont également des marqueurs biologiques de la présence d’une pollution
fécale. Ce sont des coques Gram positif, catalase négative, anaérobies aérotolérants,
immobiles qui cultivent sur gélose ordinaire. Ce groupe de microorganismes apporte une
information complémentaire à celle obtenue via la détection des coliformes thermotolérants,
principalement liée au fait qu’ils présentent un niveau élevé de survie dans des conditions
environnementales hostiles telles qu’une forte salinité (6,5% NaCl) ou une importante
variation de pH (4,4 à 9,6) (Ana Aguilar-Galvez et al. 2007). Ces bactéries mésophiles
peuvent se développer dans une gamme de température située entre 10 et 45°C mais peuvent
résister à une température de 60°C durant 30 minutes. Ces différentes propriétés expliquent
leur caractère ubiquiste avec une présence au niveau de différentes matrices telles (eau douce,
eau de mer ou les eaux usées) et du tractus gastro-intestinal des animaux à sang chaud et de
l’Homme. Les espèces les plus représentatives de tractus humain sont Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium et Enterococcus durans avec une mise en évidence au niveau de l’eau
de distribution d’E. faecalis et E. faecium (Grammenou et al. 2006). Ces deux espèces
peuvent présenter une pathogénicité humaine, la majorité des cas étant imputable à E. faecalis
(Ana Aguilar-Galvez et al. 2007). E. faecalis peut causer des infections urinaires, des
endocardites, des suppurations diverses.

II.1.1.4 Les spores de Clostridium perfringens

Clostridium perfringens est un bacille pléomorphe de 1 à 1,5 µm de diamètre (figure 12),
Gram positif, catalase négative, en paires ou en chainettes courtes, anaérobie aérotolérant,
sporulé. C. perfringens cultive facilement dans des milieux complexes à base de peptones.

Figure 12 Observations microscopique de différentes souches de C. perfringens

Du fait de leur forte résistance à la désinfection, les endospores ont été suggérées comme
indicateurs potentiels pour Cryptosporidium, en grande partie à cause leur résistance aux
désinfectants aux conditions environnementales (Chauret et al. 2001). Les eaux de distribution
doivent ainsi respecter un seuil de 0 spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices pour
100 ml au point de mise en distribution et également au robinet du consommateur. Ce
paramètre doit être particulièrement suivi lorsqu’une eau de ressource est d’origine
superficielle ou influencée par une eau d’origine superficielle. En cas de non-respect de cette
valeur seuil au niveau de l’eau potable, une enquête doit être menée sur la distribution pour

36
s’assurer qu’il n’y a aucun danger potentiel pour la santé humaine résultant de la présence de
microorganismes pathogènes, tels que Cryptosporidium (décret N°2001-1220). Les spores de
C. perfringens résistent aussi bien que les virus entériques au traitement de l'eau potable une
étude a établi un lien direct entre les virus et C. perfringens dans des sources d'eau polluées
(Payment and Franco 1993). Cependant, même s’il est considéré principalement comme un
indicateur, le genre Clostridium regroupe près de 200 espèces, et quelques-unes sont
pathogènes pour l’humain. C. perfringens produit et sécrète de nombreuses toxines et
enzymes hydrolytiques. Au sein de l’espèce C. perfringens, il existe 5 sérotypes toxigènes (de
A à E), dont seulement deux (A et C) sont pathogènes pour l’humain (Li et al. 2013). C.
perfringens cause des intoxications alimentaires et des entérites nécrotiques chez l’homme.
Les intoxications alimentaires à C. perfringens surviennent uniquement après consommation
d'aliments fortement contaminés par une souche entérotoxinogène.

II.1.2. Les virus

Les virus ne peuvent pas être qualifiés de microorganismes au sens strict du terme, du fait
qu’ils ne possèdent pas de machinerie cellulaire et n’appartiennent donc pas au vivant. Par
conséquent, les virus peuvent être assimilés à des « particules biologiques ». Leur mode
d’action nécessite une cellule hôte, à l’intérieur de laquelle est injecté le matériel génétique
viral qui permettra la réplication via le métabolisme de la cellule infectée. On parle de
« particules infectieuses». Les virus sont donc des parasites obligatoires qui ne peuvent que
survivre en dehors de leur hôte.

II.1.2.1 Les virus entériques

Les virus entériques associés à des maladies humaines d'origine hydrique comprennent les
adénovirus, astrovirus, norovirus, hépatovirus, rotavirus et entérovirus, ce dernier genre
incluant poliovirus, virus Coxsackie et echovirus (Borchardt et al. 2012). Même s'ils ne
peuvent se multiplier dans l'environnement, les virus peuvent survivre plus longtemps dans
l'eau que la plupart des bactéries intestinales et sont hautement résistants à la désinfection.
Ces virus entériques sont excrétés en grandes quantités dans les matières fécales des sujets
humains et animaux infectés qui peuvent contenir de 105 à 1011 virus par gramme. Les eaux
souterraines peuvent être contaminées par l'évacuation d'eaux usées domestiques ou de boues
sur les sols, par des effluents provenant de champs d'épandage des eaux de fosses septiques et
par l'infiltration d'eaux de surface. De fortes précipitations peuvent entraîner des
contaminations massives d’eau de surface et d’eaux souterraines à partir d’eaux usées. Par
exemple, la présence d’agents pathogènes et en particulier d’adénovirus a été mise en
évidence dans des eaux de source lors d’une épidémie affectant 1450 personnes aux Etats-
Unis en 2004 (Fong et al. 2007). Par ailleurs, une étude a mis en évidence une meilleure
survie de rotavirus et astrovirus dans l’eau souterraine par rapport à l’eau de surface (Espinosa
et al. 2008). Par contre, les auteurs montrent également que le rotavirus présente une
résistance plus importante dans les 2 types d’eau, suggérant que la survie des virus peut
dépendre de sa nature mais également du type d’eau. Les rotavirus ont été utilisés dans
plusieurs évaluations des risques liés à la qualité de l'eau (Gerba et al. 1996; Westrell et al.
2003). Ils sont reconnus dans le monde entier comme étant une cause importante de
gastroentérites virales et ont une infectivité relativement élevée comparativement à d'autres

37
virus d'origine hydrique. Il a été suggéré que les adénovirus soient utilisés comme virus de
référence, car ils causent un large éventail d'infections (notamment des infections entériques
et respiratoires). Une étude confirme que les adénovirus, notamment l'adénovirus 40, sont les
virus entériques les plus résistants à l'inactivation par rayons ultraviolets (UV) (Nwachcuku
and Gerba 2004). Il a été démontré que, même s'ils provoquent des maladies moins graves
que les rotavirus, les norovirus sont la cause prévalente de maladies gastro-intestinales dans
les régions industrialisées (Maunula 2005). Par ailleurs, les adénovirus sont les virus retrouvés
le plus fréquemment dans les eaux de ressources utilisées en vue d’une production d’eau
potable.

II.1.2.2 Les bactériophages

Les virus entériques étant difficiles à détecter directement dans l'eau, des substituts ont été
choisis afin d'évaluer l'efficacité du traitement de l'eau. Les bactériophages font partie de ces
indicateurs. Par ailleurs, des bactériophages spécifiques de bactéries fécales peuvent être
utilisés comme indicateurs de contamination fécale. Les bactériophages sont des virus qui
infectent spécifiquement et exclusivement certaines bactéries présentant de nombreuses
caractéristiques et propriétés communes avec les virus entériques, tels que la structure, la
composition, la morphologie, la taille. Compte tenu de ces caractéristiques, les bactériophages
sont particulièrement utiles en tant que modèles pour évaluer le comportement et la survie des
virus entériques dans l'environnement ou en tant que substituts afin d'évaluer leur résistance
face au processus de traitement de l’eau (Boudaud et al. 2012; Grabow 2001; Havelaar et al.
1993; Jofre et al. 1995; Mendez et al. 2004). Trois types de bactériophages sont proposés
comme indicateurs : les coliphages somatiques (ex: PhiX174), les bactériophages à ARN-F
spécifiques (ex: MS2) et les phages de Bacteroides fragilis (ex: B40-8). Ces types de
bactériophages naturellement présents dans l’environnement sont utilisés en tant
qu’indicateurs de pollution fécale. Les coliphages somatiques constituent un ensemble très
hétérogène, infectant certaines souches d’E. coli par adsorption sur des récepteurs présents au
niveau des parois cellulaires. Certaines études ont démontré la possibilité pour ces coliphages
de se multiplier dans l’environnement en présence de leur bactérie (Leclerc et al. 2000).
Cependant, la faible spécificité humaine, leur multiplication possible dans l’environnement
constituent des inconvénients pour l’utilisation de ce type de phages comme indicateur de
contamination virale mais ils ont l’avantage d’être abondants dans les selles. Les
bactériophages à ARN F-spécifiques qui appartiennent à la famille des Leviviridae infectent
certaines souches de bactéries exprimant le facteur F ou pili sexuels. Au niveau de leur
multiplication potentielle dans l’environnement, les avis sont partagés : d’après une étude, les
pili sexuels ne se formant pas à des températures inférieures à 30°C, ces phages ont de faibles
chances de se multiplier dans l’environnement (Grabow 2001) et d’après une autre étude, les
bactériophages ARN-F spécifiques sont suspectés de pouvoir se développer dans
l’environnement du fait de leur spécificité à un pili et non à une souche hôte spécifique
(Leclerc et al. 2000). Une étude souligne l’existence d’une corrélation significative entre les
bactériophages ARN F-spécifiques et les virus entériques pathogènes dans la plupart des
environnements à l’exception des eaux usées (Havelaar et al. 1993). Les bactériophages à
ARN F-spécifiques pourraient donc constituer de bons indicateurs de contamination fécale
animale et humaine. Bacteroides fragilis est un hôte normal du tractus intestinal de l’homme

38
et des animaux à sang chaud. L’utilisation des phages de Bacteroides fragilis (famille des
Siphoviridae) en tant qu’indicateur de contamination virale a été initialement proposée du fait
qu’il est apparu que les phages de l’espèce Bacteroides fragilis HSP40 étaient très spécifiques
des fèces de l’homme (Tartera et al. 1989). De nombreuses études ont montré que ce phage
n’était pas retrouvé dans les selles d’animaux (Tartera and Jofre 1987). De par la faible
résistance de la bactérie hôte (Bacteroides fragilis), dans l’environnement, ce type de phage
ne peut pas se multiplier dans l’environnement et les phages de Bacteroides fragilis HSP40
n’ont pu être détectés que dans des eaux polluées par des selles humaines.

II.1.3. Les protozoaires

Les protozoaires parasites sont des microorganismes unicellulaires eucaryotes se multipliant
uniquement dans le tractus gastro-intestinal de leurs hôtes pouvant entrainer des protozooses
intestinales et peuvent se présenter, en plus de leur forme végétative, sous des formes
résistantes appelées kystes ou oocystes. On peut distinguer les protozoaires flagellés
(Giardia), les sporozoaires (Cryptosporidium), les rhizopodes (Naegleria) et les
microsporidies (Encephalitozoon, Enterocytozoon). Le mode de transmission est la voie orale
suite à une baignade dans des eaux de surface ou suite à la consommation d’eau potable
contaminée. Concernant l’eau potable, la problématique est principalement liée, d’une part,
aux parasites protozoaires pathogènes Giardia duodenalis et Cryptosporidium parvum et
d’autre part aux amibes, capable d’héberger certains pathogènes.

II.1.3.1 Les protozoaires entériques

Cryptosporidium parvum et Giardia duodenalis font partie des protozoaires entériques qui
sont le plus souvent associés aux maladies d'origine hydrique dans les pays industrialisés
comme la France (Hunter 2003; Schuster et al. 2005). Cryptosporidium parvum est résistant à
la chloration et se révèle l'un des agents pathogènes humains d'origine hydrique les plus
répandus dans les pays industrialisés. Cryptosporidium parvum est un parasite obligatoire
intracellulaire des entérocytes de mammifères. Cette espèce est subdisvisée en deux
génotypes distincts, incluant le génotype I, Cryptosporidium hominis, spécifique de l’humain
et le génotype II spécifique des bovins mais pouvant également contaminer l’Homme (Fayer
2004). La forme résistante, appelée oocyste, est celle pouvant être retrouvée dans l’eau de
distribution et être responsable de graves épidémies, la plus importante reportée étant celle de
Milwaukee en 1993 (Glaberman et al. 2002; Mac Kenzie et al. 1994; Mackenzie et al. 1995).
En effet, sous cette forme, ces microorganismes sont capables de survivre durant une longue
période dans différentes matrices hydriques, particulièrement à basse température (Fayer et al.
1998; Robertson et al. 1992). Même s’il est plus sensible au stress environnemental et aux
traitements par rapport à Cryptosporidium, Giardia duodenalis est un autre protozoaire
pathogène, également responsable d’un nombre important d’épidémies liées à l’eau potable
(Hunter 2003; Hunter and Thompson 2005). La forme résistante, appelée kyste, est la forme
contaminante par l’eau, des aliments crus souillés ou de manière manu-portée. Une étude
basée sur la corrélation entre Escherichia coli et ces deux parasites pathogènes à partir de
données de surveillance d’installation de distribution d’eau potable en France et Grande-
Bretagne a permis de mettre en lumière un risque élevé d’exposition, allant jusqu’à 28% pour
Cryptosporidium (Hunter et al. 2011).

39
II.1.3.2 Les amibes
Les amibes peuvent se présenter sous deux formes distinctes ; libre ou enkystée. Les genres
responsables d’infections opportunistes et non-opportunistes pour les humains sont
Acanthamoeba, Naegleria, Balamuthia et Sappinia. Cependant, les cas d’encéphalites, de
méningoencéphalites ou de kératites ne sont pas souvent reportés, le plus souvent liés à des
activités de baignade ou au port de lentilles. Entamoeba histolitica est également une espèce
responsable de milliers de cas d’infection à travers le monde, principalement au niveau des
pays en voie de développement. Outre le fait que certaines amibes présentent un caractère
infectieux, une problématique majeure liée aux amibes est le fait qu’elles sont capables
d’héberger et de protéger des bactéries potentiellement pathogènes responsables de maladies
nosocomiales ou de gastro-entérites (Codony et al. 2012; Delafont et al. 2013; Delafont et al.
2014). Les deux principaux représentants de ce groupe au niveau de l’eau potable ayant la
capacité d’héberger des bactéries pathogènes sont Hartmanella (Delafont et al. 2013; Kuiper
et al. 2006) et Acanthamoeaba (Lu et al. 2015; Steinert et al. 1997) mais également
Vermamoeba, Echinamoeba et Protacanthamoeba (Delafont et al. 2014). En effet, comme les
amibes libres se nourrissent de bactéries, la présence de biofilms est propice à leur
prolifération et à l’accumulation d’agents pathogènes à l’intérieur de ces dernières. Les
formes enkystées quant à elles, permettent de protéger les bactéries pathogènes ingérées
contre les différentes barrières de traitement de l’eau. Ces deux phénomènes permettent à des
bactéries pathogènes d’accéder au réseau de distribution, d’y survivre, voire de s’y multiplier,
augmentant ainsi le risque sanitaire pour le consommateur (Codony et al. 2012).

II.1.4. Les microalgues

Les différents milieux aquatiques peuvent contenir des algues, organismes autotrophes,
benthiques et pélagiques, c’est-à-dire fixes et libres, respectivement. Les algues pélagiques
sont également appelées microalgues, divisées en deux sous-ordres ; eucaryotes et
procaryotes. Concernant l’eau potable, les microalgues procaryotes, ou cyanobactéries,
présentent un intérêt majeur du fait que ce sont des microorganismes producteurs de toxines
(cyanotoxines).

II.1.4.1 Les microalgues eucaryotes

Les microalgues eucaryotes ne présentent généralement pas de risque pour la santé et sont
considérées comme de bons indicateurs concernant l’écotoxicité d’un milieu naturel, comme
par exemple l’impact de la présence de métaux lourds (De Schamphelaere et al. 2014;
Rickwood et al. 2015). Plus particulièrement, les diatomées sont utilisées comme indicateurs
biologiques de la qualité d’une eau pouvant servir de ressource, au regard des variations de
concentration et des changements de populations. Par contre, une prolifération excessive
également appelée efflorescence algale peut conduire à une anoxie du milieu induisant une
surmortalité chez les poissons notamment. De plus, certaines algues eucaryotes marines
appelées dinoflagellés (Gonyaulax, Pfiesteria, Dinophysis) sécrètent des toxines qui
s’accumulent dans les coquillages les rendant impropres à la consommation (Reguera et al.
2014).

40
II.1.4.2 Les microalgues procaryotes
La principale problématique associée aux microalgues concerne les cyanobactéries capables
de se développer sous forme d’efflorescences algales (blooms) au niveau des ressources pour
la production d’eau potable, souvent corrélées avec les variations climatiques saisonnière
(Boopathi and Ki 2014; Cheung et al. 2013; Duy et al. 2000). En effet, ce phénomène a pour
conséquence d’engendrer une potentielle perturbation du traitement en cas de forte charge de
l’eau de ressource et peut potentiellement entrainer le passage de cyanobactéries dans l’eau
traitée. Cependant, la présence d’algues dans le réseau de distribution reste extrêmement rare
et l’absence de lumière solaire dans les réseaux limite l’impact de cette présence. Le réel
problème lié aux cyanobactéries est dû au fait que les toxines produites puissent passer au
travers de la filière de traitement et se retrouver dans l’eau distribuée, entrainant ainsi un
risque sanitaire.

Les principales toxines produites par les cyanobactéries sont les microcystines, anatoxines,
saxitoxines, cylindrospermopsines et debromoapysiatoxines réparties par classes d’effet
incluant les neurotoxines, hépatotoxines, cytotoxines et endotoxines (Funari and Testai 2008;
Suzuki et al. 2013). L’OMS a établi une valeur guide de 1 µg/L pour la microcystine-LR
concernant la production d’eau potable. Plusieurs cas importants d’infections collectives liées
à des cyanotoxines présentes dans l’eau de distribution, reportées dès 1931 (Cheung et al.
2013). Les causes de ces différents événements majoritairement dus à des efflorescences
algales massives au niveau des eaux de surfaces, entrainant une insuffisance du traitement
des usines de potabilisation, a une contamination de réservoir suite à une inondation ou à une
connexion accidentelle d’un réseau de distribution avec une eau de rivière non-traitée
(Cheung et al. 2013).

II.1.5. Le biofilm
Les biofilms sont des structures complexes composées d'une communauté microbienne
englobée dans une matrice polymérique qui se développe à une interface solide-liquide ou
liquide-air. Les biofilms sont omniprésents dans les systèmes de production et de distribution
d'eau potable, parfois bénéfiques (filtres à sable, filtres à charbon actif), parfois délétères
(membranes de filtration d’eau, canalisations, réservoirs). Ce développement de biofilm est
observé malgré la nature oligotrophe du milieu et la présence de chlore libre (Hallam et al.
2001; Lehtola et al. 2004). Une partie de la flore microbienne de l’eau (bactéries
hétérotrophes en particulier) s'adapte à cet environnement oligotrophe, et peut ainsi coloniser
l'ensemble d'un réseau de distribution d'eau potable en s'organisant sous forme de
microcolonies plus ou moins dispersées mélangées à des produits de corrosion et des
précipités inorganiques.

Le développement de biofilm est inévitable dans les réseaux de distribution d'eau potable car
ils sont continuellement exposés à un flux de matière organique biodégradable et de
microorganismes divers (bactéries, champignons, protozoaires...), provenant de l'usine de
traitement mais aussi d'incidents (cassures et/ou réparations) sur le réseau lui-même. On peut
cependant diminuer le développement de biofilm en limitant la concentration en carbone
dissout biodégradable dans l’eau et en traitant l’eau par irradiation UV (Marconnet et al.
2009; Marconnet et al. 2011). Les circuits des tours aéroréfrigérantes sont également sujets à

41
la formation de biofilms, pouvant être favorable à des problèmes sanitaires (légionelles) ou
énergétique. Une étude a également mis en évidence le fait que certaines espèces bactériennes
(Flavobacterium) présentaient une capacité supérieure à d’autres (Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella pneumoniae) en ce qui concerne l’adhésion aux surfaces, leur conférant ainsi une
meilleure protection face à la désinfection (Liu et al. 2011).

II.1.5.1 La formation du biofilm

Un biofilm se forme lorsque les bactéries adhérant aux surfaces en milieux aqueux
s’organisent en microcolonies et excrètent une matrice permettant leur ancrage à tous les
types de matériaux constituant les canalisations tels que le PVC, l’acier inoxydable, le
polyéthylène ou le ciment (Allison D.G. 1998; Batté et al. 2004; Mathieu et al. 2014), les
membranes filtrantes (Houari et al. 2008; Houari et al. 2010) ou la surface des tours
aéroréfrigérantes (Mouchtouri et al. 2010). Cette conformation leur procure également une
résistance aux antimicrobiens 10 à 1000 fois plus élevée par rapport à leur forme planctonique
(Alleron et al. 2013; Coquet et al. 1998; Monroe 2007).

La figure 13 schématise le processus de formation et de régulation du biofilm. La première

étape de formation du biofilm est l'adhésion (réversible) de microorganismes mobiles à une
surface, principalement par des liaisons chimiques non-covalentes ou faibles. Ces liaisons
entre la cellule et la surface d'attachement sont de type van der Waals, électrostatique, ou
encore acide-base de Lewis. La seconde étape est l'adhésion permanente par la formation de
polymères extracellulaires de nature protéique ou polysaccharidique. Ces premiers points
fixes augmentent la capacité d'ancrage d'autres microorganismes en accroissant et en variant
les surfaces d'ancrage. En effet, certaines espèces ne sont pas capables de s'ancrer elles-
mêmes et s'intègrent à d'autres espèces déjà installées en colonies en s'attachant à leur biofilm.
Il y a ainsi plusieurs vagues de colonisation.

Figure 13 Les différentes étapes de formation et de maturation du biofilm (Monroe, 2007).

La maturation constitue les deux étapes suivantes où les microorganismes adhérants se

divisent et produisent une grande quantité d’exopolymères protéiques et polysaccharidiques.
La dernière étape est la phase de dispersion, dite phase « planctonique », induite par le

42
vieillissement du biofilm, certains stress ou carences, où les microorganismes peuvent
activement se séparer du biofilm (Hunt et al. 2004). Ce détachement concerne en général
certaines zones délimitées du biofilm. Les microorganismes retournent alors à l'état
planctonique et peuvent aller coloniser de nouvelles surfaces, complétant ainsi le cycle.

II.1.5.2 Le rôle du biofilm dans l’écologie des bactéries pathogènes

Cinq groupes de microorganismes vivants ont été identifiés dans les réseaux de distribution,
au niveau du biofilm des canalisations et dans l'eau circulante : des cellules bactériennes, des
protozoaires, des levures, des champignons, des microalgues et des virus. La majorité de ces
microorganismes est non-pathogène, cependant, des bactéries pathogènes comme Legionella,
Mycobacterium ou Pseudomonas (Dailloux et al. 2003; Mace et al. 2008), des bactéries
d'origine fécale comme Escherichia coli, des kystes de protozoaires pathogènes comme
Cryptosporidium parvum ou des virus entériques peuvent transitoirement être hébergés par
ces biofilms qui peuvent fournir un habitat pour les microorganismes et des conditions
favorables à leur persistance et parfois même leur multiplication (Berry et al. 2006; Coquet et
al. 1998; Flemming et al. 2002). Différentes études concernant les interactions entre agents
pathogènes et biofilms en termes d’adsorption et de relargage au niveau de la phase eau ont
permis de montrer que les biofilms semblent pouvoir jouer un rôle au niveau de
l'accumulation, la protection et la diffusion d'agents pathogènes dans les réseaux de
distribution d’eau potable (Berry et al. 2006; Chauret et al. 2001; Ford 1999; Quignon et al.
1997; Storey et al. 2004; Storey and Ashbolt 2001; Storey and Ashbolt 2003; Szewzyk et al.
2000; Watson et al. 2004). Ces phénomènes pourraient être la cause de pathologies,
principalement chez les personnes immunodéprimées, les enfants ou les personnes âgées et
pourrait expliquer certaines épidémies d’origine hydrique (EPA 2002).

II.2. LES MOYENS DE CONTROLE DE LA QUALITE DE L’EAU

Le contrôle de la qualité microbiologique de l’eau potable peut être effectué via une approche
directe ou indirecte. L’approche directe est basée sur la détection spécifique d’agents
pathogènes d’intérêt. Cependant, les méthodes employées peuvent être coûteuses et/ou
longues et fastidieuses et les microorganismes ciblés sont souvent en quantité extrêmement
faible, ce qui nécessite la concentration d’un grand volume d’eau potable. De ce fait, la
majorité des contrôles se fait en utilisant des méthodes indiquant indirectement la présence
potentielle de microorganismes pathogènes. Dans ce cadre, la réglementation prescrit la
recherche de bactéries indicatrices d’une pollution fécale ou d’un dysfonctionnement du
processus de potabilisation. Cependant, même si cette approche indirecte a permis de réduire
le nombre d’épidémies d’origine hydrique, elle n’est pas infaillible. En effet, la faible
fréquence d’analyse, le volume de prélèvement non-représentatif et le comportement différent
des bactéries indicatrices comparé aux agents pathogènes induisent des biais importants quant
au risque sanitaire réel. Ainsi, il est nécessaire de développer des techniques plus
performantes de contrôle de la qualité microbiologique de l’eau.

43
II.2.1. La réglementation & les méthodes d’autosurveillance
L’ensemble du système de contrôle sanitaire est gouverné par la Directive 98/83/CE, relative
à la qualité des eaux destinées à la consommation humaine, impliquant l’application de
normes établies pour la recherche de bactéries indicatrices dans un cadre précis, la fréquence
d’analyse dépendant du volume d’eau potable produit et du nombre d’habitants desservis.
Cependant, un dispositif d’autosurveillance peut être mis en œuvre par l’exploitant en vue
d’assurer la sécurité des consommateurs, en augmentant la fréquence des analyse et/ou en
utilisant des méthodes alternatives. Cela peut consister par exemple en la quantification et le
suivi du biofilm se formant sur les canalisations d’un réseau de distribution d’eau potable.

II.2.1.1 Le cadre réglementaire européen & français

L’eau destinée à la consommation doit impérativement répondre à des critères de qualité
portant sur différents paramètres microbiologiques, chimiques, physiques et organoleptiques.
En France, les normes concernant la qualité de l’eau potable sont fixées par le code de la santé
publique directement transposées à partir de la directive européenne 98/83/CE. Dans ce cadre,
une autosurveillance est mise en œuvre par les producteurs et distributeurs d’eau, avec un
contrôle officiel assuré par l’ARS. Concernant les paramètres microbiologiques contrôlés, la
réglementation française définie l’eau distribuée comme potable si elle ne contient aucune
substance ou contaminant pouvant entrainer un risque sanitaire pour le consommateur. Ce
critère est vérifié via la quantification de bactéries indicatrices de pollution fécale : les
coliformes, dont Escherichia coli, et les entérocoques dont la valeur paramétrique
réglementaires est fixée à 0 pour 100 millilitres analysés.

II.2.1.2 Les méthodes normées de détection des paramètres microbiologiques

Les méthodes normées de détection et de quantification des E. coli et des entérocoques sont
basées sur des techniques culturales. La norme ISO 9308-1: 2000, « Recherche et
dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes - Partie 1: Méthode par
filtration sur membrane » est la méthode de référence pour la détection des bactéries
coliformes et Escherichia coli, basé sur le principe de culture sur milieu gélosé en boîte de
Petri avec un délai de résultat de 24 à 48 heures. La méthode ISO 9308-2:2012,
« Dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes - Partie 2: Méthode du
nombre le plus probable » préconise la technique Colilert® 18 (Société Idexx) basée sur la
mise en évidence de l’activité des enzymes β-galacosidase et β-glucoronidase pour la
détection simultanée des coliformes et d’Escherichia coli. Un substrat fluorogénique
spécifique de chaque enzyme est incorporé dans un milieu nutritif, permettant une détection
des bactéries en 18 heures en phase liquide.

L’avantage de cette technique est sa facilité de mise en œuvre, le réactif déshydraté étant
ajouté directement au prélèvement d’eau. Cette méthode est très souvent utilisée pour
l’autocontrôle et plus spécifiquement en ce qui concerne la remise en eau des canalisations
suite à un arrêt (suspicion de pollution, intervention de maintenance…).

Concernant les entérocoques, une méthode existe, également basée sur le même principe de
culture sur milieu gélosé, décrite dans la norme NF EN ISO 7899-2 : 2000, « Recherche et
dénombrement des entérocoques intestinaux - Partie 2 : méthode par filtration sur

44
membrane ». La méthode Enterolert® (Idexx), analogue à celle utilisée pour la détection des
coliformes et d’Escherichia coli, est certifiée AFNOR (2013) et est également couramment
utilisée pour l’autocontrôle.

II.2.2. Les techniques alternatives de prélèvement & de détection quantitative

Les méthodes réglementaires ne peuvent pas donner directement d’informations quant à
l’évaluation du risque sanitaire lié à un agent pathogène donné. De ce fait, des approches
alternatives performantes en termes de spécificité et de sensibilité sont disponibles. Il existe
plusieurs problématiques relatives à la détection des microorganismes pathogènes.

L’une des plus contraignantes est leur faible concentration souvent inférieure à la limite de
détection des méthodes. Or, leur dose infectieuse peut être très faible, entre 1 et 10
microorganismes ingérés pour certains agents pathogènes (Leggett et al. 2012); de ce fait, cela
requiert des méthodes capables de quantifier de petites quantités de microorganismes. Dans ce
cas, une étape de concentration de l’échantillon est nécessaire afin de pouvoir augmenter la
quantité de microorganismes dans un volume analysable par une technique de détection ayant
une limite de quantification élevée.

Un autre aspect bloquant est le fait que certaines cibles ne peuvent être détectées que par une
méthode donnée, tels que les norovirus dont la présence ne peut être mis en évidence que par
biologie moléculaire. L’utilisation exclusive d’une technique de biologie moléculaire a
comme limite l’absence d’information concernant l’infectiosité des particules virales
détectées. Cependant, de récentes avancées ont permis d’ajouter une notion de viabilité lors de
la détection des microorganismes, ce qui constitue un atout concernant l’évaluation du risque.

En effet, le fait de pouvoir distinguer les microorganismes viables et non-viables permet de

n’inclure que la fraction considérée comme infectieuse au niveau du calcul tenant compte de
l’occurrence et de la dose-réponse, permettant ainsi de bénéficier d’une vision plus réaliste du
risque d’infection.

Le délai de résultat est également un point important au niveau de la gestion active du risque
infectieux : une méthode de détection doit permettre aux exploitants d’avoir une réactivité
compatible avec la production et la distribution d’eau potable conforme à la réglementation et
ne présentant aucun risque sanitaire pour le consommateur.

II.2.2.1 Les méthodes de concentration d’eau

La détection des microorganismes pathogènes dans l'eau comporte généralement trois étapes
principales: (1) récupération et concentration, (2) extraction et purification, (3) détection et
quantification. Lors de la première phase, de grands volumes d’eau doivent être prélevés en
vue d’une concentration en un volume plus faible. Cependant, les volumes concentrés sont
encore souvent trop importants pour la détection des agents pathogènes ciblés et par
conséquent, des mesures supplémentaires d’extraction/purification sont nécessaires.

La difficulté réside également dans le fait que ces microorganismes ne présentent pas les
mêmes caractéristiques. Les propriétés des agents pathogènes concernés telles que la taille, la
forme et la charge ont une influence sur leur capacité à être récupérés par les différentes

45
méthodes de séparation disponibles dont les principes et seuils de coupure sont présentées
dans la figure 14.

Figure 14 Rétention des différents groupes de microorganismes, particules et molécules en fonction du seuil de
coupure du système de filtration utilisé.

Les différentes propriétés physiques, chimiques et biologiques des agents infectieux doivent
être prises en compte dans l'élaboration et l'application de méthodes visant à concentrer ces
microorganismes à partir de grands volumes d’eau.

La méthode de filtration par exclusion par la taille est la plus largement utilisée pour la
récupération des bactéries et des parasites présents dans un échantillon d’eau. Les bactéries
récupérées sur la membrane après filtration (porosité 0,22 ou 0,45 µm) d’un volume d’eau
relativement faible (10 à 100 mL en général) peuvent alors être directement détectées par
développement des colonies bactériennes par application de la membrane sur un milieu de
culture spécifique, suivi d’une identification des colonies isolées obtenues.

Concernant les parasites protozoaires, des cartouches renfermant un filtre de porosité 1 µm

permettent la filtration de grands volumes d’eau (20 litres pour l’eau de surface et 100-1000
litres pour l’eau potable) avec une bonne efficacité de rétention des parasites enkystés
présents dans l’échantillon. L’élution par un traitement chimique (à base de détergents EDTA
et Laureth-12) et mécanique (10 minutes à 600 rpm) permet la récupération des kystes et
oocystes mais également de particules pouvant interférer au niveau de l'examen
microscopique du parasite sous forme de kystes et oocystes. Concernant les virus, les
méthodes de concentration les plus largement utilisées sont des techniques employant des
membranes ou de la fibre de verre retenant les virus principalement par adsorption liée aux
propriétés de surface. Les virus adsorbés sont ensuite élués (utilisation d’agents compétiteurs)
en vue d’une analyse par culture sur cellules et/par analyse de biologie moléculaire (qPCR).

Une avancée technique déterminante serait le développement d’une méthode de concentration

universelle permettant la concentration simultanée de tous les groupes de microorganismes
(virus, bactéries, parasites, microalgues) à partir de différents types de matrices (eau potable,

46
eau de rivière, eau de mer, eaux usées). L’intégration des technologies disparates en une seule
pour la création d’une méthode de concentration universelle permettrait de gagner en
réactivité face à une pollution. Une vérification de la qualité de l’eau par le biais d’une telle
technique aurait plusieurs avantages et plusieurs applications. Par exemple, le contrôle de
l’efficacité du traitement au niveau de plusieurs points de la filière pourrait être plus
facilement estimé permettant ainsi d’établir un abattement pour chaque microorganisme et
une évaluation du risque relatif à chaque agent pathogène. Une autre application serait
l’obtention de données d’occurrence de différents types d’agents pathogènes en vue d’études
de la vulnérabilité des ressources.

L’une des difficultés majeure dans l’élaboration d'une méthode universelle de concentration
réside dans le fait qu’il est nécessaire de concentrer efficacement de grands volumes d'eau
présentant des caractéristiques très différentes de matrice pouvant être une eau de surface, une
eau souterraine ou une eau produite. En effet, la nature de l’eau joue un rôle important sur la
concentration d’un volume d’eau important ; une eau présentant une importante quantité de
matières en suspensions pourrait entraîner un colmatage rapide du système de filtration, selon
la méthode employée. Par ailleurs, dans le réseau de distribution, les microorganismes sont
généralement présents en très faibles concentrations, pouvant engendrer des résultats
faussement négatifs. Des échantillons représentatifs représentant de grands volumes d’eau
doivent donc être analysés en vue d’augmenter la fiabilité du résultat obtenu. Cet aspect pose
alors un problème majeur, dû au transport d’un grand volume d’eau pour une filtration au
laboratoire. Il apparaît donc intéressant de développer une technique de concentration sur le
site de prélèvement même de l’échantillonnage.

Un autre problème qui se pose est dû aux différences caractérisant les microorganismes
ciblés. En effet, la taille et les propriétés de surfaces des différents microorganismes
recherchés étant très variables, le choix de la méthode pour les isoler simultanément à partir
d’un échantillon d’eau est déterminant. Si une grande partie des microorganismes et
notamment les bactéries et les parasites est retenue par exclusion, c’est-à-dire par la taille en
fonction de la porosité du filtre, certains microorganismes, comme les virus, ne sont
généralement retenus sur un filtre que par adsorption, c’est-à-dire en fonction des interactions
entre les propriétés de surface du filtre et celles des microorganismes cibles. Il est donc
important de rappeler qu’une méthode de concentration simultanée constitue un compromis
au regard des caractéristiques des différents types de microorganismes. De nombreuses
techniques de concentration des microorganismes à partir de grands volumes d’eau sont
disponibles. Parmi elles, quelques méthodes permettent la détection simultanée de différents
microorganismes à partir d’un même échantillon, comme l’utilisation de membranes de
microfiltration, de systèmes d’ultrafiltration ou d’utilisation de la force centrifuge.

II.2.2.1.1 Les membranes de microfiltration

Les membranes filtrantes représentent à ce jour la technique la plus répandue pour la
concentration des microorganismes à partir d’échantillons d’eau. La filtration sur membrane
est une technique basée sur le principe de rétention des microorganismes présents dans un
échantillon d’eau en fonction de leur taille (exclusion stérique) et/ou de leurs propriétés de
surface (adsorption). Ces membranes peuvent être constituées de divers matériaux

47
(polycarbonate, fibre de verre, esters de cellulose…) et présentent une porosité variable. Deux
catégories principales se distinguent: les membranes planes et les membranes plissées (sous
forme de cartouche). La capacité de filtration dépend de la porosité de la membrane, de sa
configuration et de la qualité de l’eau filtrée. En effet, une forte turbidité (eaux de surface)
et/ou une faible porosité peut entraîner le colmatage de ce type de membrane en raison du
mode frontal de filtration. Une fois la filtration effectuée, la récupération des
microorganismes est réalisée par ajout d’une solution éluante. En vue de favoriser la
récupération des particules virales après adsorption en fonction de la charge de la membrane,
la solution éluante contient des agents compétiteurs, telles que des protéines, qui vont entrer
en compétition au niveau des sites de fixation des virus (extrait de bœuf, albumine…) et des
agents chaotropiques pour déstabiliser les liaisons hydrogènes (Glycine, Tween 80…). La
désorption est également favorisée à un pH alcalin, pH pour lequel il y a un changement de
polarité des microorganismes et du support.

La plupart des études réalisées à l’aide de membranes filtrantes présentent des résultats
satisfaisants au niveau des rendements de récupération des virus, parasites et bactéries. Pour
éviter un colmatage trop rapide dans le cas d’une filtration frontale, on peut utiliser une
cartouche de porosité plus importante en tant que préfiltre mais avec le risque d’engendrer
une perte de microorganismes. Par ailleurs, la récupération des microorganismes est plus
fastidieuse à partir d’un filtre plat car un traitement mécanique est difficilement applicable.
Un autre problème majeur lors de l’utilisation de filtres électronégatifs est la nécessité
d’acidifier l’échantillon (pH ≈ 3,5) afin de charger les particules virales positivement pour
favoriser leur adsorption. Cette étape limite donc la filtration de grands volumes. Cependant,
certains filtres électronégatifs ne nécessitent qu’un traitement en début de filtration.

Une étude a été menée sur des échantillons de 400 litres d’eau potable dopés avec 105 kystes
de Giardia lamblia, 105 oocystes de Cryptosporidium parvum et 105 Poliovirus-1 (Watt et al.
2002). Pour ce faire, 2 types de filtres sous forme de cartouche à filtre plissé 0,45 µm ont été
testés : un filtre en fibre de verre chargé électronégativement (Filterite) et un filtre chargé
électropositivement 1 MDS en fibre de verre te cellulose (Modularly Designed System,
Virosorb). Après dopage et filtration d’un volume de 400 litres, la récupération des
microorganismes est effectuée par « backflushing » (inversion du flux) avec une solution
contenant 1,5% d’extrait de bœuf et 0,01% de Tween 80. Les rendements calculés pour le
filtre en fibre de verre sont de 45,5 ± 14,8, 36,8 ± 6,2 et 26,5 ± 4,9 % pour le Poliovirus,
Cryptosporidium parvum et Giardia lamblia, respectivement. Les rendements calculés pour le
filtre 1 MDS sont 86 ± na, 17 ± 1,4 et 14,5 ± 4,9 % pour le Poliovirus, Cryptosporidium
parvum et Giardia lamblia, respectivement. Une autre étude a été menée en utilisant le filtre 1
MDS en cartouche mais également sous forme de membrane plane (Polaczyk et al. 2007).
Cependant, les volumes filtrés étaient faibles : 1 litre et 20 litres pour les filtres plats et les
cartouches, respectivement. Les niveaux de dopages étaient variables : 103 ou 106 de chaque
microorganisme pour les filtres plats et 104 ou 106 de chaque microorganisme pour les filtres
sous forme de cartouche. Après dopage et filtration, la récupération des microorganismes est
effectuée par « backflushing » avec une solution contenant 1,5% d’extrait de bœuf et 0,05 M
de glycine, en observant un temps de contact avant collection de l’éluat et application d’air

48
comprimé à l’intérieur de la cartouche. Les rendements calculés pour le filtre plat sont 44 ±
8,7, 65 ± 1, 50 ± 9,9 et 17 ± 0,4 % pour le bactériophage MS2, le bactériophage PhiX174,
Cryptosporidium parvum et Salmonella, respectivement. Les rendements calculés pour le
filtre sous forme de cartouche sont 32 ± 13, 37 ± 26, 8,7 ± na et 18 ± 10 pour le
bactériophage MS2, le bactériophage PhiX174, Cryptosporidium parvum et Salmonella,
respectivement. L’obtention de rendements relativement faibles peut être expliquée par le fait
que l’étape de récupération est difficile à partir de filtres électropositifs sous forme de
cartouche. Dans une autre étude, un filtre plat électronégatif (HA, Millipore, 0,45µm, 293
mm) a été utilisé lors d’une campagne de prélèvement/concentration d’échantillons d’eau
potable au Japon. L’analyse de 98 échantillons avec des volumes filtrés allant de 100 à 532
litres a révélé la présence 4,1% et 7,1% de norovirus génogroupe 1 et génogroupe 2,
respectivement (Haramoto et al. 2004). Un prétraitement du filtre à l’aide d’AlCl3 en début de
filtration suivi d’une élution par une solution de NaOH (1,0 mM, pH 10.8) puis d’un rinçage
avec une solution acide (0,5 mM H2SO4, pH 3.0) permettent d’obtenir des rendements de
récupération de virus supérieurs à 80%. Comme la porosité est faible (0,45 µm), ce filtre
permettrait en théorie une co-concentration des microorganismes incluant les virus (par
adsorption), les parasites et les bactéries (par exclusion stérique). Cependant, une porosité de
0,45µm risque de favoriser un colmatage du filtre dans le cas d’une eau turbide, en particulier
pour la filtration de grands volumes d’échantillons. Par ailleurs, après filtration, la membrane
plane doit être retirée du bâtit en vue du transport au laboratoire pour procéder à l’analyse, ce
qui pourrait entraîner une inactivation des microorganismes adsorbés et/ou une contamination
par des microorganismes non présents initialement dans l’eau. Des essais réalisés avec
utilisation d’une membrane électronégative de porosité 1,2 µm (uniquement pour la
concentration de virus par adsorption) couplée à un système d’ultrafiltration (facteur de
concentration x 10000) ont permis la filtration de volumes supérieurs à 600 litres d’eau de
réseau et la détection d’entérovirus par technique de biologie moléculaire (Rutjes et al. 2005).
Cependant, du fait de la charge négative du filtre, la filtration nécessite un traitement de
l’échantillon en vue d’une réduction de pH.

Des méthodes utilisant des filtres électropositifs ont été développées et préconisées par l’EPA
(Environmental Protection Agency) comme une alternative au filtre 1 MDS dont le coût élevé
limite l’utilisation au niveau d’un contrôle de routine. La première méthode est le filtre
NanoCeram, présentant des rendements variant entre 14% et 85% selon le virus testé (Francy
et al. 2013; Karim et al. 2009), cela pouvant s’expliquer par le fait que ces virus présentent
des points isoélectriques différents, pouvant varier entre 2 et 7 selon l’espèce et de ce fait que
leur récupération est différente face à une méthode d’élution unique. En effet, les rendements
obtenus pour le phage MS2, Poliovirus, l’echovirus, les coxsakievirus et les entérovirus sont
de 84%, 54%, 27% and 32% et 14,5% respectivement. Une autre technique utilise le filtre
Virocap (nano alumina fiber, Scientific Methods) présentant un rendement de 44%, 53% et
51% à partir d’eau souterraine, eau de surface et eau de mer, respectivement, artificiellement
contaminées avec le bactériophages MS2 (Bennett et al. 2010).

Une autre technique développée sur cartouche filtrante électropositive (Diamond filter tube,
Filterite) a été testée pour la concentration simultanée de microorganismes à partir de grands

49
volumes d’eau potable (Payment et al. 1989). Différents microorganismes ont été utilisés pour
le dopage: Poliovirus, bactériophages, spores de Clostridium perfringens, kystes de Giardia
lamblia et Legionella pneumophila. Des volumes compris entre 20 et 1000 litres ont été dopés
à hauteur de 105 à 106 particules et filtrés sur des filtres en fibre de verre de porosité 3 µm et 1
µm, successivement (le filtre de porosité 3 µm étant utilisé comme préfiltre mais également
analysé). Après filtration, la récupération des microorganismes est effectuée par
« backflushing » avec 1,8 litres d’une solution contenant 1,5 % d’extrait de bœuf (pH 9,75) et
0,5 % de Tween 80, puis le pH de l’éluat est neutralisé. L’éluat est ensuite divisé en vue des
concentrations secondaires spécifiques à chaque microorganisme. Les rendements obtenus
sont les suivants : 71 ± 9 % pour Giardia, 64 ± 11 % pour Legionella, 92 ± 2 % pour le
Poliovirus, 82 ± 6 % pour les bactériophages et 86 ± 15 % pour les spores de Clostridium.

II.2.2.1.2 Systèmes d’ultrafiltration

L’ultrafiltration est un procédé de séparation des particules en fonction de leur poids
moléculaire en utilisant un système à flux tangentiel dans l'eau c’est-à-dire un flux parallèle à
la surface de la membrane. Les particules retenues dans le rétentat sont alors concentrées
tandis que l’on élimine l’eau et les particules de plus faible poids moléculaire par le filtrat.
Ceci a donc pour but de maintenir les microorganismes d’intérêt et autres particules (ayant un
poids moléculaire supérieur au seuil de coupure) en suspension dans l'eau retenue (rétentat). Il
existe un second procédé, alternatif au mode tangentiel (avec recirculation de l’échantillon),
appelé le mode « impasse » (sans recirculation de l’échantillon), représenté sur la figure 15.

Figure 15 Principe de concentration par ultrafiltration en fibres creuses en mode (a) tangentiel et (b) « impasse »

Comme pour les études portant sur les dispositifs de microfiltration, la plupart des études
réalisées sur les systèmes d’ultrafiltration sont basées sur l’ajout d’une quantité connue de
microorganismes pathogènes modèles dans un échantillon d’eau et le rendement de
récupération est calculé après filtration et détection spécifique de chaque type de
microorganisme cible (biologie moléculaire, culture /ou microscopie). Concernant le mode
tangentiel, une étude utilisant des échantillons de 10 litres d'eau de surface, dopés

50
simultanément avec E.coli XL1-Blue (105 UFC/litre), des oocystes de Cryptosporidium
parvum (10 oocystes/litre), des phages T1 (105 PFU/litre) et des phages PP7 (105 PFU/litre)
ont abouti à des rendements de récupération moyens de 96%, 54%, 59%, et 46 %,
respectivement (Morales-Morales et al. 2003). Une autre étude a permis de perfectionner le
mode de récupération des microorganismes par ajout d’un détergent (Tween 80) à la solution
d’élution lors de l’étape de « backflushing » (rétro-lavage) du filtre (Hill et al. 2005). Les
rendements obtenus à partir de 10 litres d’eau potable étaient de 91 ± 33, 49 ± 47, 70 ± 13, 83
± 13, 84 ± 47, 83 ± 17 et 102 ± 23 % pour les bactériophages MS2, echovirus 1, Salmonella,
E. faecalis, spores de Bacillus globigii, Cryptosporidium parvum et les microsphères en
polystyrène de 4,5 µm, respectivement. Cette recherche démontre que l'ultrafiltration peut être
efficace pour le recouvrement simultané des divers microorganismes dans l'eau du robinet et
que les produits chimiques dispersants peuvent être bénéfiques pour l'amélioration de la
récupération microbienne dans ce cas. Le même procédé appliqué à l’analyse de 100 litres
d’eau potable (Hill et al. 2007) présente des rendements de 71 ± 21, 97 ± 26, 120 ± 51, 110 ±
81, et 91 ± 9 % pour le bactériophage PhiX174, le bactériophage MS2, Enterococcus faecalis,
les spores de Clostridium perfringens, et les oocystes de Cryptosporidium parvum,
respectivement. Cependant, une variabilité au niveau des résultats obtenus après
détection/quantification par biologie moléculaire des microorganismes recueillis a été
observée. Cela suggère un potentiel impact de la qualité de l’eau mais aucun paramètre
physico-chimique n’a pu être incriminé dans ces pertes de performance.

L’ultrafiltration en mode « impasse », a été proposée en vue de simplifier le principe de

filtration et de pouvoir l’adapter directement en ligne pour la concentration et la détection
d’agents pathogènes au niveau d’usines de production d’eau potable. Des auteurs reportent les
performances de ce principe, automatisé, avec des rendements maximum de 68% pour des
volumes filtrés de 15 à 21 litres et 40% pour des volumes supérieurs à 100 litres (Kearns et al.
2008). Ce type de système a par la suite été utilisé pour la collecte et l’analyse d’échantillons
d’eau au niveau de la ressource (indicateurs de pollution fécale) et d’eau de tours
aéroréfrigérantes (Legionella pneumophila) et ont montré une plus grande fiabilité au niveau
de la variabilité par rapport aux méthodes de prélèvement standards (Leskinen et al. 2012).
Différents auteurs employant le mode « impasse », ont étudié les rendements de récupération
d’un large panel de microorganismes (Francy et al. 2013; Mull and Hill 2012; Smith and Hill
2009a). Ils ont obtenu des rendements compris entre 49% et 94%, selon le type de
microorganisme, pour des volumes d’eau potable filtrés de 100 litres malgré l’observation
(Mull and Hill 2012) ou l’absence (Smith and Hill 2009b) de colmatage. A partir de volumes
de 10 litres d’eau de lac, des rendements relatifs à Enterococcus faecalis, aux kystes de
Giardia et au virus de la grippe aviaire de 80%, 57% et 0,02% ont été obtenus, respectivement
(Francy et al. 2013).

II.2.2.1.3 Concentration par force centrifuge

Un autre système de concentration a été testé en évaluant l'efficacité de la force centrifuge
pour la récupération de microorganismes à partir d’échantillons d’eau. L'échantillon d’eau est
injecté dans le canal par le biais d’une pompe péristaltique. Une vitesse de rotation du rotor
sur lequel est placé le canal est alors appliquée à 900 g. Une paroi sépare le canal en 2 parties

51
(entre l’entrée et la sortie) de manière à ce que l’échantillon d’eau injecté parcoure la totalité
du canal avant d’en ressortir. Les particules présentes sont alors concentrées par force
centrifuge dans un compartiment inclus dans le canal, qui est à usage unique. Après
centrifugation, le contenu du compartiment contenant les particules d’intérêt est transféré dans
un récipient auquel est ajouté le volume résultant des rinçages du canal en présence de Tween
80 à une concentration de 0,01%. Le volume total de concentrat obtenu est compris entre 200
et 250 ml. Pour le modèle représenté appelé CFC (Continuous Flow Filtration), le système est
constitué d’une pompe péristaltique intégrée et d’un moteur à vitesse réglable permettant la
centrifugation continue de l’échantillon injecté. Le modèle présenté ci-dessus est distribué par
la société Scientific Methods (Indiana) et peut-être associé à un filtre Virocap. En effet, le
CFC permet la concentration des parasites et des bactéries et éliminerait les impuretés en vue
d’une filtration sur filtre Virocap pour la détection des virus.

Des études utilisant ce principe ont été menées en vue de concentrer des parasites protozoaires
et Escherichia coli) (Borchardt and Spencer 2002; Francy et al. 2013) ajoutés dans différents
types de matrices. Les rendements obtenus pour Cryptosporidium parvum sont 104%, 97%,
et 54% pour l’eau potable, l’eau de rivière (Borchardt and Spencer 2002) et l’eau de lac
(Francy et al. 2013), respectivement. Un rendement de 98% est obtenu pour Escherichia coli
dans une solution saline et 68% pour l’eau de lac. D’autres études ont été réalisées, mais
uniquement avec des parasites, en utilisant le même principe mais avec un système étudié
pour le « terrain ». Ce dispositif présente l’avantage d’utiliser un système portatif pouvant
concentrer des microorganismes à partir de grands volumes d’eau (100 ou 1000 litres).
Cependant, les résultats obtenus lors des quelques études réalisées, présentent une importante
variabilité au niveau du rendement. Pour la concentration d’oocystes de Cryptosporidium à
partir de 1000 litres d’eau de réseau, ce système présente un rendement moyen de 35.4 ± 23 %
(n= 40 tests indépendants) avec un minimum de 11,3% et un maximum de 72%. Ces
différents essais ont été réalisés avec une quantité moyenne de 90 oocystes inoculés dans
l’échantillon de 1000 litres. Il est important de noter que la variabilité de rendements de
récupération observée peut-être dépendante des propriétés des microorganismes eux-mêmes,
de la méthode de concentration mais également de la méthode spécifique à leur détection
(culture, microscopie, biologie moléculaire…). Une étude a été menée afin de comparer les
méthodes usuelles par culture et par biologie moléculaire (qPCR) pour la détection de
bactéries pathogènes après concentration par ultrafiltration et affirme que les résultats sont
qualitativement proches mais précise que les rendements doivent être quantitativement
estimée en ce qui concerne la qPCR (Francy et al. 2009).

II.2.2.2 Les méthodes de détection des microorganismes viables

La viabilité étant un critère majeur concernant l’évaluation du risque sanitaire lié à la
consommation de l’eau. Cette section présente les principes les plus couramment utilisés pour
la mise en évidence de la présence de microorganismes viables dans le domaine de la
surveillance de la qualité de l’eau. De nombreuses méthodes existent, basées sur des principes
différents, liés à la capacité à cultiver, la détection d’ARN par biologie moléculaire, l’intégrité
membranaire ou l’activité métabolique. Le tableau 3 présente différentes méthodes usuelles

52
pour la détection et la discrimination de microorganismes viables parmi la population
microbienne globale.
Tableau 3 Principes et méthodes usuelles de détection et de discrimination des microorganismes viables dans l’eau.

Technique Spécifique Quantitatif Rapide Terrain

Culture +/- + - -
ATPmétrie - - + +
Microscopie +/- + +/- -
Cytométrie en phase solide +/- + + -
Cytométrie en flux +/- + + +
qPCR-PMA + + +/- -
DVC-FISH + + +/- -

Chaque méthode présente des avantages et inconvénients concernant leur applicabilité dans le
domaine du contrôle de la qualité microbiologique de l’eau. Certaines méthodes sont allouées
uniquement à une détection spécifique ou non-spécifique, d’autres peuvent être utilisées pour
les deux approches. Certaines méthodes sont applicables à différents types de
microorganismes, d’autres ne sont applicables qu’aux bactéries. Par ailleurs, les aspects
quantitatifs, le délai de résultat et la possibilité d’être appliqué directement sur site
représentent également des atouts importants.

II.2.2.2.1 Les méthodes de culture

La culture est la méthode la plus répandue pour le contrôle de la qualité microbiologique de
l’eau du fait de sa simplicité de mise en œuvre, de son caractère peu coûteux et réglementaire.
Sa limite principale est la non-détection des germes viables non cultivables.

Méthodes de dénombrement des germes cultivables

La culture permet de quantifier les cellules bactériennes capables de se multiplier et former
des colonies visibles sur un milieu de croissance nutritif gélosé et dans un environnement
d'incubation spécifique (température, atmosphère). Concernant les germes totaux
revivifiables, les substances nutritives sont généralement apportées par la tryptone (source
d’azote et de carbone) l’extrait de levure (source de vitamines et de facteurs de croissance) et
le glucose (source de carbone et d’énergie la plus universelle). Ces composants favorisent la
croissance de la plupart des bactéries hétérotrophes. Cependant, la culture ne permet de ne
voir que les bactéries ayant conservé leur aptitude à cultiver dans les conditions données et la
lecture définitive se fait au bout de 48 heures dans le meilleur des cas ou de 11 jours selon le
milieu utilisé.

Concernant les bactéries ne cultivant pas sur milieu usuel, des milieux spécifiques sont
préconisés. Pour exemple, pour les légionelles, un milieu de culture liquide est utilisé pour
leur croissance (BYE, Buffered Yeast Extract, supplémenté avec cystéine et fer) et un milieu
de culture gélosé pour la formation des colonies (BCYE, Buffered Charcoal Yeast Extract).

53
 (a) (b)

Figure 16 Colonies de (a) Legionella pneumophila sur milieu BCYE (Biomérieux) et (b) flore totale hétérotrophe
gélose PCA (Sound microbiology laboratory)

La culture cellulaire
Certains microorganismes pathogènes (virus et parasites protozoaires) retrouvés dans l’eau ne
cultivent pas sur milieu synthétique et nécessitent de réaliser des infections en laboratoire. Le
principe de la méthode in vitro est une alternative aux méthodes d’inoculation in vivo et est
basé sur la mise en évidence d’une multiplication de certaines espèces d’agents pathogènes
capables d’infecter des cellules eucaryotes. L’avantage principal de cette méthode est la
possibilité de mise en évidence in vitro de l’infectiosité de virus et de parasites protozoaires.
Ce caractère infectieux peut être détecté par visualisation directe par microscopie des cellules
lysées (effet cytopathogène) ou via une étape de détection supplémentaire basée sur une
technique de biologie moléculaire (Di Giovanni and LeChevallier 2005; Quintero-Betancourt
et al. 2002) ou immunologique (Quintero-Betancourt et al. 2002; Woods et al. 1995). Une des
premières difficultés est le choix de la lignée cellulaire adaptée à une prolifération du
pathogène ciblé car certaines lignées peuvent n’être sensibles qu’à certains sérotypes du
pathogènes. On peut ainsi se heurter à des résultats « faux-négatifs ». Par ailleurs, une autre
complication repose sur le fait que la méthode est complexe et nécessite une grande technicité
et un laboratoire spécifique pour l’entretien de la lignée cellulaire, la maîtrise des risques de
contamination et/ou de toxicité apportés par la matrice eau analysée. Pour Cryptosporidium,
la mise en évidence de l’aspect infectieux passe par une étape de dékystement, c’est-à-dire
l’application de conditions permettant l’extraction naturelle des formes infestantes appelées
sporozoïtes (Neumann et al. 2000; Upton et al. 1994), puis l’inoculation de ces dernières au
niveau d’une culture cellulaire (lignées Caco-2 ou HCT8). Par ailleurs, le délai de résultat est
très long, entre une semaine et dix jours, ce qui ne permet pas d’utiliser cette méthode pour la
surveillance active de la production d’eau potable. Enfin, certaines études ont montré que la
culture cellulaire peut s’avérer plus sensible qu’une inoculation in vivo, entrainant une
surestimation potentielle du risque (Slifko et al. 1997). L’utilisation de la méthode standard de
dénombrement des oocystes par observation microscopique est donc conseillée en parallèle
(Slifko et al. 1997). L’échantillon doit parfois subir des prétraitements avant inoculation sur
culture cellulaire.

54
II.2.2.2.2 Les méthodes de biologie moléculaire
Les méthodes de biologie moléculaire sont largement utilisées dans le domaine de l’analyse
quantitative pour la surveillance de la qualité de l’eau du fait de leur rapidité, de leur
sensibilité et de leur spécificité. Ces dernières se déclinent sous de nombreuses formes et
peuvent s’adapter à plusieurs domaines.

La PCR quantitative
La PCR (Polymerase Chain Reaction) en temps réel ou quantitative (qPCR) est une technique
de biologie moléculaire basée sur l’amplification d’une séquence d’un acide nucléique (ADN
ou ARN) spécifique à une entité microbiologique (Jones et al. 2005). Le suivi cinétique des
cycles d’amplification par le biais de marqueurs fluorescents, sondes ou SYBR Green, permet
de calculer la quantité initiale d’ADN. Cette estimation est réalisable au moyen de valeurs
seuils appelées « Cycle Threshold », directement comparées à une gamme de différentes
concentrations de la cible effectuée parallèlement ou préalablement à l’analyse. Cependant, la
mise en évidence spécifique d’un génome donné et la quantification associée ne permettent
pas d’obtenir d’information quant à la viabilité des microorganismes. Afin de pallier ce
manque, deux approches principales ont été mise en place. La première est basée sur la RT-
qPCR (Retro Transcriptase- Quantitative Polymerase Chain Reaction) qui permet de détecter
les ARNm (ARN messager) par amplification des ADNc (ADN complémentaires). Les
ARNm ne sont présents que lorsqu’un microorganisme possède une machinerie cellulaire en
état de fonctionner ; leur production est donc garante de la viabilité du microorganisme ciblé.
Il est important de noter que la RT-PCR est également utilisée pour la détection des virus,
dont le génome est uniquement constitué d’ARN, mais pas dans un but de mise en évidence
d’une activité du fait de l’absence de métabolisme au niveau de la particule virale.

Concernant la détection de microorganismes viables, une technique plus récente a été décrite
(Cattani et al. 2016; Elizaquivel et al. 2014; Inoue et al. 2015; Lee et al. 2015). Il s’agit de la
qPCR-PMA (Propidium MonoAzide) et, de manière moins répandue, de la qPCR-EMA
(Ethidium MonoAzide). Ces méthodes couplent le principe de la qPCR avec une molécule
capable de pénétrer dans les cellules dont la paroi n’est pas intègre, considérées comme non-
viables, et de se fixer à l’ADN et d’en bloquer la réplication et donc l’amplification par PCR.
Cette méthode peut s’appliquer aux bactéries dans l’eau (Zacharias et al. 2015) et aux
bactéries des biofilms (Tavernier and Coenye 2015). En ce qui concerne les virus, l’intégrité
de la capside, qui n’a qu’un rôle d’enveloppe, sans fonction d’échanges avec le milieu
extérieur, démontre que le matériel génétique n’est plus protégé. Il est également possible
d’appliquer cette méthode pour la mise en évidence du potentiel infectieux d’un virus
(Moreno et al. 2015). Cependant, une étude a montré que, au niveau de la mise en évidence du
potentiel infectieux, la corrélation entre la culture cellulaire et la biologie moléculaire (qPCR-
PMA/EMA) n’était significative que suite à un traitement au chlore, contrairement à des
traitements UV et thermique (Leifels et al. 2015). Des études ont appliqué cette méthode pour
la recherche des bactéries Escherichia coli, des entérocoques et Pseudomonas aeruginosa
dans le domaine de l’eau potable (Gensberger et al. 2013; Gensberger et al. 2014). Les
résultats montrent que, par rapport à la méthode qPCR usuelle (pas de notion de viabilité) la
qPCR-PMA permet d’avoir d’obtenir une approche réaliste quant à la proportion de bactéries
viables, une corrélation avec les méthodes classique étant démontrée pour les espèces

55
bactériennes précitées. Les auteurs précisent également que, afin d’éviter les faux négatifs (7 à
23%), la préparation de l’échantillon doit être optimisée au niveau de l’extraction de l’ADN.

L’ICC-PCR (Integrated Cell Culture-PCR) est une méthode couplant la biologie moléculaire
et la culture a été développée pour la mise en évidence du maintien du caractère infectieux de
certains agents pathogènes (Ogorzaly et al. 2013). Pour ce faire, différentes lignées cellulaires
peuvent être utilisées selon le mode de contamination du type de microorganisme ciblé
(BGM, HCT8, CACO2), entretenues avec un milieu spécifique à base de glucose et
supplémenté en acides aminé et sérum de bœuf. Ces dernières sont ensuite mises en contact
avec un échantillon et mis en conditions favorisant l’infection (37°C, 5% CO2), avec ajout
d’antibiotiques est également préconisé afin d’éviter le développement bactérien (pénicilline,
streptomycine, amphotéricine). La durée de contact avant extraction de l’ADN est directement
dépendante du virus ciblé (entre 1 et 10 jours). Cette approche est majoritairement utilisée
pour la détection des virus infectieux (Reynolds et al. 2001; Reynolds 2004). L’avantage
principal de cette technique est qu’elle est plus rapide et plus sensible que la culture cellulaire
classique, du fait de l’amplification du génome ciblé. Des applications sur échantillons réels
ont mis en évidence le gain de cette méthode en termes de sensibilité en comparaison avec la
culture cellulaire classique (effet cytopathogène). En effet, l’ICC-PCR a permis de détecter la
présence de virus infectieux dans des échantillons d’eau potable alors que l’analyse de ces
derniers donnait des résultats négatifs par la méthode de culture cellulaire classique. Ainsi,
l’une des études reporte 23% d’échantillons positifs par ICC-PCR contre aucune détection via
la méthode classique (Grabow et al. 2001). Si ces résultats ont été confirmé par d’autres
études pour une matrice d’eau potable, mais la quantification obtenue par ICC-PCR peut
s’avérer moins performante que la méthode classique pour une matrice d’eau de source (Lee
and Jeong 2004).

La technique FISH
La technique FISH (Fluorescent in situ Hybridization) fait partie des méthodes couramment
utilisées en microbiologie (Rompre et al. 2002) et permet de cibler une séquence nucléique
spécifique directement à l’intérieur d’un microorganisme par le biais d’une sonde
fluorescente, sans passer par une étape d’extraction du génome, contrairement à la qPCR. Ce
principe a été appliqué dans le domaine de l’eau potable (Hugler et al. 2011; Wilhartitz et al.
2007) et également au niveau des biofilms (Deines et al. 2010; Juhna et al. 2007; Lehtola et
al. 2007; Moreno et al. 2007). La survie de bactéries et le maintien de virus dans des biofilms
d’eau potable ont été étudiés par une approche FISH dans des conditions similaires à celles
rencontrées dans un réseau de distribution (Juhna et al. 2007; Lehtola et al. 2007). Cela a
montré les capacités de persistance de bactéries et de virus dans un réseau en soulignant la
potentielle sous-estimation inhérente aux méthodes de culture (Juhna et al. 2007; Lehtola et
al. 2007). Les principales limites de l’utilisation de la technique FISH pour l’analyse de l’eau
sont…. Des voies principales d’optimisation sont l’amplification du signal et la mise en
évidence de la viabilité cellulaire. La méthode TSA-FISH (Tyramide Signa Amplification-
Fluorescent in situ Hybridization) également appelée CARD-FISH (Catalyzed Reporter
Deposition) est basée sur une sonde à laquelle est fixée l’enzyme HRP (Horse Radish
Peroxydase) qui, suite à l’étape d’hybridation sera mise en contact avec son substrat, la
tyramide, qui engendrera par hydrolyse un signal fluorescent plus intense qu’une sonde

56
classique (Kubota et al. 2006; Pernthaler et al. 2002). La discrimination des bactéries
cultivables dans un échantillon peut être effectuée via le test DVC-FISH (Direct Viable
Count-Fluorescent in situ Hybridization) ((Moreno-Mesonero et al. 2016; Santiago et al.
2015; Tirodimos et al. 2014). Au préalable d’une détection, l’échantillon est mis en présence
d’un milieu de culture supplémenté d’une substance antibiotique dosée pour bloquer la
scission des bactéries, ce qui entraine une élongation cellulaire. Après marquage par FISH, les
bactéries observées présentant une taille supérieure à la normale et une fluorescence plus
intense (due à l’augmentation de la quantité de matériel génétique par cellule), sont
considérées comme viables et cultivables. Cette méthode permet d’évaluer l’efficacité de
traitements biocides et met en lumière la persistance de bactéries viables au-delà de la
quantification observable par culture. Pour exemple, une étude montre que des bactéries
Helicobacter pylori restent viables 3 heures alors qu’elles perdent leur capacité à cultiver en 5
minutes en présence de chlore à une concentration proche de 1 mg/litre (Moreno et al. 2007).

II.2.2.2.3 Les marqueurs de l’activité métabolique et de l’intégrité cellulaire

La viabilité d’une cellule microbienne peut-être mise en évidence via l’utilisation de
marqueurs capable de révéler une activité métabolique et/ou de démontrer l’intégrité de la
paroi membranaire. Cette section présente une sélection de marqueurs adaptés pour cet
objectif mais dont la fonction et le mode d’actions sont différents.

Les marqueurs bioluminescents

La mesure de l’ATP (Adénosine Tri-Phosphate) est couramment utilisée pour évaluer
l’activité globale d’une population microbienne (incluant les bactéries, protozoaires, algues et
champignons) planctonique et en biofilm. Cette méthode est également utilisée dans le
domaine de l’eau potable pour l’évaluation de l’impact d’un traitement (Nescerecka et al.
2016) ou la mise en évidence d’une contamination (Vang et al. 2014). L’ATP est la forme
d’énergie immédiatement utilisable pour les besoins de la cellule et cette molécule est
retrouvée dans toutes les cellules vivantes. La durée de vie de l’ATP en dehors d’une cellule
est courte. L’ATP intracellulaire est obtenue en filtrant l’échantillon (élimination de l’ATP
extracellulaire) et en procédant à une lyse des bactéries retenues sur le filtre pour libérer leur
ATP. La réaction responsable de l’émission de bioluminescence est décrite dans la figure 17.

Figure 17 Principe de la mesure de l’ATP par production de bioluminescence (Protocole Aquatools).

Le principe de la mesure repose sur le comptage de photons produits par l’action d’une
enzyme, la luciférase. L’hydrolyse enzymatique en résultant émet des photons
(bioluminescence) et l’intensité lumineuse est ensuite mesurée par le biais d’un luminomètre.
Les résultats sont exprimés en différentes unités telles que les RLU (Relative Luminescent

57
Unit), en picogrammes d’ATP ou en équivalents microorganismes. Les RLU permettent de
calculer une concentration en ATP. L’avantage de cette méthode est qu’elle peut aisément
être utilisée sur site, des dispositifs portables et des kits de mesure étant commercialisés.
Cependant, Cette approche ne permet pas de conversion fiable de l’intensité du signal en
nombre de cellules. En effet, peu de cellules très actives peuvent contenir autant d’ATP que
dix fois plus de cellules peu actives. De plus, cette approche se limite à l’activité cellulaire
globale et ne permet pas de constater directement les dégâts causés au niveau de la membrane
ou des acides nucléiques. Pour cela, il faudra coupler la mesure d’ATP à l’utilisation d’autres
marqueurs.

Les marqueurs fluorescents

Un marqueur fluorescent (ou fluorochrome) est une molécule capable d'émettre une lumière
de fluorescence après excitation par une source lumineuse. Chaque marqueur fluorescent
permet de mettre en évidence un état physiologique ou un état structural donné pour les
bactéries présentes dans un échantillon. Le tableau 4 présente les informations principales
concernant les différents marqueurs les plus répandus.
Tableau 4 Les marqueurs majeurs utilisés pour la détection des microorganismes et la mise en évidence de leur état
physiologique ou structural.

Nom Fluorescence Absorption Emission Cible

4',6-Diamidino-2-phenylindole
Bleue 344 449 ADN (A-T sélectif)
(DAPI)

SYBR Green II Verte 494 521 ADN/ARN

SYTO 9 Verte 480 500 ADN/ARN

SYTO 59 Rouge 622 645 ADN/ARN

Iodure de propidium (PI) Rouge 536 617 ADN

Ethidium homodimer-2 Rouge 534 624 ADN

SYTOX Green Verte 504 523 ADN/ARN

Chlorure de 5-cyano-2,3-ditolyl Activité enzymatique

Rouge 400/450 602
tetrazolium (CTC) déshydrogénase

Activité enzymatique
Chemchrome V6 (CV6) Verte 480 500
estérase

5(6)-Carboxyfluorescein Activité enzymatique

Verte 494 520
diacetate (CFDA) estérase
Potentiel membranaire -
Rhodamine 123 Rouge 541 572
mitochondrie

Ces différents fluorochromes peuvent être utilisés principalement pour la détection de

bactéries via la microscopie à fluorescence (microscope à épifluorescence ou microscope
confocal) ou la cytométrie à balayage laser ou la cytométrie en flux (Leonard et al. 2016).

58
Le 5-(et-6)- diacétate de carboxyfluorescéine (5(6)-CFDA), permet la mise en évidence d’une
activité estérase au niveau de la bactérie (Guilini et al. 2015; Hoefel et al. 2003a). Cette
molécule lipophile non-fluorescente a la propriété de pénétrer passivement dans la plupart des
cellules qui ont une tendance naturelle à l’accumuler. Une fois à l’intérieur, il subit une
hydrolyse enzymatique par des estérases intracellulaires non spécifiques, ce qui donne un
produit polaire fluorescent, la carboxyfluorescéine (figure 18). Cependant, la
carboxyfluorescéine peut être rapidement expulsée par la cellule bactérienne via les pompes à
efflux (Leonard et al. 2016); ce phénomène implique donc que l’analyse soit effectuée
immédiatement après le délai nécessaire au marquage.

Figure 18 Principe du marquage cellulaire par le biais de la molécule de 5(6)-CFDA et exemple de mise en évidence
de l’activité estérase (microscope à épifluorescence) (Zotta, 2012).

Ce produit fluorescent est uniquement maintenu dans les cellules qui présentent des
membranes plasmiques intègres. Un avantage majeur du CFDA est la présence importante de
charges électriques négatives qui accroissent sa rétention dans le milieu cellulaire (par rapport
au FDA classique). Par ailleurs, dans le cas de bactéries endommagées présentant une activité
estérase résiduelle, les membranes détériorées ne retiennent plus ni le CFDA non hydrolysé,
ni son produit fluorescent qui ressortent alors dans le milieu. Il existe plusieurs réactifs
commerciaux utilisant ce principe, dont le Chemchrome V6 (AES Chemunex, France). Les
bactéries viables peuvent être quantifiées en couplant ce principe avec des méthodes de
détection adaptées telles que la cytométrie en phase solide (Parthuisot et al. 2000; Parthuisot
et al. 2011) ou la cytométrie en flux (Herrero et al. 2006; Hoefel et al. 2003b) montrant une
quantification sous-estimée par la culture par rapport aux bactéries actives (Hoefel et al.
2003b). Le CTC (chlorure de 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium) permet de mettre en évidence
la respiration bactérienne par le biais de l’activité de la déshydrogénase (Bernard et al. 2001;
Leonard et al. 2016; Sawaya et al. 2008). De la réduction par ces enzymes de la chaîne
respiratoire résulte une précipitation, générant le formazan, un composé insoluble fluorescent
rouge (figure 19).

Figure 19 Structure du CTC et exemple de marquage sur des bactéries (Bartscht, 1999).

59
C’est un indicateur de l’activité respiratoire (transport des électrons) des microorganismes
dont l’utilisation peut présenter une corrélation avec les méthodes de culture (Ramalho et al.
2001) ou l’intégrité membranaire (Lopez-Amoros et al. 1997). Cependant, il a été démontré
que certaines bactéries ne réduisent pas le CTC malgré une activité métabolique et que seules
les plus actives peuvent être détectées par cette méthode (Parthuisot et al. 2000; Servais et al.
2001).

Il existe également des moyens de détection spécifiques, basés sur une activité enzymatique
qui n’est pas universelle chez les bactéries mais présente uniquement chez certaines espèces.
Cette activité peut être révélée via un substrat couplé à un composé capable d’émettre un
signal, suite au clivage de ce complexe par l’enzyme ciblée, spécifique d’un microorganisme
donné. Dans le cas d’Escherichia coli, l’enzyme spécifique visée est la β-D-glucoronidase. Ce
principe a été testé pour la détection d’Escherichia coli dans des échantillons d’eau potable
(Van Poucke and Nelis 2000a; Van Poucke and Nelis 2000b) via la cytométrie en phase
solide; l’étude reporte que 90% des échantillons testés présentent une corrélation entre cette
méthode alternative et la culture classique et une meilleure sensibilité avec une détection de
faibles concentrations de cellules situées entre 1 et 11 bactéries par millilitre.

Les marqueurs sensibles au potentiel membranaire

Certains fluorochromes peuvent s’accumuler en fonction de l’intensité du potentiel de
membrane des différents compartiments cellulaires. En effet, les compartiments internes étant
très électronégatifs par rapport au milieu extérieur, ils attirent ces molécules. Le potentiel
interne de la mitochondrie des cellules eucaryotes étant 2 à 3 fois plus élevé que celui de la
membrane plasmique, l'accumulation de la sonde est donc majoritairement mitochondriale.
Chez les bactéries, il n’y a pas de mitochondrie ni d’autre compartiment cellulaire, mais le
compartiment cytoplasmique est électronégatif par rapport à l’environnement extracellulaire.

La rhodamine 123 est le chef de file de ce type de fluorochrome, sous forme d’une sonde
cationique lipophile et son incorporation dépend principalement du potentiel membranaire.
Elle s’accumule au niveau des mitochondries des eucaryotes ou du cytoplasme des
procaryotes révélant ainsi une activité cellulaire (Forsman et al. 2000; Lopez-Amoros et al.
1995; Lopez-Amoros et al. 1997). L’utilisation de la rhodamine a cependant un inconvénient
majeur car elle peut marquer de la même manière les cellules bactériennes vivantes et les
cellules bactériennes mortes dont le potentiel de membrane n’est pas totalement dissipé.

Une autre molécule, la 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6(3)), est capable de

traverser aisément les membranes bactériennes (figure 20) quel que soit leur état (Diaper et al.
1992).

Figure 20 Molécule de DIOC6(3) et exemple de marquage sur bactéries (Herskovits, 2002).

60
L’inconvénient majeur de cette molécule est qu’elle ne peut pas pénétrer à l’intérieur des
bactéries à Gram négatif du fait de la présence d’une membrane externe (absente chez les
bactéries à Gram positif) qui l’empêche d’atteindre la membrane cytoplasmique. Cet
inconvénient a constitué un frein à son usage en microbiologie d’une manière générale et en
microbiologie de l’eau en particulier.

Les marqueurs des acides nucléiques

Cette partie présente des exemples de marqueurs fluorescents capables de se fixer sur les
acides nucléiques et d’émettre de la fluorescence après fixation et excitation. Ces techniques
permettent de visualiser les bactéries possédant encore de l’ADN et/ou de l’ARN mais
également témoigner de l’intégrité de la paroi cellulaire par association de plusieurs
fluorochromes. Les fluorochromes considérés comme perméants ont la capacité de pénétrer
librement dans toutes les cellules, qu’elles soit viable puis de se fixer sur les acides
nucléiques. Le DAPI (4',6’-diamino-2-phenylindole) est une molécule se liant de façon forte à
l’ADN (grâce à la reconnaissance spécifique des liaisons A-T), marquant ainsi sans
distinction l’ensemble des cellules possédant un ADN et émettant dans le bleu sous excitation
aux UV (figure 21).

Figure 21 Structure du DAPI et exemple de marquage sur des bactéries (Kikot, 2010).

Cette méthode est l’une des plus couramment utilisées pour le marquage des bactéries totales
(Marconnet et al. 2011). Les marqueurs Hoechst (33258 et 33342), dont les longueurs d’ondes
d’absorption et d’émission sont similaires, peuvent également être utilisés en remplacement
du DAPI. Le principe de marquage des bactéries par le Hoechst ou par d’autres marqueurs
comme le SYTO 9, le SYTO 59 ou le SYBR Green I ou II est identique à celui du DAPI. Le
SYBR Green est un marqueur des acides nucléiques capable de pénétrer dans toutes les
cellules et ce, quel que soit leur état physiologique. Ce principe est très largement utilisé pour
le dénombrement de bactéries par cytométrie en flux (Hammes et al. 2008; Hammes et al.
2012a; Hammes and Egli 2010; Wang et al. 2010b) avec une potentielle application pour
l’écologie virale (Brown et al. 2015; Duhamel and Jacquet 2006).

Les fluorochromes considérés comme imperméants ne peuvent marquer que les cellules
mortes ou endommagées, c’est-à-dire celles qui ont perdu leur intégrité membranaire. Ces
molécules peuvent donc être utilisées comme indicateurs de viabilité cellulaire car les
membranes plasmiques intactes, caractéristiques des cellules vivantes, sont imperméables à
ces composés. L’iodure de propidium (PI) est un colorant fluorescent des acides nucléiques
(figure 22). Il se fixe au niveau des ADN en s’intercalant entre les bases sans affinité
particulière pour des séquences spécifiques et avec une stœchiométrie d’une molécule de PI

61
pour 4 à 5 paires de bases. Cependant, il a été démontré que les bactéries marquées par le PI,
indiquant une perte de l’intégrité membranaire, peuvent être dans un état transitoire
réversible, en particulier au cours de le la phase de croissance exponentielle (Shi et al. 2007).
Cet aspect suggère que l’interprétation liée à l’utilisation du PI est à nuancer quant à la
viabilité des cellules bactériennes.

Figure 22 Structure du PI (a) et exemple de marquage sur des cellules (Mei, 2013).

L’éthidium homodimer-2 (EthD-2) est également un intercalant des acides nucléiques et a une
forte affinité pour les molécules d’ADN double brin. A l’instar de l’iodure de propidium, le
SYTOX est une molécule ne pouvant pénétrer que dans une cellule ayant une membrane
compromise pour se lier à son ADN.

L’utilisation conjointe de marqueurs peut permettre d’atteindre un niveau d’information qu’il

n’aurait pas été possible d’obtenir avec une utilisation séparée de chacun des marqueurs. Un
exemple de ce double marquage, implique le SYBR Green II et l’iodure de propidium appelé
« Nucleic Acid Double Staining ou NADS » (Berney et al. 2007; Gregori et al. 2001; Gregori
et al. 2003; Hammes et al. 2012b). Les membranes cellulaires sont perméables au SYBR
Green II quel que soit leur état alors que les cellules vivantes sont imperméables au PI.
L’avantage de cette association réside dans le fait qu’une seule longueur d’onde peut
permettre d’exciter deux fluorochromes présentant des longueurs d’onde d’émission très
éloignées. En effet, lors de l’excitation à 488 nm, l’efficacité du marquage repose sur le
transfert d’énergie de fluorescence par résonance (FRET) du SYBR Green vers le PI lorsque
ces deux fluorochromes sont fixés à proximité l’un de l’autre sur les acides nucléiques (figure
23). L’énergie de fluorescence verte du SYBR Green peut donc être absorbée par le PI dans
les conditions requises, qui pourra alors émettre une fluorescence rouge. Par conséquent, les
cellules dont les membranes sont compromises, donc perméables au PI, fluorescent en rouge
alors que les cellules aux membranes intactes, donc imperméables au PI, ne fluorescent que
dans le vert.

62
Figure 23 Principe du transfert d’énergie par résonance (FRET) et exemple de marquage au SYBR Green II et au PI
sur des bactéries (Présentation Gérald Grégori).

Les cellules dont les membranes sont partiellement endommagées laissent pénétrer des
quantités variables de PI ce qui entraîne une augmentation de l’intensité de fluorescence rouge
au détriment de l’intensité de leur fluorescence verte, en relation directe avec l’importance du
transfert d’énergie du SYBR Green sur le PI. Le SYTO 9 est une molécule pouvant traverser
aussi bien les membranes endommagées que celles intactes. Une fois lié à l’ADN et excité
(485 nm), le SYTO 9 émet une fluorescence verte (498).

Couplé avec l’iodure de propidium (de manière analogue au double marquage SYBR
Green/PI), il permet d’évaluer la viabilité bactérienne (Hoefel et al. 2003b) mais avec une
sensibilité moindre en réponse à un stress oxydant par rapport à une méthode telle que le CTC
(Boulos et al. 1999). Un kit utilisant ces deux fluorochromes est commercialisé sous
l’appellation BACLIGHT (Invitrogen).

III. ETAT DES LIEUX ET AVANT-PROPOS

La précédente synthèse bibliographique a permis de mettre en lumière d’une part les
différentes problématiques liées à l’eau et de lister différentes solutions pour y remédier. En
effet, outre le fait de garantir une qualité microbiologique de l’eau destinée à a consommation
humaine, c’est-à-dire d’être dépourvue de toute entité biologique susceptible d’engendrer une
pathologie, la raréfaction et la pollution de la ressource nécessaire à la production d’eau
potable s’avère être également une complication majeure. Il apparait donc que le suivi de la
prise d’eau jusqu’à la distribution à la population est indispensable pour assurer la fiabilité
d’une filière de production. En marge des méthodes et des paramètres préconisées par la
réglementation, un large panel de moyens alternatifs est actuellement disponible en ce qui
concerne l’autocontrôle. La difficulté réside dans le fait d’être en mesure de sélectionner la ou
les méthodes les plus adaptées aux contraintes relatives à la gestion de l’eau. La précision, la
sensibilité, la représentativité, la rapidité, la complexité, représentant ce que l’on pourrait
qualifier de performances des différentes techniques, sont à confronter aux besoins des acteurs
intervenant au niveau de la qualité de l’eau, et ainsi être utilisé comme outils d’aide à la
décision.

63
Le choix de la méthodologie d’analyse peut en premier lieu être effectué en tenant compte du
niveau d’information requis, c’est-à-dire la détection d’un pathogène ou d’un indicateur
spécifique (ex : Legionella pneumophila ou Escherichia coli), d’une population ciblée (ex :
les cyanobactéries) ou d’un état physiologique donnée (ex : bactéries viables non-cultivables).
En second lieu, la représentativité de l’échantillon est également primordiale. En effet, la
quantité de microorganismes diminue au cours de la filière de production d’eau potable, au fur
et à mesure des étapes de traitements. De ce fait, la quantité de microorganismes dans l’eau
produite est théoriquement faible et peut donc nécessiter une concentration préalable avant de
procéder à l’analyse elle-même.

Les présents travaux avaient pour objectif de répondre à une demande de contrôle rapide et
précis de l’efficacité de différents types de traitement de l’eau destinée à la consommation
humaine et également à usage industriel. Au regard des besoins recensés au niveau de la
production d’eau potable et de la gestion des tours aéroréfrigérantes, une méthode capable de
permettre la quantification de la population microbienne globale avec distinction de la
fraction de cellules viables a été souhaitée. De plus, des contraintes liées à l’application de la
méthode par l’opérateur et au délai d’obtention du résultat ont complété les spécifications
techniques. Cette démarche vise à pouvoir être capable de juger de l’efficacité et de l’impact
de traitements actuels ou en cours de développement tant à l’échelle du laboratoire que sur des
installations réelles.

La cytométrie en flux a été proposée du fait que ses avantages annoncés au niveau de la
littérature répondent au cahier des charges. En vue de l’évaluation des performances et de la
validation de la cytométrie en flux, le protocole a été axé en premier lieu sur une phase
d’optimisation expérimentale en laboratoire utilisant différentes souches bactériennes et
matrices environnementales, puis sur une seconde phase de validation à échelle réelle avec
pour objectif de permettre aux potentiels futurs utilisateurs de se projeter vers une application
industrielle.

64
Partie II - MATERIEL & METHODES

65
 I. VUE D’ENSEMBLE: ECHANTILLONS ET METHODES ANALYTIQUES
Cette section présente une vue globale du type d’échantillons et des méthodes analytiques
employées pour les caractériser au cours de ces travaux. Il est important de souligner que
toutes les méthodes présentées dans cette partie n’ont pas été appliquées pour chaque étude,
du fait de leur disponibilité au moment des essais et/ou de leur nécessité selon les besoins
relatifs aux objectifs. Le tableau 5 expose le domaine d’application, la nature des échantillons
et les techniques utilisées selon l’étude.
Tableau 5 Origine des souches bactériennes et type de traitement biocide appliqué
Application Etude n°1 Etude n°2 Etude n°3
Production d'eau potable Production d'eau potable Tours aéroréfrigérantes
Echantillons Eau avant chloration Eau de rivière (ressource) Eau de circuit de TAR tertiaires
naturels
Eau après chloration Eau filtrée sable* Cultures isolées de TAR tertiaire et industrielle
Eau produite Eau ozonée*
Eau filtrée CAG*
Eau produite
Echantillons Eau physiologique et Escherichia coli Eau physiologique et Escherichia coli Eau physiologique et isolats de TAR tertiaire
artificiels**
Eau physiologique et Enterobacter Eau potable et Escherichia coli Eau physiologique et isolats de TAR industrielle
Eau physiologique et Enterococcus faecalis Eau filtrée sable et Escherichia coli
Méthodes Cytométrie en flux (FACSCalibur) Cytométrie en flux (FACSCanto II) Cytométrie en flux (FACSCanto II et Accuri C6)
analytiques
Cytométrie en phase solide (Chemscan) Cytométrie en phase solide (Chemscan) ATPmétrie (Aquatools)
Microscopie à épifluorescence Microscopie à épifluorescence Microscopie à épifluorescence
Culture (PCA et R2A) Culture (PCA et R2A) Culture (PCA)
* eau prévelée en cours de process de production d’eau potable
** l’eau physiologique utilisée est stérilisée par autoclavage avant l’ajout de bactéries
PCA : Plate Count Agar
R2A: Reasoner's 2 Agar
CAG : Carbone Activé Granulaire

Les travaux peuvent se découper en 3 études différentes mais ayant pour but commun de
confronter les performances de la cytométrie en flux à celles de méthodes usuelles appliquées
pour le contrôle de la qualité de l’eau en cours de traitement.

 L’étude n°1 porte sur l’analyse d’eau en sortie d’une filière de traitement avant
distribution dans le réseau d’eau potable.
 L’étude n°2 est axée sur l’analyse d’eau au niveau des différentes étapes de traitement
de 3 usines de potabilisation.
 L’étude n°3 a pour objectif d’évaluer l’impact de traitements biocides d’eaux issues de
circuits de tours aéroréfrigérantes.

Un échantillon naturel est un échantillon n’ayant subit aucun traitement particulier en

laborartoire avant le marquage et l’analyse. Un échantillon dit artificiel peut être soit (1) une
eau physiologique dopée avec une souche pure provenant d’une collection, soit (2) une eau
physiologique dopée avec une population naturelle isolée de l’environnement ou soit (3) une
eau naturelle dopée avec une souche pure de collection.

66
Les différentes approches employées permettent d’obtenir des informations distinctes et
précises quant à l’état physiologique ou à l’intégrité de structure des cellules, au niveau de
l’intégrité de leur membrane ou de leur matériel génétique, au niveau de leur activité
métabolique ou de leur capacité à se multiplier. L’utilisation conjointe de ces méthodes
permet de comparer leurs performances et leur pertinance en ce qui concerne la surveillance
d’installations en termes de qualité microbiologique de l’eau. Le tableau 6 représente un
récapitulatif des informations pouvant être obtenues concernant l’état physiologique cellulaire
selon la méthode utilisée.
Tableau 6 Type d’information obtenue sur l’état physiologique de cellules en fonction de la méthode analytique

PCA : Plate Count Agar

R2A : Reasoner's 2 Agar
DAPI: 4,6-diamino-2-phenylindole
CTC: 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride

 La cytométrie en flux permet de quantifier les cellules totales, intègres et actives

 La cytométrie en phase solide à balayage laser permet de quantifier les cellules actives
 La microscopie permet de quantifier les cellules totales, intègres et actives
 La culture sur en milieu gélosé permet de quantifier les cellules cultivables

67
L’interprétation des résultats obtenus par les méthodes précitées permet d’obtenir des
informations quant à la cible cellulaire impactée par les conditions environnementales ou un
traitement de désinfection.

II. METHODES ANALYTIQUES UTILISEES

Cette section présente d’une part les méthodes de quantification de cellules et de mise en
évidence de leur viabillité et d’autre part les outils anaytiques utilisés pour la mise en œuvre
des différents principes de détection.

II.1. LA CYTOMETRIE EN FLUX

Le principe de la cytométrie en flux est basé sur la quantification et la classification des
cellules en suspension dans une matrice liquide. Lors de l’analyse d’un échantillon, les
cellules sont visualisées sous forme de représentations électroniques, appelées événements, en
fonction des signaux relatifs à leur forme, structure et fluorescence. La figure 24 présente un
cytogramme type après marquage d’un échantillon au SYBR Green II (fluorescence verte) et
iodure de propidium (fluorescence rouge) pour la mise en évidence de l’intégrité de la paroi
cellulaire des bactéries.

Figure 24 Représentation type d’un cytogramme suite au marquage d’un échantillon d’eau par SYBR Green
II et iodure de propidium

Trois types de cytomètres en flux ont été utilisés lors des 3 études menées de la manière
suivante : le FACSCaliburTM pour l’étude n°1 (eau potable chlorée en fin de filière), le
FACSCantoTM II pour l’étude n°2 (suivi de 3 usines de production d’eau potable), le
FACSCantoTM II et l’ACCURITM C6 pour l’étude n°3 (désinfection d’eaux de tours
aéroréfrigérantes).

68
II.1.1. Appareillage

II.1.1.1 FACSCantoTM II
Le cytomètre en flux de type FACSCantoTM II (Becton Dickinson, Californie, USA) est
équipé d’un laser bleu (488 nm, 20 mW) et d’un laser rouge (633 nm, 17 mW) avec des
photomultiplicateurs de 530/30, 585/42, >670, 660/20, 780/60 nm (figure 25). La résolution
FSC et SSC sont de 1,0 µm et 0,5 µm, respectivement. Les débits minimum et maximum sont
de 10µL/min. et 120 µL/min., respectivement. Le logiciel associé est FACSDIVATM.

TM
Figure 25 Cytomètre en flux FACSCanto II utilisé au laboratoire
Il s’agit d’un appareil de laboratoire (non-transportable) avec une prise d’échantillon
ponctuelle du fait d’un système pressurisé. Le volume maximum analysé est de 1 ml avec une
sensibilité d’environ 100-1000 bactéries/mL. L’avantage majeur de cet équipement réside
dans le fait qu’il est possible de régler les différents paramètres de détection tels que la
puissance des lasers.

II.1.1.2 ACCURI C6
Le cytomètre en flux de type ACCURITM C6 (Becton Dickinson, Californie, USA) est équipé
d’un laser bleu (488nm, 20 mW) et d’un laser rouge (640 nm, 14,7 mW) avec des
photomultiplicateurs de 533/30, 585/40, >670, 675/25 nm (figure 26). La résolution maximale
au niveau de la taille des particules et de 0,5 µm. Les débits applicables sont de 14 µL/min.,
35 µL/min. et 66 µL/min., respectivement.

TM
Figure 26 Cytomètre en flux ACCURI C6 utilisé au laboratoire
Il s’agit d’un appareil transportable avec une prise d’échantillon ponctuelle ou en continu via
une pompe péristaltique intégrée, ce qui constitue deux avantages majeurs. De ce fait, le
volume pouvant être analysé n’est pas limité. Cependant, il est important de rappeler que plus
le volume est grand, plus le délai de résultat est long. La sensibilité de ce système est similaire
au système fixe FACSCantoTM II (100-1000 bactéries/mL). Contrairement au système précité,
le paramétrage est plus limité (pas de réglage de l’intensité des lasers).

69
II.1.1.3 FACSCaliburTM
Le cytomètre en flux de type FACSCaliburTM (Becton Dickinson, Californie, USA) est équipé
d’un laser bleu (488 nm, 15 mW) avec des photomultiplicateurs de 530/30, 585/42, >650,
661/16 nm (figure 27). Les débits applicables sont de 12 µL/min., 35 µL/min. et 60 µL/min.,
respectivement. Le logiciel associé est CellQuestTM.

TM
Figure 27 Cytomètre en flux FACSCalibur utilisé au laboratoire

Similairement au FACSCantoTM II, il s’agit d’un appareil de laboratoire (non-transportable)

avec une prise d’échantillon ponctuelle du fait d’un système pressurisé. Le volume maximum
analysé est de 1 mL avec une sensibilité d’environ 100-1000 bactéries/mL. Cependant, le fait
qu’il n’y ait qu’un seul laser pour l’excitation peut limiter le panel d’utilisation de marqueurs
fluorescents.

II.1.2. Marquage
Les marqueurs sont choisis de façon à induire l’émission d’une fluorescence permettant d’une
part la quantification des cellules et d’autre part la discrimination de la fraction viable au sein
de la population. Pour éviter toute déperdition de fluorescence, tous les marquages se font à
l’obscurité. Pour évaluer l’autofluorescence des cellules et des particules inertes présentes
dans chaque échantillon et la déduire de la fluorescence mesurée après marquages, des tubes
non-marqués de chaque échantillon servant de témoins négatifs sont soumis aux différentes
analyses dans les mêmes conditions.

II.1.2.1 Méthode de marquage pour l'estimation de l'intégrité membranaire des

bactéries
Le protocole utilisé lors de cette étude est dérivé de travaux issus de la littérature (Barbesti et
al. 2000; Falcioni et al. 2006; Falcioni et al. 2008b; Gregori et al. 2001; Joux and Lebaron
2000; Manini and Danovaro 2006). La méthode de marquage permet d’évaluer la viabilité
d’une bactérie via son état d’intégrité membranaire. Le principe est basé sur l’utilisation
conjointe des deux fluorochromes SYBR Green II (SGII) et iodure de propidium (PI). La
procédure de marquage des bactéries est la suivante : à 1 mL ou 100 µL d’échantillon dilué
dans 880 µL d’eau physiologique, 10 µL de la solution stock de PI (concentration finale de 10
µg/ml) et 10 µL de la solution intermédiaire de SYBR Green II (solution commerciale diluée
au 1:100 dans du Dimethyl Sulfoxyde, DMSO) sont simultanément ajoutés. Le marquage se
fait à température ambiante, à l’obscurité avec un temps de contact de 20 minutes. L’analyse
est ensuite effectuée extemporanément. Les résultats sont exprimés en bactéries/mL.

70
II.1.2.2 Méthode de marquage pour la détection de l'activité enzymatique cellulaire
La méthode utilisée pour la mise en évidence de l’activité bactérienne emploie le
fluorochrome ChemchromeV6. Le principe est basé sur la pénétration passive d’un substrat
fluorogénique à l’intérieur de la cellule qui ne libère un métabolite fluorescent uniquement
après dégradation du substrat par les enzymes estérases. La procédure de marquage pour
estimer l’activité enzymatique des bactéries est la suivante : 100 µL d’échantillon sont ajoutés
à 890 µL de solution tampon Chemsol B16 (AES-Chemunex, France) et 10 µL de la solution
stock (concentration initiale non précisée) de Chemchrome V6 (AES-Chemunex, France). Le
marquage se fait à l’obscurité, à 30°C durant 30 minutes. L’analyse est ensuite effectuée
extemporanément. Les résultats sont exprimés en bactéries/mL.

II.2. LA CYTOMETRIE EN PHASE SOLIDE A BALAYAGE LASER

Le principe de la cytométrie à balayage laser est proche de celui de la cytométrie en flux ; la
différence majeure est liée au fait que l’échantillon est préalablement filtré sur une membrane
(phase solide). La cytométrie en phase solide à balayage laser a été utilisée lors de l’étude n°1
(eau potable chlorée en fin de filière) et l’étude n°2 (suivi de 3 usines de production d’eau
potable). Lors de l’analyse d’un échantillon, les cellules sont visualisées sous forme de
représentations électroniques, appelées événements, en fonction des signaux relatifs à leur
fluorescence. Ces événements sont ensuite validés via un microscope en vue de confirmer s’il
s’agit d’une cellule ou d’une particule autofluorescente.

II.2.1. Appareillage
Le cytomètre en phase solide à balayage laser ChemScan® RDI (Chemunex, France) est
équipé d’un laser bleu (488 nm) avec des photomultiplicateurs présentant des fenêtres de 500–
530 nm et 540–585 nm (figure 28).

Figure 28 Cytomètre en phase solide à balayage laser ChemScan® RDI utilisé au laboratoire

Il s’agit d’un appareil de laboratoire (non-transportable) avec une prise d’essai de 100 µL
d’échantillon du fait du risque de bruit de fond apporté par les particules retenues sur la
membrane lors de la filtration de l’échantillon. En revanche, les avantages résident dans le fait
que la sensibilité est d’une seule bactérie par volume filtré et que la membrane scannée peut
être ensuite visualisée par microscopie. En effet, une fois le scan effectué automatiquement
par le système (environ 3 minutes), la lame supportant la membrane est placée sur un
microscope à épifluorescence associé et chaque évènement fluorescent détecté et repositionné
pour être validé manuellement par un opérateur. Malgré l’aspect automatisé, cette validation
après le scan peut s’avérer fastidieuse et ajouter un délai au niveau de l’obtention du résultat.

71
II.2.2. Marquage
A l’instar de la cytométrie en flux, le protocole de marquage pour la mise en évidence des
cellules actives utilise également le réactif Chemchrome V6. Après filtration sur une
membrane de porosité 0,2 µm, un réactif favorisant la revivification des cellules et un contre
colorant sont ajoutés à la surface de la membrane, suivi d’une une incubation d’1 heure à
37°C. Après rinçage, le Chemchrome V6 est ajouté avec une période de contact de 30 minutes
à 30°C à l’obscurité. Après montage entre lame et lamelle, la membrane est placée à
l’intérieur du système en vue de subir un scan laser pour la détection des évènements
fluorescents. Les résultats sont exprimés en bactéries/mL.

II.3. LA MICROSCOPIE A EPIFLUORESCENCE

La microscopie à épifluorescence a été utilisée lors de l’étude n°1 (eau potable chlorée en fin
de filière) et l’étude n°2 (suivi de 3 usines de production d’eau potable).

II.3.1. Appareillage
Le microscope LEITZ DMRB (Leica Microsystems, Allemagne) est équipé d’un système à
épifluorescence (lampe OSRAM, Allemagne) et d’un jeu de filtres permettant d’obtenir des
longueurs d’ondes d’excitation de 404/20, 494/20 et 576/20 nm (figure 29).

Figure 29 Microscope à épifluorescence LEITZ DMRB utilisé au laboratoire

Il s’agit d’un appareil de laboratoire (non-transportable) avec une prise d’essai pouvant aller
de 1 à 10 mL selon le réactif utilisé. L’avantage réside dans le fait que les bactéries peuvent
être directement visualisées et discriminées et l’inconvénient que la lecture est manuelle et
donc longue et opérateur-dépendante. D’autre part, seule une partie des champs représentant
une fraction du volume analysé est dénombrée, résultant en un possible biais lors de
l’extrapolation au volume total analysé.

II.3.2. Marquage
La procédure de marquage concernant l’utilisation conjointe du SYBR Green II et de l’iodure
de propidium, pour l’évaluation de l’intégrité membranaire, est similaire à celle décrite pour
la cytométrie en flux. L’échantillon marqué (1 mL) est filtré (sur une rampe de filtration
Millipore, Massachusetts, USA) à travers une membrane noire en polyéthylène de 25 mm de
diamètre et de 0,2 µm de porosité (Millipore, Massachusetts, USA). Le marquage au DAPI
(4,6-diamino-2-phenylindole) pour le dénombrement des cellules totales, est basé sur l’ajout à
hauteur de 1% (v/v) d’une solution à 0,25 mg/mL à un échantillon (1 à 10 mL) suivi d’une

72
incubation de 20 minutes à température ambiante à l’obscurité. L’échantillon marqué est filtré
(sur une rampe de filtration Millipore, USA) à travers une membrane noire en polycarbonate
de 25 mm de diamètre et de 0,2 µm de porosité (Millipore, USA). Le marquage au CTC (5-
cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride, Polysciences, USA), pour la mise en évidence de la
respiration bactérienne, est obtenu par mise en contact de l’échantillon avec une solution à
0,64 mg/mL suivi d’une incubation de 2 heures à température ambiante à l’obscurité.
L’échantillon marqué est filtré (sur une rampe de filtration Millipore, USA) à travers une
membrane noire en polycarbonate de 25 mm de diamètre et de 0,2 µm de porosité (Nuclepore,
France). La membrane est ensuite placée sur une lame, puis une goutte de « Mounting
medium » (Chemunex laboratoire, France) est déposée, avant de placer une lamelle. Le
montage, protégé de la lumière, est directement observé au microscope à épifluorescence.
Pour cela, une goutte d’huile à immersion pour microscopie (Merck, Allemagne) est déposée
sur le montage. La lecture est effectuée à l’objectif x100 (grossissement final x1000) avec une
excitation adaptée selon le fluorochrome utilisé. Les concentrations des échantillons sont
ajustées théoriquement par dilution (selon la concentration usuelle rencontrée pour un
échantillon donné) afin de pouvoir dénombrer toutes les bactéries présentes sur un champ
microscopique. La numération des bactéries s’opère en dénombrant au minimum 10 champs
microscopiques contenant idéalement un minimum de 20 cellules. La concentration de
bactéries par millilitres est obtenue par le calcul suivant (les résultats sont exprimés en
bactéries/ml) : C=Nxcxd
C = Concentration en bactérie par millilitre d’échantillon
N = Nombre moyen de bactéries / champ microscopique
c = coefficient du microscope à épifluorescence (= nombre de champs total)
d = Facteur de dilution

II.4. LA MESURE DE L’ATP

La mesure de l’ATP a été utilisée uniquement lors de l’étude n°3 (désinfection d’eaux de
tours aéroréfrigérantes).

II.4.1. Appareillage
Le luminomètre LB 9509 (Berthold, Allemagne) couvre une gamme de lecture de
luminescence allant de 380 à 630 nm (figure 30).

Figure 30 Luminomètre LB 9509 utilisé au laboratoire

Il s’agit d’un appareil transportable mesurant instantanément l’intensité de luminescence pour

un volume donné avec une sensibilité de 3 fmol d’ATP par tube d’échantillon. L’avantage

73
principal réside dans le fait que la mesure soit instantanée. En revanche, l’inconvénient
majeur est le fait qu’une conversion du signal est nécessaire en vue d’obtenir une estimation
du nombre de cellules actives correspondant à l’intensité de luminescence. Or, il n’y a aucune
proportionnalité entre une concentration en ATP et une concentration cellulaire.

II.4.2. Marquage
Le kit QGA Quench-Gone Aqueous (Aquatools) a été utilisé pour la mesure de la
concentration en ATP contenu par les cellules actives. La première étape de la procédure
comprend une filtration de l’échantillon (25 mL) via une seringue sur un filtre (0,22 µm). Une
fois les bactéries immobilisées sur le filtre, 1 mL d’une solution de lyse (Ultralyse 7) est passé
au travers du filtre en vue d’extraire le contenu cellulaire (dont l’ATP) et le filtrat est récupéré
dans un tube de dilution (Ultralute).

Concernant la lecture, 100 µL de l’échantillon dilué sont mélangés avec 100 µL de solution
de l’enzyme luminase préalablement réhydratée (nature du tampon non spécifié par le
fournisseur) puis est placée pour lecture dans le luminomètre (Belkin) ; la valeur RLUcATP
mesurée est notée. Avant chaque série de test, un témoin positif est analysé : mélange de 100
µL d’Ultracheck et 100 µL d’enzyme luminase.

La mesure (RLUUC1) doit être supérieure à 5000 RLU afin de s’assurer de la stabilité de la
luminase. Ces valeurs sont prises en compte dans le calcul de conversion du signal en quantité
de bactéries via les formules suivantes (les résultats sont exprimés en microorganismes
équivalents/ml) :

II.5. LE DENOMBREMENT DES CELLULES BACTERIENNES

Le lecteur automatique de colonies sur boîte de Petri a été utilisé pour l’étude n°2 (suivi de 3
usines de production d’eau potable) et pour l’étude n°3 (désinfection d’eaux de tours
aéroréfrigérantes). Concernant l’étude n°1 (eau potable chlorée en fin de filière), le comptage
des colonies a été manuel.

II.5.1. Appareillage
Le compteur automatique de colonies Scan® 1200 est composé d’une caméra présentant une
résolution de 1,2 mégapixels et d’un système d’éclairage (figure 31). Cet appareil permet la
détection de colonie d’une taille minimum de 0,05 mm et également de dénombrer des
colonies confluentes par prise d’image.

74
 Figure 31 Compteur de colonies Scan® 1200 utilisé au laboratoire

Le logiciel associé permet d’une part de paramétrer le contraste et l’intensité liés à la source
lumineuse et d’autre part de sélectionner soit la totalité de la surface de la boîte de Petri, soit
une partie de celle-ci, dont la quantité de colonies sera extrapolée à la totalité de la surface.

II.5.2. Mise en culture

Les germes totaux hétérotrophes ont été dénombrés (1) par inclusion dans le milieu PCA
(Plate Count Agar- AES Laboratoire - France) après incubation d’1 ml des dilutions adéquate
à 37°C durant 48 heures (NF EN ISO 6222) et (2) par inclusion dans le milieu R2A
(Reasoner's 2 Agar - AES Laboratoire - France) qui est un milieu contenant de faibles
concentrations d’éléments nutritifs variés permettant de mettre en évidence les bactéries
hétérotrophes stressées par les conditions du milieu environnemental et/ou par les traitements
subis, après 11 jours d’incubation à 22°C.

La lecture via le système automatisé Scan® 1200 a été effectuée à une intensité lumineuse
fixée entre 80 et 85% selon l’échantillon. Les résultats sont exprimés en UFC/mL (Unité
Formant Colonie par millilitre). Le dénombrement des Escherichia coli a été effectué selon la
méthode normalisée (ISO 9308-1, 1990) via le milieu gélosé TTC (chlorure de 2-3-5
triphényl-tétrazolium) Tergitol 7 (AES Chemunex, France). Le TTC indique le pouvoir
réducteur des bactéries et le tergitol 7 permet de sélectionner les coliformes en inhibant les
bactéries à Gram positif. Les E. coli donnent des colonies jaunes-oranges qui indiquent une
absence de réduction du TTC. Les géloses sont incubées à 37°C pendant 48h en aérobiose
pour E. coli et E. faecalis Une lecture intermédiaire est réalisée à 24h. Les résultats sont
exprimés en UFC/mL.

II.6. LES MESURES PHYSICO-CHIMIQUES

Concernant les échantillons réels provenant des usines de production d’eau potable (étude n°1
& 2), les mesures de carbone organique total (COT en mg/L), la turbidité (en NTU ou NFU),
la température de l’eau (°C), le chlore libre (mg/L) et les précipitations (mm) durant toute la
période de la campagne ont été effectuées et transmises par chacune des trois usines.

Concernant les échantillons réels provenant de tours aéroréfrigérantes (étude n°3), les
analyses physico-chimiques ont été effectuées soit directement sur le terrain par l’opérateur
chargé du prélèvement, soit au laboratoire avec les méthodes suivantes :

75
  pHmètre pH 1000 L pHenomenal (VWR) pour la mesure du pH. Les résultats sont
exprimés en unités pH.
 Turbidimètre 2100 AN IS (HACH) pour la mesure de la turbidité. Les résultats sont
exprimés en NTU ou NFU.

 Metrhom 712 conductometer pour la mesure de la conductivité. Les résultats sont

exprimés en S/cm.

 Spectrophotomètre EUTECH Instruments ECC201 pour la mesure du chlore libre par

colorimétrie après addition de DPD. Les résultats sont exprimés en mg/L ou ppm
(partie par million).

Les méthodes précitées ont également été appliquées pour la mesure des données physico-
chimiques des échantillons dits artificiels (ex : PBS, eau physiologique).

III. MATERIEL BIOLOGIQUE & ECHANTILLONNAGE

Cette section expose pour chacune des études la provenance et la nature du matériel
biologique utilisé pour l’optimisation et la validation de l’approche analytique. Dans un
premier temps, avant de procéder aux essais sur échantillons réels, des souches pures ou des
souches naturelles isolées ont été employées afin de s’affranchir d’un potentiel effet matrice
et de pouvoir se focaliser uniquement sur les cellules. Le tableau 7 résume par étude les
espèces et/ou populations bactériennes utilisées et le type de traitement appliqué en vue de
pouvoir créer des fractions viables et non-viables.
Tableau 7 Origine des souches bactériennes et type de traitement biocide appliqué
Etude n°1 Etude n°2 Etude n°3
Population bactérienne Escherichia coli* Escherichia coli* Isolat de TAR tertiaire
Enterococcus faecalis** Enterobacter cloacae*** Isolat de TAR industrielle
Enterococcus faecalis**
Type de traitement Thermique Physique Chimique
Moyen employé Température Ultra-violets HOBr, NaOCl, NaBr
2
Dose appliquée 70°C 1500 µW/cm 0,5 ppm
Durée d’exposition 15 minutes 0, 5, 15, 25 minutes 0, 5, 15, 30, 60 minutes
*Escherichia coli : NCTC 13167
**Enterococcus faecalis : CCM 2541
***Enterobacter cloacae : NCTC 10005

Concernant les souches de référence issues de collections (étude n°1 & 2), ces espèces ont été
sélectionnées en vue de représenter différentes structures pariétales bactériennes pouvant être
rencontrées dans l’environnement : Escherichia coli K-12 (NCTC 13167) et Enterobacter
cloacae (NCTC 10005) pour les bacilles à Gram négatif et Enterococcus faecalis (CCM
2541) pour les coques à Gram positif. Concernant les populations naturelles isolées (étude
n°3), les deux isolats utilisés proviennent d’échantillons d’eau de tours aéroréfrigérantes
tertiaire et industrielle, respectivement (culture sur milieu PCA, 24h à 37°C).

76
III.1. ETUDE N°1 : APPLICATION SUR UNE EAU PRODUITE

III.1.1. Souches pures et isolées

Afin d’obtenir une population en phase exponentielle de croissance, une colonie de chaque
souche modèle (Escherichia coli et Enterococcus faecalis) est mise en culture dans un
bouillon cœur-cervelle (Brain Heart Infusion Broth, AES Chemunex, France), à une
température de 37°C et sous agitation rotative de 120 rpm durant 3h. La suspension obtenue
subit ensuite 2 lavages successifs : le culot cellulaire, obtenu après centrifugation (3000g, 10
min, 4°C), est resuspendu dans 10 mL de tampon phosphate buffer saline (PBS, Sigma
Aldrich, USA) à 0,01M, pH 7,4 et stérile (autoclavé à 121°C, 15 min).

Pour chaque souche modèle, des dilutions décimales en tampon PBS stérile (0,01M ; pH 7,4)
sont réalisées. En vue d’évaluer l’efficacité des méthodes de marquages développées pour
l’estimation de la viabilité des bactéries, des échantillons présentant différents ratios de
bactéries viables/bactéries non-viables sont réalisés. Pour ce faire, une suspension de bactéries
non-viables est nécessaire. Cette fraction est obtenue en plaçant 10 mL de la suspension
viable, au bain-marie à 70°C pendant 15 minutes, permettant, après vérification d’obtenir
100% d’inactivation. Des suspensions à des ratios de 0% de bactéries viables (traitement à
70°C/15 min.), 25%, 50% ou 75% de bactéries viables (mélange v/v de suspension traitée à
70°C/15 min. et suspension non-traitée) et 100% de bactéries viables (suspension n’ayant subi
aucun traitement).

III.1.2. Echantillons réels

Les échantillons analysés proviennent d’une filière de production d’eau potable (usine A)
utilisant une eau de rivière pour ressource, collectés de manière hebdomadaire durant 5
semaines. Pour chaque point, des volumes d’1 litre sont prélevés en duplicats dans des flacons
plastiques contenant 20 mg de thiosulfate de sodium (Na2S203, 5 H 20) pour neutralisation
du chlore résiduel. Les échantillons sont conservés à 4°c durant le transport et après réception
et sont analysés dans les 24 heures maximum après réception. L’eau est prélevée (i) avant le
début du traitement par chloration, puis (ii) après transfert dans un bassin de désinfection pour
subir un choc chloré suivi d’une déchloration intermédiaire au bisulfite de sodium et enfin
(iii) après une nouvelle étape de chloration afin d'atteindre une concentration résiduelle
appropriée pour l'eau distribuée.

Les valeurs CT (concentration x temps), fournies par les exploitants de l’usine, ont été
calculées en tenant compte du temps de contact dans le bassin de désinfection et le chlore
résiduel mesuré à la sortie du bassin. Cette valeur implique un coefficient de correction
(rendement hydraulique) pour connaître le temps de séjour efficace du bassin, ce qui reflète le
degré de court-circuit dans le bassin. Son utilisation garantit que 90% de l'eau traitée était en
contact avec le désinfectant pendant le temps requis.

77
III.2. ETUDE N°2 : APPLICATION SUR 3 FILIERES DE PRODUCTION D’EAU POTABLE

III.2.1. Souches pures et isolées

Afin d’obtenir une population en phase exponentielle de croissance, une colonie de chaque
souche modèle (Escherichia coli, Enterococcus faecalis et/ou Enterobacter cloacae) est mise
en culture dans un bouillon cœur-cervelle (Brain Heart Infusion Broth, AES Chemunex,
France), à une température de 37°C et sous agitation rotative de 120 rpm durant 3h. La
suspension obtenue subit ensuite 2 lavages successifs : le culot cellulaire, obtenu après
centrifugation (3000g, 10 min, 4°C), est resuspendu dans 10 mL de tampon PBS (Sigma
Aldrich, USA) à 0,01M, pH 7,4 et stérile (autoclavé à 121°C, 15 min). Une mesure de la
densité optique (entre 0,6 et 0,7) à 600 nm est réalisée en guise de confirmation. Pour chaque
souche modèle, des dilutions décimales en tampon PBS stérile (0,01M ; pH 7,4) sont
réalisées.

En vue d’évaluer l’efficacité des méthodes de marquages développées pour l’estimation de la

viabilité des bactéries, un suivi cinétique d’exposition aux UV a été appliqué. Pour ce faire,
une boîte de Petri ouverte contenant la suspension bactérienne est placée dans un caisson UV
(SpectrolinkerTM Spectronics Corporation - XL-100 UV Crosslinker). Une intensité moyenne
de 1500 µW/cm2, soit 15 J/s/m2 est appliquée en continu et des prélèvements sont effectués
avant exposition et après 5 minutes (lors du premier test pour Escherichia coli uniquement en
vue d’évaluer l’impact d’une durée courte), 15 minutes et 25 minutes (pour Escherichia coli,
Enterococcus faecalis et/ou Enterobacter cloacae) d’exposition. Chaque prélèvement est
ensuite analysé par culture et par cytométrie en flux.

III.2.2. Echantillons réels

Les échantillons naturels proviennent de 3 filières de potabilisation différentes (usines A, B et
C) utilisant des eaux de rivières distinctes pour ressource. Les points d’échantillonnage ont été
sélectionnés en vue du suivi sur une période de 5 mois de la quantité et de la viabilité de la
population bactérienne tout au long de la filière de production d’eau potable. Pour tous les
échantillons, des volumes d’1 litre ont été prélevés de manière hebdomadaire dans un
flaconnage plastique contenant 20 mg de thiosulfate de sodium (Na2S203, 5H20) pour
neutraliser le résiduel de chlore et ont été maintenus à une température de 4°C jusqu’à
réception au laboratoire. Les échantillons ont été analysés dès réception. La figure 32 présente
les points de prélèvement localisés au niveau d’une filière de potabilisation.

Figure 32 Localisation des points de prélèvement au niveau de la filière de production d’eau potable avec eau (1)
brute, (2) filtrée sable, (3) après ozonation, (4) après filtration sur charbon actif granulaire et (5) produite

78
Les 5 points d’échantillonnage précités sont communs aux 3 usines, excepté des prélèvements
supplémentaires pour les usines A (n=6) et C (n=11) en amont et aval d’un traitement UV,
situé après les filtres CAG, présentant des doses appliquées de 400 J/m2 et 250 J/m2,
respectivement.

III.3. ETUDE N°3 : APPLICATION SUR DES EAUX DE TOURS AEROREFRIGERANTES

III.3.1. Souches pures et isolées

En vue d’évaluer plus finement l’impact des biocides oxydants sur les cellules bactériennes
issues d’un échantillon de tour tertiaire et de tour industrielle, des essais en cinétique ont été
réalisés au laboratoire. Les bactéries utilisées pour ces tests proviennent d’une eau de TAR
tertiaire (essai n°1) alimentée avec de l’eau potable et d’une eau de TAR industrielle (essai
n°2) alimentée avec de l'eau de la rivière.

Après mise en culture sur milieu PCA (37°C, 48 heures) les colonies sont récupérées et
remises en suspension dans de l’eau physiologique pour analyse de la quantité initiale par
cytométrie en flux après marquage. Dans 100 mL d’eau physiologique a ensuite été ajoutée
une quantité connue de bactéries (calibrée préalablement par cytométrie en flux avec
marquage au SGII), 6 log pour l’essai 1 et 5 log pour l’essai 2. Des dilutions à partir des
solutions initiales de brome complexé (HOBr), hypochlorite de sodium (NaOCl) et bromure
de sodium (NaBr) ont été effectuées en vue d’obtenir la concentration finale visée pour
chaque biocide, c’est-à-dire 0,5 ppm.

Il est important de rappeler que les biocides HOBr et NaOCl sont utilisés seuls (pH visé= 8,5-
9 et 7-7,4, respectivement), contrairement au biocide NaBr qui est couplé au NaOCl (produit
de réaction= HOBr, pH visé= 8,5-9) avec des proportions de 70% et 30%, respectivement, en
termes de concentration. Après ajout du volume adéquat dans chaque flacon (excepté 1 flacon
témoin sans biocide), le mix bactéries/biocide est mis sous agitation continue (figure 33).

Figure 33 Cinétique d’exposition de bactéries (a) sans biocide, (b) HOBr, (c) NaOCl et (d) NaOCl+NaBr

Des prélèvements ont été effectués à T0 (avant ajout du biocide), T5min., T15min., T30min.
et T60min. pour analyse par cytométrie en flux, par culture (méthode standard, PCA) et
mesure du chlore libre (DPD).

79
III.3.2. Echantillons réels
Un total de 27 échantillons d’eau de tours aéroréfrigérantes tertiaires provenant de sites
différents a été prélevé. Pour 5 sites, 2 à 3 échantillons ont été collectés avec des écarts allant
de 3 à 6 mois. Pour tous les échantillons, un volume d’1 litre dans un flaconnage plastique
contenant du thiosulfate de sodium (Na2S203, 5H20) pour neutraliser le résiduel de chlore et
maintenu à une température de 4°C jusqu’à réception au laboratoire. Les échantillons ont été
analysés dans les 24 heures maximum après réception.

IV. TRAITEMENT STATISTIQUES DES DONNEES

Dans le but de confirmer les tendances observées au cours de l’étude, des tests statistiques
non-paramétriques ont été effectués afin de s’affranchir des conditions de normalité des
distributions nécessaire à une application fiable des tests paramétriques. Ces tests de
corrélations et les comparaisons de séries ont été réalisés via le logiciel XLSTAT (Addinsoft,
USA).

IV.1. LE TEST DE SPEARMAN

Le coefficient de corrélation de Spearman est un test non-paramétrique permettant de mettre
en évidence l'existence d'une corrélation entre deux variables quantitatives mais également
d’en préciser l’intensité. Le calcul est effectué à partir de rangs attribués suite à un classement
des valeurs numériques par ordre croissant (étude n°1, 2 & 3).

IV.2. LE TEST DE WILCOXON

Le test de Wilcoxon est un test non-paramétrique (alternative au test t de Student
paramétrique) permettant de comparer deux mesures d'une variable quantitative effectuées sur
les mêmes sujets (étude n°1, 2 & 3).

IV.3. L’ANALYSE EN COMPOSANTES PRINCIPALES

L'Analyse en Composantes Principales (ACP) permet d’indiquer et de représenter
graphiquement le degré de similarité entre des variables via la corrélation de Spearman (étude
n°3).

IV.4. LA REGRESSION LINEAIRE

La régression linéaire permet d’établir quel type de relation existe en vue d’expliquer les
valeurs entre une variable dépendante et une variable indépendante via un coefficient (étude
n°3)

80
Partie III - RESULTATS

81
I. OPTIMISATION EN LABORATOIRE DE LA METHODE DE QUANTIFICATION ET DE
MISE EN EVIDENCE DE LA VIABILITE

I.1. OPTIMISATION DE LA METHODE DE MARQUAGE POUR UNE APPLICATION A LA

CYTOMETRIE EN FLUX

Cette partie présente la démarche globale employée concernant le choix des marqueurs
fluorescents, le paramétrage des systèmes de cytométrie en flux au travers d’essais sur
échantillons de référence (souches pures) et échantillons environnementaux. Il est important
de noter que les différents essais ont été réalisés soit avec un système FACSCaliburTM
(logiciel associé CellQuestTM), soit avec un système FACSCantoTM II (logiciel associé
FACSDIVATM), utilisés pour les campagnes d’analyses sur eau potable n°1 et n°2,
respectivement.

Le système portable ACCURITM C6 n’a pas fait l’objet d’une validation en soit, du fait d’une
inaccessibilité au logiciel concernant le paramétrage, mais a été directement comparé au
FACSCantoTM II lors de la campagne d’analyse menée sur les tours aéroréfrigérantes.
L’objectif de cette première partie était de paramétrer le cytomètre pour une détection
optimale des bactéries dans l’eau, incluant la quantification et l’estimation de leur état
physiologique (intégrité membranaire et activité enzymatique). Des méthodes de détection
conventionnelles ont été effectuées en parallèle : mise en culture pour estimer la cultivabilité
et observation au microscope à épifluorescence après marquage pour la quantification des
bactéries.

I.1.1. Intégrité membranaire

En vue d’affiner le paramétrage et de vérifier la compatibilité des méthodes de marquage avec
des bactéries Gram négatif et Gram positif, des échantillons de souches pures ayant subi ou
non un traitement thermique altérant leur intégrité membranaire ont été marqués et analysés
avec un cytomètre en flux.

I.1.1.1 Validation du marquage des cellules intègres sur souches pures

La première étape consistait à sélectionner les marqueurs fluorescents les plus adaptés pour la
mise en évidence de l’intégrité membranaire. Au cours des différentes expérimentation, des
essais portant sur la comparaison entre le SYBR Green I et le SYBR Green II (SGI et SGII,
respectivement) utilisables pour le marquage simultané avec l’iodure de propidium (PI) ont
permis de déterminer le plus performant pour l’analyse des bactéries par cytométrie en flux.
Des suspensions d’E. coli (NCTC 13167) en phase exponentielle de croissance ont été
parallèlement marquées avec les couples SGI/PI et SGII/PI. En théorie, des bactéries en phase
exponentielle de croissance sont intègres à 100% et ne doivent émettre qu’une fluorescence
verte. Deux concentrations différentes ont été utilisées pour chacune des deux molécules
testées ; dilutions 1:10 et 1:100 des solutions mères commerciales (concentration initiale non-
communiquée par le fournisseur). Une compensation entre la fluorescence verte (bactéries
intègres) et la fluorescence rouge (bactéries non-intègres) a été préalablement appliquée à
hauteur de 25% afin de limiter les fuites optiques (chevauchement d’émissions de
fluorescence entre deux longueurs d’ondes). L’objectif de cette étape était de déterminer

82
quelle combinaison est optimale en vue d’éviter des fuites optiques supplémentaires malgré la
compensation appliquée

Figure 34 Comparaison des cytogrammes obtenus après marquage au SYBR Green I et SYBR Green II
combinés avec l’iodure de propidium (NADS) sur FACSCanto TM, (a) marquage au SYBR Green I dilué au
1/10ième , (b) marquage au SYBR Green I dilué au 1/100ième , (c) marquage au SYBR Green II dilué au 1/10 ième
, (d) marquage au SYBR Green II dilué au 1/100 ième

Un premier type de fuite optique a été constaté au niveau des marquages utilisant les SGI et
SGII dilués au 1:10 (figure 34a et 34c), suggérant une trop forte concentration en
fluorochrome. En effet, on observe un grand nombre d’événements fluorescents rouges qui ne
devraient pas être visibles car les bactéries n’ayant subi aucun traitement d’inactivation
doivent uniquement apparaitre au niveau de la fluorescence verte. En revanche, le fait de
diluer les solutions de SYBR Green au 1:100 réduit considérablement ce phénomène et en
particulier en ce qui concerne le SGII (figure 34d). En effet, les proportions de cellules
intègres passent pour le SGI de 49% à 98% et pour le SGII de 93% à 99% lorsque la solution
de travail est diluée au 1 :100 plutôt qu’au 1:10. Il en ressort que le SGII dilué au 1:100 offre
les meilleures conditions pour la mise en évidence de l’intégrité membranaire des bactéries,
en vue d’une utilisation conjointe avec l’iodure de propidium (PI). Pour deux souches
modèles Escherichia coli (bacille Gram négatif, NCTC 13167) et Enterococcus faecalis
(coque Gram positif, CCM 2541), des suspensions à des ratios de 0% (traitement à 70°C/15
min.), 50% (mélange moitié échantillon traité 70°C/15 min. et moitié échantillon non-traité)
et 100% (aucun traitement) de bactéries en phase exponentielle de croissance (intègres,
considérées comme viables), obtenues après traitement thermique, ont été analysées par
cytométrie en flux après marquage simultané SGII et PI.

83
La figure 35 présente les cytogrammes générés avec un FACSCaliburTM, fluorescence verte
(intègres) versus fluorescence rouge (non-intègres), une fois les paramètres de voltage fixés et
les fluorochromes sélectionnés. Les faibles signaux, enregistrés près de l’origine, sont liés aux
particules autofluorescentes ou au bruit de fond électronique malgré un seuil placé à 52 au
niveau du canal FL1 en vue de limiter les interférences.

Figure 35 Distinction des fractions intègre et non-intègre sur FACSCaliburTM (marquage SYBR Green II
et PI) pour E. faecalis a= 100%, b= 50%, c=0% et E. coli d= 100%, e= 50%, f=0%

Les résultats présentés au niveau de la figure 35 démontrent qu’il est possible de discriminer
la fraction de cellules intègres de la fraction de bactéries non-intègres à partir de souches
pures de bactéries ayant subi ou non un traitement visant à altérer leur membrane. En plus du
couplage du SGII avec le PI, un couplage du SGII avec l’éthidium homodimère (EthD-2) a
également été testé. Contrairement à ce qui a été observé avec le PI, l’évaluation de la fraction
non-intègre n’est pas satisfaisante en ce qui concerne l’EthD-2. En effet, cette fraction de la
population ne se distingue pas suffisamment du bruit de fond (figure 36).

Figure 36 Distinction des fractions 50% intègre et 50% non-intègre sur FACSCaliburTM (marquage
SYBR Green II et EthD-2) pour a, E. coli et b, E. faecalis

84
Ce phénomène peut être lié au fait que la molécule d’EthD-2 présente un poids moléculaire
plus important que le PI dû à la présence de 4 ammoniums quaternaires et de ce fait ne peut
pénétrer que dans les cellules dont les membranes sont fortement endommagées (Manini and
Danovaro 2006). Le choix de la molécule pour le protocole de double marquage s’est donc
porté sur le PI. Lors de l’utilisation du système FACSCantoTM II, la démarche de
discrimination s’est également portée sur l’application de l’approche « Gating ». Cette
stratégie est basée sur la sélection d’une région spécifique permettant de s’affranchir des
événements extérieurs à cette région. Pour ce faire, la population bactérienne visible au niveau
du cytogramme classant les particules en fonction de leur taille relative (FSC) et de leur
structure (SSC), est sélectionnée manuellement. Seule cette sélection est représentée au
niveau du cytogramme classant les particules en fonction de leur intensité de fluorescence
rouge (PI) et verte (SGII). De ce fait, ce principe permet d’épurer le cytogramme et de ne
distinguer que les cellules d’intérêt. Une illustration est proposée en figure 37suite à
l’exposition d’une suspension d’une souche d’E. coli à une irradiation UV (200 µJ/cm2)
durant 5, 15 et 25 minutes.

Figure 37 Distinction des fractions intègres et non-intègres d’une souche Escherichia coli en eau physiologique sur
FACSCantoTM suite à l’application de la stratégie de « Gating » et après (a) 0 minutes d’exposition aux UV, (b) 5
minutes d’exposition aux UV, (c) 15 minutes d’exposition aux UV, (d) 25 minutes d’exposition aux UV (200 µJ/cm2, la
partie haute représentant les cytogrammes SSC/FSC et la partie basse représentant les cytogrammes SGII/PI

Comme présenté dans la figure 37, l’utilisation du « Gating » a permis de cibler précisément
la région où sont localisés les événements représentant la population bactérienne, au niveau
du cytogramme SSC/FSC. De ce fait, les particules non-désirables (matérialisées en noir) ne
sont pas prises ne compte au niveau de la représentation sur le cytogramme SGII/PI, évitant
ainsi une quantification biaisée voire un aveuglement potentiel du système, c’est-à-dire que ce
dernier n’est plus en mesure de prendre en compte de trop nombreux événement, entrainant
un arrêt automatique de l’analyse. Le suivi de l’évolution de la perte d’intégrité membranaire

85
est donc facilitée et fiabilisée par l’application de cette sélection de région du cytogramme.
Cependant, cette approche est plus difficilement utilisable dans certains cas en ce qui
concerne des échantillons de l’environnement contenant plusieurs familles de
microorganismes.

I.1.1.2 Validation du marquage des cellules intègres sur matrice réelle

L’une des plus grandes difficultés rencontrées lors d’analyses en cytométrie en flux est
l’impact de la matrice sur le signal du fait de l’hétérogénéité de la flore microbienne en termes
de structure, de taille et d’une potentielle autofluorescence. En vue d’observer le potentiel
bruit de fond fluorescent pouvant être généré par différentes matrices, des échantillons d’eau
physiologique, d’eau du potable et d’eau filtrée sable non-dopés et dopés avec E. coli (NCTC
13167) ont été marqués ou non au SGII et analysés avec le système FACSCantoTM II (figure
38).

a.

b.

c.

Figure 38 Comparaison de la fluorescence des particules et d’Escherichia coli avec et sans marquage au SYBR Green
II et à l’iodure de propidium analysé sur FACSCanto II dans (a) de l’eau physiologique, (b) de l’eau potable et (c) de
l’eau filtrée sable

86
Les résultats présentés figure 38 montrent que quelle que soit la matrice, la fluorescence
naturelle liée aux particules est extrêmement faible et ne gêne pas l’interprétation quant au
dénombrement de la population bactérienne. Cependant, le fait que des particules
autofluorescentes soient visibles au niveau des zones de lecture pour la quantification des
bactéries souligne la nécessité d’effectuer un contrôle négatif non-marqué pour chaque
échantillon analysé. En effet, cette étape permet de soustraire ces événements fluorescents au
comptage des bactéries visibles après marquage. L’ajout de SGII et PI dans les échantillons
non-dopés montre une modification de la répartition des particules mais n’entraine pas
d’augmentation significative de fluorescence pouvant interférer avec la quantification des
bactéries. Le marquage de l’échantillon non dopé permet également d’observer la présence de
la flore naturellement présente dans l’eau potable et l’eau filtrée sable. Le dopage des
échantillons avec E. coli et le marquage au SGII et PI permet de visualiser la population
bactérienne et sa répartition au niveau des différentes régions représentant l’état d’intégrité de
leur membrane.

Afin de confirmer la pertinence des différents réglages effectués avec les souches pures et les
échantillons naturels, et de fiabiliser l’analyse concernant la quantification et la distinction
entre les fractions intègre et non-intègre, il a été nécessaire de calibrer le cytomètre en flux par
rapport à une méthode usuelle. Pour ce faire, des échantillons naturels (sortie de filtre à
charbon actif en grain, CAG sur une filière de production d’eau potable) ont été parallèlement
analysés par cytométrie en flux et par microscopie à épifluorescence après marquage au
SGII/PI.

Des prélèvements issus de CAG ont été utilisés pour cette partie du fait d’une quantification
plus aisée par microscopie. En effet, l’eau brute et l’eau filtrée sable contiennent trop de
matière organique, empêchant la lecture des lames et l’eau ozonée et l’eau chlorée ne
contiennent pas assez de bactéries pour pouvoir les dénombrer par microscopie. Trois
échantillons, provenant de deux filières de potabilisation différentes (a et b provenant de la
même usine), subissent donc exactement le même marquage (SGII/PI) avant d’être analysés
par microscopie à épifluorescence et par cytométrie en flux.

Les particules en suspension présentes en grande quantité dans les échantillons naturels
risquent de perturber la détection et peuvent également entrainer une saturation avec arrêt de
l’analyse du fait d’un trop grand nombre d’évènements passant au niveau du flux
(« overflow »). La première partie concernant les solutions apportées sont basées sur (1) la
modification des voltages FSC et SSC en vue d’isoler de manière optimale les bactéries sur le
cytogramme (respectivement 513 et 613 mV), (2) un élargissement des seuils de détection
FSC et SSC pour visualiser la totalité des événements quantifiés (abaissés à la valeur la plus
basse, soit 200).

La figure 39 montre un exemple de l’amélioration obtenue au niveau de la détection des

bactéries dans un échantillon naturel (eau filtrée sable), après application de modifications
précitées.

87
Figure 39 Apport des modifications de paramétrage sur la détection de bactéries dans un échantillon réel d’eau filtrée
TM
sable, (a) avant modification, (b) après modification soit FSC= 513 mV et SSC= 613 mV sur FACSCanto

La seconde partie de l’optimisation porte sur la fiabilisation de la quantification des fractions

intègres et non intègres au niveau d’échantillons naturels. Le tableau 8 présente les
proportions de cellules intègres et non intègres déterminées par microscopie et par cytométrie
en flux avant puis après modification du paramétrage pour de l’eau filtrée sable.
Tableau 8 Proportion de cellules bactériennes intègres et non-intègres estimée par microscopie à épifluorescence et
par cytométrie en flux avant et après paramétrage du laser
Echantillon a Echantillon b Echantillon c

Microscopie à Bactéries intègres 36% 43% 58%

épifluorescence
Bactéries non-intègres 64% 57% 42%

Cytométrie en flux Bactéries intègres 96% 75% 97%

avant paramétrage
Bactéries non-intègres 4% 25% 3%

Cytométrie en flux Bactéries intègres 37% 46% 61%

après paramétrage
Bactéries non-intègres 63% 54% 39%

Au regard de l’importante différence observée entre les quantifications effectuées par

microscopie et par cytométrie en flux, le voltage du PMT « rouge » a dû subir un ajustement
en fonction des proportions de bactéries intègres et non intègres dénombrées pour un même
échantillon. Cet écart a été pallié en faisant varier progressivement le voltage pour la mesure
de l’intensité de fluorescence rouge liée au marquage par le PI entre 453 mV (valeur initiale)
et 520 mV. La valeur optimale atteinte est de 500 mV et permet d’obtenir des résultats
correspondants à ceux observés par microscopie (tableau 8). En revanche, le voltage pour le
SGII n’a subi aucune modification par rapport au réglage initial. Cette première partie de la
phase d’optimisation a permis de montrer la fiabilité de la méthode de détection par
cytométrie en flux au niveau de l’estimation de l’état physiologique de la flore bactérienne.

88
I.1.2. Activité enzymatique
Toutes les bactéries ayant une membrane intègre ne présentent pas forcément une activité
cellulaire, or, cette activité est étroitement liée à la capacité de cultivabilité voire de
pathogénicité pour certaines bactéries. La partie suivante expose les essais effectués
concernant l’optimisation de la mise en évidence des bactéries présentant une activité
métabolique.

I.1.2.1 Validation du marquage des cellules actives avec des souches pures
Les mêmes suspensions bactériennes (Gram négatif et positif) utilisées lors des essais sur
l’intégrité membranaire ont été utilisées pour mettre en évidence la fraction bactérienne
présentant une activité enzymatique. La méthode retenue pour l’estimation de l’activité
enzymatique bactérienne est basée sur le principe du substrat fluorogénique Chemchrome V6
(CV6) (Parthuisot et al. 2000).

Il a également été nécessaire d’optimiser les conditions de marquage avec le système

FACSCantoTM. Ces essais ont été réalisés en premier lieu avec la même souche d’E. coli que
celle utilisée pour la mise au point du protocole utilisant le NADS (souche NCTC 13167).
Des cinétiques (5, 15 et 30 minutes de temps de contact) ont été effectuées parallèlement avec
deux températures d’incubation différentes (température ambiante et 37°C). La figure 40
présente les résultats obtenus :

TM
Figure 40 Essais de détermination sur FACSCanto des paramètres température et temps de marquage par le
ChemChrome V6. (a) (b) et (c) : à Température ambiante, pour respectivement un marquage de 5, 15 et 30 min. (d) (e) et
(f) : Température de 37°C, pour respectivement un marquage de 5, 15 et 30 min.

89
Les intensités de fluorescence sont plus élevées à 37°C qu’à température ambiante, en
particulier lors d’un temps de contact de 15 ou 30 minutes. En revanche, un marquage plus
prononcé est observé avec l’augmentation de la durée du temps de contact, et ce pour la
température ambiante et l’incubation à 37°C.

Dans un premier temps, un temps de contact de 15 minutes a été retenu pour la suite des
essais, dans le but d’éviter que le « cluster » de bactéries actives ne sorte partiellement ou
intégralement du champ du cytogramme, risquant de fausser la quantification des cellules.

I.1.2.2 Validation du marquage des cellules actives avec des échantillons réels
Il a été nécessaire de valider les conditions déterminées avec des souches pures avec des
échantillons réels. Lors des premiers essais menés avec des échantillons provenant de
différents points de filières de potabilisation, des modifications ont été effectuées. Ces
changements comprennent (1) l’augmentation du temps de contact à 30 minutes et
l’incubation de l’échantillon à 30°C et (2) l’ajustement du seuil d’intensité de fluorescence à
900 (unités relatives de fluorescence) afin de déclencher la quantification à partir d’une
fluorescence forte (induite par le CV6) et de s’affranchir des particules autofluorescentes.

Ces modifications soulignent le fait qu’un paramétrage mis en place avec une souche pure
n’est pas directement applicable à des échantillons naturels comportant une multitude
d’espèces différentes de bactéries et de particules autofluorescentes.

I.2. EVALUATION DES PERFORMANCES DE LA METHODE

En vue de déterminer la fiabilité de la méthode, la linéarité et à la limite de détection ont été
évaluées.

I.2.1. Linéarité liée à la viabilité

Suite aux essais de discrimination des bactéries viables (intégrité membranaire et activité
cellulaire) et non-viables (perte de l’intégrité membranaire), la linéarité de la méthode a été
vérifiée par le biais d’échantillons présentant des ratios de bactéries viables différents (0, 25,
50, 75 à 100%) obtenus suite à des mélanges de bactéries ayant subi ou non un traitement
thermique (70°C/15 min.). Pour ce faire, des échantillons (en triplicat) à des ratios croissants
de bactéries viables mais à des concentrations cellulaires identiques ont été marqués
simultanément au SYBR Green II et au PI (NADS) ou au CV6 puis dénombrés par cytométrie
en flux.

Le travail a été réalisé avec des cultures pures d’E. coli (NCTC 13167) et d’E. faecalis (CCM
2541). Les dénombrements par cytométrie en flux ont également été comparés aux
dénombrements obtenus par la culture sur milieu X et Y, respectivement. Les dénombrements
sont exprimés sous la forme de pourcentages viables/non viables et sont présentés en figure
41.

90
 a. b.

Figure 41 Corrélation des ratios expérimentaux en fonction des ratios théoriques pour la souche E.
faecalis (a) et E. coli (b) sur FACSCaliburTM au niveau des bactéries intactes (intègres), actives (métabolisme
actif) et cultivables (capable de former des colonies sur gélose)

Pour les deux souches, les droites représentant les pourcentages expérimentaux de bactéries
viables (protocole NADS), viables actives (CV6) et bactéries viables cultivables (milieu de
culture) présentent toutes un coefficient de corrélation linéaire de 0,99 à l’exception de la
culture pour E. faecalis dont la valeur est r2=0,95 pouvant être considéré comme acceptable
(Sakamoto et al. 2005), témoignant d’une bonne corrélation entre les ratios expérimentaux et
les ratios théoriques.

Ces résultats confirment ainsi l’efficacité et la fiabilité de la cytométrie en flux pour la

discrimination des différentes fractions viables (dont actives) et non viables d’une population
donnée et ce pour des bactéries Gram négatif et positif.

I.2.2. Exemple avec Escherichia coli

Une comparaison de l’impact d’une exposition aux UV (200 µJ/cm2) sur la viabilité de
différents genres bactériens a été effectuée afin de déterminer si la cytométrie en flux permet
de mettre en évidence une potentielle résistance à ce traitement (tableau 9).
Tableau 9 Comparaison de l’évolution des l’intégrité membranaire de 3 genres bactériens en fonction d’une
TM
exposition aux UV (200 µJ/cm2) après 15 min. et 25 min. sur FACSCanto
E. coli Enterobacter Enterococcus
Bactéries Bactéries Bactéries Bactéries Bactéries Bactéries
intègres actives intègres actives intègres actives
0 min. 100% 100% 100% 100% 100% 100%
15 min. 1% 0% 13% 1% 3% 2%
25 min. 1% 0% 0% 0% 3% 0%

Après 15 minutes d’exposition aux UV, la majorité des cellules a perdu son intégrité
membranaire avec cependant 13% de bactéries ayant conservé une membrane intacte pour
Enterobacter. En revanche, si la proportion de bactéries intègres reste constante entre 15 et 25

91
 minutes d’exposition pour E. coli (1%) et Enterococcus (3%), plus aucune cellule intacte n’est
détectée après 25 minutes pour Enterobacter (NCTC 10005), qui a été sélectionnée en vue de
bénéficier d’une seconde souche Gram négative en plus du modèle E. coli. Concernant
l’activité enzymatique, des cellules d’Enterobacter et Enterococcus sont encore détectables
après 15 minutes (1 et 2%, respectivement), mais après 25 minutes, plus aucune bactérie
active n’est détectée, et ce pour les 3 souches testées. Afin de vérifier si la méthode globale
par cytométrie en flux (mise en évidence de l’intégrité membranaire et de l’activité
enzymatique) permet d’observer l’effet d’un traitement bactéricide, en comparaison avec la
culture, des cinétiques d’exposition aux UV (200 µJ/cm2) ont été effectuées avec une souche
d’E.coli (NCTC 13167) en ajoutant une mesure supplémentaire précoce après 5 minutes
d’exposition. La figure 42 présente un exemple de résultat obtenu au cours de ces essais.

a. b. c. d.

Figure 42 Estimation de l’impact d’un traitement par irradiation UV sur une suspension d’Escherichia coli par
FACSCantoTM avec marquage au SGII et CV6 et par culture, (a) 0 minutes d’exposition aux UV, (b) 5 minutes
d’exposition aux UV, (c) 15 minutes d’exposition aux UV, (d) 25 minutes d’exposition aux UV (200 µJ/cm2)

La culture sur boîte permet en parallèle de déterminer si les bactéries sont également
cultivables. Après 5 minutes d’exposition aux UV (b), il n’y a plus de bactéries cultivables.
En revanche, il reste des bactéries intègres et présentant une activité enzymatique (13,6% et
0,3%, respectivement). Au-delà de 15 minutes d’exposition aux UV (c) et (d), il n’y a plus de
bactéries cultivables, actives ou intègres. Les cytogrammes représentant le marquage via
NADS montrent bien l’évolution de l’état de la membrane des bactéries au fur et à mesure du
temps d’exposition : intègres (vertes), non-intègres « endommagées » (oranges) et non-

92
intègres « mortes » (rouges). Ces essais (avec confirmation par la culture) montrent bien que
la méthode de détection par cytométrie en flux permet de suivre l’impact d’un traitement sur
l’état physiologique d’une population bactérienne. En effet, il a fallu moins d’une heure par
cytométrie en flux pour pouvoir observer l’effet des UV sur l’activité bactérienne et sur leur
intégrité membranaire, contrairement à la méthode par culture qui nécessite 48 heures. De
plus, la cytométrie en flux permet de montrer qu’une fraction des bactéries est encore viable
après 5 minutes d’irradiation et que parmi ces viables, une proportion présente encore une
activité.

I.2.3. Linéarité liée aux bactéries totales

Des suspensions d’E. coli (NCTC 13167) ont été réalisées par dilutions décimales (triplicat)
puis marquées au SYBR Green II afin de contrôler la linéarité de la méthode de détection des
bactéries totales par cytométrie en flux. Les résultats sont présentés en figure 43.

Figure 43 Détermination de la linéarité de la méthode de détection par cytométrie en flux sur

FACSCaliburTM via application avec une souche pure d’Escherichia coli

La droite ci-dessus représente la corrélation entre les dénombrements évalués

expérimentalement par cytométrie en flux et des valeurs théoriques de la gamme de dilutions
décimales (dilutions sériées à partir d’une suspension de 9 log d’E. coli). La régression
linéaire obtenue (r2=0,99) permet d’affirmer que la corrélation dénombrement
expérimental/quantité théorique est forte et, par la même, que la méthode de détection est
acceptable dans cette gamme de concentration (entre 0 et 107 bactéries/mL).

Cependant, au vu des écart-types, en-dessous d’une concentration d’environ 100-1000

cellules/mL, les résultats ne semblent plus linéaires. En effet, il est difficile de détecter
précisément des cellules qui sont à des concentrations faibles au sein d’échantillons naturels
hétérogènes (Vives-Rego et al. 2000).

93
II. APPLICATIONS & CAMPAGNES SUR LE TERRAIN
II.1. APPLICATION AU CONTROLE QUALITE DE LA PRODUCTION D’EAU POTABLE
La présente partie porte sur l’application de la cytométrie en flux pour le contrôle de la qualité
microbiologique de l’eau en cours de traitement de potabilisation ou de traitement d’eaux
usées. Deux campagnes d’analyses ont été menées en ce qui concerne la production d’eau
potable, et une campagne d’analyse concernant la désinfection d’eau provenant de tours
aéroréfrigérantes.

Une comparaison des résultats obtenus via la cytométrie en flux avec les méthodes
normalisées et/ou usuelles a été parallèlement effectuée. L’objectif de ces applications en
conditions réelles était de mettre en évidence le potentiel gain apporté par l’utilisation de la
cytométrie en flux par rapport aux contraintes liées à la gestion active des installations, tels
que la précision de l’information, le délai de résultat ou l’utilisation sur site.

II.1.1. Campagne n°1, usine de potabilisation

La première campagne correspond au recueil de plusieurs séries d’échantillons provenant
d’une usine de potabilisation, réparties sur 5 semaines avec un prélèvement hebdomadaire.
Les échantillons ont été analysés parallèlement par cytométrie en flux sur le système
FACSCaliburTM (intégrité membranaire et activité métabolique) et par les méthodes usuelles
employées en laboratoire de contrôle (microscopie à fluorescence, culture). L’ensemble de ces
résultats a fait l’objet de la publication n°2 (Helmi et al. 2015).

II.1.1.1 Comparaison des performances de la cytométrie en flux, de la cytométrie en

phase solide, de la microscopie à épifluorescence et de la culture
Une comparaison des 4 techniques permettant de mettre en évidence l’état physiologique des
bactéries a été effectuée avec les différents échantillons d'eau provenant d’une usine de
production d’eau potable. Les échantillons ont été analysés en parallèle par cytométrie de flux
sur système FACSCaliburTM (FCM), cytométrie en phase solide sur système ChemScan®
(SPC), microscopie à épifluorescence (MSP) et par culture sur gélose.

Les résultats sont présentés dans la figure 44 pour l’eau non-chlorée, l’eau fortement chlorée
(chlore=1,08 à 2,13 mg/L) et l’eau produite (chlore <0,5 mg/L).

94
Figure 44 Comparaison de la réponse de différentes techniques au niveau de la quantification des bactéries totales
et viable provenant d’échantillons issus d’une usine de production d’eau potable. FCM= cytométrie en flux, MSP=
microscopie à épifluorescence, SPC= cytométrie en phase solide, PCA= plate count agar

Les analyses réalisées consistaient à évaluer, d’une part les fractions de bactéries viables
actives (chaîne respiratoire) et totales par la méthode CTC-DAPI (lecture au microscope à
épifluorescence) et d’autre part, la fraction de bactéries viables actives (activité enzymatique),
par un marquage au CV6 (lecture par cytométrie en flux et par cytométrie en phase solide,
ChemScan®). Enfin, la fraction de bactéries viables cultivables a été mise en évidence par
l’ensemencement de géloses PCA (Plate Count Agar) et R2A.

Des bactéries cultivées sur milieu R2A ont été mises en évidence dans 39% des échantillons
chlorés contre 0% lorsque la culture a été effectuée sur milieu PCA. Cette différence peut être
expliquée par les caractéristiques de la gélose R2A. En effet, ce milieu, bien qu’il contienne
des sources variées de nutriments, en contient de faibles concentrations et est incubé durant
une longue période (11 jours à 22 °C), afin de favoriser la croissance des bactéries stressées
par un séjour prolongé en eau potable (Gensberger et al. 2015; Simoes et al. 2006).

La chloration appliquée correspond à des valeurs de CT (concentration x temps) importantes,

comprises entre de 156 et 250 mg L-1 min-1. Malgré ce haut niveau de désinfection au chlore,
des signaux pouvant être interprétés comme des bactéries actives ont été détectés dans 72%
des échantillons chlorés par microscopie (marquage CTC). Dans les mêmes conditions,
aucune bactérie intacte (marquage SGII) ni aucune bactérie présentant une activité
enzymatique (marquage CV6) n’a été détectée par cytométrie en flux ou en phase solide. Ceci
peut être expliqué par des faux-positifs lors du marquage CTC liés à la présence de dépôts
extracellulaires de formazan, cristaux fluorescents produits par des bactéries actives,
difficilement discernables des vraies bactéries actives (Cools et al. 2005). Des bactéries
actives ont été détectées par cytométrie en phase solide dans 11% des échantillons d'eau
produite, contre aucun échantillon positif mis en évidence par cytométrie de flux.

95
Sur l’ensemble des échantillons non-chlorés analysés par cytométrie en flux (n=8), les
bactéries viables représentent 80,6% (intègres et actives) de la population totale, dont 21,4%
de cellules actives et 0,7% de bactéries cultivables, ce qui est cohérent avec les observations
rapportées par des études antérieures (Berney et al. 2008; Vives-Rego et al. 2000). Ainsi,
79,9% des bactéries totales pourraient être des cellules viables non-cultivables. Des études
antérieures mentionnent que les cellules bactériennes viables non-cultivables, potentiellement
capables d'exprimer des facteurs de virulence et capables de s’organiser en biofilms dans les
réseaux d’eau potable, devraient être prises en compte pour l'évaluation des risques sanitaires
(Alleron et al. 2008; Falcioni et al. 2008a). D'autre part, 100% des bactéries détectées par
cytométrie en flux dans les échantillons d'eau chlorée, ont été identifiées comme non-intègres,
démontrant que la cytométrie en flux a permis de mettre en évidence l'effet bactéricide des
conditions de désinfection employées.

II.1.1.2 Traitement statistique des données

Afin de comparer rigoureusement les méthodes susceptibles de fournir le même type
d’information, le test statistique de Wilcoxon a été choisi, permettant de comparer
quantitativement les résultats obtenus pour un même échantillon avec deux méthodes
différentes. Les résultats montrent une corrélation significative entre la microscopie à
épifluorescence (DAPI) et la cytométrie en flux (SGII) concernant la quantification des
bactéries totales (n=21, p=0,137). De même, les valeurs obtenues pour les bactéries actives
par microscopie à épifluorescence (CTC) et par cytométrie de flux système FACSCaliburTM
(CV6) présentent une corrélation significative (n=27, p=0,329). Cependant, malgré
l’utilisation du même fluorochrome (CV6) aucune corrélation quantitative n’a pu être mise en
évidence entre la cytométrie en flux système FACSCaliburTM et la cytométrie en phase solide
(n=27, p=0,005). Ainsi, une différence d’environ 1 log a été systématiquement observée entre
les résultats obtenus avec ces deux méthodes pour un même échantillon. Ceci pourrait être
expliqué par le fait que, pour la technique de cytométrie en phase solide, le seuil d'intensité de
fluorescence est configuré pour détecter seulement les bactéries fortement fluorescentes,
c’est-à-dire hautement actives.

En conséquence, les bactéries présentant une faible intensité de fluorescence, suggérant une
activité estérase faible (y compris les cellules lésées présentant une activité enzymatique
résiduelle), ne sont pas prises en compte lors de l'énumération. A l'inverse, cette catégorie de
bactéries faiblement active a été détectée en cytométrie de flux. Ces résultats suggèrent ainsi
qu'environ 10% de la population bactérienne présente potentiellement une faible activité
enzymatique au sein des échantillons non-chlorés. Toutefois, les écarts observés entre les
deux méthodes sont en contradiction avec une étude précédente (Parthuisot et al. 2000) qui
montrait des résultats similaires entre la cytométrie en flux et la cytométrie en phase solide.
Cependant, cette comparaison avait été effectuée en utilisant des souches pures et non des
prélèvements environnementaux, ce qui, au regard des résultats obtenus lors de la campagne
qui analyse des flores complexes, suggère un effet de stress lié à l’environnement d’une usine
de production d’eau potable sur le comportement des bactéries indigènes par rapport aux
marqueurs et à l’émission de fluorescence.

96
 II.1.2. Campagne n°2 au niveau de 3 usines de potabilisation
La seconde campagne correspond à une campagne d'échantillonnage au niveau de 3 usines
(A, B et C) de production d’eau potable qui a duré 4 mois afin de suivre l'évolution de la
population bactérienne tout au long du processus industriel et d'observer l'effet spécifique de
chaque étape de traitement sur les cellules. L’objectif était d’élargir les connaissances
concernant l’efficacité des traitements appliqués et d’évaluer les possibilités de mise en
évidence de défaillances pouvant survenir en cours de production. La culture étant la méthode
de référence, une mise en culture sur milieu R2A et PCA a été réalisée parallèlement aux
analyses par cytométrie en flux système FACSCantoTM II. L’ensemble de ces résultats a fait
l’objet de la publication n°1 (Helmi et al. 2014).

II.1.2.1 Comparaison de différentes techniques d’analyse des flores bactériennes pour

le suivi des filières de production d’eau potable
Cette partie regroupe les résultats obtenus pour les 3 filières au niveau du suivi global de la
population bactérienne et au niveau de traitements particuliers différents d’une usine à l’autre.
Les résultats de quantification bactérienne (bactéries/mL) sont présentés en échelle
logarithmique pour permettre d’observer sur un même graphe les proportions de bactéries
mortes, endommagées, viables actives et cultivables aux différetentes étapes de la filière.

La figure 45 présente les profils obtenus, (moyenne des valeurs obtenues suite au suivi
effectué sur 4 mois) de la population bactérienne au niveau de différentes étapes de traitement
des usines A (n=14), B (n=14) et C (n=12).

a.

97
b.

c.

Figure 45 Suivi des différents états physiologiques de la population bactérienne au sein des les usines A (a), B (b) et
C (c) avec détection des bactéries totales, viables et actives par cytométrie en flux et des bactéries cultivables par culture
sur milieu PCA et R2A

Concernant la population bactérienne totale quantifiée par cytométrie en flux pour l’usine A,
la concentration est supérieure à 106 bactéries/mL en entrée d’usine. Le profil résultant du
suivi a révélé une réduction de 0,8 log après filtration sur sable et 1,6 log après ozonation
concernant les bactéries intègres (figure 45a). La quantification des bactéries par la méthode

98
standard de culture sur PCA (48 heures d’incubation) a montré une sous-estimation par
rapport à la méthode permettant de détecter les bactéries cultivables stressées sur gélose R2A
(11 jours d’incubation). Cette différence était particulièrement notable après ozonation. Après
passage sur charbon actif granulaire (CAG), on observe un relargage important de bactéries (+
0,9 log). Ce phénomène a déjà été observé lors d’études précédentes (Hammes et al. 2008) et
est dû au décrochage de fractions de la communauté bactérienne naturelle qui colonise ces
filtres CAG. L’abattement final en sortie d’usine après chloration était de 3,0 log, 3,1 log, 2,4
log et 1,9 log pour les bactéries totales, intègres, actives et cultivables, respectivement. La
gamme résultant pour les bactéries actives et cultivables est comprise entre 1 et 10
bactéries/mL.

La concentration en bactéries en entrée d’usine (106 bactéries/mL) et le profil obtenu pour

l’usine B est similaire à celui de l’usine A (figure 45b). Les courbes d’abattement des
bactéries actives et cultivables en cours de traitement présentent la même tendance, mais
montrent que les traitements chimiques (ozone et chlore) ont un impact plus important sur la
viabilité des bactéries en comparaison avec la filtration sur sable. Le relargage de bactéries
après passage sur filtre CAG est également observé (≈ 1 log) et l’abattement des bactéries
intègres est de 2,9 log après la chloration avec une gamme de concentration finale de 1 à 10
bactéries/mL. Une différence est cependant constatée au niveau des bactéries cultivables
(PCA) qui présente un abattement proche d’un log en sortie d’usine, contre deux log pour
l’usine A. La tendance des bactéries revivifiables par R2A est quant à elle similaire de celle
observée pour l’usine A.

La quantification par cytométrie en flux met en évidence un profil différent concernant l’usine
C, principalement lié à l’étape d’ozonation, se traduisant par un abattement de 0,3 log,
contrairement aux deux autres usines présentant un abattement moyen supérieur à 2 log après
cette étape (figure 45c). Les concentrations moyennes correspondantes mesurées après
ozonation par cytométrie en flux correspondant respectivement à 1000 bactéries/mL pour
l’usine C et 10 bactéries/mL pour les usines A et B. Cette observation est confirmée par la
méthode réglementaire (PCA, 48h) qui montre une concentration moyenne de 100
bactéries/mL pour l’usine C en comparaison avec une concentration moyenne proche de 10
bactéries/mL pour les usines A et B. Cependant, la qualité microbiologique de l’eau en sortie
d’usine est équivalente à celle constatée au niveau de l’eau produite par les deux autres usines
au regard de la faible quantité de bactéries actives et cultivables détectée. Cela peut
s’expliquer par l’efficacité de la chloration mais également par le fait que l’eau en sortie de
l’usine C est un mélange d’eau traitée par la filière classique biologique et la filière
membranaire (nanofiltration associée à un traitement UV). De manière générale, les bactéries
quantifiées par la méthode réglementaire (culture par PCA, 48 heures) montrent une sous-
estimation en comparaison avec la méthode permettant de voir les bactéries cultivables ayant
subi un stress (culture par R2A, 11 jours). Cet écart est plus particulièrement marqué au
niveau de l’étape d’ozonation. Par ailleurs, les résultats obtenus pour les bactéries cultivables
sur gélose PCA et les bactéries totales quantifiées par cytométrie sont semblables en terme de
profils (même évolution de la population en fonction du traitement) mais décalés de 2 à 3 log
en terme de concentrations de cellules, la cytométrie en flux étant bien plus sensible.

99
La culture étant la méthode de référence, le test statistique de Spearman a été appliqué afin de
mettre en évidence une potentielle corrélation entre les bactéries présentant une activité
métabolique (déterminé par cytométrie en flux système FACSCantoTM) et leur capacité à
cultiver (milieux PCA et R2A). Pour ce faire, l’ensemble des données aquises lors de la
campagne concernant ces paramètres a été pris en compte (n=200). Il s’est avéré qu’une
corrélation significative existe entre ces 2 états physiologiques (p<0,0001). Les facteurs de
corrélation avec les bactéries actives quantifiées par cytométrie sont r=0,582 et r =0,488 pour
les milieux PCA et R2A, respectivement, et une valeur de r=0,587 a été trouvée pour
corrélation entre les deux méthodes de culture.

Le nombre de cellules actives est la plupart du temps supérieur à la quantité de bactéries

cultivables. Dans ce cas, cette différence peut être expliquée par la présence de bactéries
viables non-cultivables du fait d’un stress ou d’une déficience ou non cultivables dans les
conditions du test car non-hétérotrophes (Hoefel, 2003c). Dans certains cas, avec le milieu
R2A, la quantité de bactéries cultivables est plus élevée que les bactéries actives. Ce
phénomène est dû au fait que ce milieu favorise la croissance des bactéries stressées, dans un
délai de 11 jours. Cela suggère que certaines bactéries ne présentant pas d’activité détectable à
un instant T ont pu récupérer leur aptitude à se développer dans des conditions favorables
après plusieurs heures ou plusieurs jours d’incubation.

Les tests non-paramétriques de Spearman et de Wilcoxon ont été utilisés afin de voir si la
cytométrie en flux système FACSCantoTM permet d’obtenir une quantification similaire à
celle via une méthode de référence usuelle pour l’obtention d’une même information. Pour ce
faire, 2 séries de prélèvements par usine ont été analysés en parallèle par cytométrie en flux et
par méthodes usuelles (n=38). Concernant la quantification des bactéries totales, les résultats
obtenus par cytométrie en flux après marquage au SGII/PI ont été confrontés au
dénombrement obtenu par microscopie à épifluorescence suite à un marquage au DAPI. Le
test de Spearman montre une corrélation significative entre les 2 méthodes (p<0,0001) mais le
test de Wilcoxon montre une distribution différente (p=0,0002). Cela peut s’expliquer par le
fait que, d’une part le fluorochrome utilisé est différent et d’autre part par le fait que la
méthode de microscopie à épifluorescence soit manuelle, pouvant induire un biais opérateur-
dépendant. Cependant, il est important de souligner que la méthode par marquage au DAPI ne
donne qu’une information sur les bactéries totales et que la cytométrie en flux, en plus du
nombre de bactéries totales, permet de distinguer les cellules mortes des viables (via leur
intégrité membranaire). Concernant la quantification des bactéries actives, les résultats
obtenus par cytométrie en flux système FACSCantoTM II après marquage au ChemchromeV6
ont été confrontés au dénombrement obtenu par cytométrie en phase solide (Chemscan) suite
à un marquage également au ChemchromeV6. Le test de Spearman (p<0,0001) et le test de
Wilcoxon (p=0,104) montrent une corrélation significative et une distribution identique
certainement parce que les 2 méthodes sont automatisées et le fluorochrome utilisé est le
même. Il est important de noter que, lors de la campagne n°1, aucune corrélation quantitative
(test de Wilcoxon) n’avait pu être mise en évidence entre la cytométrie en flux et la
cytométrie en phase solide, alors qu’une corrélation significative a été prouvée suite à la
campagne n°2. Outre une dissimilitude au niveau du nombre de données, soit n=27 pour la

100
campagne n°1 et n=38 pour la campagne n°2, la principale différence entre les 2 campagnes
est liée au système utilisé. En effet, le système FACSCaliburTM a été utilisé pour la campagne
n°1 et le système FACSCantoTM II a été utilisé pour la campagne n°2. Le fait d’avoir employé
un appareillage et un logiciel associé différents pourrait expliquer la présence ou l’absence de
corrélation avec une même technique de cytométrie en phase solide (Chemscan ®). Les UV
représentent une étape de traitement importante en termes d’inactivation des
microorganismes. Afin de vérifier l’impact de cette étape en conditions réelles, le suivi en
amont et en aval d’un traitement UV a également été effectué, respectivement, au niveau des
usines A (400 J/m2, n=6) et C (250 J/m2, n=11). La figure 46 présente les résultats avant et
après application du traitement UV.

a.

b.

Figure 46 Estimation de l’impact des UV sur la viabilité des bactéries au niveau de l’usine A (a) après une exposition
UV de 400 J/m2 et C (b) après une exposition UV de 250 J/m2, avec détection des bactéries totales, intègres et actives par
cytométrie en flux et des bactéries cultivables par culture sur milieu PCA et R2A

101
Concernant l’usine A, il est observé que l’irradiation UV diminue la capacité à cultiver des
bactéries. En effet, après UV, aucune bactérie n’a été détectée par culture sur gélose PCA
(48h) et la population revivifiable par culture sur gélose R2A a été réduite d’un facteur 20 en
moyenne. Cependant, les UV ne semblent pas avoir un effet aussi important sur l’activité
bactérienne avec une réduction d’un facteur 1,5 seulement. Le témoin sans marquage effectué
en parallèle permet de confirmer que les événements compatabilisés ne sont pas des faux
positifs et qu’il s’agit bien de bactéries actives, dont une partie est restée cultivable. Un
impact notable des UV sur l’ADN des bactéries est également observé, avec une réduction
mineure des bactéries totales d’un facteur 7 en moyenne. Le fait que l’ADN soit endommagé
par les UV et qu’il y ait toujours une activité métabolique au sein des bactéries est un
phénomène déjà observé préalablement (Hijnen et al. 2006), cela pouvant être expliqué par
une activité résiduelle. Une autre hypothèse serait que les bactéries actives visibles feraient
partie des cellules dont l’ADN n’a pas été impacté par les UV, suggérant que l’impact des UV
serait différent selon les espèces et/ou souches (Zemke et al. 1990).

Au niveau de l’usine C, un impact notable sur l’ADN est également constaté du fait de
l’abattement des bactéries totales. Il apparait que la majorité des bactéries restantes sont
intègres et actives, une partie d’entre elles ayant gardé leur capacité à cultiver. L’impact des
UV sur l’état physiologique des bactéries est moindre pour l’usine C en comparaison avec
l’usine A. Cette observation peut être expliquée par la différence de dose UV appliquée au
niveau de l’usine A (400 J/m2) est supérieure à celle de l’usine C (250 J/m2).

II.1.2.2 Suivi de la population bactérienne par cytométrie en flux en fonction de

données physico-chimiques de l’eau
Outre les données microbiologiques obtenues par cytométrie en flux et par culture, des
données physico-chimiques des échantillons d’eau ont été fournies par les exploitants des
usines A, B et C. Les courbes suivantes présentent un suivi sur 2 mois des bactéries totales de
l’eau brute quantifiées par cytométrie en flux (bactéries/mL) et de différents paramètres
physico-chimiques pour les usines A, B et C (figure 47).

a.

102
b.

c.

Figure 47 Courbes de suivi sur 2 mois de la population bactérienne totale par cytométrie en flux en fonction des
données physico-chimiques pour les usines A (a), B (b) et C (c)

103
Parallèlement, un test de corrélation de Spearman (ACP, n=20) a également été effectué
(figure 48) sur l’ensemble de ces données et aucune corrélation significative n’a pu être
déterminée avec l’ensemble des paramètres physico-chimiques mesurés.

Figure 48 Analyse en Composante Principale pour la mise en évidence de corrélation entre les paramètres physico-
chimiques, météorologiques et la concentration bactérienne

Le COT (mg.L-1) et la température ne présentent pas de fluctuations importantes. Pour la

température, les variations observées sont comprises entre 17 et 21,4 °C pour l’usine C ; 18,2
et 23,5 °C pour l’usine A et 18,2 et 22,4 °C pour B, durant tout le mois de juillet. En
revanche, les précipitations (mm) et la turbidité (en NTU pour les usines A et C, en NFU pour
l’usine B) fluctuent avec une conséquence apparente sur la charge en bactéries totales. En
effet, chaque pic de précipitations semble entrainer une augmentation de la turbidité au bout
de 2 à 3 jours. Une vue globale sur les 2 mois montre que la concentration en bactéries évolue
dans le même sens que la turbidité, observation plus particulièrement visible au niveau des
usines B et C.

II.2. APPLICATION A LA QUALITE DES EAUX DE TOURS AEROREFRIGERANTES

Au regard de la problématique liée à la prolifération des légionelles au niveau des circuits de
tour aéroréfrigérentes (TAR), cette partie présente les résultats relatifs à l’application de la
cytométrie en flux pour le contrôle de l’efficacité de désinfection de ces installations. La
faisabilité d’une telle approche a été réalisée via des essais pour la mesure de l’impact de
biocides oxydants utilisés en TAR et l’analyse d’échantillons réels. Parallèlement, les
performances d’un cytomètre en flux de laboratoire et d’un cytomètre en flux portable ont été
confrontées aux méthodes usuelles employées pour la surveillance microbiologique des TAR,
comprenant la méthode par culture et l’ATPmétrie.

104
II.2.1. Evaluation de l’impact des biocides oxydants en laboratoire
En vue d’évaluer plus finement l’impact des biocides oxydants sur les cellules bactériennes
issues d’un échantillon de tour tertiaire et de tour industrielle, des essais en cinétique de
traitement ont été réalisés au laboratoire. Les bactéries utilisées pour ces tests proviennent
d’une eau de TAR tertiaire (essai n°1) et d’une eau de TAR industrielle (essai n°2).

Après mise en culture sur milieu PCA (37°C, 48 heures) les colonies sont récupérées et
remises en suspension dans de l’eau physiologique pour analyse de la quantité initiale par
cytométrie en flux après marquage. Dans 100 mL d’eau physiologique a ensuite été ajoutée
une quantité connue de bactéries, 6 log pour l’essai 1 et 5 log pour l’essai 2. Des dilutions à
partir des solutions initiales de brome complexé (HOBr), hypochlorite de sodium (NaOCl) et
bromure de sodium (NaBr) ont été effectuées en vue d’obtenir la concentration finale visée
pour chaque biocide, c’est-à-dire 0,5 ppm. Il est important de rappeler que les biocides HOBr
et NaOCl sont utilisés seuls (pH visé= 8,5-9 et 7-7,4, respectivement), contrairement au
biocide NaBr qui est couplé au NaOCl (produit de réaction= HOBr, pH visé= 8,5-9) avec des
proportions de 70% et 30%, respectivement, en termes de concentration. Après ajout du
volume adéquat dans chaque flacon (excepté 1 flacon témoin sans biocide), le mix
bactéries/biocide est mis sous agitation continue.

Des prélèvements ont été effectués à T0 (avant ajout du biocide), T5min, T15min, T30min et
T60min pour analyse par cytométrie en flux (cellules totales, intègres et actives), par culture
(méthode standard, PCA) et mesure du chlore libre (DPD). Le tableau 10 présente les valeurs
moyennes (n=4, T5 à T60) en équivalent chlore mesuré pour les 2 essais et les 3 types de biocides
oxydants.

Tableau 10 Concentration moyenne (n=4) en équivalent chlore par type de biocide oxydant
HOBr NaOCl NaBr

Equivalent chlore pH Equivalent chlore pH Equivalent chlore pH

(ppm) (ppm) (ppm)

Essai n°1 0,45 ± 0,10 8,58 0,54 ± 0,01 7,32 0,60 ± 0,04 8,89

Essai n°2 0,50 ± 0,06 8,75 0,53 ± 0,04 7,31 0,53 ± 0,02 8,99

ppm= partie par million

En vue de vérifier la corrélation entre la quantification des bactéries actives obtenue par
cytométrie en flux et des bactéries cultivables obtenue par milieu PCA en présence ou
absence de biocide, un test statistique a été employé à partir des données présentées dans le
tableau 11.

105
Tableau 11 Evolution de la concentration de cellules bactériennes actives ou cultivables (par mL) en fonction du temps
de contact avec 3 biocides oxydants, mesuré par FACSCantoTM
Biocide Cellules 0 min. 5 min. 15 min. 30 min. 60 min.
HOBr Actives 6,36E+06 6,36E+06 1,65E+06 4,66E+05 5,20E+04
Cultivables 3,87E+05 9,39E+04 6,25E+04 4,44E+04 4,81E+04
NaOCl Actives 4,30E+06 6,76E+05 4,68E+05 3,64E+05 3,12E+05
TAR tertiaire

Cultivables 1,19E+06 3,66E+04 3,77E+04 5,11E+04 2,78E+04

NaOCl + NaBr Actives 4,57E+06 2,60E+05 1,04E+05 5,20E+04 5,20E+04
Cultivables 1,51E+06 4,12E+04 3,68E+04 5,48E+04 1,06E+05
Contrôle Actives 4,42E+06 4,42E+06 4,41E+06 4,51E+06 4,36E+06
Cultivables 1,25E+06 1,28E+06 1,23E+06 1,89E+06 1,11E+06
HOBr Actives 1,73E+05 8,67E+04 6,93E+04 1,21E+05 1,73E+04
Cultivables 5,10E+04 4,00E+02 1,80E+03 1,10E+03 8,00E+02
NaOCl Actives 2,25E+05 1,73E+04 1,73E+04 1,73E+04 1,73E+04
TAR industrielle

Cultivables 5,00E+04 6,00E+02 7,00E+02 1,30E+03 1,30E+03

NaOCl + NaBr Actives 1,39E+05 3,47E+04 1,73E+04 1,73E+04 3,47E+04
Cultivables 4,80E+04 8,00E+02 1,30E+03 1,40E+03 9,00E+02
Contrôle Actives 2,25E+05 1,91E+05 1,56E+05 1,73E+05 1,91E+05
Cultivables 4,80E+04 3,39E+04 3,95E+04 3,61E+04 4,18E+04

En tenant compte de toutes les observations issues des essais n°1 & 2 (n=40), il s’avère
qu’une corrélation significative est mise en évidence (Spearman, P< 0,0001 et r=0,79) entre
les bactéries actives (délai de résultat=1 heure) et les bactéries cultivables (délai de
résultat=48 heures).

II.2.1.1 Impact des biocides oxydants sur l’ADN et l’intégrité membranaire des
bactéries
La figure 49 présente les quantités de bactéries totales (SGII) et intègres (SGII/PI) mesurées
par cytométrie en flux en fonction du temps de contact avec chacun des 3 biocides oxydants
testés (n=1 pour chaque mesure). Les deux populations bactériennes distinctes présentées
proviennent d’une eau de TAR tertiaire (essai n°1) et d’une eau de TAR industrielle (essai
n°2), respectivement.

a.

106
 b.

Figure 49 Suivi de la quantité de bactéries totales et évolution de l’intégrité membranaire d’une population
bactérienne issue (a) d’une TAR tertiaire et (b) d’une TAR industrielle en fonction du temps de contact avec HOBr,
NaOCl et le mélange NaOCl +NaBr

Au regard du contrôle sans biocide, la première information importante est le fait que la
quantité de bactéries totales n'a pas changé de façon significative, quel que soit le traitement
et quel que soit la population bactérienne. Les bactéries sont encore fluorescentes et donc
visibles, ce qui signifie que les marqueurs (SGII et PI) ont pu se fixer à l’ADN, suggérant une
absence de dommages critique au niveau de l'ADN. En ce qui concerne l’essai n°1, après 1
heure de temps de contact, HOBr, NaOCl et l'association de NaOCl et NaBr conduisent à des
proportions de 5,59%, 0,37% et 0,45% de bactéries intactes par rapport à la population totale,
respectivement.

En ce qui concerne l’essai n°2, après 1 heure de temps de contact, HOBr, NaClO et
l'association de NaClO et NaBr conduisent à des proportions de 22,4%, 12,7% et 11,6% de
bactéries intactes, respectivement. Pour HOBr, l’impact sur l’intégrité est relativement
progressif sur la période d’une heure d’essai, en comparaison avec NaOCl (associé ou non à
NaBr), qui permet d’atteindre l’abattement maximum après 5 minutes de temps de contact.
Cette observation est illustrée dans la figure 50, représentant, l’impact des 3 biocides en
fonction du temps sur la population bactérienne d’une TAR tertiaire, en comparaison avec un
contrôle sans biocide.

107
a. b. c. d.

Figure 50 Suivi de la perte d’intégrité membranaire d’une population bactérienne issue d’une TAR tertiaire en
fonction du temps de contact et du biocide oxydant testé avec (a) HOBr, (b) NaOCl, (c)NaBr+ NaOCl (d) témoin sans
biocide

Selon les résultats présentés dans la figure 50, le témoin sans biocide ne présente pas de
différence en termes de perte d’intégrité. En revanche, les cytogrammes permettent de
visualiser la rapidité d’action d’un traitement à base de NaOCl, révélant un abattement des
bactéries en 5 minutes contre une heure pour un traitement avec HOBr.

108
II.2.1.2 Impact des biocides oxydants sur l’activité et la cultivabilité des bactéries
La figure 51 présente les concentrations de bactéries actives (CV6) et cultivables mesurées
par cytométrie en flux et milieu PCA, respectivement, en fonction du temps de contact avec
les 3 biocides oxydants testés (n=1 pour chaque mesure). Les deux populations bactériennes
distinctes présentées proviennent d’une eau de TAR tertiaire (essai n°1) et d’une eau de TAR
industrielle (essai n°2), respectivement.

a.

b.

Figure 51 Suivi de la quantité de bactéries actives et cultivables d’une population bactérienne issue (a) d’une TAR
tertiaire et (b) d’une TAR industrielle en fonction du temps de contact avec HOBr, NaOCl et le mélange NaOCl +NaBr

109
Le témoin sans biocide montre qu'il n'y a pas eu de changements au niveau de la
concentration en cellules actives ou cultivables au cours des expériences (période de 60
minutes) avec une variation maximale allant 0,01 à 0,07 log. Une diminution des bactéries
actives et cultivables a été observée après exposition aux biocides, avec un impact différent
sur la viabilité cellulaire selon l'origine de la population. En effet, pour la population
provenant d’une TAR tertiaire (essai n°1), HOBr conduit au bout d’une heure à une réduction
d'environ 2 log concernant les cellules actives et 1 log pour les cellules cultivables, alors que
l'inverse est observé pour la population bactérienne issue d’une TAR industrielle (essai n°2).

La même tendance est observée avec l'addition simultanée de NaOCl et NaBr, où l’impact est
plus élevé sur l'activité que sur cultivabilité pour l’essai n°1 en comparaison avec l’essai n°2.
Inversement, l'effet observé avec NaOCl est similaire pour les 2 populations avec une
réduction d’environ 1 log et 1,5 log pour les cellules actives et cultivables, respectivement.

L’utilisation couplée de NaOCl et NaBr offre une action intermédiaire entre celles observées
avec HOBr et NaOCl seul. En effet, HOBr montre une action progressive et NaOCl présente
une action très rapide (5 minutes), alors que le couplage NaOCl+NaBr présente une action
rapide équivalente à NaOCl seul mais avec une efficacité finale moins importante que ce
dernier. Ce phénomène peut être expliqué par la génération de HOBr sous forme libre, due à
la réaction entre NaClO et NaBr.

En effet, une réaction de substitution génère la production d’HOBr en environ 5 minutes

(Rees et al. 2010). En conséquence, NaOCl pourrait avoir une première action rapide sur les
bactéries avant réaction avec NaBr puis une action plus progressive sur les cellules intègres
restantes du fait de l’action de HOBr produit. Cependant, même si la fraction cellulaire intacte
était proche de 0% après un temps de contact de 1 heure pour la population issue d’une TAR
tertiaire, il subsiste toujours une forte proportion de bactéries intactes pour la population issue
d’une TAR industrielle, à savoir entre un tiers et la moitié de la fraction initiale, en fonction
du biocide.

En outre, il est important de rappeler que tous les microorganismes utilisés pour les tests ont
été collectés à partir d'une culture fraîche, la perte importante de cultivabilité associée à une
faible diminution de bactéries actives suggère donc le passage d’une fraction de la population
à l’état viable non cultivable. Un test statistique Spearman a été également effectué afin
d'attester la corrélation entre les cellules actives et cultivables qui ont subi ou non un
traitement biocide. Compte tenu de toutes les observations des essais n°1 & 2 (n=40), une
corrélation significative a été démontrée (p<0,0001, r=0,79), soulignant le lien entre les
variations des concentrations en cellules actives et cultivables.

II.2.2. Suivi de tours aéroréfrigérantes par cytométrie en flux

L'analyse de 27 échantillons provenant de TAR a été effectuée afin de comparer les
performances d’un cytomètre en flux de laboratoire (FACSCanto™ II), d’un cytomètre en
flux utilisable sur le terrain (ACCURI™ C6), de la mesure de l'ATP (Aquatools) et de la
méthode standard basée sur la culture (milieu PCA) en termes de précision et de délai de
résultat.

110
Le tableau 12 regroupe les résultats obtenus concernant la détection des microorganismes
présentant une activité métabolique, par cytométrie en flux (CV6), ATPmétrie (pour les 10
derniers échantillons) et culture et la caractérisation physico-chimique des échantillons d’eau
de TAR. Concernant les mesures microbiologiques, n=1 pour les échantillons 1 à 17 et n=3
pour les échantillons de 18 à 27.
Tableau 12 Suivi des bactéries par cytométrie en flux (CV6), ATPmétrie et culture (PCA) et mesures physico-chimiques
(pH, turbidité, conductivité) de 27 échantillons de TARs
Cytométrie en flux ATP Culture pH Turbidité Conductivité
Echantillon Système labo Système terrain
-1
cellules/mL cellules/mL MEQ /mL UFC /mL NFU µS.cm
1 0,00E+00 0,00E+00 nd 0,00E+00 8,47 0,54 843
2 3,47E+05 2,28E+05 nd 3,86E+03 8,70 4,60 923
3 9,53E+04 4,27E+04 nd 1,97E+04 9,15 1,50 1500
4 4,33E+04 9,16E+05 nd 1,17E+04 8,95 2,60 1370
5 1,75E+06 1,84E+06 nd 3,40E+04 9,60 1,90 1040
6 9,01E+05 2,04E+05 nd 3,53E+04 9,20 0,90 1430
7 4,33E+05 1,47E+05 nd 3,87E+03 9,15 0,43 2380
8 1,32E+06 3,32E+05 nd 2,03E+03 9,20 1,50 1290
9 9,19E+05 4,60E+05 nd 4,14E+04 9,35 0,41 1540
10 2,22E+06 2,13E+06 nd 2,31E+05 9,25 3,60 2790
11 4,52E+06 2,84E+06 nd 1,31E+05 9,35 0,74 1920
12 4,51E+06 3,04E+06 nd 3,53E+04 9,30 0,74 1620
13 6,59E+05 6,98E+05 nd 1,15E+05 9,60 3,80 4650
14 6,76E+05 7,41E+05 nd 1,54E+05 9,00 0,96 1270
15 2,22E+06 1,52E+06 nd 1,15E+04 9,15 1,00 1580
16 7,11E+06 4,35E+06 nd 4,72E+05 9,20 1,80 1710
17 1,02E+06 6,13E+05 nd 2,49E+03 9,10 0,89 1590
18 1,33E+06 9,38E+05 1,12E+05 2,18E+04 9,40 0,29 2050
19 1,39E+05 1,42E+05 5,67E+03 4,50E+01 8,95 0,88 1580
20 3,64E+05 3,69E+05 6,10E+04 4,50E+04 9,10 1,00 1700
21 5,20E+04 5,91E+04 4,28E+04 1,75E+01 8,10 0,26 634
22 4,02E+06 3,13E+06 4,72E+05 3,55E+04 8,95 1,40 1360
23 1,85E+06 1,69E+06 1,75E+04 2,25E+03 8,80 10,00 925
24 4,30E+06 3,65E+06 4,53E+05 7,70E+03 9,10 1,20 1980
25 1,68E+05 2,34E+05 1,48E+05 2,83E+03 9,05 1,80 1550
26 3,11E+06 2,54E+06 3,35E+05 1,20E+03 9,40 2,60 3040
27 3,52E+05 2,91E+05 9,34E+05 2,60E+02 9,15 2,10 1890
nd= non-déterminé, MEQ= microorganism equivalent, UFC= unité formant colonies, NFU= nephelometric unit

Pour l’échantillon n°1, la valeur en chlore résiduel mesurée après neutralisation au thiosulfate,
était de 4,2 m/L, ce qui explique l'absence de bactéries, quelle que soit la méthode de
détection utilisée. En revanche, en ce qui concerne les autres échantillons, les valeurs de
chlore après la neutralisation étaient inférieures à 0,05 mg/L. Concernant les données physico-
chimiques, le pH varie entre 8,10 et 9,60, la turbidité varie entre 0,26 et 10 NFU et la
conductivité varie entre 843 et 3040 µS/cm. La quantité moyenne de bactéries quantifiées
était de 1,71.106 cellules/mL avec le cytomètre en flux de laboratoire, 1,27.106 cellules/mL
avec les cytomètre en flux de terrain, 2,58.105 cellules/mL et 5.46.104 CFU/mL, par culture
sur milieu PCA. La différence moyenne entre la cytométrie de flux et la culture est de 1,43
log, soulignant que les bactéries cultivables représentent 3,7% de la partie active de la
population.

111
Parmi les 27 échantillons analysés, plusieurs ont été prélevés à des dates différentes sur un
même site. Les variations observées entre 2 dates de prélèvement sont comprises entre 0,2 log
et 1,6 log pour le cytomètre de laboratoire (FACSCanto™ II), 0,3 log et 1,3 log pour le
cytomètre de terrain (ACCURI™ C6) et 0,3 log et 2,2 log pour la culture sur milieu PCA. La
cause de ces différences de concentrations est difficile à expliquer car de nombreux facteurs
varient tels que la teneur en microorganismes de l’eau d’alimentation des TARs ou le
traitement de désinfection appliqué.

La figure 52 illustre un exemple pour un même site (n=3 dates de prélèvements) avec un
espacement de 2 mois entre chaque échantillon.

Figure 52 Exemple de variation de la concentration en bactéries actives et cultivables pour des échantillons prélevés à
3 dates différentes au niveau d’une même TAR

Les concentrations au niveau des bactéries cultivables sont très différentes d’une date à l’autre
(4,3 log, 3,4 log et 1,7 log) alors que les concentrations en bactéries actives varient dans une
moindre mesure (4,6 log à 6,0 log). Cet écart permet d’émettre l’hypothèse que le traitement
de désinfection appliqué a altéré la capacité de croissance des bactéries mais qu’une partie de
celles-ci a conservé une activité métabolique détectable par cytométrie en flux.

L’ensemble des données a été traité statistiquement (tableau 13) en vue de mettre en évidence
une potentielle corrélation ou influence d’un paramètre sur un autre.

112
Tableau 13 Matrice de corrélation de Spearman pour les mesures microbiologiques et physico-chimiques (n=27)
Variables FACSCanto™ ACCURI™ C6 Culture pH Turbidité Conductivité

FACSCanto 1 0,886 0,466 0,522 0,074 0,404

Accuri C6 0,886 1 0,515 0,403 0,260 0,373

Culture 0,466 0,515 1 0,478 0,064 0,313

pH 0,522 0,403 0,478 1 0,024 0,620

Turbidité 0,074 0,260 0,064 0,024 1 0,038

Conductivité 0,404 0,373 0,313 0,620 0,038 1

Au regard du tableau 13, il apparait que les valeurs obtenues avec les 2 cytomètres en flux
présentent une corrélation significative entre échantillons appariés (Spearman, p<0,05,
r=0,886) mais pas au niveau quantitatif (Wilcoxon, p<0,05). Cette tendance est présentée
visuellement dans la figure 53 par la régression linéaire avec un coefficient assez faible (r2=
0,92).

Figure 53 Régression linéaire des données obtenues par cytomètre labo et cytomètre portable (n=27)

Concernant la culture sur milieu PCA, une corrélation significative avec la cytométrie en flux
est également mise en évidence mais dans une moindre mesure (r=0,466 et 0,515 pour
FACSCanto™ II et ACCURI™ C6, respectivement). Cette différence de corrélation peut
s’expliquer par le fait que les deux approches permettent la mise en évidence d’états
physiologiques différents. En effet, la cytométrie en flux détecte les bactéries présentant une

113
activité cellulaire (incluant une partie des bactéries cultivables) contrairement à la culture sur
milieu PCA qui permet de dénombrer les bactéries capables de croître dans les conditions de
température et nutritives imposées.

Selon la courbe de dissociation (brome ou chlore), la forme active des biocides oxydants est
prépondérante à pH proche de 8 (par rapport à un pH≥ 9). Le test statistique appliqué permet
de confirmer ce phénomène au niveau des TARs tertiaires analysées. En effet, les variations
de pH observées montrent une corrélation significative positive avec les 3 méthodes de
quantification des bactéries. Cela signifie que plus le pH est élevé (ex : pH=9,5), plus la
concentration en bactéries est élevée ou que plus le pH est faible (ex : pH=8,0), plus la
concentration en bactéries est faible.

En revanche, la turbidité ne présente pas de lien significatif avec les variations en

concentrations bactériennes ni avec les autres paramètres. La conductivité présente une
corrélation uniquement avec la quantification par FACSCanto™ II et le pH.

Concernant les 10 échantillons analysés parallèlement par cytométrie en flux (n=3),

ATPmétrie (n=3) et culture (n=2), la figure 54 permet de visualiser les niveaux de bactéries
quantifiées et la variabilité de la mesure.

Figure 54 Comparaison de la quantification des bactéries par cytométrie en flux (CV6), ATPmétrie et culture en eau
de TAR tertiaire

Un écart moyen de 0,08 log est observé entre les 2 systèmes de cytométrie en flux,
démontrant que la réponse quantitative est similaire pour la mesure des bactéries actives. En
revanche, l’intervalle pour la quantification des bactéries actives est de 0,8 log entre la
cytométrie en flux et l’ATPmétrie. Cette observation suggère une potentielle sous-estimation
liée à la mesure indirecte de l’ATP, c’est-à-dire un signal converti en nombre de cellules via

114
une formule de calcul en partie basée sur la théorie. Les observations précédentes sont
confirmées statistiquement, avec une corrélation significative au niveau de la quantification
entre les 2 cytomètres en flux (Wilcoxon, p>0,05) et une absence de corrélation entre la
cytométrie en flux et la mesure de l’ATP (Wilcoxon, p<0,05). Par ailleurs, dans le cadre de
l’estimation de la précision d’une méthode analytique, il est admis que le coefficient de
variation (CV) ne doit pas excéder 20% (Food and Drug Administration 2014). Le tableau 14
présente les CV moyens estimés à partir des CV calculés individuellement pour chaque
échantillon et chaque méthode de quantification.
Tableau 14 Estimation des coefficients de variation liés à la cytométrie en flux, l’ATPmétrie et la culture sur milieu
PCA pour la quantification des bactéries en eau de TAR
Echantillon FACSCanto II Accuri C6 ATPmétrie Culture
18 54% 9% 41% 12%
19 45% 29% 64% 47%
20 13% 3% 54% 6%
21 33% 25% 230% 28%
22 2% 2% 8% 18%
23 3% 2% 8% 53%
24 1% 2% 19% 37%
25 6% 12% 18% 3%
26 1% 1% 19% 24%
27 8% 6% 41% 16%
Moyenne 17% 9% 50% 24%

Au regard du tableau 14, les CV calculés pour la mesure de l’ATP et la culture sont supérieurs
à 20% (50% et 24%, respectivement). En revanche, les CV obtenus concernant la cytométrie
en flux sont inférieurs à la limite de 20% avec 9% et 17% pour les systèmes ACCURI™ C6 et
FACSCanto™ II, respectivement.

115
Partie IV - DISCUSSION

116
I. UTILISATION DE LA CYTOMETRIE EN FLUX POUR L’ANALYSE DE LA QUALITE
DE L’EAU
Les performances et le potentiel de la cytométrie en flux dans le domaine du contrôle de la
qualité microbiologique de l’eau ont été évalués en comparaison à différentes méthodes
incluant la culture sur milieu gélosé, l’ATPmétrie, la microscopie à fluorescence ou la
cytométrie en phase solide. Ces méthodes, qu’elles soient normalisées ou alternatives,
présentent des niveaux d’informations différents relatifs à l’état physiologique de la
population microbiologique globale. Même s’il est possible d’obtenir une information sur une
espèce donnée avec la plupart de ces méthodes (FISH pour la microscopie, milieu de culture
chromogénique spécifique, anticorps pour la cytométrie…), les conclusions présentées ici
sont uniquement relatives à ces méthodes avec un mode d’utilisation non-spécifique pour le
suivi de la population globale viable. Le développement de cette technique pour des
applications de contrôle et de suivi de flores microbiennes spécifiques sera évoqué en
perspectives. L’objectif de la mise en œuvre d’une telle approche est de pouvoir répondre aux
contraintes d’une gestion active des installations, c’est-à-dire en fournissant aux exploitants
un accès à la réactivité nécessaire pour agir face à un problème au niveau de la filière.

I.1. APPLICATION A L’EAU POTABLE

Le code de la santé publique issu de la directive européenne 98/83/CE impose les paramètres,
les méthodes et la fréquence relatifs à la surveillance de la qualité de l’eau potable en France.
Les analyses réglementaires sont basées sur la quantification par culture sur milieu gélosé de
bactéries indicatrices de pollution fécale, incluant Escherichia coli et les entérocoques avec un
seuil fixé à 0 UFC/100 mL. La réglementation établit que toute mise en évidence spécifique
d’agents pathogènes ou d’indicateurs de contamination fécale nécessite de déclencher
immédiatement des actions correctives sur le terrain et la réalisation de nouveaux contrôles
(MINISTÈRE DE LA SANTÉ ET DES SOLIDARITÉS 2007).

En revanche, en France, concernant les germes totaux (détectés dans cette étude par culture et
cytométrie en flux), la réglementation ne fixe pas de seuil. Cependant, il est préconisé que la
variation de leur nombre ne dépasse pas un facteur 10 par rapport aux niveaux habituels. A
l’échelle internationale, les recommandations de l’OMS conseillent des seuils d’acceptation
de 20 UFC/mL pour l’eau produite et 300 UFC/mL pour l’eau distribuée (WHO 2006). Il a
été démontré au cours de cette étude que la cytométrie en flux permet d’obtenir des profils
représentant le comportement, au niveau quantitatif et qualitatif (présence/absence), de la
population bactérienne globale au sein d’une usine de traitement d’eau potable. Ces profils
que l’on peut qualifier de niveau « habituel » ou « de niveau de base » peuvent donc permettre
de visualiser rapidement et aisément et rapidement un dépassement anormal de la
concentration les germes totaux, tel que le facteur 10 préconisé et ainsi créer un seuil d’alerte.

Les résultats obtenus dans le cadre de la surveillance de 3 filières de production d’eau potable
ont permis de démontrer que la cytométrie en flux permet de s’assurer de la fiabilité de
chaque étape de traitement (filtration sur sable, ozonation, filtration CAG, chloration) et de
vérifier la qualité microbiologique de l’eau distribuée (Helmi et al. 2014; Helmi et al. 2015).
Peu d’études ont été effectuées dans ce domaine en conditions réelles (Hammes et al. 2008;

117
Hoefel et al. 2005; Prest et al. 2013) et les présents travaux sont à notre connaissance les
premiers réalisés en France sur l’ensemble d’une filière de potabilisation. Une étude similaire
précédemment effectuée en Suisse a été appliquée pour le suivi de la population bactérienne
au sein d’une usine de potabilisation (Hammes et al. 2008). Cependant, deux différences
majeures sont à noter par rapport aux présents travaux, incluant d’une part le fait que la filière
étudiée ne présente pas d’étape finale de chloration et d’autre part que seules les cellules
totales ont été quantifiées, ces dernières incluant également les cellules non-viables.

En se basant en premier lieu sur l’évolution des cellules totales au sein de la filière, les profils
de concentrations bactériennes établis au niveau des 3 filières étudiées sont corroborés par
cette étude de 2008 (figure 55).

Figure 55 Comparaison entre les présents travaux et ceux menés par Hammes et al. (2008) concernant les
concentrations bactériennes obtenues au niveau des différentes étapes de traitement de l’eau potable

Le premier constat est lié à la concentration en cellules totales mesurée au niveau de la prise
d’eau de rivière en entrée d’usine (eau de ressource), s’élevant à approximativement
106 cellules/mL. Après l’étape d’ozonation, les auteurs annoncent un abattement de 3 log
contre un abattement moyen proche de 2 log pour les usines étudiées présentement.
Concernant le relargage de microorganismes suite au passage de l’eau au niveau des filtres
CAG, la quantité de cellules est comparable avec une concentration moyenne de 4.104
cellules/mL pour les 3 usines étudiées aux cours de nos travaux et environ 105 cellules/mL
concernant l’étude publiée en 2008. En ce qui concerne l’eau produite, les concentrations
moyennes sont de 5.102 et 2.102 cellules/mL pour les 3 usines étudiées et l’étude antérieure,
respectivement.

Un autre point de comparaison avec cette étude, est l’écart observé entre les cellules totales et
les cellules cultivables sur milieu PCA, soit 2 à 3 log, confirmé par d’autres auteurs ((Hoefel
et al. 2003b). Ces observations appuient le fait que l’utilisation de méthodes capables de
mettre en évidence les cellules viables non-cultivable est pertinente (activité métabolique,

118
intégrité membranaire, quantité d’ADN). Les résultats moyens obtenus en tenant compte des
différentes étapes et des 3 filières concernant cet écart est de 3,4 log. Cependant, cet écart est
réduit lorsque l’on se base sur les résultats obtenus via le milieu R2A, plus adapté pour le
dénombrement des cellules cultivables dans le domaine de l’eau potable ; dans ce cas, l’écart
entre les cellules totales et celles ayant conservé leur capacité à cultiver est de 2,2 log.

Outre cet écart quantitatif, le temps nécessaire pour être en mesure de dénombrer les colonies
nécessite plusieurs jours (Hammes et al. 2008), selon la méthode employée (PCA et R2A,
respectivement). Du fait de cette vue partielle de la population (ne prenant pas en compte les
cellules viables non-cultivables) et du délai d’obtention du résultat, il est possible de convenir
que cette approche n’est pas compatible avec une gestion active du traitement de l’eau.
Cependant, selon les résultats des présents travaux, une corrélation entre les cellules
présentant une activité métabolique et les cellules capables de croître sur milieu gélosé a pu
être mise en évidence au niveau du suivi de filières de production d’eau potable. Cet aspect
souligne le fait que la cytométrie en flux, malgré l’écart quantitatif, suit la tendance des
bactéries cultivables, tout en fournissant un regard plus précis quant à la quantité et l’état
physiologique de cellules. En effet, les méthodes basées sur la culture sont les plus
couramment utilisées du fait qu’elles soient (1) issues de normes, (2) simples de mise en
œuvre et (3) peu coûteuses. Cependant, malgré une limite de détection admise à 1 cellule par
volume analysé, la culture sur gélose ne permet de visualiser qu’une très faible partie de la
population réellement présente dans un échantillon. En effet, il a été mis en évidence lors de
ces travaux que la proportion de cellules cultivables, estimée sur l’ensemble des analyses
effectuées lors de la surveillance de 3 usines de production d’eau potable, était en moyenne de
1% (Vives-Rego et al. 2000) par rapport à la quantité de cellules totales.

Ce phénomène observé lors d’études antérieures soulève donc la question de la pertinence

quant à l’utilisation de méthodes basées sur la culture pour la surveillance de la qualité de
l’eau (Allen et al. 2004; Hoefel et al. 2003b; Parthuisot et al. 2000; Phe et al. 2005a). En effet,
ces auteurs soulignent le fait que la prise en compte d’une absence de bactéries
hétérotrophiques (cultivables sur milieu usuel non-spécifique) uniquement ne permet pas aux
exploitants de s’assurer que l’eau produite est dépourvue de microorganismes viables, du fait
de la présence de cellules ayant conservé une activité métabolique avec une quantité
supérieure de 2 à 4 log. En conséquence, ces cellules actives mais non-cultivables peuvent à
termes contribuer à la formation du biofilm voire engendrer une épidémie dans le cas d’agents
pathogènes.

Une autre étude également menée en Suisse portait sur l’analyse de différents types d’eaux,
comprenant des eaux usées, de rivière, de pluie, embouteillées et distribuées (Prest et al.
2013). L’idée était d’établir une empreinte de la distribution de la fluorescence avec un critère
unique basé sur une proportion de cellules classifiées comme HNA/LNA (High Nucleic
Acid/Low Nucleic Acid) qui permet de déterminer si les cellules renferment une forte ou une
faible proportion d’ADN en relation avec l’intensité de fluorescence obtenue après marquage
au SGI. Cependant, cette approche reste controversée. En effet, certains travaux antérieurs
montrent que ce paramètre permettrait de distinguer les cellules actives (Harry et al. 2016;
Lebaron et al. 2001; Liu et al. 2013) alors que d’autre démontrent que le contenu d’une cellule

119
peut être variable selon la communauté bactérienne étudiée et de ce fait que cela ne permet
pas de témoigner directement d’une réelle activité cellulaire (Bouvier et al. 2007; Vila-Costa
et al. 2012). Suite à une contamination d’échantillons d’eau distribuée par de l’eau usée, les
résultats montrent qu’il s’avère complexe de pouvoir juger quant à une pollution en ne se
basant que sur les cellules HNA. Par ailleurs, les auteurs mentionnent que suite à l’étape
d’ozonation entrainant une élimination de la population équivalente à 3 log, la méthode
employée ne permet pas d’estimer l’état physiologique de cellules encore quantifiables après
ce traitement, soit environ 103 cellules/mL. De plus, les auteurs précisent qu’une notion de
viabilité représente un atout majeur pour ce type d’étude. En effet, l’abattement des cellules
totales n’est pas un paramètre suffisant pour conclure quant à l’efficacité d’un traitement en
termes d’inactivation des microorganismes. Le chainon manquant entre les cellules totales et
les cellules cultivables est représenté par les cellules viables non-cultivables (Hoefel et al.
2003b).

Une autre étude a été menée en Australie au sein d’une usine de production d’eau potable en
associant la quantification des cellules totales et la mise en évidence de la viabilité (Hoefel et
al. 2005). Les auteurs ont utilisé le kit BACLIGHT® (SYTO9/PI) pour la mise en évidence de
l’intégrité membranaire et le CFDA (carboxyfluorescein diacetate) pour la mise ne évidence
de l’activité cellulaire ; ces moyens de marquages sont analogues au couple SGII/PI et CV6,
respectivement, utilisés parallèlement lors des présents travaux. L’abattement global des
cellules totales entre la prise d’eau (4.106 cellules/mL) et l’eau produite (1.104 cellules/mL)
est de 1,81 log. Cette concentration au niveau de l’eau produite est 100 fois supérieure à celle
observée lors de la présente étude et de l’étude décrite précédemment (Hammes, 2008)
(Hammes et al. 2008). En ce qui concerne les bactéries viables, les concentrations s’élèvent à
8.102 et 6.102 cellules/mL via le kit BACLIGHT® et le CFDA, respectivement. En
comparaison avec la présente étude, les concentrations mesurées sont bien inférieures en
moyenne (n=36) de l’ordre de 80 cellules intègres/mL et 7 cellules actives/mL. Cependant, la
comparaison directe s’avère complexe du fait que les auteurs ne précisent pas si plusieurs
séries de prélèvements ont été effectuées et analysées, de ce fait la variabilité des
concentrations ne peut pas être prise en compte.

Les méthodes normatives ne sont basées que sur une seule approche, n’apportant une
information quantitative que sur les cellules ayant la capacité de cultiver, en occultant les
cellules viables mais non cultivables. Les présents travaux ont permis de mettre en œuvre une
approche multiparamétrique (offrant plusieurs niveaux d’information relatifs à une cellule
bactérienne ou à une population) permettant de visualiser aisément ce que l’on pourrait
qualifier de différents « étages » de discrimination concernant l’état des cellules.
L’application en parallèle de marquages distincts permet de quantifier la population totale
(SGII) et de distinguer les cellules viables non-cultivables, comprenant les cellules intègres
(SGII/PI) et actives (CV6). Les informations relatives à la viabilité des microorganismes
représentent un atout avéré pour le contrôle de l’efficacité de chaque étape de traitement du
fait qu’elles permettent de statuer non seulement sur la viabilité des cellules mais également
de déterminer la cible cellulaire de chaque traitement, telle que l’intégrité membranaire ou
l’activité métabolique. Ce suivi a également permis de mettre en évidence l’apport de la

120
cytométrie en flux quant à l’observation de l’impact spécifique de chaque type de traitement
sur les bactéries dont l’effet relatif est présenté dans le tableau 15 ; la classification « faible »,
« moyen » et « fort » au niveau de l’impact est attribuée en fonction de la quantité de bactéries
considérées comme viables avant et après application d’un traitement donné.
Tableau 15 Impact de l’ozonation, des UV et de la chloration sur les bactéries

Ozonation Ultra-violet Chloration

Bactéries Totales ++ - ++
Bactéries Intègres ++ + +
Usine A
Bactéries Actives ++ - ++
Bactéries Cultivables + ++ ++
Bactéries Totales ++ nd ++
Bactéries Intègres ++ nd +
Usine B
Bactéries Actives ++ nd ++
Bactéries Cultivables + nd ++
Bactéries Totales + ++ ++
Bactéries Intègres + + +
Usine C
Bactéries Actives - - ++
Bactéries Cultivables ++ + ++

- Impact faible

+ Impact moyen

++ Impact fort
nd= non-déterminé

La comparaison du nombre total de cellules avant et après un traitement chimique a permis

d’évaluer l'incidence sur l'ADN. C’est-à-dire que si aucun signal fluorescent n’est obtenu en
utilisant une méthode de marquage avec un intercalent des acides nucléiques, cela suggère
que des lésions importantes de l'ADN empêchent la liaison ou que la cellule est totalement
détruite (Hammes et al. 2008; Phe et al. 2009). La méthode de marquage qui permet de
visualiser l'intégrité de la membrane nécessitant la fixation des molécules fluorescentes sur
l'ADN, il est difficile d'évaluer avec précision l'effet des traitements sur l'intégrité de la
membrane bactérienne dans le cas d'importants dommages au niveau des acides nucléiques.

En effet, pour la majorité des types de traitements, on observe un fort impact au niveau de
l’ADN. Cette observation est basée sur le nombre de bactéries totales avant et après
traitement. Le chlore semble être le traitement le plus efficace pour inactiver les bactéries,
quelle que soit la cible (ADN, activité métabolique ou capacité à cultiver). Compte tenu de
ces informations et en accord avec des études précédentes (Cho et al. 2010; Phe et al. 2005b),
le chlore conduit à une inactivation du métabolisme et provoque des lésions au niveau de
l'ADN. L’ozone présente également un effet significatif au niveau de l'ADN et de l'activité

121
métabolique. En revanche, la capacité à cultiver est faiblement affectée par l’ozonation, ce qui
suggère que les cellules encore viables après ce traitement peuvent également avoir conservé
leur aptitude à se multiplier. Cependant, il est important de souligner que cette fraction de
cellules plus résistantes reste minoritaire par rapport à l’ensemble de la population
microbienne. Le traitement impliquant une irradiation UV a montré un impact très faible sur
l'activité des bactéries. Cette observation confirme les observations d’études précédentes,
montrant qu’une exposition de bactéries à des doses UV de 3,5 mJ/cm2 (Cho et al. 2010) et 40
mJ/cm2 (Marconnet et al. 2011) n’avait pas d’effet significatif sur son activité métabolique et
pouvant potentiellement engendrer une recroissance ultérieure. Inversement, un impact
significatif a été mis en évidence sur la cultivabilité et l'ADN, tel que rapporté dans des études
précédentes (Eischeid and Linden 2007; Oguma et al. 2001).

I.2. APPLICATION SUR EAU DE TOURS AEROREFRIGERANTES

La contrôle de la contamination au niveau des tours aéroréfrigérantes est primordial en vue de
limiter (1) la perte énergétique selon l’épaisseur du biofilm fixé aux parois des circuits et
d’autre part (2) la prolifération et de la dissémination des légionelles. La conception et la
surveillance des tours aéroréfrigérantes dans le cadre de la prévention du risque légionelles
sont réglementées par l’arrêté du 14 décembre 2013 du Ministère chargé de l’écologie, relatif
aux installations de refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air soumises à
autorisation au titre de la rubrique n° 2921 (installations de refroidissement évaporatif par
dispersion d’eau dans un flux d’air généré par ventilation mécanique ou naturelle). Celui-ci
précise les caractéristiques des installations soumises à Déclaration ou à Enregistrement. La
gestion du risque sanitaire repose sur le contrôle de la présence de légionelles dans la phase
eau selon la norme NF T90-431 (légionnelles cultivables) afin de vérifier que le niveau reste
en-dessous des seuils d’alerte.

En effet, une valeur supérieure ou égale à 103 UFC/L et inférieure à 106 UFC/L représente un
seuil d’action avec analyse de risque suivi de mesures correctives et un niveau supérieur ou
égal à 105 UFC/L représente le seuil d’arrêt de l’installation avec vidange, nettoyage et
désinfection. De ce fait, la maîtrise du dosage des biocides utilisés et leur efficacité quant à
l’effet sur l’abattement de la population microbienne doit être surveillé en vue d’éviter de
possibles épidémies (Mouchtouri et al. 2010). En effet, aux Etats-Unis, un cas récent de
contamination due à la présence de légionelles a été observé, la raison de cet événement étant
un arrêt du système automatisé de désinfection (Quinn et al. 2015). Les paramètres
microbiologiques incluent la détection des légionelles (paramètre réglementaire) par culture
et/ou biologie moléculaire et le suivi de l’activité de la population globale (autocontrôle) par
culture et/ou mesure de l’ATP.

Suite à l’étude liée au domaine de la production d’eau potable, un second volet avait pour but
de confirmer l’intérêt et le gain apporté par cette approche pour le contrôle de l’efficacité des
procédés de désinfection au niveau des circuits de tours aéroréfrigérantes. Ces travaux sont à
notre connaissance les premiers menés portant sur l’analyse d’échantillons réels par
cytométrie en flux d’eaux provenant de tours aéroréfrigérantes pour mesurer l’impact des
traitements sur la population microbienne. La majorité des recherches effectuées dans ce

122
domaine sont basées spécifiquement sur l’étude de souches pures de légionelles et leur
résistance face à un traitement biocide. En effet, les méthodes mises en œuvre pour la
détection des légionelles par cytométrie en flux sont basées sur l’utilisation d’anticorps
couplés à un élément fluorescent, permettant ainsi de détecter spécifiquement cette cible
d’intérêt (Fuchslin et al. 2010; Tyndall et al. 1985) voire de mettre en évidence leur viabilité
(Keserue et al. 2012). Cependant, cette approche présente (1) un coût considérable en termes
de consommables du fait de l’utilisation d’anticorps pour la séparation immuno-magnétique et
pour la détection spécifique et (2) demande une certaine expertise au niveau de la préparation
de l’échantillon. Au regard de ce constat, cette méthode est difficilement applicable en
conditions réelles. De plus, cette approche ne donne pas d’information concernant le second
aspect important de l’impact de la désinfection, c’est-à-dire sur l’ensemble de la population
microbienne, ayant potentiellement le pouvoir de générer un biofilm.

D’autres essais ont également été menés directement sur des cultures pures de légionelles,
c’est-à-dire sans utilisation d’anticorps, en vue d’évaluer l’impact de différents traitements
biocides. Une équipe a étudié la résistance de différentes souches de légionelles vis-à-vis du
dioxide de chlore (ClO2) (Mustapha et al. 2015) et ont démontré qu’une dose supérieure à 5
mg/L était nécessaire à l’inactivation des cellules. Les auteurs précisent que le passage au
stade VBNC (mesuré par cytométrie en flux via kit BACLIGHT) a lieu entre 4 et 5 mg/L. Ce
point est important à souligner car certaines cellules VBNC ont pu recouvrer leur capacité à
cultiver par la suite. Une autre étude (Allegra et al. 2008) démontre que les légionelles
peuvent perdre leur capacité à cultiver suite à un traitement thermique, puis la retrouver en
passant pas un état VBNC intermédiaire, qui n’est pas détectable par les méthodes culturales
classiques. Ce point souligne le fait que la mesure de cellules VBNC est un aspect important
en termes de sécurité sanitaire.

Les présents travaux ont été menés sur la quantification des cellules microbiennes actives,
catégorie pouvant inclure les VBNC et les bactéries cultivables, sans distinction de genre ou
d’espèce. En comparaison avec les approches décrites précédemment, les avantages sont liés
au fait que la mesure de l’impact d’un traitement biocide est évalué sur l’ensemble de la
population indigène naturelle, pouvant présenter un comportement différent par rapport à des
souches pures. Des essais comparatifs ont été réalisés avec des échantillons réels d’eau de
TARs avec différentes méthodes, incluant la cytométrie en flux de laboratoire et de terrain, la
culture sur gélose et la mesure de l’ATP. La mesure de la concentration intracellulaire en ATP
est un moyen simple et rapide d’estimer une activité globale d’une population microbienne
dans un échantillon, souvent utilisé au niveau des tours aéroréfrigérantes (Duda et al. 2015;
Mueller et al. 2009). Cependant, la donnée quantitative (en équivalent microorganismes/mL)
est obtenue de manière indirecte ; la quantité de cellules calculée est proportionnelle à
l’intensité de fluorescence mesurée, en se basant sur une concentration intracellulaire par
cellule convenue. Ce principe est généralisé pour tous types de microorganismes, ce qui n’est
pas avéré du fait de la grande variété de microorganismes aquatiques en termes de
métabolisme et de taille. De ce fait, même si une corrélation significative qualitative a pu être
mis en évidence entre la cytométrie en flux et la mesure de l’ATP (Liu et al. 2013;

123
Nescerecka et al. 2014), la quantification obtenue peut présenter un biais (Duda et al. 2015),
expliquant les valeurs souvent inférieures à celles obtenues par cytométrie en flux.

Plusieurs études précédentes soulignent le fait que la combinaison d’une analyse des cellules
totales par cytométrie en flux et d’une analyse de l’activité par mesure de l’ATP permet de
bénéficier d’une meilleure vision de la population microbienne, avec distinction de la viabilité
(Hammes et al. 2008; Nescerecka et al. 2014; Vital et al. 2012). Les présents travaux
répondent donc à ce besoin mais avec l’utilisation d’une méthode unique car la cytométrie en
flux apporte simultanément ces 2 informations, en utilisant conjointement des fluorochromes
tels que le SGII (pour les bactéries totales) et le CV6 (pour les bactéries actives en
remplacement de la mesure de l’ATP).

D’autre part, une évaluation de l’impact de 3 biocides oxydants sur les cellules bactériennes a
été effectuée sur des populations isolées à partir d’une eau de TAR tertiaire et d’une eau de
TAR industrielle. Les résultats démontrent que la cytométrie en flux apporte des réponses en
termes de quantification des bactéries viables et d’efficacité d’impact des traitements biocides
avec un délai de résultat très court parfaitement adapté aux besoins industriels. L’une des
informations importantes obtenues lors de l’analyse des prélèvements provenant de
différentes TARs est que les niveaux de bactéries après traitement restent élevés : 106/mL
pour les bactéries actives et 104/mL pour les bactéries cultivables, soulignant également
l’écart de 2 log entre la population restant active et celle ayant la capacité de cultiver
(Hammes et al. 2008). Peu d’études reportent la concentration relative à l’abattement de la
population globale après un traitement biocide en conditions réelles, la majorité apportant des
informations uniquement liées aux légionelles. Cependant, une étude (Duda et al. 2015)
présente des résultats concernant la flore totale cultivable en TAR, avec des concentrations
après chloration supérieures à 103 UFC/mL (milieux R2A et PCA, également utilisés au cours
des présents travaux).

Les résultats obtenus avec les cytomètres en flux portable et de laboratoire présentent une
corrélation en termes de quantification absolue des bactéries actives dans un échantillon
donné, suggérant qu’une utilisation pour une analyse directement sur site avec le système
portable est envisageable. De plus, une corrélation significative entre les variations de
concentrations des bactéries actives quantifiées par cytométrie de flux (terrain et laboratoire)
et des bactéries cultivables a été mise en évidence (1) pour des échantillons réels d’eau de
TARs et (2) suite à une exposition à différents biocides sur des populations spécifiques isolées
d’eaux de TARs. Cependant, la méthode par culture présente certains désavantages dont une
vision partielle de la population car seulement 1% en moyenne des bactéries peuvent être
cultivées dans les conditions standards (Vives-Rego et al. 2000). D’autre part, le délai
d’obtention de résultat varie entre 24 et 48 heures, ce qui n’est pas compatible avec une
gestion active du traitement. De plus, la culture ne donne pas d’information relative à l’effet
de chaque biocide sur les bactéries. La cytométrie en flux permet d’une part de quantifier les
bactéries viables, incluant les cultivables et non-cultivables (VBNC) et d’autre part d’avoir
une réponse quantitative en 1 heure.

124
Les quantités relatives aux bactéries actives mesurées parallèlement par ATPmétrie se situent
généralement entre la valeur donnée par la cytométrie en flux et la valeur obtenue via la
méthode de culture. La mesure de l’ATP présente donc une potentielle sous-estimation de la
fraction ciblée (c’est-à-dire les bactéries actives) et présente une variabilité de mesure plus
importante suite à l’estimation du coefficient de variation (CV=50%) que la cytométrie en
flux (CV=9-17%) ou la culture (CV=24%). Cette instabilité au niveau de la précision peut
être expliquée par la transcription de l’intensité de fluorescence obtenue à partir de contenus
cellulaire pouvant être variable selon l’état physiologique des cellules (Hammes et al. 2008).

Par ailleurs, la mesure de l’ATP permet uniquement d’avoir une estimation de l’efficacité de
traitement sur la viabilité globale mais elle ne permet pas, au même titre que la culture,
d’obtenir d’information précise quant à l’impact sur la cellule elle-même. Les essais
concernant l’impact des biocides oxydants ont montré des différences en termes (1)
d’abattement, (2) d’effet et/ou (3) de rapidité d’action. Le tableau ci-dessous résume, dans les
conditions de cette étude, ces aspects pour des populations différentes issues d’une eau de
TAR tertiaire et d’une eau de TAR industrielle. Les différents effets des biocides testés sur
les cellules bactériennes sont présentés dans le tableau 16.
Tableau 16 Impact du brome complexé, de l’hypochlorite de sodium et du couple bromure de sodium et hypochlorite de
sodium sur les bactéries sur les bactéries

Brome complexé Hypochlorite de sodium Bromure de sodium et

hypochlorite de sodium
(HOBr) (NaOCl) (NaOCl+NaBr)

Rapidité + ++ ++
Bactéries Totales - - -
TAR
tertiaire
Bactéries intègres + ++ ++
Bactéries actives ++ + ++
Bactéries cultivables + ++ +
Rapidité - ++ ++
Bactéries Totales - - -
TAR
industrielle
Bactéries intègres + + +
Bactéries actives + + +
Bactéries cultivables ++ ++ ++

- Impact faible

+ Impact moyen

++ Impact fort

L’une des premières informations est une absence d’effet sur l’ADN bactérien car aucune
variation significative au niveau de la concentration en bactéries totales n’a été observée via la

125
cytométrie en flux (quel que soit le biocide ou l’échantillon) pour une concentration moyenne
en biocide de 0,5 mg/L avec un temps de contact maximum d’1 heure. Une observation
similaire a été rapportée (Phe et al. 2005a) pour un CT (Concentration x temps) proche de 30
mg.min/L, stipulant que pour une concentration en chlore de 0,3 mg/L avec un temps de
contact de 1 heure 30, la quantité de cellules bactériennes (Salmonella typhimurium) n’a
diminué que de 12%. Les auteurs précisent également que pour s’assurer d’une désinfection
dont l’effet sur les cellules est irréversible, il est nécessaire que l’impact sur l’ADN soit
significatif. De ce fait, il est recommandé d’utiliser le SYBR Green II (SGII) en vue de
vérifier l’altération du matériel génétique du fait que ce marqueur se fixe directement au
niveau de l’ADN bactérien (Phe et al. 2004).

En revanche, un abattement est observé après exposition aux différents biocides concernant
les bactéries actives, confirmé par la culture. Cela permet d’affirmer que les concentrations en
biocide utilisées n’impactent pas les acides nucléiques (ADN) des bactéries mais uniquement
leur métabolisme. D’après les données d’une étude précédente (Phe et al. 2005b), la quantité
de cellules totales marquées au SGII diminue progressivement (0 à 3 mg/L de chlore)
suggérant une altération de l’ADN avec un abattement inférieur à 1 log, contrairement aux
cellules cultivables diminuant de manière plus drastique avec un abattement équivalent à 1 log
pour la même gamme de concentration. Cela peut suggérer qu’une bactérie qui n’est pas
totalement détruite peut potentiellement relancer sa machinerie cellulaire et redevenir active.
En effet, une étude récente (Fernandez-Delgado et al. 2015) démontre ce phénomène en
quantifiant différents états de la bactérie Vibrio cholerae (cellules totales par DAPI, cellules
viables intègres par BACLIGHT® et cellules cultivables sur milieu gélosé BHI) en constate
un retour significatif à l’état cultivable de cellules considérées comme dormantes.

Les bactéries actives issues de l’eau de TAR tertiaire présentent une sensibilité plus grande
aux biocides (1-2 log) par rapport aux bactéries actives isolées à partir d’une eau de TAR
industrielle (0,5-1 log). En revanche, même si elles peuvent conserver un métabolisme actif,
les bactéries de l’eau de TAR industrielle perdent plus rapidement leur aptitude à cultiver par
rapport à celles de l’eau de TAR tertiaire. Une hypothèse concernant ces observations pourrait
être le fait que l’eau de la TAR tertiaire est alimentée par de l’eau potable et que l’eau de la
TAR industrielle est alimentée par de l’eau non-potable. En effet, cette différence notable de
population microbienne peut expliquer le fait que la diversité microbienne provenant d’un
milieu naturel (alimentation TAR industrielle) offre un plus grand panel de cellules résistantes
sans pour autant avoir la capacité de cultiver. En revanche, les cellules issues d’une eau
potable ont été soumises à un stress, actionnant ainsi un mécanisme de défense (VBNC) tout
en conservant leur aptitude à cultiver selon certaines conditions de température et
nutritionnelles (Leonard et al. 2016).

Concernant l’intégrité membranaire des bactéries, un effet plus rapide est observé avec le
biocide NaOCl et le mélange NaOCl+NaBr par rapport au biocide HOBr complexé (plus
stable pour le stockage), et ce avec les deux types de population bactérienne. Une hypothèse
pouvant expliquer ces résultats pourrait être lié au fait que les molécules ayant une activité
biocide sont disponibles plus rapidement avec NaOCl (molécule biocide) et NaOCl couplé à
NaBr (=produit HOBr, molécule biocide) comparé au HOBr complexé qui libère HOBr

126
(molécule biocide) de manière plus lente. Cependant, si les 3 biocides ont permis d’atteindre
des valeurs proches de 0% de bactéries viables entre 5 minutes et 1 heure pour la population
issue de TAR tertiaire, aucun des biocides n’a pu totalement abattre la population viable
provenant de la TAR industrielle. L’ensemble de ces résultats montrent que la cytométrie en
flux permet un suivi quasi-instantané de l’impact d’un traitement biocide et de doser la
concentration nécessaire en produit actif et/ou le temps de contact avec le biocide pour
s’assurer de l’élimination des bactéries de manière irréversible en suivant par exemple la
destruction de l’ADN (Phe et al. 2007).

II. AVANTAGES ET LIMITES OPERATIONNELLES DE LA CYTOMETRIE EN FLUX

La cytométrie en flux, malgré une limite de détection plus élevée que la plupart des autres
méthodes précitées, supérieure à 100 cellules par mL (Hammes et al. 2008), présente un
ensemble d’avantages non-négligeable concernant le contrôle de la qualité microbiologique
de l’eau. Ce qui pourrait à première vue être considéré comme un inconvénient, permet de
pallier le problème relatif à la représentativité. En effet, la nécessité de quantifier entre 100 et
1000 cellules par cytométrie en flux, contrairement au faible nombre de colonies sur milieu
gélosé, limite le biais lié à l’extrapolation du petit volume mesuré (10 à 60µL), au volume de
l’échantillon initial. De ce fait, la cytométrie en flux permet d’obtenir une quantification plus
précise et plus réaliste quant à la population microbiologique présente dans un échantillon.

Une autre difficulté peut venir du fait qu’il n’est pas possible de visualiser directement les
cellules quantifiées par le système mais uniquement leur représentation électronique. Ce
problème peut être pallié par (1) une bonne calibration préalable du système et (2) la
réalisation systématique d’échantillons de contrôle.

La calibration doit en premier lieu prendre en compte les caractéristiques du marqueur

fluorescent utilisé, principalement en termes de fuites optiques (chevauchement des longueurs
d’ondes d’émissions de la fluorescence). Ce problème peut être évité par application de
compensations de fluorescence et/ou par modifications des voltages relatifs à une
fluorescence. Cette calibration peut être effectuée sur une souche modèle telle que E. coli. En
second lieu, il est important de vérifier la concordance entre par la quantification obtenue par
cytométrie en flux et une méthode usuelle capable de fournir le même type d’information. Par
exemple, l’estimation de l’intégrité membranaire (SGII et PI) par microscopie à
épifluorescence et par cytométrie en flux parallèlement. L’avantage d’un dénombrement par
microscopie à épifluorescence réside dans le fait qu’il est possible de couvrir un large panel
de marqueurs tels que le DAPI ou le SYBR Green, permettant d’obtenir une estimation de la
concentration en cellules totales (Lebaron et al. 1998; Reynolds and Fricker 1999).

L’utilisation en parallèle de marqueurs de viabilité analogues au kit BACLIGHT ®, CFDA ou

CTC permettent également de connaître la proportion de cellules viables. Un autre avantage
réside dans le fait que la microscopie permet de visualiser directement la morphologie des
cellules et de ce fait de distinguer l’hétérogénéité d’une population. Lors des présents travaux,
il a été mis une corrélation significative quantitative entre la microscopie et la cytométrie en

127
flux, concernant le dénombrement des cellules totales et des cellules actives, précédemment.
Cette corrélation confirme la fiabilité de la méthode par cytométrie en flux face à la méthode
éprouvée par microscopie à épifluorescence (Lebaron et al. 1998). De même, au cours de ces
travaux, la cytométrie en flux a été comparée à la cytométrie en phase solide, méthode
présentant une très bonne sensibilité, avec une limite de détection d’une cellule par volume
analysé, généralement 100 µL. Le système étant couplé à un microscope à épifluorescence, il
est possible de rejeter visuellement un élément fluorescent sélectionné à tort par le système
automatisé. Cela permet d’éliminer le signal apporté par des particules autofluorescentes. Le
délai de résultat est de l’ordre de 3 heures, incluant les étapes de préparation de l’échantillon
et de validation des événements (le temps de scan de la membrane par l’appareil étant de
l’ordre de 3 minutes en moyenne). L’analyse la plus courante opérée sur ce système est la
détection des bactéries actives, via la mise en évidence de l’activité enzymatique estérase
(Parthuisot et al. 2000; Reynolds and Fricker 1999). Lors des présents travaux, il a été mis en
évidence une corrélation significative quantitative entre la cytométrie en phase solide et la
cytométrie en flux, pour la quantification des cellules actives. Ce constat suggère que la
cytométrie en flux, dont la limite de détection est supérieure à celle de la cytométrie en phase
solide, présente une sensibilité suffisante quant à la surveillance de l’eau produite, avec
chloration préalable.

Par la suite, il est nécessaire de prendre en compte la réponse des réglages en présence d’un
échantillon réel en vue de paramétrer les seuils de quantification en vue de s’affranchir des
particules gênantes pour une quantification optimale des cellules. Par ailleurs, suite à cette
calibration préalable, les échantillons contrôles permettent de croiser certaines informations
relatives à des événements fluorescents visibles au niveau de témoins non-marqués par
exemple et donc de pouvoir conclure quant à l’échantillon à analyser.

Un avantage majeur de cette approche concerne le délai d’analyse pouvant être inférieur à 1
heure à partir de la réception de l’échantillon. Cet intervalle de temps comprend (1) la dilution
si nécessaire et le marquage, (2) le temps de contact ou incubation, (3) la détection elle-même
et (4) l’interprétation des cytogrammes. La cytométrie en flux permet également de détecter et
quantifier les cellules totales et d’en distinguer la fraction viable. La rapidité de la procédure
de marquage permet d’obtenir ces informations en temps quasi-réel contrairement aux
méthodes présentées préalablement qui soit (1) ne permettent pas d’obtenir les 2 niveaux
d’information soit (2) nécessitent un délai de préparation et/ou de lecture plus important.

Outre les performances techniques d’une méthode telles que la sensibilité et le délai
d’obtention du résultat, sa propension à être appliquée en conditions réelles est tout aussi
importante. Cet aspect de l’application d’une méthode analytique englobe sa complexité à être
utilisée par un opérateur mais également les coûts engendrés en termes d’investissement
initial pour l’acquisition du matériel (CAPEX) et de consommables et coût salarial des
opérateurs (OPEX). La figure 46 présente une estimation du CAPEX nécessaire et de l’OPEX
pour 10 analyses par jour durant 1 an avec la cytométrie en flux, la cytométrie en phase
solide, la mesure de l’ATP, la microscopie à épifluorescence et la culture sur gélose.

128
Figure 56 Comparaison OPEX/CAPEX entre la cytométrie en flux, la cytométrie en phase solide, la mesure de l’ATP,
la microscopie à épifluorescence et la culture sur gélose pour 10 analyses quotidiennes durant une année

Les points pris en compte pour ces estimations incluent (1) l’acquisition et amortissement de
l’appareillage, (2) la maintenance relative à l’équipement, (3) les consommables et (4) le coût
horaire lié à l’opérateur effectuant les analyses. Il s’avère que la culture sur gélose et
l’ATPmétrie ne nécessitent qu’un très faible investissement en termes de matériel et
présentent également les coûts opérationnels les moins élevés. La cytométrie en flux et la
cytométrie en phase solide sont les méthodes les plus onéreuses au niveau des systèmes
analytiques alors que l’acquisition d’un microscope à épifluorescence présente un coût
intermédiaire. En revanche, l’OPEX engendré par la cytométrie en flux est inférieur à celui
généré par la microscopie et la cytométrie en phase solide. Ces différences observées au
niveau de l’OPEX dépendent directement du coût des réactifs mais également du temps passé
par l’opérateur en termes de manipulation, lecture et interprétation.

En effet, le dénombrement et l’interprétation liés à la microscopie à épifluorescence sont

d’une part fastidieux et d’autre part dépendants de l’opérateur, suggérant de possibles écarts
au niveau de la reproductibilité. A l’exception de la microscopie à épifluorescence, les autres
méthodes analytiques testées bénéficient de moyens automatisés favorisant la lecture et de ce
fait l’objectivité de l’interprétation. Par contre, l’automatisation ne doit pas et ne peut pas
remplacer totalement l’expertise liée à une méthode donnée. Par exemple, en ce qui concerne
la cytométrie en phase solide, une validation visuelle est recommandée après le
dénombrement automatique effectué par le système car ce système est susceptible de
comptabiliser des événements fluorescents non-désirables (Lebaron et al. 1998). Au niveau de
la cytométrie en flux, une visualisation directe des cellules n’étant pas possible, le « Gating »
(sélection de la fenêtre de lecture) doit être préalablement défini lors de la calibration et de la
validation.

129
Pour la culture sur gélose, les compteurs de colonies facilitent le dénombrement mais la
décision quant au paramétrage de lecture (telle que l’intensité lumineuse appliquée) revient à
l’opérateur, en vue de limiter la prise en compte d’artefact tels que des bulles d’air.
Concernant l’ATPmétrie, l’opérateur n’a en revanche aucune marge de manœuvre possible au
niveau de l’interprétation, le résultat étant délivré par un fluorimètre sans aucune
représentation visuelle des cellules. Cependant, avant chaque série d’analyse, une calibration
préalable basée sur un standard avec une valeur seuil minimale de luminescence, permet de
valider les valeurs obtenues pour les échantillons analysés. La possibilité d’utiliser une
technique directement sur le site à contrôler joue également un rôle non-négligeable en ce qui
concerne la capacité de déploiement de la méthode d’analyse. En effet, cela permet d’une part
(1) de s’affranchir du transport de l’échantillon, pouvant engendrer un biais quant à la
viabilité cellulaire et d’autre part (2) de pouvoir bénéficier d’une certaine liberté
d’échantillonnage en fonction des résultats obtenus suite par exemple à un essai de choc de
désinfection. Cet aspect de transportabilité est possible avec l’ATPmétrie et la cytométrie en
flux, le matériel relatif à leur application et le délai de résultat (inférieur à 1 heure) étant
compatible avec une utilisation directement sur le terrain.

III. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES QUANT A L’UTILITE DE LA CYTOMETRIE EN

FLUX POUR LE CONTROLE DE L’EFFICACITE DE TRAITEMENT DE L’EAU
Différents aspects concernant les techniques usuelles pour le contrôle de la qualité
microbiologique de l’eau ont été confrontés permettant de positionner ces méthodes
analytiques les unes par rapport aux autres en termes de performances (sensibilité,
représentativité, délai) et de déploiement (complexité, transportabilité, coût), ont été
confrontés. La figure 57 présente une vision schématique de cette hiérarchisation.

Figure 57 Positionnement de la cytométrie en flux, la cytométrie en phase solide, la mesure de l’ATP, la microscopie à
épifluorescence et la culture sur gélose en fonction de leurs performances et de leur déploiement

Au regard de ce double critère, la méthode réglementaire basée sur une culture sur gélose
présente un intérêt très limité pour un contrôle efficace de la qualité microbiologique de l’eau.

130
En effet, malgré le fait que cette méthode techniquement simple offre le coût le plus faible, la
représentativité, le délai de résultat et l’obligation d’une structure spécifique ne permettent pas
une gestion optimale de la qualité de l’eau. De même, la microscopie à épifluorescence et la
cytométrie en phase solide sont difficilement transportables et nécessitent également un local
dédié à leur utilisation, réduisant leur possibilité d’application sur site. En revanche, leurs
performances en termes de délai d’obtention de résultat et de sensibilité avec un atout
supplémentaire pour la cytométrie en phase solide apporté par l’automatisation de la lecture.

L’ATPmétrie et la cytométrie en flux présentent des performances intermédiaires,

essentiellement du fait d’une limite de quantification plus élevée, qui reste cependant
suffisante pour quantifier une population microbienne aquatique. Par contre, un délai de
résultat inférieur à 1 heure, la quantification des cellules actives et leur transportabilité sur le
terrain apporte un gain majeur en ce qui concerne une gestion efficace de la qualité de l’eau.
Aussi, malgré un avantage relatif concernant la transportabilité lié au matériel pour la mesure
de l’ATP, la cytométrie en flux apparait comme la plus adaptée à l’analyse de l’eau. En effet,
les résultats obtenus au cours de ces travaux ont permis de démontrer que la quantification des
cellules a été possible à partir d’eaux de ressource, en cours de traitement, produite et
industrielle. Cela démontre que cette technique permet de distinguer les cellules du bruit de
fond particulaire et électronique non-fluorescent et/ou auto-fluorescent dans les conditions de
ces études. Cependant, une validation de plus grande envergure, c’est-à-dire en analysant de
plus grandes quantités d’échantillons de nature et de provenance diverse permettra de
confirmer les performances de la cytométrie en flux et des gains associés.

L’utilisation de cette technologie permettrait donc de garantir une qualité et une sécurité
accrues par l’obtention de résultats sur les abattements et l’efficacité de traitement en temps
quasi réel (Hammes et al. 2008). L’avantage réside également dans le fait que l’évaluation de
l’effet des traitements de potabilisation sur la viabilité des bactéries permettrait d’évaluer plus
finement chacune des étapes de traitement. Ainsi, leur optimisation en serait facilitée, tout en
garantissant une efficacité inchangée. En effet, en moins d’une heure, cette méthode a permis
d’obtenir différentes informations sur une population microbienne présente dans un
échantillon donné : les cellules totales, intègres, et actives. Les limites de cette méthode
comporte le seuil de détection (≈ 100-1000 cellules/mL) et le fait de ne pouvoir visualiser
qu’une représentation électronique des bactéries. Cependant, comme démontré
précédemment, cette limite de détection est suffisante pour un contrôle d’une filière de
traitement et une calibration robuste permet de s’affranchir de visualiser les bactéries.

Suite à l’optimisation et la validation de la méthode par cytométrie en flux, l’intérêt de cette

dernière a été reconnu via une sollicitation pour la gestion d’événements, hors du périmètre
d’un suivi classique de filière (travaux non-décrits ici car résultats confidentiels). En effet,
l’utilisation de la cytométrie en flux a permis de participer à l’évaluation de l’efficacité d’un
nouveau taux de traitement au sein d’une filière de potabilisation avec un suivi dans le temps
de l’impact sur les cellules avant et après sa mise en place. Une autre intervention a permis de
suivre en temps quasi-réel l’évolution de la concentration bactérienne au niveau de chaque
étape de traitement suite à une pollution ponctuelle de la ressource, permettant ainsi d’en
évaluer l’impact et d’adapter le traitement. Les deux missions d’assistances techniques

131
précitées mettent en avant l’intérêt que portent les exploitants d’usines de production d’eau
potable pour l’application de la cytométrie en flux en conditions réelles, que ce soit pour
l’aide à l’ajustement de nouveaux taux de traitement ou en situation d’urgence.

En plus de la quantification de la flore totale dans l’eau, la grande flexibilité apportée par la
cytométrie en flux permet d’accéder à d’autres niveaux d’information en élargissant son
applicabilité non-seulement aux matrices mais également aux cibles. Des essais (non-publiés)
ont été menés sur la détection spécifique de microorganismes d’intérêt, plus particulièrement
sur les parasites protozoaires pathogènes Giardia duodenalis et Cryptosporidium parvum.
Leur détection et quantification étaient basées sur l’utilisation d’anticorps fluorescents. La
figure 58 présente une détection simultanée de C. parvum (bleu) et G. duodenalis (vert).

Figure 58 Détection des parasites protozoaires pathogènes Giardia duodenalis et Cryptosporidium parvum par
cytométrie en flux après marquage par des anticorps spécifiques fluorescents

La méthode de référence pour la détection de ces parasites (USEPA 1623 2005) est basée (1)
sur une concentration de 20 à 100 litres sur une cartouche filtrante de porosité 1µm, suivi (2)
d’une concentration secondaire par une technique immuno-magnétique puis (3) d’une
détection via un marquage à l’aide d’anticorps spécifiques fluorescents avec quantification par
microscopie à épifluorescence ou cytométrie à balayage laser (Chemscan ®). Cependant cette
méthode peut présenter des rendements très variables, allant de 1% à 75%, selon la turbidité
de l’échantillon (Keserue et al. 2011a). L’étape de quantification présente les mêmes limites
que pour les bactéries, en termes de délai de résultat et de possible biais opérateur-dépendant.
La cytométrie en flux peut permettre de pallier ces inconvénients du fait que le « gating »
couplé à une série de témoins permet de s’affranchir de certains doutes possible liés à un autre
microorganisme présentant visuellement des caractéristiques similaires en microscopie à
épifluorescence (ex : microalgues auto-fluorescentes). Les expérimentations ont démontré la
possibilité de détecter spécifiquement ces microorganismes recherchés dans le cadre de
l’auto-contrôle lié à la production d’eau potable du fait qu’ils constituent (2) un indicateur de
performance de filtres à sable et (2) un risque sanitaire.

Parallèlement, des tests prometteurs visant à mettre en évidence la viabilité des sporozoïtes et
trophozoïtes, respectivement à l’intérieur des oocystes de Cryptosporidium et kystes de
Giardia ont été réalisés. Cependant il est important de mentionner que, contrairement à la

132
quantification de la flore totale (dont la fraction viable), ces essais sur les parasites n’ont pas
été testés en conditions réelles. De nombreuses études ont été rapportées concernant la
détection spécifique de ces parasites (Barbosa et al. 2008a; Barbosa et al. 2008b) mais
également d’autres pathogènes d’intérêt par cytométrie en flux tels que Escherichia coli et
Legionella pneumophila (Keserue et al. 2011b; Keserue et al. 2012). Cependant, même si les
performances des méthodes développées en conditions maitrisées sont prometteuses, le défi
reste leur application à échelle réelle. En effet, leur mise en œuvre nécessite une certaine
robustesse pour faire face à la variabilité physico-chimique de la matrice et de la flore
associée.

La quantité de ces microorganismes dans l’environnement étant très inférieure à celle des
bactéries, leur détection est incompatible avec le seuil de détection de la cytométrie en flux.
Cette limite souligne l’importance d’utiliser une étape de concentration de l’eau à analyser en
vue d’augmenter la probabilité de pouvoir détecter de tels microorganismes, dont la dose
infectieuse est faible. Dans cette optique, une étude a été menée sur la concentration
simultanée des microorganismes (incluant les bactéries, les virus, les parasites et les
microalgues) sur un module unique d’ultrafiltration en fibres creuses (Jacob et al. 2015). Ces
essais ont permis de confirmer l’intérêt d’une telle approche en vue d’une harmonisation et
d’une simplification de la collecte des microorganismes à partir de grands volumes d’eau (50
litres d’eau de surface et 1000 litres d’eau distribuée). Pour exemple, certains
microorganismes tels que les parasites précités et certaines cyanobactéries, n’ont pu être
détectés (par qPCR et microscopie, respectivement) qu’après concentration d’un grand
volume d’eau de rivière (50 litres). En revanche, cette étape engendre également la
concentration de particules en suspension, et peut entrainer l’application d’une étape
supplémentaire de concentration secondaire/purification pour certains types de
microorganismes. De ce fait, des axes d’amélioration sont à prévoir avant une utilisation de la
cytométrie en flux après cette étape de concentration.

Au regard de l’ensemble des travaux menés, la cytométrie en flux est actuellement

opérationnelle en laboratoire ou sur le terrain en tant qu’outil d’aide à la décision pour :

 Le suivi de l’efficacité des différentes étapes de filière de production d’eau potable

incluant la prise d’eau de ressource, la filtration sur sable, l’ozonation, la filtration
CAG et la chloration avant distribution.
 La modification de la filière par ajout/remplacement d’un procédé ou changement
d’un taux de traitement, en vue de vérifier une perte ou un gain en efficacité.

 Le contrôle de l’impact de la désinfection de l’eau circulant dans les circuits de tours

aéroréfrigérantes lors de l’utilisation de biocides oxydants et la détermination de la
dose optimale.

 La surveillance de la ressource et/ou des eaux de baignades concernant la prévention

les efflorescences algales et le suivi des variations de la charge microbienne pouvant
témoigner d’une potentielle pollution.

133
Dans l’optique du renforcement du panel d’applications de la cytométrie en flux, plusieurs
axes d’amélioration sont en cours d’optimisation ou envisagés :

 La détection d’agents pathogènes d’origine hydrique en conditions réelles, avec mise

en évidence de leur viabilité, en tenant compte de leur occurrence dans
l’environnement et de la variabilité des souches.

 Le couplage de la cytométrie en flux et d’une étape de concentration simultanée de

microorganismes par ultrafiltration sur fibres creuses pour l’amélioration de la
sensibilité de la méthode et tendre vers une méthode unique de multidétection.

 Le développement et l’installation de systèmes en ligne pour le contrôle continu de la

concentration microbienne après certaines étapes de traitement et en sortie d’usine.

 Le contrôle de la qualité microbiologique de l’air en milieu hospitalier avec une

concentration préalable sur « cycloneur à impaction liquide »

La robustesse et la fiabilité de la cytométrie en flux en termes d’informations, de portabilité et

de délai laisse à penser que cette technique serait également un atout dans le cadre d’actions
humanitaires. En effet, ce type d’interventions nécessite de faire preuve de réactivité dans des
conditions complexes pour répondre à une situation d’urgence, telle que la mise en place d’un
système de potabilisation en cas de crise (conflit, catastrophe naturelle, déplacement de
populations, etc.). Contrairement aux méthodes précitées, la souplesse analytique apportée par
la cytométrie en flux permet de répondre rapidement aux besoins actuels et futurs (Keserue et
al. 2012; Leonard et al. 2016). En termes de réglementation, la cytométrie en flux a été
reconnue comme méthode réglementaire à l’échelle internationale (ISO 19344 2015) pour la
quantification des bactéries lactiques acidifiantes au moyen de la cytométrie en flux dans les
produits laitiers fermentés, les levains et les probiotiques. Par ailleurs, la cytométrie en flux a
également été intégrée dans le cadre de la réglementation Suisse pour la détection des
bactéries totales dans l’eau potable (Swiss Federal Office of Public Health 2013). Le fait que
cette technique soit adoptée officiellement en tant que méthode alternative à la culture
souligne l’intérêt qu’elle représente pour le contrôle de la qualité de l’eau. Un autre objectif
serait donc de faire valider la cytométrie en flux au niveau de la réglementation française, en y
ajoutant en plus de la quantification de la population totale, la notion de viabilité via la
détection des bactéries intègres et actives. Une corrélation entre les cellules actives et
cultivables ayant été mise en évidence, ceci permettrait d’utiliser la cytométrie en flux pour un
contrôle réglementaire rapide et efficace de la qualité de l’eau en cours de traitement et
distribuée. Un tel projet peut être possible par la mise en place d’un programme national de
grande envergure dont le consortium regrouperait constructeurs de cytomètres en flux,
universitaires et producteurs d’eau potable. A terme, l’objectif serait de soumettre à la
Commission Européenne, une ou plusieurs méthodes alternatives pour la mesure de
paramètres d’intérêt en vue de l’amélioration du contrôle sanitaire de l’eau. En effet, en 2015,
la Commission Européenne a adopté la directive (UE) 2015/1787 introduisant de nouvelles
règles autorisant davantage de flexibilité au niveau du contrôle des eaux destinées à la
consommation humaine.

134
Partie V - REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

135
Allegra,S., F.Berger, P.Berthelot, F.Grattard, B.Pozzetto, and S.Riffard. 2008. "Use of flow cytometry
to monitor Legionella viability." Applied Environmental Microbiology. 74:7813-7816.

Allen,M.J., S.C.Edberg, and D.J.Reasoner. 2004. "Heterotrophic plate count bacteria--what is their
significance in drinking water?" International Journal of Food Microbiology. 92:265-274.

Alleron,L., A.Khemiri, M.Koubar, C.Lacombe, L.Coquet, P.Cosette, T.Jouenne, and J.Frere. 2013.
"VBNC Legionella pneumophila cells are still able to produce virulence proteins." Water
Research. 47:6606-6617.

Alleron,L., N.Merlet, C.Lacombe, and J.Frere. 2008. "Long-term survival of Legionella pneumophila in
the viable but nonculturable state after monochloramine treatment." Current Microbiology.
57:497-502.

Allison D.G. 1998. "Exopolysaccharide production in bacterial biofilms." Biofilms. 3.

Ana Aguilar-Galvez, Robin Dubois-Dauphin, Jacqueline Destain, David Campos, and Philippe Thonart.
2007. "
Les entérocoques : avantages et inconvénients en biotechnologie."
Biotechnol.Agron.Soc.Environ.2012 16(1), 67-76.

Anaissie,E.J., S.R.Penzak, and M.C.Dignani. 2002. "The hospital water supply as a source of
nosocomial infections: a plea for action." Arch.Intern.Med. 162:1483-1492.

Ashbolt,N.J. 2015. "Microbial Contamination of Drinking Water and Human Health from Community
Water Systems." Curr.Environ.Health Rep. 2:95-106.

Baghal,A.F., M.Nikaeen, and H.Mirhendi. 2013. "Rapid monitoring of Pseudomonas aeruginosa in

hospital water systems: a key priority in prevention of nosocomial infection." FEMS
Microbiol.Lett. 343:77-81.

Bain,R., R.Cronk, R.Hossain, S.Bonjour, K.Onda, J.Wright, H.Yang, T.Slaymaker, P.Hunter, A.Pruss-
Ustun, and J.Bartram. 2014. "Global assessment of exposure to faecal contamination through
drinking water based on a systematic review." Trop.Med.Int.Health. 19:917-927.

Barbesti,S., S.Citterio, M.Labra, M.D.Baroni, M.G.Neri, and S.Sgorbati. 2000. "Two and three-color
fluorescence flow cytometric analysis of immunoidentified viable bacteria." Cytometry.
40:214-218.

Barbosa,J., S.Costa-de-Oliveira, A.G.Rodrigues, and C.Pina-Vaz. 2008a. "Optimization of a flow

cytometry protocol for detection and viability assessment of Giardia lamblia."
Travel.Med.Infect.Dis. 6:234-239.

Barbosa,J.M., S.Costa-de-Oliveira, A.G.Rodrigues, T.Hanscheid, H.Shapiro, and C.Pina-Vaz. 2008b. "A

flow cytometric protocol for detection of Cryptosporidium spp." Cytometry A. 73:44-47.

Barer,M.R., R.J.Smith, R.P.Cooney, and P.T.Kimmitt. 2000. "Relationships between culturability,

activity and virulence in pathogenic bacteria." Journal of Infection and Chemotherapy. 6:108-
111.

Batté,M., B.M.R.Appenzeller, D.Grandjean, S.Fass, V.Gauthier, F.Jorand, L.Mathieu, M.Boualam,

S.Saby, and Block J.C. 2004. "Biofilms in drinking water distribution systems." Reviews in
Environmental Science and Bio/Technology. 2:147-168.

136
Bennett,H.B., H.D.O'Dell, G.Norton, G.Shin, F.C.Hsu, and J.S.Meschke. 2010. "Evaluation of a novel
electropositive filter for the concentration of viruses from diverse water matrices." Water
Sci.Technol. 61:317-322.

Bernard,L., C.Courties, C.Duperray, H.Schafer, G.Muyzer, and P.Lebaron. 2001. "A new approach to
determine the genetic diversity of viable and active bacteria in aquatic ecosystems."
Cytometry. 43:314-321.

Berney,M., F.Hammes, F.Bosshard, H.U.Weilenmann, and T.Egli. 2007. "Assessment and

interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with
flow cytometry." Applied Environmental Microbiology. 73:3283-3290.

Berney,M., M.Vital, I.Hulshoff, H.U.Weilenmann, T.Egli, and F.Hammes. 2008. "Rapid, cultivation-
independent assessment of microbial viability in drinking water." Water Research. 42:4010-
4018.

Berry,D., C.Xi, and L.Raskin. 2006. "Microbial ecology of drinking water distribution systems."
Curr.Opin.Biotechnol. 17:297-302.

BIPE/FP2E. 2008. "Les services collectifs d'eau et d'assainissement en France." Rapport.

Boopathi,T. and J.S.Ki. 2014. "Impact of environmental factors on the regulation of cyanotoxin
production." Toxins.(Basel). 6:1951-1978.

Boorman,G.A. 1999. "Drinking water disinfection byproducts: review and approach to toxicity
evaluation." Environ.Health Perspect. 107 Suppl 1:207-217.

Borchardt,M.A. and S.K.Spencer. 2002. "Concentration of Cryptosporidium, microsporidia and other

water-borne pathogens by continuous separation channel centrifugation." Journal of Applied
Microbiology. 92:649-656.

Borchardt,M.A., S.K.Spencer, B.A.Kieke, E.Lambertini, and F.J.Loge. 2012. "Viruses in nondisinfected

drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal
illness." Environ.Health Perspect. 120:1272-1279.

Boudaud,N., C.Machinal, F.David, B.A.Freval-Le, J.Jossent, F.Bakanga, C.Arnal, M.P.Jaffrezic, S.Oberti,

and C.Gantzer. 2012. "Removal of MS2, Qbeta and GA bacteriophages during drinking water
treatment at pilot scale." Water Research. 46:2651-2664.

Boudier,Y. 2008. "Qualification d'un système de production et de distribution d'eau pour préparations
injectables." Thèse.

Boulos,L., M.Prevost, B.Barbeau, J.Coallier, and R.Desjardins. 1999. "LIVE/DEAD BacLight : application
of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking
water." Journal of Microbiological Methods. 37:77-86.

Bouvier,T., P.A.Del Giorgio, and J.M.Gasol. 2007. "A comparative study of the cytometric
characteristics of high and low nucleic-acid bacterioplankton cells from different aquatic
ecosystems." Environemntal Microbiology. 9:2050-2066.

Brown,M.R., S.Camezuli, R.J.Davenport, E.Petelenz-Kurdziel, L.Ovreas, and T.P.Curtis. 2015. "Flow

cytometric quantification of viruses in activated sludge." Water Research. 68:414-422.

137
Cano,R.J. and M.K.Borucki. 1995. "Revival and identification of bacterial spores in 25- to 40-million-
year-old Dominican amber." Science. 268:1060-1064.

Cattani,F., V.C.Barth, Jr., J.S.Nasario, C.A.Ferreira, and S.D.Oliveira. 2016. "Detection and
quantification of viable Bacillus cereus group species in milk by propidium monoazide
quantitative real-time PCR." J.Dairy Sci. 99:2617-2624.

Chauret,C., C.Volk, R.Creason, J.Jarosh, J.Robinson, and C.Warnes. 2001. "Detection of Aeromonas
hydrophila in a drinking-water distribution system: a field and pilot study." Canadian Journal
of Microbiology. 47:782-786.

Cheung,M.Y., S.Liang, and J.Lee. 2013. "Toxin-producing cyanobacteria in freshwater: a review of the
problems, impact on drinking water safety, and efforts for protecting public health."
J.Microbiol. 51:1-10.

Cho,M., J.Kim, J.Y.Kim, J.Yoon, and J.H.Kim. 2010. "Mechanisms of Escherichia coli inactivation by
several disinfectants." Water Research. 44:3410-3418.

Codony,F., L.M.Perez, B.Adrados, G.Agusti, M.Fittipaldi, and J.Morato. 2012. "Amoeba-related health
risk in drinking water systems: could monitoring of amoebae be a complementary approach
to current quality control strategies?" Future.Microbiol. 7:25-31.

Comité Technique Régional de l'Environnement Hospitalier. 2005. "L'eau dans les établissements de
santé." Guide technique.

Commissariat général au développement durable. 2012. "Chiffres & statistiques." Bulletin n°290.

Cools,I., E.D'Haese, M.Uyttendaele, E.Storms, H.J.Nelis, and J.Debevere. 2005. "Solid phase cytometry
as a tool to detect viable but non-culturable cells of Campylobacter jejuni." Journal of
Microbiological Methods. 63:107-114.

Coquet,L., G.A.Junter, and T.Jouenne. 1998. "Resistance of artificial biofilms of Pseudomonas

aeruginosa to imipenem and tobramycin." J.Antimicrob.Chemother. 42:755-760.

Dailloux,M., M.Albert, C.Laurain, S.Andolfatto, A.Lozniewski, P.Hartemann, and L.Mathieu. 2003.

"Mycobacterium xenopi and drinking water biofilms." Applied Environmental Microbiology.
69:6946-6948.

De Marsily. 2013. "Les usages au cœur du grand cycle de l'eau et leurs interactions." Journées de
l'eau du CNRS.

De Schamphelaere,K.A., C.Nys, and C.R.Janssen. 2014. "Toxicity of lead (Pb) to freshwater green
algae: development and validation of a bioavailability model and inter-species sensitivity
comparison." Aquat.Toxicol. 155:348-359.

Deines,P., R.Sekar, P.S.Husband, J.B.Boxall, A.M.Osborn, and C.A.Biggs. 2010. "A new coupon design
for simultaneous analysis of in situ microbial biofilm formation and community structure in
drinking water distribution systems." Appl.Microbiol.Biotechnol. 87:749-756.

Delafont,V., A.Brouke, D.Bouchon, L.Moulin, and Y.Hechard. 2013. "Microbiome of free-living

amoebae isolated from drinking water." Water Research. 47:6958-6965.

138
Delafont,V., F.Mougari, E.Cambau, M.Joyeux, D.Bouchon, Y.Hechard, and L.Moulin. 2014. "First
evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network." Environmental
Sience and Technology. 48:11872-11882.

DGS. 2005a. "La qualité de l'eau potable en France." Rapport.

DGS. 2005b. "La qualité de l'eau potable en France." Rapport.

DGS. 2012a. "La qualité de l'eau du robinet en France." Rapport.

DGS. 2012b. "Principales caractéristiques des piscines ouvertes au public en France." Rapport.

DGS/ARS. 2008. "Enquête Eau ." Rapport.

DGS/SD7A. 2003. "Mesures à mettre en oeuvre en matière de protection des systèmes d'alimentation en
eau destinée à la consommation humaine, y compris les eaux conditionnées, dans le cadre de
l'application du plan Vigipirate." Circulaire n° 2003-524/DE/19-03.

Di Giovanni,G.D. and M.W.LeChevallier. 2005. "Quantitative-PCR assessment of Cryptosporidium

parvum cell culture infection." Applied Environmental Microbiology. 71:1495-1500.

Di Martino,P., B.Doumeche, L.Galas, H.Vaudry, V.Heim, and H.Habarou. 2007. "Assessing chemical
cleaning of nanofiltration membranes in a drinking water production plant: a combination of
chemical composition analysis and fluorescence microscopy." Water Sci.Technol. 55:219-225.

Di Martino,P., H.Gagniere, H.Berry, and L.Bret. 2002. "Antibiotic resistance and virulence properties
of Pseudomonas aeruginosa strains from mechanically ventilated patients with pneumonia in
intensive care units: comparison with imipenem-resistant extra-respiratory tract isolates
from uninfected patients." Microbes and Infection. 4:613-620.

Diaper,J.P., K.Tither, and C.Edwards. 1992. "Rapid assessment of bacterial viability by flow
cytometry." Appl.Microbiol.Biotechnol. 38:268-272.

DIRECCTE. 2012. "Ecoindustrie du secteur de l'adduction, de l'assainissement et du traitement de

l'eau." Rapport.

Doocy,S., A.Daniels, S.Murray, and D.Kirsch. 2013. "The Human Impact of Floods: a Historical Review
of Events 1980-2009 and Systematic Literature Review." Current Disasters.

Duda,S., J.L.Baron, M.M.Wagener, R.D.Vidic, and J.E.Stout. 2015. "Lack of correlation between
Legionella colonization and microbial population quantification using heterotrophic plate
count and adenosine triphosphate bioluminescence measurement." Environmental
Monitoring and Assessment. 187:393.

Duhamel,S. and S.Jacquet. 2006. "Flow cytometric analysis of bacteria- and virus-like particles in lake
sediments." Journal of Microbiological Methods. 64:316-332.

Dunn,R.R., T.J.Davies, N.C.Harris, and M.C.Gavin. 2010. "Global drivers of human pathogen richness
and prevalence." Proc.Biol.Sci. 277:2587-2595.

Duy,T.N., P.K.Lam, G.R.Shaw, and D.W.Connell. 2000. "Toxicology and risk assessment of freshwater
cyanobacterial (blue-green algal) toxins in water." Rev.Environ.Contam Toxicol. 163:113-185.

139
Eischeid,A.C. and K.G.Linden. 2007. "Efficiency of pyrimidine dimer formation in Escherichia coli
across UV wavelengths." Journal of Applied Microbiology. 103:1650-1656.

Elizaquivel,P., R.Aznar, and G.Sanchez. 2014. "Recent developments in the use of viability dyes and
quantitative PCR in the food microbiology field." Journal of Applied Microbiology. 116:1-13.

EPA. 2002. "Health Risks from Microbial Growth and Biofilms in Drinking Water Distribution
Systems." Rapport.

Espinosa,A.C., M.Mazari-Hiriart, R.Espinosa, L.Maruri-Avidal, E.Mendez, and C.F.Arias. 2008.

"Infectivity and genome persistence of rotavirus and astrovirus in groundwater and surface
water." Water Research. in press.

Falcioni,T., A.Manti, P.Boi, B.Canonico, M.Balsamo, and S.Papa. 2006. "Comparison of disruption
procedures for enumeration of activated sludge floc bacteria by flow cytometry." Cytometry
part B: Clinical Cytometry. 70:149-153.

Falcioni,T., S.Papa, R.Campana, A.Manti, M.Battistelli, and W.Baffone. 2008a. "State transitions of
Vibrio parahaemolyticus VBNC cells evaluated by flow cytometry." Cytometry part B: Clinical
Cytometry. 74:272-281.

Falcioni,T., S.Papa, and J.M.Gasol. 2008b. "Evaluating the flow-cytometric nucleic acid double-
staining protocol in realistic situations of planktonic bacterial death." Applied Environmental
Microbiology. 74:1767-1779.

Falkinham,J.O., III. 2010. "Hospital water filters as a source of Mycobacterium avium complex."
J.Med.Microbiol. 59:1198-1202.

Falkinham,J.O., III, E.D.Hilborn, M.J.Arduino, A.Pruden, and M.A.Edwards. 2015. "Epidemiology and
Ecology of Opportunistic Premise Plumbing Pathogens: , , and." Environ.Health Perspect.

Falkinham,J.O., III, C.D.Norton, and M.W.LeChevallier. 2001. "Factors influencing numbers of

Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, and other Mycobacteria in drinking
water distribution systems." Applied Environmental Microbiology. 67:1225-1231.

Falkinham,J.O., A.Pruden, and M.Edwards. 2015. "Opportunistic Premise Plumbing Pathogens:

Increasingly Important Pathogens in Drinking Water." Pathogens. 4:373-386.

Fayer,R. 2004. "Cryptosporidium: a water-borne zoonotic parasite." Veterinary Parasitology. 126:37-

56.

Fayer,R., T.K.Graczyk, E.J.Lewis, J.M.Trout, and C.A.Farley. 1998. "Survival of infectious

Cryptosporidium parvum oocysts in seawater and eastern oysters (Crassostrea virginica) in
the Chesapeake Bay." Applied Environmental Microbiology. 64:1070-1074.

Feazel,L.M., L.K.Baumgartner, K.L.Peterson, D.N.Frank, J.K.Harris, and N.R.Pace. 2009. "Opportunistic

pathogens enriched in showerhead biofilms." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106:16393-16399.

Fernandez-Delgado,M., M.A.Garcia-Amado, M.Contreras, R.N.Incani, H.Chirinos, H.Rojas, and

P.Suarez. 2015. "Survival, induction and resuscitation of Vibrio cholerae from the viable but
non-culturable state in the Southern Caribbean Sea." Rev.Inst.Med.Trop.Sao Paulo. 57:21-26.

140
Flemming,H.C., S.L.Percival, and J.T.Walker. 2002. "Contamination potential of biofilms in water
distribution systems." Water Sci.Technol: Water Supply. 2:271-280.

Fong,T.T., L.S.Mansfield, D.L.Wilson, D.J.Schwab, S.L.Molloy, and J.B.Rose. 2007. "Massive

microbiological groundwater contamination associated with a waterborne outbreak in Lake
Erie, South Bass Island, Ohio." Environ.Health Perspect. 115:856-864.

Food and Drug Administration. 2014. "METHODS, METHOD VERIFICATION AND VALIDATION." ORA-
LAB.5.4.5.

Ford,T.E. 1999. "Microbiological Safety of Drinking Water: United States and Global Perspectives."
Environ.Health Perspect. 107:191-206.

Forsman,M., E.W.Henningson, E.Larsson, T.Johansson, and G.Sandstrom. 2000. "Francisella tularensis

does not manifest virulence in viable but non-culturable state." FEMS Microbiology Ecology.
31:217-224.

Francy,D.S., R.N.Bushon, A.M.Brady, E.E.Bertke, C.M.Kephart, C.A.Likirdopulos, B.E.Mailot,

F.W.Schaefer, III, and H.D.Lindquist. 2009. "Comparison of traditional and molecular
analytical methods for detecting biological agents in raw and drinking water following
ultrafiltration." Journal of Applied Microbiology. 107:1479-1491.

Francy,D.S., E.A.Stelzer, A.M.Brady, C.Huitger, R.N.Bushon, H.S.Ip, M.W.Ware, E.N.Villegas,

V.Gallardo, and H.D.Lindquist. 2013. "Comparison of filters for concentrating microbial
indicators and pathogens in lake water samples." Applied Environmental Microbiology.
79:1342-1352.

Fromantin,I., D.Seyer, S.Watson, F.Rollot, J.Elard, M.C.Escande, R.Y.De, I.Kriegel, and G.Larreta, V.
2013. "Bacterial floras and biofilms of malignant wounds associated with breast cancers."
Journal of Clinical Microbiology. 51:3368-3373.

Fuchslin,H.P., S.Kotzsch, H.A.Keserue, and T.Egli. 2010. "Rapid and quantitative detection of
Legionella pneumophila applying immunomagnetic separation and flow cytometry."
Cytometry A. 77:264-274.

Funari,E. and E.Testai. 2008. "Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure." Crit
Rev.Toxicol. 38:97-125.

Gensberger,E.T., E.M.Gossl, L.Antonielli, A.Sessitsch, and T.Kostic. 2015. "Effect of different

heterotrophic plate count methods on the estimation of the composition of the culturable
microbial community." PeerJ. 3:e862.

Gensberger,E.T., M.Polt, M.Konrad-Koszler, P.Kinner, A.Sessitsch, and T.Kostic. 2014. "Evaluation of

quantitative PCR combined with PMA treatment for molecular assessment of microbial water
quality." Water Research. 67:367-376.

Gensberger,E.T., A.Sessitsch, and T.Kostic. 2013. "Propidium monoazide-quantitative polymerase

chain reaction for viable Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa detection from
abundant background microflora." Anal.Biochem. 441:69-72.

Gerba,C.P., J.B.Rose, C.N.Haas, and Crabtree K.D. 1996. "Waterborne rotavirus: A risk assessment."
Water Research. 30:2929-2940.

141
Glaberman,S., J.E.Moore, C.J.Lowery, R.M.Chalmers, I.Sulaiman, K.Elwin, P.J.Rooney, B.C.Millar,
J.S.Dooley, A.A.Lal, and L.Xiao. 2002. "Three drinking-water-associated cryptosporidiosis
outbreaks, Northern Ireland." Emerg.Infect.Dis. 8:631-633.

Grabow,W.O. 2001. "Bacteriophages: Update on application as models for viruses in water." Water
SA. 27:251-268.

Grabow,W.O., M.B.Taylor, and J.C.de Villiers. 2001. "New methods for the detection of viruses: call
for review of drinking water quality guidelines." Water Sci.Technol. 43:1-8.

Grammenou,P., I.Spiliopoulou, E.Sazakli, and M.Papapetropoulou. 2006. "PFGE analysis of

enterococci isolates from recreational and drinking water in Greece." Journal of Water
Health. 4:263-269.

Gregori,G., S.Citterio, A.Ghiani, M.Labra, S.Sgorbati, S.Brown, and M.Denis. 2001. "Resolution of
viable and membrane-compromised bacteria in freshwater and marine waters based on
analytical flow cytometry and nucleic acid double staining." Applied Environmental
Microbiology. 67:4662-4670.

Gregori,G., M.Denis, D.Lefevre, and J.C.Romano. 2003. "[Viability of heterotrophic bacteria in the Bay
of Marseilles]." C.R.Biol. 326:739-750.

Guilini,C., C.Baehr, E.Schaeffer, P.Gizzi, F.Rufi, J.Haiech, E.Weiss, D.Bonnet, and J.L.Galzi. 2015. "New
fluorescein precursors for live bacteria detection." Anal.Chem. 87:8858-8866.

Hallam,N.B., J.R.West, C.F.Forster, and J.Simms. 2001. "The potential for biofilm growth in water
distribution systems." Water Research. 35:4063-4071.

Hammes,F., M.Berney, Y.Wang, M.Vital, O.Koster, and T.Egli. 2008. "Flow-cytometric total bacterial
cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatment
processes." Water Research. 42:269-277.

Hammes,F., T.Broger, H.U.Weilenmann, M.Vital, J.Helbing, U.Bosshart, P.Huber, R.P.Odermatt, and

B.Sonnleitner. 2012a. "Development and laboratory-scale testing of a fully automated online
flow cytometer for drinking water analysis." Cytometry A. 81:508-516.

Hammes,F., T.Broger, H.U.Weilenmann, M.Vital, J.Helbing, U.Bosshart, P.Huber, R.P.Odermatt, and

B.Sonnleitner. 2012b. "Development and laboratory-scale testing of a fully automated online
flow cytometer for drinking water analysis." Cytometry A. 81:508-516.

Hammes,F. and T.Egli. 2010. "Cytometric methods for measuring bacteria in water: advantages,
pitfalls and applications." Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397:1083-1095.

Haramoto,E., H.Katayama, and S.Ohgaki. 2004. "Detection of noroviruses in tap water in Japan by
means of a new method for concentrating enteric viruses in large volumes of freshwater."
Applied Environmental Microbiology. 70:2154-2160.

Harry,I.S., E.Ameh, F.Coulon, and A.Nocker. 2016. "Impact of Treated Sewage Effluent on the
Microbiology of a Small Brook Using Flow Cytometry as a Diagnostic Tool." Water Air Soil
Pollut. 227:57.

142
Havelaar,A.H., M.van Olphen, and Y.C.Drost. 1993. "F-specific RNA bacteriophages are adequate
model organisms for enteric viruses in fresh water." Applied Environmental Microbiology.
59:2956-2962.

Helmi,K., F.Barthod, G.Meheut, A.Henry, F.Poty, F.Laurent, and N.Charni-Ben-Tabassi. 2015.

"Methods for microbiological quality assessment in drinking water: a comparative study."
Journal of Water Health. 13:34-41.

Helmi,K., A.Watt, P.Jacob, I.Ben-Hadj-Salah, A.Henry, G.Meheut, and N.Charni-Ben-Tabassi. 2014.

"Monitoring of three drinkingwater treatment plants using flow cytometry." Water Science &
Technology: Water Supply. 14:850-856.

Herrero,M., C.Quiros, L.A.Garcia, and M.Diaz. 2006. "Use of flow cytometry to follow the
physiological states of microorganisms in cider fermentation processes." Applied
Environmental Microbiology. 72:6725-6733.

Hijnen,W.A., E.F.Beerendonk, and G.J.Medema. 2006. "Inactivation credit of UV radiation for viruses,
bacteria and protozoan (oo)cysts in water: a review." Water Research. 40:3-22.

Hill,V.R., A.M.Kahler, N.Jothikumar, T.B.Johnson, D.Hahn, and T.L.Cromeans. 2007. "Multistate

evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric
microbes in 100-liter tap water samples." Applied Environmental Microbiology. 73:4218-
4225.

Hill,V.R., A.L.Polaczyk, D.Hahn, J.Narayanan, T.L.Cromeans, J.M.Roberts, and J.E.Amburgey. 2005.

"Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking
water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants." Applied Environmental
Microbiology. 71:6878-6884.

Hoefel,D., W.L.Grooby, P.T.Monis, S.Andrews, and C.P.Saint. 2003a. "A comparative study of
carboxyfluorescein diacetate and carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester as
indicators of bacterial activity." J.Microbiol.Methods. 52:379-388.

Hoefel,D., W.L.Grooby, P.T.Monis, S.Andrews, and C.P.Saint. 2003b. "Enumeration of water-borne

bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based
techniques." Journal of Microbiological Methods. 55:585-597.

Hoefel,D., P.T.Monis, W.L.Grooby, S.Andrews, and C.P.Saint. 2005. "Profiling bacterial survival
through a water treatment process and subsequent distribution system." Journal of Applied
Microbiology. 99:175-186.

Houari,A., J.Picard, H.Habarou, L.Galas, H.Vaudry, V.Heim, and M.P.Di. 2008. "Rheology of biofilms
formed at the surface of NF membranes in a drinking water production unit." Biofouling.
24:235-240.

Houari,A., D.Seyer, F.Couquard, K.Kecili, C.Democrate, V.Heim, and M.P.Di. 2010. "Characterization
of the biofouling and cleaning efficiency of nanofiltration membranes." Biofouling. 26:15-21.

Hsu,W.B., J.H.Wang, P.C.Chen, Y.S.Lu, and J.H.Chen. 2007. "Detecting low concentrations of Shigella
sonnei in environmental water samples by PCR." FEMS Microbiol.Lett. 270:291-298.

143
Hugler,M., K.Bockle, I.Eberhagen, K.Thelen, C.Beimfohr, and B.Hambsch. 2011. "Development and
validation of a FISH-based method for the detection and quantification of E. coli and coliform
bacteria in water samples." Water Science and Technology. 64:1435-1442.

Hunt,S.M., E.M.Werner, B.Huang, M.A.Hamilton, and P.S.Stewart. 2004. "Hypothesis for the role of
nutrient starvation in biofilm detachment." Applied Environmental Microbiology. 70:7418-
7425.

Hunter,P.R. 2003. "Climate change and waterborne and vector-borne disease." Journal of Applied
Microbiology. 94 Suppl:37S-46S.

Hunter,P.R., M.A.de Sylor, H.L.Risebro, G.L.Nichols, D.Kay, and P.Hartemann. 2011. "Quantitative
microbial risk assessment of cryptosporidiosis and giardiasis from very small private water
supplies." Risk Anal. 31:228-236.

Hunter,P.R. and R.C.Thompson. 2005. "The zoonotic transmission of Giardia and Cryptosporidium."
International Journal for Parasitology. 35:1181-1190.

Inoue,H., T.Takama, M.Yoshizaki, and K.Agata. 2015. "Detection of Legionella species in

environmental water by the quantitative PCR method in combination with ethidium
monoazide treatment." Biocontrol.Sci. 20:71-74.

ISO 19344. 2015. "Milk and milk products - Starter cultures, probiotics and fermented products -
Quantification of lactic acid bacteria by flow cytometry." Standard.

Jacob,P., A.Henry, G.Meheut, N.Charni-Ben-Tabassi, V.Ingrand, and K.Helmi. 2015. "Health risk
assessment related to waterborne pathogens from the river to the tap."
Int.J.Environ.Res.Public Health. 12:2967-2983.

Jofre,J., E.Olle, F.Ribas, A.Vidal, and F.Lucena. 1995. "Potential usefulness of bacteriophages that
infect Bacteroides fragilis as model organisms for monitoring virus removal in drinking water
treatment plants." Applied Environmental Microbiology. 61:3227-3231.

Jones,S.W., M.E.Dobson, S.C.Francesconi, R.Schoske, and R.Crawford. 2005. "DNA assays for
detection, identification, and individualization of select agent microorganisms." Croat.Med.J.
46:522-529.

Joux,F. and P.Lebaron. 2000. "Use of fluorescent probes to assess physiological functions of bacteria
at single-cell level." Microbes and Infection. 2:1523-1535.

Juhna,T., D.Birzniece, S.Larsson, D.Zulenkovs, A.Sharipo, N.F.Azevedo, F.Menard-Szczebara,

S.Castagnet, C.Feliers, and C.W.Keevil. 2007. "Detection of Escherichia coli in biofilms from
pipe samples and coupons in drinking water distribution networks." Applied Environmental
Microbiology. 73:7456-7464.

Kaper,J.B., J.P.Nataro, and H.L.Mobley. 2004. "Pathogenic Escherichia coli." Nat.Rev.Microbiol. 2:123-
140.

Karim,M.R., E.R.Rhodes, N.Brinkman, L.Wymer, and G.S.Fout. 2009. "New electropositive filter for
concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water." Appl Environ
Microbiol. 75:2393-2399.

144
Kearns,E.A., S.Magana, and D.V.Lim. 2008. "Automated concentration and recovery of micro-
organisms from drinking water using dead-end ultrafiltration." Journal of Applied
Microbiology. 105:432-442.

Keserue,H.A., A.Baumgartner, R.Felleisen, and T.Egli. 2012. "Rapid detection of total and viable
Legionella pneumophila in tap water by immunomagnetic separation, double fluorescent
staining and flow cytometry." Microb.Biotechnol. 5:753-763.

Keserue,H.A., H.P.Fuchslin, and T.Egli. 2011a. "Rapid detection and enumeration of Giardia lamblia
cysts in water samples by immunomagnetic separation and flow cytometric analysis."
Applied Environmental Microbiology. 77:5420-5427.

Keserue,H.A., H.P.Fuchslin, and T.Egli. 2011b. "Rapid detection and enumeration of Giardia lamblia
cysts in water samples by immunomagnetic separation and flow cytometric analysis."
Appl.Environ.Microbiol. 77:5420-5427.

Kubota,K., A.Ohashi, H.Imachi, and H.Harada. 2006. "Visualization of mcr mRNA in a methanogen by
fluorescence in situ hybridization with an oligonucleotide probe and two-pass tyramide
signal amplification (two-pass TSA-FISH)." Journal of Microbiological Methods. 66:521-528.

Kuiper,M.W., R.M.Valster, B.A.Wullings, H.Boonstra, H.Smidt, and D.van der Kooij. 2006.
"Quantitative detection of the free-living amoeba Hartmannella vermiformis in surface water
by using real-time PCR." Applied Environmental Microbiology. 72:5750-5756.

Lebaron,P., N.Parthuisot, and P.Catala. 1998. "Comparison of blue nucleic acid dyes for flow
cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems." Applied Environmental
Microbiology. 64:1725-1730.

Lebaron,P., P.Servais, H.Agogue, C.Courties, and F.Joux. 2001. "Does the high nucleic acid content of
individual bacterial cells allow us to discriminate between active cells and inactive cells in
aquatic systems?" Applied Environmental Microbiology. 67:1775-1782.

Leclerc,H., S.Edberg, V.Pierzo, and J.M.Delattre. 2000. "Bacteriophages as indicators of enteric

viruses and public health risk in groundwaters." Journal of Applied Microbiology. 88:5-21.

Leclerc,H., D.A.Mossel, S.C.Edberg, and C.B.Struijk. 2001. "Advances in the bacteriology of the
coliform group: their suitability as markers of microbial water safety." Annual Review of
Microbiology. 55:201-234.

Lee,E.S., M.H.Lee, and B.S.Kim. 2015. "Evaluation of propidium monoazide-quantitative PCR to detect
viable Mycobacterium fortuitum after chlorine, ozone, and ultraviolet disinfection."
International Journal of Food Microbiology. 210:143-148.

Lee,H.K. and Y.S.Jeong. 2004. "Comparison of total culturable virus assay and multiplex integrated
cell culture-PCR for reliability of waterborne virus detection." Applied Environmental
Microbiology. 70:3632-3636.

Leggett,H.C., C.K.Cornwallis, and S.A.West. 2012. "Mechanisms of pathogenesis, infective dose and
virulence in human parasites." PLoS.Pathog. 8:e1002512.

Lehtola,M.J., I.T.Miettinen, M.M.Keinanen, T.K.Kekki, O.Laine, A.Hirvonen, T.Vartiainen, and

P.J.Martikainen. 2004. "Microbiology, chemistry and biofilm development in a pilot drinking
water distribution system with copper and plastic pipes." Water Research. 38:3769-3779.

145
Lehtola,M.J., E.Torvinen, J.Kusnetsov, T.Pitkanen, L.Maunula, C.H.von Bonsdorff, P.J.Martikainen,
S.A.Wilks, C.W.Keevil, and I.T.Miettinen. 2007. "Survival of Mycobacterium avium, Legionella
pneumophila, Escherichia coli, and caliciviruses in drinking water-associated biofilms grown
under high-shear turbulent flow." Applied Environmental Microbiology. 73:2854-2859.

Leifels,M., L.Jurzik, M.Wilhelm, and I.A.Hamza. 2015. "Use of ethidium monoazide and propidium
monoazide to determine viral infectivity upon inactivation by heat, UV- exposure and
chlorine." International of Hygiene and Environmental Health. 218:686-693.

Leonard,L., C.L.Bouarab, B.B.Ouled, P.Degraeve, and N.Oulahal. 2016. "Recent Advances on Multi-
Parameter Flow Cytometry to Characterize Antimicrobial Treatments." Front Microbiol.
7:1225.

Leskinen,S.D., E.A.Kearns, W.L.Jones, R.S.Miller, C.R.Bevitas, M.T.Kingsley, R.L.Brigmon, and D.V.Lim.

2012. "Automated dead-end ultrafiltration of large volume water samples to enable
detection of low-level targets and reduce sample variability." Journal of Applied
Microbiology. 113:351-360.

Li,J., V.Adams, T.L.Bannam, K.Miyamoto, J.P.Garcia, F.A.Uzal, J.I.Rood, and B.A.McClane. 2013. "Toxin
plasmids of Clostridium perfringens." Microbiol.Mol.Biol.Rev. 77:208-233.

Liu,G., E.J.Van der Mark, J.Q.Verberk, and J.C.Van Dijk. 2013. "Flow cytometry total cell counts: a field
study assessing microbiological water quality and growth in unchlorinated drinking water
distribution systems." Biomed.Res.Int. 2013:595872.

Liu,Y., W.Zhang, T.Sileika, R.Warta, N.P.Cianciotto, and A.I.Packman. 2011. "Disinfection of bacterial
biofilms in pilot-scale cooling tower systems." Biofouling. 27:393-402.

Lopez-Amoros,R., S.Castel, J.Comas-Riu, and J.Vives-Rego. 1997. "Assessment of E. coli and

Salmonella viability and starvation by confocal laser microscopy and flow cytometry using
rhodamine 123, DiBAC4(3), propidium iodide, and CTC." Cytometry. 29:298-305.

Lopez-Amoros,R., J.Comas, and J.Vives-Rego. 1995. "Flow cytometric assessment of Escherichia coli
and Salmonella typhimurium starvation-survival in seawater using rhodamine 123, propidium
iodide, and oxonol." Applied Environmental Microbiology. 61:2521-2526.

Lu,J., I.Struewing, S.Yelton, and N.Ashbolt. 2015. "Molecular survey of occurrence and quantity of
Legionella spp., Mycobacterium spp., Pseudomonas aeruginosa and amoeba hosts in
municipal drinking water storage tank sediments." Journal of Applied Microbiology.

Mac Kenzie,W.R., N.J.Hoxie, M.E.Proctor, M.S.Gradus, K.A.Blair, D.E.Peterson, J.J.Kazmierczak,

D.G.Addiss, K.R.Fox, J.B.Rose, and . 1994. "A massive outbreak in Milwaukee of
cryptosporidium infection transmitted through the public water supply." N.Engl.J.Med.
331:161-167.

Mace,C., D.Seyer, C.Chemani, P.Cosette, P.Di-Martino, B.Guery, A.Filloux, M.Fontaine, V.Molle,

G.A.Junter, and T.Jouenne. 2008. "Identification of biofilm-associated cluster (bac) in
Pseudomonas aeruginosa involved in biofilm formation and virulence." PLoS.One. 3:e3897.

Mackenzie,W.R., W.L.Schell, K.A.Blair, D.G.Addiss, D.E.Peterson, N.J.Hoxie, J.J.Kazmierczak, and

J.P.Davis. 1995. "Massive outbreak of waterborne cryptosporidium infection in Milwaukee,
Wisconsin: recurrence of illness and risk of secondary transmission." Clin.Infect.Dis. 21:57-62.

146
Manini,E. and R.Danovaro. 2006. "Synoptic determination of living/dead and active/dormant
bacterial fractions in marine sediments." FEMS Microbiology Ecology. 55:416-423.

Marconnet,C., A.Houari, L.Galas, and P.Di Martino. 2009. "Biodegradable dissolved organic carbon
concentration of feed water and NF membrane biofouling: A pilot train study." Desalination.
242:228-235.

Marconnet,C., A.Houari, D.Seyer, M.Djafer, G.Corriton, V.Heim, and P.Di Martino. 2011. "Membrane
biofouling control by UV irradiation." Desalination.75-81.

Mathieu,L., I.Bertrand, Y.Abe, E.Angel, J.C.Block, S.Skali-Lami, and G.Francius. 2014. "Drinking water
biofilm cohesiveness changes under chlorination or hydrodynamic stress." Water Research.
55:175-184.

Maunula,L. 2005. "Norovirus outbreaks from drinking water." Emerg.Infect.Dis. 11:1716-1721.

Mendez,J., A.Audicana, M.Cancer, A.Isern, J.Llaneza, B.Moreno, M.Navarro, M.L.Tarancon, F.Valero,

F.Ribas, J.Jofre, and F.Lucena. 2004. "Assessment of drinking water quality using indicator
bacteria and bacteriophages." Journal of Water Health. 2:201-214.

Ministère chargé de la santé. 2014. "La qualité de l'eau du robinet en France." Rapport.

Ministère de l'Ecologie. 2008. Rapport.

Ministère de l'écologie du développement durable et du logement. 2015. "Plan national d'adaptation

au changement climatique ." Rapport.

Ministère de l'écologie et du développement durable. 2004. "Arrêté relatif aux installations de

refroidissement par dispersion d'eau dans un flux d'air soumises à autorisation ." Arrêté.

MINISTÈRE DE LA SANTÉ ET DES SOLIDARITÉS. 2007. "Arrêté du 11 janvier 2007 relatif aux limites et
références de qualité des eaux brutes et des eaux destinées à la consommation humaine
mentionnées aux articles R. 1321-2, R. 1321-3, R. 1321-7 et R. 1321-38 du code de la santé
publique." JOURNAL OFFICIEL DE LA RÉPUBLIQUE FRANÇAISE.

Ministère de la Sante,d.l.J.d.S.e.d.l.V.a. 2008. "L'eau potable en France." Rapport.

Ministère des Finances,d.l.e.d.l. 2001. "Guide des bonnes pratiques : Legionella et Tours
aéroréfrigérantes." Guide.

Monroe,D. 2007. "Looking for chinks in the armor of bacterial biofilms." PLoS.Biol. 5:e307.

Morales-Morales,H.A., G.Vidal, J.Olszewski, C.M.Rock, D.Dasgupta, K.H.Oshima, and G.B.Smith. 2003.

"Optimization of a reusable hollow-fiber ultrafilter for simultaneous concentration of enteric
bacteria, protozoa, and viruses from water." Applied Environmental Microbiology. 69:4098-
4102.

Moreno,L., R.Aznar, and G.Sanchez. 2015. "Application of viability PCR to discriminate the infectivity
of hepatitis A virus in food samples." International Journal of Food Microbiology. 201:1-6.

Moreno,Y., P.Piqueres, J.L.Alonso, A.Jimenez, A.Gonzalez, and M.A.Ferrus. 2007. "Survival and
viability of Helicobacter pylori after inoculation into chlorinated drinking water." Water
Research. 41:3490-3496.

147
Moreno-Mesonero,L., Y.Moreno, J.L.Alonso, and M.A.Ferrus. 2016. "DVC-FISH and PMA-qPCR
techniques to assess the survival of Helicobacter pylori inside Acanthamoeba castellanii."
Res.Microbiol. 167:29-34.

Mouchtouri,V.A., G.Goutziana, J.Kremastinou, and C.Hadjichristodoulou. 2010. "Legionella species

colonization in cooling towers: risk factors and assessment of control measures."
Am.J.Infect.Control. 38:50-55.

Mueller,S.A., J.E.Anderson, B.R.Kim, and J.C.Ball. 2009. "Comparison of plate counts, Petrifilm,
dipslides, and adenosine triphosphate bioluminescence for monitoring bacteria in cooling-
tower waters." Water Environ.Res. 81:401-406.

Mull,B. and V.R.Hill. 2012. "Recovery of diverse microbes in high turbidity surface water samples
using dead-end ultrafiltration." Journal of Microbiological Methods. 91:429-433.

Mustapha,P., T.Epalle, S.Allegra, F.Girardot, O.Garraud, and S.Riffard. 2015. "Monitoring of Legionella
pneumophila viability after chlorine dioxide treatment using flow cytometry." Res.Microbiol.
166:215-219.

Nescerecka,A., T.Juhna, and F.Hammes. 2016. "Behavior and stability of adenosine triphosphate
(ATP) during chlorine disinfection." Water Research. 101:490-497.

Nescerecka,A., J.Rubulis, M.Vital, T.Juhna, and F.Hammes. 2014. "Biological instability in a

chlorinated drinking water distribution network." PLoS.One. 9:e96354.

Neumann,N.F., L.L.Gyurek, L.Gammie, G.R.Finch, and M.Belosevic. 2000. "Comparison of animal

infectivity and nucleic acid staining for assessment of Cryptosporidium parvum viability in
water." Applied Environmental Microbiology. 66:406-412.

Nwachcuku,N. and C.P.Gerba. 2004. "Emerging waterborne pathogens: can we kill them all?"
Curr.Opin.Biotechnol. 15:175-180.

Ogorzaly,L., H.M.Cauchie, C.Penny, A.Perrin, C.Gantzer, and I.Bertrand. 2013. "Two-day detection of
infectious enteric and non-enteric adenoviruses by improved ICC-qPCR."
Appl.Microbiol.Biotechnol. 97:4159-4166.

Oguma,K., H.Katayama, H.Mitani, S.Morita, T.Hirata, and S.Ohgaki. 2001. "Determination of

pyrimidine dimers in Escherichia coli and Cryptosporidium parvum during UV light
inactivation, photoreactivation, and dark repair." Applied Environmental Microbiology.
67:4630-4637.

Oliver,J.D. 2010. "Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria." FEMS
Microbiol.Rev. 34:415-425.

OMS. 2013. "Progrès en matière d'assainissement et d'alimentation en eau ." Rapport.

OMS. 2015. "Aide mémoire n°239." Memo.

Onema/OIEau. 2015. "Pratiques agricoles et nitrates dans les milieux aquatiques." Synthèse eaufrance.
11.

Parthuisot,N., M.Binet, A.Touron-Bodilis, C.Pougnard, P.Lebaron, and J.Baudart. 2011. "Total and
viable Legionella pneumophila cells in hot and natural waters as measured by

148
 immunofluorescence-based assays and solid-phase cytometry." Applied Environmental
Microbiology. 77:6225-6232.

Parthuisot,N., P.Catala, K.Lemarchand, J.Baudart, and P.Lebaron. 2000. "Evaluation of ChemChrome

V6 for bacterial viability assessment in waters." Journal of Applied Microbiology. 89:370-380.

Payment,P., A.Berube, D.Perreault, R.Armon, and M.Trudel. 1989. "Concentration of Giardia lamblia
cysts, Legionella pneumophila, Clostridium perfringens, human enteric viruses, and
coliphages from large volumes of drinking water, using a single filtration." Canadian Journal
of Microbiology. 35:932-935.

Payment,P. and E.Franco. 1993. "Clostridium perfringens and somatic coliphages as indicators of the
efficiency of drinking water treatment for viruses and protozoan cysts." Applied
Environmental Microbiology. 59:2418-2424.

Pernthaler,A., J.Pernthaler, and R.Amann. 2002. "Fluorescence in situ hybridization and catalyzed
reporter deposition for the identification of marine bacteria." Applied Environmental
Microbiology. 68:3094-3101.

Phe,M.H., M.Dossot, and J.C.Block. 2004. "Chlorination effect on the fluorescence of nucleic acid
staining dyes." Water Research. 38:3729-3737.

Phe,M.H., M.Dossot, H.Guilloteau, and J.C.Block. 2005a. "Nucleic acid fluorochromes and flow
cytometry prove useful in assessing the effect of chlorination on drinking water bacteria."
Water Research. 39:3618-3628.

Phe,M.H., M.Dossot, H.Guilloteau, and J.C.Block. 2005b. "Nucleic acid fluorochromes and flow
cytometry prove useful in assessing the effect of chlorination on drinking water bacteria."
Water Research. 39:3618-3628.

Phe,M.H., M.Dossot, H.Guilloteau, and J.C.Block. 2007. "Highly chlorinated Escherichia coli cannot be
stained by propidium iodide." Canadian Journal of Microbiology. 53:664-670.

Phe,M.H., C.M.Hajj, H.Guilloteau, C.Merlin, and J.C.Block. 2009. "Assessment of Damage to Nucleic
Acids and Repair Machinery in Salmonella typhimurium Exposed to Chlorine." Int.J.Microbiol.
2009:201868.

Polaczyk,A.L., J.M.Roberts, and V.R.Hill. 2007. "Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for
simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water." J.Microbiol.Methods.
68:260-266.

Préfet des Yvelines. 2009. "Approbation du plan ORSEC." Arrêté préfectoral.

Préfet Ile-de-France. 2012. "Eco-industrie du secteur de l'adduction, de l'assainissement et du

traitement de l'eau." Rapport.

Prest,E.I., F.Hammes, S.Kotzsch, M.C.van Loosdrecht, and J.S.Vrouwenvelder. 2013. "Monitoring

microbiological changes in drinking water systems using a fast and reproducible flow
cytometric method." Water Research. 47:7131-7142.

Quignon,F., M.Sardin, L.Kiene, and L.Schwartzbrod. 1997. "Poliovirus-1 inactivation and interaction
with biofilm: a pilot-scale study." Applied Environmental Microbiology. 63:978-982.

149
Quinn,C., A.Demirjian, L.F.Watkins, S.Tomczyk, C.Lucas, E.Brown, N.Kozak-Muiznieks, A.Benitez,
L.E.Garrison, J.Kunz, S.Brewer, S.Eitniear, and M.DiOrio. 2015. "Legionnaires' Disease
Outbreak at a Long-Term Care Facility Caused by a Cooling Tower Using an Automated
Disinfection System--Ohio, 2013." J.Environ.Health. 78:8-13.

Quintero-Betancourt,W., E.R.Peele, and J.B.Rose. 2002. "Cryptosporidium parvum and Cyclospora

cayetanensis: a review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites."
Journal of Microbiological Methods. 49:209-224.

Ramalho,R., J.Cunha, P.Teixeira, and P.A.Gibbs. 2001. "Improved methods for the enumeration of
heterotrophic bacteria in bottled mineral waters." Journal of Microbiological Methods. 44:97-
103.

Rees,M.D., J.M.Whitelock, E.Malle, C.Y.Chuang, R.V.Iozzo, A.Nilasaroya, and M.J.Davies. 2010.

"Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan
sulfate proteoglycan perlecan." Matrix Biol. 29:63-73.

Reguera,B., P.Riobo, F.Rodriguez, P.A.Diaz, G.Pizarro, B.Paz, J.M.Franco, and J.Blanco. 2014.
"Dinophysis toxins: causative organisms, distribution and fate in shellfish." Mar.Drugs.
12:394-461.

Reynolds,D.T. and C.R.Fricker. 1999. "Application of laser scanning for the rapid and automated
detection of bacteria in water samples." Journal of Applied Microbiology. 86:785-795.

Reynolds,K.A. 2004. "Integrated cell culture/PCR for detection of enteric viruses in environmental
samples." Methods Mol.Biol. 268:69-78.

Reynolds,K.A., C.P.Gerba, M.Abbaszadegan, and L.L.Pepper. 2001. "ICC/PCR detection of

enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples." Canadian Journal of
Microbiology. 47:153-157.

Rickwood,C.J., M.King, and P.Huntsman-Mapila. 2015. "Assessing the fate and toxicity of Thallium I
and Thallium III to three aquatic organisms." Ecotoxicol.Environ.Saf. 115:300-308.

Robertson,L.J., A.T.Campbell, and H.V.Smith. 1992. "Survival of Cryptosporidium parvum oocysts

under various environmental pressures." Applied Environmental Microbiology. 58:3494-3500.

Rompre,A., P.Servais, J.Baudart, M.R.de-Roubin, and P.Laurent. 2002. "Detection and enumeration of
coliforms in drinking water: current methods and emerging approaches." Journal of
Microbiological Methods. 49:31-54.

Rutjes,S.A., R.Italiaander, H.H.van den Berg, W.J.Lodder, and A.M.Roda Husman. 2005. "Isolation and
detection of enterovirus RNA from large-volume water samples by using the NucliSens
miniMAG system and real-time nucleic acid sequence-based amplification." Applied
Environmental Microbiology. 71:3734-3740.

Sakamoto,C., N.Yamaguchi, and M.Nasu. 2005. "Rapid and simple quantification of bacterial cells by
using a microfluidic device." Applied Environmental Microbiology. 71:1117-1121.

Santiago,P., Y.Moreno, and M.A.Ferrus. 2015. "Identification of Viable Helicobacter pylori in Drinking
Water Supplies by Cultural and Molecular Techniques." Helicobacter. 20:252-259.

150
Sawaya,K., N.Kaneko, K.Fukushi, and J.Yaguchi. 2008. "Behaviors of physiologically active bacteria in
water environment and chlorine disinfection." Water Science and Technology. 58:1343-1348.

Schuster,C.J., A.G.Ellis, W.J.Robertson, D.F.Charron, J.J.Aramini, B.J.Marshall, and D.T.Medeiros.

2005. "Infectious disease outbreaks related to drinking water in Canada, 1974-2001."
Can.J.Public Health. 96:254-258.

Servais,P., H.Agogue, C.Courties, F.Joux, and P.Lebaron. 2001. "Are the actively respiring cells (CTC+)
those responsible for bacterial production in aquatic environments?" FEMS Microbiology
Ecology. 35:171-179.

Setlow,P. 2006. "Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and
chemicals." Journal of Applied Microbiology. 101:514-525.

Shi,L., S.Gunther, T.Hubschmann, L.Y.Wick, H.Harms, and S.Muller. 2007. "Limits of propidium iodide
as a cell viability indicator for environmental bacteria." Cytometry A. 71:592-598.

Sibille,I., T.Sime-Ngando, L.Mathieu, and J.C.Block. 1998. "Protozoan bacterivory and Escherichia coli
survival in drinking water distribution systems." Applied Environmental Microbiology. 64:197-
202.

Simoes,L.C., N.Azevedo, A.Pacheco, C.W.Keevil, and M.J.Vieira. 2006. "Drinking water biofilm
assessment of total and culturable bacteria under different operating conditions." Biofouling.
22:91-99.

Slifko,T.R., D.Friedman, J.B.Rose, and W.Jakubowski. 1997. "An in vitro method for detecting
infectious Cryptosporidium oocysts with cell culture." Applied Environmental Microbiology.
63:3669-3675.

Smith,C.M. and V.R.Hill. 2009a. "Dead-end hollow-fiber ultrafiltration for recovery of diverse
microbes from water." Applied Environmental Microbiology. 75:5284-5289.

Smith,C.M. and V.R.Hill. 2009b. "Dead-end hollow-fiber ultrafiltration for recovery of diverse
microbes from water." Applied Environmental Microbiology. 75:5284-5289.

Steinert,M., L.Emody, R.Amann, and J.Hacker. 1997. "Resuscitation of viable but nonculturable
Legionella pneumophila Philadelphia JR32 by Acanthamoeba castellanii." Applied
Environmental Microbiology. 63:2047-2053.

Storey,M.V. and N.J.Ashbolt. 2001. "Persistence of two model enteric viruses (B40-8 and MS-2
bacteriophages) in water distribution pipe biofilms." Water Science and Technology. 43:133-
138.

Storey,M.V. and N.J.Ashbolt. 2003. "Enteric virions and microbial biofilms--a secondary source of
public health concern?" Water Science and Technology. 48:97-104.

Storey,M.V., J.Langmark, N.J.Ashbolt, and T.A.Stenstrom. 2004. "The fate of legionellae within
distribution pipe biofilms: measurement of their persistence, inactivation and detachment."
Water Science and Technology. 49:269-275.

Suzuki,S., S.Ishii, A.Wu, A.Cheung, A.Tenney, G.Wanger, J.G.Kuenen, and K.H.Nealson. 2013.
"Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity
serpentinizing ecosystem." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110:15336-15341.

151
Swiss Federal Office of Public Health. 2013. "Swiss Food Compendium." Standard.

Szewzyk,U., R.Szewzyk, W.Manz, and K.H.Schleifer. 2000. "Microbiological safety of drinking water."
Annual Review of Microbiology. 54:81-127.

Tamburini,S., P.Foladori, G.Ferrentino, S.Spilimbergo, and O.Jousson. 2014. "Accurate flow

cytometric monitoring of Escherichia coli subpopulations on solid food treated with high
pressure carbon dioxide." Journal of Applied Microbiology. 117:440-450.

Tartera,C. and J.Jofre. 1987. "Bacteriophages active against Bacteroides fragilis in sewage-polluted
waters." Applied Environmental Microbiology. 53:1632-1637.

Tartera,C., F.Lucena, and J.Jofre. 1989. "Human origin of Bacteroides fragilis bacteriophages present
in the environment." Applied Environmental Microbiology. 55:2696-2701.

Tavernier,S. and T.Coenye. 2015. "Quantification of Pseudomonas aeruginosa in multispecies biofilms

using PMA-qPCR." PeerJ. 3:e787.

Tirodimos,I., M.Bobos, E.Kazakos, A.B.Haidich, T.Dardavessis, I.Kostopoulos, and M.Arvanitidou.

2014. "Molecular detection of Helicobacter pylori in a large Mediterranean river, by direct
viable count fluorescent in situ hybridization (DVC-FISH)." Journal of Water Health. 12:868-
873.

Torvinen,E., S.Suomalainen, L.Paulin, and J.Kusnetsov. 2014. "Mycobacteria in Finnish cooling tower
waters." APMIS. 122:353-358.

Tyndall,R.L., R.E.Hand, Jr., R.C.Mann, C.Evans, and R.Jernigan. 1985. "Application of flow cytometry to
detection and characterization of Legionella spp." Applied Environmental Microbiology.
49:852-857.

Upton,S.J., M.Tilley, M.V.Nesterenko, and D.B.Brillhart. 1994. "A simple and reliable method of
producing in vitro infections of Cryptosporidium parvum (Apicomplexa)." FEMS
Microbiol.Lett. 118:45-49.

USEPA 1623. 2005. "Cryptosporidium and Giardia in Water Filtration/IMS/FA." Protocol. EPA 821-R-
01-025. Office of Water, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C..

Van Poucke,S.O. and H.J.Nelis. 2000a. "A 210-min solid phase cytometry test for the enumeration of
Escherichia coli in drinking water." Journal of Applied Microbiology. 89:390-396.

Van Poucke,S.O. and H.J.Nelis. 2000b. "Rapid detection of fluorescent and chemiluminescent total
coliforms and Escherichia coli on membrane filters." Journal of Microbiological Methods.
42:233-244.

Vang,O.K., C.B.Corfitzen, C.Smith, and H.J.Albrechtsen. 2014. "Evaluation of ATP measurements to

detect microbial ingress by wastewater and surface water in drinking water." Water
Research. 64:309-320.

Verhille,S., R.Hofmann, C.Chauret, and R.Andrews. 2003. "Indigenous bacterial spores as indicators of
Cryptosporidium inactivation using chlorine dioxide." Journal of Water Health. 1:91-100.

152
Vila-Costa,M., J.M.Gasol, S.Sharma, and M.A.Moran. 2012. "Community analysis of high- and low-
nucleic acid-containing bacteria in NW Mediterranean coastal waters using 16S rDNA
pyrosequencing." Environemntal Microbiology. 14:1390-1402.

Vital,M., M.Dignum, A.Magic-Knezev, P.Ross, L.Rietveld, and F.Hammes. 2012. "Flow cytometry and
adenosine tri-phosphate analysis: alternative possibilities to evaluate major bacteriological
changes in drinking water treatment and distribution systems." Water Research. 46:4665-
4676.

Vives-Rego,J., P.Lebaron, and C.G.Nebe-von. 2000. "Current and future applications of flow
cytometry in aquatic microbiology." FEMS Microbiology Reviews. 24:429-448.

von Reyn,C.F., R.D.Waddell, T.Eaton, R.D.Arbeit, J.N.Maslow, T.W.Barber, R.J.Brindle, C.F.Gilks,

J.Lumio, J.Lahdevirta, and . 1993. "Isolation of Mycobacterium avium complex from water in
the United States, Finland, Zaire, and Kenya." Journal of Clinical Microbiology. 31:3227-3230.

Wang,Y., F.Hammes, R.K.De, W.Verstraete, and N.Boon. 2010a. "Past, present and future
applications of flow cytometry in aquatic microbiology." Trends Biotechnol. 28:416-424.

Wang,Y., F.Hammes, R.K.De, W.Verstraete, and N.Boon. 2010b. "Past, present and future
applications of flow cytometry in aquatic microbiology." Trends Biotechnol. 28:416-424.

Watson,C.L., R.J.Owen, B.Said, S.Lai, J.V.Lee, S.Surman-Lee, and G.Nichols. 2004. "Detection of
Helicobacter pylori by PCR but not culture in water and biofilm samples from drinking water
distribution systems in England." Journal of Applied Microbiology. 97:690-698.

Watt,P.M., D.C.Johnson, and C.P.Gerba. 2002. "Improved method for concentration of Giardia,
Cryptosporidium, and poliovirus from water." J.Environ.Sci.Health A
Tox.Hazard.Subst.Environ.Eng. 37:321-330.

Westrell,T., O.Bergstedt, T.A.Stenstrom, and N.J.Ashbolt. 2003. "A theoretical approach to assess
microbial risks due to failures in drinking water systems." Int.J.Environ.Health Res. 13:181-
197.

WHO. 2006. "Guidelines for Drinking-Water Quality : Incorporating First Addendum." 3rd edition.

Wilhartitz,I., R.L.Mach, E.Teira, T.Reinthaler, G.J.Herndl, and A.H.Farnleitner. 2007. "Prokaryotic

community analysis with CARD-FISH in comparison with FISH in ultra-oligotrophic ground-
and drinking water." Journal of Applied Microbiology. 103:871-881.

Woods,K.M., M.V.Nesterenko, and S.J.Upton. 1995. "Development of a microtitre ELISA to quantify

development of Cryptosporidium parvum in vitro." FEMS Microbiol.Lett. 128:89-94.

Young,S.B. and P.Setlow. 2003. "Mechanisms of killing of Bacillus subtilis spores by hypochlorite and
chlorine dioxide." Journal of Applied Microbiology. 95:54-67.

Zacharias,N., T.Kistemann, and C.Schreiber. 2015. "Application of flow cytometry and PMA-qPCR to
distinguish between membrane intact and membrane compromised bacteria cells in an
aquatic milieu." International of Hygiene and Environmental Health.

Zemke,V., L.Podgorsek, and D.Schoenen. 1990. "Ultraviolet disinfection of drinking water. 1.

Communication: Inactivation of E. coli and coliform bacteria." Zentralbl.Hyg.Umweltmed.
190:51-61.

153
154
Partie VI - ANNEXES

155