Biotechnologie

Ce sont des méthodes ou techniques utilisant des éléments du vivant (organismes, cellules, éléments
subcellulaire ou moléculaire) pour rechercher, produire ou modifier des éléments ou organisme
d’origines végétales ou animales
Les biotechnologies concernent donc des procédures qui peuvent contribuer au développement de
nouveaux produits ou de services et des produits déterminés

Déf : les biotechnologies consistent en l’utilisation de bactéries, de levure et de cellules animales et

végétales en culture, dont le métabolisme et la capacité de biosynthèse sont orientés vers la
fabrication de substance spécifiques

Domaines
Biotechnologie rouge/ médecine
Biotechnologie verte/ agriculture
Biotechnologie jaune/ environnement
Biotechnologie blanche / industrie
Biotechnologie bleu/ mer
Applications
♪ Production de vaccins et d’antibiotiques
♪ Technique de diagnostic moléculaire
♪ Industrie pharmaceutique et cosmétique
♪ Production de variétés végétales modifiées
♪ Production de races animales modifiées
♪ Production de biofertilisants et de biopesticides
♪ Entretien de la biodiversité
♪ Dépollution
♪ Procédés industriels non polluants
♪ Développement de nouvelles sources d’énergie
♪ durables comme les biocarburants
♪ Exploitation des ressources maritimes pour
créer de nouveaux produits
♪ Production de biomatériaux et d’agent
pharmacologiques régénératifs

La biotechnologie rouge
♪ Liée à la médecine, au domaine de la santé, du médicament et du diagnostic.
♪ Ce domaine a permis l’élaboration de systèmes permettant la production de vaccins,
d’antibiotiques, d’hormones qu’aucuns chimiste ne pourrait synthétiser.
♪ On retrouve aussi la thérapie génique qui consiste à produire un gène médicament capable de
remplacer ou modifier un gène déficient.
♪ La thérapie cellulaire qui sert à remplacer des cellules malades ou détruites par des cellules saines.
♪ Intervient dans le diagnostic médical comme les puces à ADN.

La biotechnologie verte
♪ Liée à l’agriculture et à l’alimentation.
♪ Elle utilise le génie génétique pour transférer certains gènes d’une espèce de plante à une autre et
améliorer de façon ciblée la résistance aux insectes, aux champignons.
♪ Les chercheurs veulent assurer la production alimentaire, d’énergie et de production de
biomatériaux en préservant l’environnement.

Biotechnologie blanche
♪ Sert à la production et les processus à l’échelle industrielle
La fermentation
♪ Phénomène naturel, se produisant lors de la décomposition de la matière organique par les
microorganismes, substrats glucidiques sans utilisation d’oxygène.
♪ Au cours de cette dégradation il y a production d’acide, d’alcool ou de gaz.

Conditions de la fermentation
Chimique
 Sources de carbone
(sucres, déchets
agroalimentaire)
 Ingrédient (source
d’azote)
 Facteurs de croissance
Physique
 La température
 L’agitation
 L’aération
 La pression
 Le ph
 La configuration
géométrique

Les micro-organismes sont :

♪ Les procaryotes avec les bactéries et les algues bleues.
♪ Les eucaryotes unicellulaires comme les levures.

Génie génétique : ensemble des techniques utilisées pour modifier librement l’information génétique
d’un organisme par un changement de son adn

Génie enzymatique : = génie génétique avec obtention d’une enzyme modifiée.

Transgénèse
♪ Transfert artificiel d’un gène par un vecteur(plasmide) d’un organisme à un autre d’une espèce,
avec possibilité de réplication et d’expression.
♪ C’est la manipulation directe comparable à de la chirurgie sur de l’adn des micro-organismes
végétaux ou animal
♪ Techniques et procédés qui permettent la recombinaison de l’adn dans le domaine médical, de la
recherche pharmaceutique

♪ Il est devenu possible de réaliser des microorganismes, des plantes ou des animaux transgéniques
en introduisant chez les êtres vivants une séquence d’adn étranger appelé transgène dans une cellule
somatique ou gamète qui après fécondation produirait un organisme transgénique pouvant
synthétiser des protéines non synthétisées chez l’organisme normale de la même espèce.
Le clonage
Au sens strict : copier en un grand nombre d’exemplaire.
Le clonage désigne toutes les techniques permettant de générer des molécules d’ADN chimères en
fusionnant une séquence d’adn d’intérêt, appelé insert avec une séquence appelé vecteur.
La molécule chimère est dans un premier temps introduit dans une bactérie.

Au moins deux molécules d’adn sont nécessaire avant le clonage

Le clonage génère des outils permettant de caractériser une protéines ou une séquence adn et est
donc à la base de la plupart des projets de recherche en biologie moléculaire.
Comment localiser le gène d’intérêt ?
Les sondes d’adn
Molécule d’acide nucléique antiparallèle et complémentaire (un oligonucléotide) d’une séquence
spécifique d’un génome ou d’une banque capable de reconnaitre par hybridation et de marquer cette
séquence pour permettre son identification ou son isolement.
Lorsqu’elles sont marquées nous pouvons les suivre dans le milieu

Si localisation du gène impossible

♪ On peut séquencer la protéine synthétisée et en déduire une séquence ADN qu’on pourra
synthétiser artificiellement.
♪ On peut extraire les ARNm qui ne possèdent pas d’introns et on réalise une RT-PCR
Cette enzyme sera capable de synthétiser un ADNc puis de l’amplifier afin d’en avoir une grande
quantité.

Besoin d’un vecteur

♪ Un vecteur est l’adn du plasmide utilisé pour faire plus de copies ou de
produire une protéine à partir d’un certain gène.
♪ Les plasmides sont circulaires, extra-chromosomique, l’adn sera
répliquer par les bactéries.
♪ un plasmide possède un site de clonage multiple qui contient des sites
de reconnaissance pour des endonucléase de restriction.
♪ différents insert peuvent être incorporés au niveau du site MCS dans le
plasmide par ligation.
♪ Les plasmides possède un gène qui code pour une résistance à un antibiotique.

Le clonage génère des outils permettant de caractériser une protéine ou une séquence d’adn et est
donc à la base de la plupart des projets de recherche en biologie

La PCR et la Q PCR
Se fais quand la quantité des échantillon d’adn est trop petite pour qu’on puisse les utiliser
Dès que la synthèse est réalisée on amplifie par PCR
Cette technique permet de synthétiser une molécule courte d’adn contenant la séquence voulue de
nucléotides.
L’intérêt de la pcr est d’amplifier à partir d’une matrice et de 2 amorces très rapidement n’importe
quel fragment d’adn ;

2 types de PCR
 Pcr classique non quantitative (on doit attendre que la réaction soit finie pour quantifié l’adn)
 Pcr en temps réel toujours quantitative mais soit spécifique, soit non spécifique
Intérêt : amplifier à partir d’une matrice et de 2 amorces très rapidement n’importe quel fragment
d’adn.

Limites de la technique PCR

La PCR suppose la synthèse chimique de deux oligonucléotides, il faut connaitre la séquence
nucléotidique du fragment à analyser au niveau de ces régions d’amorçage.

Remarq : il est possible de contourner le problème en clonant le fragment dont la séquence est
totalement inconnue dans un vecteur afin d’utiliser la séquence du vecteur pour amorcer la réaction
de PCR.
3 étapes :
 Dénaturation : 95°C pour dénaturer et donc séparer les deux brins d’adn.
 Hybridation : température diminue pour permettre l’hybridation des amorces sur leurs
séquence cible.
 Élongation

Tm
Si T>au Tm, l’adn plasmidique et l’oligonucléotide ne s’hybrident
pas
Si T=Tm il y aura hybridation spécifique
Si T< Tm, il y aura hybridation sur la séquence complémentaire mais
aussi hybridation non spécifique

Plus elle sera proche du Tm des amorces, plus la pcr sera spécifique

Le Tm dépend de nombreux facteurs

 Longueur du fragment d’adn
 Richesse en c et g et concentration en ions Na du milieu réactionnel

Tm= AT* 2 + CG*4

La polymérisation
L’adn polymérase est thermostable et est capable de résister à plusieurs cycles de 94°
Le temps d’élongation dépend de la longueur de la séquence à amplifier
Il existe plusieurs types de polymérase
 Taq polymérase (Thermus aquaticus bactérie aquatique thermophile), ne possède pas
d’activité exonucléasique 3’-5’ ce qui rend impossible la correction d’erreur lors de la copie.
Elle possède une activité adn terminal transférase qui ajoute une adénine à l’extrémité 3’des
nouveaux brins synthétisés.
 Tht ADN polymérase est une eubactérie Thermus thermophilus qui possède les mêmes
caractéristiques que la taq et possède une activité de transcriptase réverse très élevée en
présence d’ions manganèse.
  Vent adn polymérase venant de Thermococcus litoralis et possède une activité exonucléasique
3’-5’ (plus fidèle que la taq polymérase).
 Tlf polymérase
 Tma polymérase
Polymérase de types A
Elles ont une activité polymérase 5’-3’ et une activité exonucléase 5’-3’ (enlève ce qu’elles croissent
sur son chemin) et ajoutent une adénosine du côtés 3’.

Pfu polymérase
♪ Provient de pyrococcus furiosus qui est une bactérie
hyperthermophile.
♪ Thermiquement plus stable
♪ une activité exonucléase 3’-5’ donc élimine les erreurs
d’insertion de base de nucléotides

Optimisation de la PCR
Se fait en jouant sur plusieurs paramètres :
 Équipement
 Paramètres physiques et chimiques (Tm, nombre de cycle)
 Choix des amorces
♪ La taille du fragment à amplifier ne peux pas dépasser quelques kilobases
♪ Jamais de rendement de 100%
 R- rendement
Qn=Q0* (1+R) n
 N – nombre de
cycles
♪ Au-delà d’un certain nombre de cycle, le taux d’amplification diminue car il y a une diminution de la
concentration des nucléotides et en oligonucléotides, augmentation de la concentration du produit
de PCR qui tente de s’hybrider entre eux.

Détection d’OMG
Pour rechercher la présence d’un transgène chez un organisme, on peut utiliser des amorces de PCR
spécifiques de la séquence de ce transgène.

Si le transgène n’est pas présent dans l’organismes testé, les amorces ne s’hybrideront pas sur l’adn
extrait de cet organisme et il n’y aura pas d’amplification.
Si le transgène est présent, il sera détectable par l’obtention d’un produit d’amplification.

Pcr en temps réel ou quantitative

Applications :
♪ On peut détecter une aneuploïdie
♪ Détecter une grande délétion dans un gène
♪ Quantifier l’expression d’un gène, c’est-à-dire mesurer la quantité d’ARNm produit par le gène.
Il existe deux grandes méthodes de détection :

 Non spécifique
La SYBR Green est un fluorophore
capable de se lier à l’adn double brin. Il
n’est pas fluorescent lorsqu’il est sous
sa forme libre.
 Rond vert : subr green
Plus le brin double hélice est grand et plus de subr green se fixe

 Spécifique
♪ Méthode Taqman qui provient de Taq polymérase et Pac man.
♪ En effet la taq polymérase possède une activité exonucléase 5’-3’ permettant de dégrader
tous les oligonucléotides se trouvant sur son passage.
♪ La sonde est porteuse de deux molécules, un fluorochrome en 5’ et un extincteur en 3’.
♪ L’extincteur empêche le fluorochrome d’émettre s’ils sont trop proche l’un de l’autre.
♪ La taq polymérase dégrade la sonde grâce à son activités exonucléasique donc le
fluorochrome n’est plus éteint par l’extincteur et peut donc émettre de la fluorescence.

La méthode est donc très précise car la fluorescence émise

est strictement proportionnelle au nombre de
copies synthétisées au cours de la pcr.
Cette fluorescence est mesurée grâce à des appareils
dédiés qui mesurent la fluorescence émise par le
fluorochrome au cours du temps.

Vecteurs
Il existe deux types de vecteurs :
 Vecteur de clonage (vecteur d’étude de
fragment d’adn d’intérêt)
Un vecteur de clonage est un plasmide ayant
une réplication autonome dans la cellule hôte et un site multiple de clonage afin de cloner un
fragment d’adn d’intérêt.
Les vecteurs sont en grande majorité des plasmides bactériens. Les vecteurs ont été modifiés, les
séquences qu’ils renferment sont for différentes des plasmides naturels desquels ils sont tirés
Ces molécules d’adn circulaire possèdent au minimum 3 éléments :

o Une origine de réplication (Ori) qui

permet son maintien dans
l’organismes hôte.
o Un marqueur de sélection bactérien
qui correspond le plus souvent à un
gène de résistance à un antibiotique.
o Un site de clonage dans lequel sera
inséré l’adn d’intérêt.
Ce genre de vecteur permet de cloner un fragment d’adn d’intérêt, de l’amplifier, de l’isoler et de le
séquencer.

 Vecteur d’expression protéique

Il s’agit d’un vecteur d’expression dans lequel on va cloner le même fragment d’adn après
vérification du clonage dans le vecteur clonage et grâce à son promoteur (constitutif ou
inductible). Ce vecteur va dirigé la bactérie hôte d’expression pour produire la protéine
d’intérêt
Promoteur ubiquitaire : promoteur qui peut être induit dont la synthèse protéique va être déclencher
par n’importe quelle molécule
Promoteur spécifique : se fait que lorsque les molécules spécifiques sont présente
S’il s’agit de produire une protéine dans un organisme donné. D’autres éléments peuvent être présent
dans le vecteur

En amont du site de clonage, le vecteur peut

présenter un promoteur qui peut être
inductible ou constitutif fort ou faible,
ubiquitaire ou spécifique de certains types
cellulaires

Pour déterminer la fonction d’une protéine

donnée, il est important de connaitre sa
localisation au sein de la cellule ou encore les
protéines avec lesquelles elle interagit.
Il est donc parfois nécessaire pour répondre à
ces deux questions de créer des vecteurs de type protéine-fusion
Dans ce cas, la séquence codante de la protéine d’intérêt est alors clonée en amont

Pour déterminer la fonction d’une protéine donnée, il

est important de connaitre sa localisation au sein de la
cellule ou encore les protéines avec lesquelles elle
interagit.
Il est donc parfois nécessaire pour répondre à ces deux
questions de créer des vecteurs de type protéine-fusion
Dans ce cas, la séquence codante de la protéine d’intérêt
est alors clonée en amont ou en aval d’une séquence qui
peu coder pour une protéine fluorescente appelé tag

La création de plasmide rapporteurs permet d’étudier les fonctions régulatrices d’un gène.
Un gène rapporteur, en aval du site de clonage peut facilement être mesuré dans une cellule.
Parmi les plus fréquents , citons le gène de la luciférase, une enzyme naturellement présente chez la
luciole. En présence d’atp , cette enzyme catalyse une réaction chimique qui permet à son substrat la
luciférine de générer de la lumière. Cette lumière peut être mesurée soit sur les lysats cellulaire , soit
directement sur les cellules vivantes

Techniques de clonage
La digestion enzymatique et ligature ou ligation
Repose sur l’emploie d’enzyme appelées
endonucléases de restriction
Ces enzymes présentes naturellement chez les
bactéries afin de se défendre contre les invasions
des phages, se lient sur l’adn au niveau de
séquences spécifiques que l’on appelle sites de
restriction et génèrent des cassures double brins
Elles sont réparties en 3 classes selon l’endroit où la
coupure se fait par rapport au site de restriction.
Les enzymes de types II sont les plus utilisées :
contrairement aux enzymes des autres classes, elles
coupent l’adn précisément au niveau du site de
restriction

Attention : si le clonage (insertion du gène d’intérêt dans un plasmide) se fait par l’intermédiaire
d’une enzyme de restriction, le vecteur ne doit posséder dans sont site de clonage que des sites de
restrictions uniques. Ils ne doivent pas être présents ailleurs sur la séquence du plasmide

Solution pour cloner un insert dans un vecteur aux extrémités non compatibles :
L’adn complémentaire ou ADNc à insérer dans le plasmide est modifié pour être complémentaire des
extrémités générées par l’enzyme de restriction employée pour couper le plasmide

Nous incubons la séquence d’adn complémentaire

modifiée dans une solution renfermant un plasmide
coupé à l’aide de EcoR1 et une enzyme qui relie les
segments d’adn (adn ligase). On obtient alors un
plasmide fermé qui renferme l’adn complémentaire
ou gène cible

Si l’insert n’est pas compatible avec les extrémités générées par

l’enzye de restriction sur le vecteur, on peut ajouter les sites de
restrictions compatibles sur l’insert par PCR en introduisant ces
sites sur les amorces

Méthode alternative au clonage classique

Le gibson Assembly master mix est une méthode rapide et facile permettant de construire des
plasmides sans l’aide de sites de restriction.
Kit contenant trois enzymes :
  Exonucléase 5’-3’
 Polymérase 5’-3’
 Une adn ligase
Les fragments d’adn à assembler sont amplifiés par pcr
Chaque fragment d’adn possède 15 à 80 pb
qui sont identiques à celles de la séquence
adjacente.
Ces fragments sont ensuite mélangés avec une
exonucléase 5’-3’ qui va générer des
extrémités 3’ sortantes.

Après l’action de l’exonucléase, les fragments

sont assemblés grâce à une polymérase qui
synthétise l’ADN dans le sens 5’-3’ et à une
ligase qui va forer des liaisons phosphodiesters
covalentes afin de ligaturer et donc connecter
les brins d’adn ensemble.

Introduction du plasmide recombiné dans une bactérie.

Les vecteurs qui ont été générés par clonage doivent être introduits dans une cellule hôte
S’il s’agit de bactérie, de levures ou de cellules végétales, on parle de transformation de transduction
Alors que pour les cellules animales, il s’agit de transfection.

Une transformation bactérienne :

Une première étape est nécessaire pour rendre les cellules receveuse compétentes à cette
transformation ;
2 techniques majeures existent : l’électroporation et le choc thermique

L’électroporation : les bactéries en phase exponentielle de croissance sont récoltées par

centrifugation. Elles sont rendues électro compétentes par des lavages successifs à l’eau désionisée à
T° proche de 0°c.
Placer ensuite les cellules et l’adn dans une cuvette étroite munie de 2 plaques métalliques et générer
un champ électrique très intense sur une durée très courte. Pendant le choc électrique, des
microlésions sur les membres plasmiques permettront le passage de l’adn.

Le choc thermique :
Dans ce type de transformation les bactéries en phase exponentielle de croissance sont traitées avec
du CaCl2
Les ions Ca 2+ vont neutraliser les charges négatives présentes sur les phospholipides membranaires
Les cellules sont ensuite placées sur glace pour stabiliser cette interaction et rigidifier la membrane
L’adn est ajouté et se fixe sur le ca 2+. Les bactéries sont placées à 42°C pendant 1 minutes. Le choc
thermique perturbe temporairement la membrane plasmique, ce qui permet à l’adn d’entrer dans les
cellules.

La transduction bactérienne :
Étapes :
1. Attachement du phage au récepteur
2. Pénétration, injection de l’adn du phage—phage végétatif
3. Dégradation du chromosome de la bactérie
4. Réplication de l’ADN du phage
5. Biosynthèse des ARNm et protéines virales
6. Maturation : encapsidation de l’adn viral et formation de nouveau phages
7. Libération des phages néoformés