cours resume de biochimie :14
Concentration ADN en mg / ml= DO260 x 50 x dilution
outils de biologie moléculaire et applications
I / Les techniques d’extraction :
sources d’ADN toute cellule nucléée
® Cellules animales ou végétale
® Leucocytes
® Villosités choriales
® Cellules en culture :fibroblastes, amniocytes, lignées
lymphoblastoïdes
® Prélèvements anatomopathologique
® Tissus congelés
® Goutte de sang
® Racine de cheveux
® Restes de momie, cadavre….
principe d’extraction :
1- Affinité des acides nucléiques pour Les phases aqueuses
Solubilité différentielle entre 2 phases non miscibles
2- Précipitation des acides nucléiques
(par l’éthanol ou isopropanol à froid / sels)
Techniques d’extraction (ADN / ARN)
Approche Globale
® Lyse cellulaire (par action des détergents)
® Dissociation des protéines nucléaires
(par action Protéinase K + SDS)
® Purification (par extraction au phénol-chloroforme)
principe : solubilité différentielle entre 2 phases non miscibles
® Précipitation des acides nucléiques
(par l’éthanol ou isopropanol à froid / sels)
® Elimination des ARN
(par traitement à la RNase-DNase free)
® Dissolution dans une solution tampon et conservation
1- lyse cellulaire (par action des détergents)
1-Lyse des GR En TLP ou SLR (Tampon Lyse des Rouges / Solution
Lyse des Rouges)
KHCO3 10 mM – NH4Cl 155 mM – EDTA 1 mM - pH=7,4
2-Lyse des GB En TLB ou SLB (Tampon Lyse des blancs)
Tris-HCl 10 mM pH 8 –NaCl 400 mM – EDTA 2 mM
2- Dissociation des protéines nucléaires
(par action Protéinase K + SDS)
3- Purification (par extraction au phénol-chloroforme)-
une Purification au Phénol-Chloroforme-Alcool IsoAmylique
une Purification au Chloroforme-Alcool IsoAmylique (24v / 1v)
4-Précipitation par l’éthanol
5- Elimination des ARN (par traitement à la RNase-DNase free)
6- Dissolution dans une solution tampon et conservation
Précautions Pour préserver l’intégrité de l’ADN
1- Eviter l’hydrolyse par les DNases (exogènes ou endogènes)
Travailler proprement ® gants / matériel stérilisé / tampons stérilisés
®+ EDTA
2- Limiter les dégradations (cassures mécaniques)
Pas d’agitation trop violente / pas d’ultrasons pour lyser les cellules
3- Eviter la dénaturation thermique
- Ne pas exposer à T°C > 80°C
-longue conservation à T°C ambiante en eau distillée déconseillée
Les autres techniques
§ Salting-out
§ Chromatographie échangeuse d’ions
§ Automates
II / Les techniques de dosage ADN et ARN :
Spectre d’absorption des Acides nucléiques
Concentration ARN en mg / ml= DO260 x 40 x dilution
Rapport de pureté = DO260 / DO280. 1,8 – 2
Maximum d’absorption à 260 nm
courbe de fusion
L'ADN absorbe à 260 nm (bases puriques et pyrimidiques).
lorsque l'on chauffe l'ADN, la viscosité diminue et la densité optique à
260 nm augmente :
➨ C'est l'hyperchromicité ou
effet hyperchrome.
Ceci est dû à la séparation des
2 brins d'ADN appelée fusion.
Température de fusion ou de
Tm = le point de transition où
la moitié des brins sont
dissociés (donc fonction de GC et AT).
Dénaturation - Renaturation = fonction de la composition en bases
nucléotidiques
III / Les outils enzymatique :
Bactéries (1970) Endonucléases de classe II :hydrolysent les liaisons
phosphodiester ; Reconnaissent spécifiquement séquences
palindromique 5’-G / AATTC-3’ / 3’-CTTAA / G-5’
Les coupures à bouts francs ou bouts cohésifs
Autres enzymes utilisés en biologie moléculaire
- ADN polymérase (isolée en 1958)
- Terminale transférase
- Transcriptases inverses Transcrire l’ARN en ADNc
- DNA Ligase
- Nucléases :
DNase I Endonucléase coupe ADN simple et double brin Coupe après
pyrimidine ;Origine : extraite du pancréas
Nucléase S1 Dégrade spécifiquement les simples brins ADN
bicaténaires et hybrides ADN-ARN ne sont pas attaqués
Exonucléase III
RNases
RNases A clive ARN simple brin (pas le duplex ADN-ARN)
Résiste à forte température (1h à 90°C)
RNases H clive ARN dans les hybrides ADN-ARN
Destruction ARN après transcription inverse (synthèse cDNA)
Les autres enzyme
T4 polynucléotide kinase
Phosphatase alcaline (retire les P en 5’ sur ADN et ARN..)
IV/Les techniques de séparation :
1-Eléctrophorèse :
1- Principe : c’estbune méthode de séparation des protéines et des
acides nucléiques (ADN, ARN) en fonction de leur taille.
Electrophorèse de ADN et ARN en gel d'agarose : Les acides
nucléiques chargés négativement sont déposés sur un support (agarose
ou acrylamide) et séparés par migration sous l'effet d'un champ
électrique.
2- Gels utilisés- Agarose
- Acrylamide
3- Courbe d’étalonnage Détermination de la taille des fragments
d’ADN
 En fin de PCR
2- Autres méthodes de séparation : Chromatographie - Conditions de plus en plus défavorables à Polymérase
- On comprend alors que le nombre de cycles est limité
Facteur d’amplification attendu 230 ® Facteur d’amplification réel 105
V/Les techniques d’analyse : les cycles successifs de PCR
Augmentation exponentielle du nombre de copies 2n®30 cycles®106
Quantité initiale de l'ordre du pgr® quantité finale de l'ordre du µgr
® RFLP Southern ou Northern blots Rôle des composants de la PCR
® Amplification du DNA par PCR L’ADN polymérase :
® séquençage d'acide nucléique Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie
thermophile (résistante à des températures très élevées), comme par
Southern blot : exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase).
De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui
1- Restriction enzymatique simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été
2- Electrophorèse sur gel d’agarose largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles.
3- Traitement du gel (dénaturation/dépurination) Le tampon :
4- Transfert sur membrane de nylon (cellulose) (Blot) Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH
5- Hybridation avec sonde spécifique marquée (P32) du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase
6- Autoradiographie (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations bivalents Mg2+,
Les méthodes d’études de l’ADN et de l’ARN cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la
Taq polymérase. La présence dans le milieu réactionnel des cations
PCR et Techniques dérivées : bivalents Mg2+ et de cations monovalents (K+ ou NH4+) vont
neutraliser les charges négatives des groupements phosphates au
Reaction de PCR ou Polymerase chain reaction ( PCR ) : niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En
(ACP : Amplification en Chaîne par Polymérisation) pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec
- Révolution ®la génétique moléculaire ® méthode d'amplification l’activité de l’ADN polymérase.
génique in vitro, ADN
- l'analyse rapide et peu coûteuse des gènes, on utilise souvent de l'ADN génomique (100 ng) total extrait de
La PCR a révolutionné la Biologie Moléculaire, cellules.
la quantité d’ADN n’est plus un facteur limitant. Sources d’ADN :
Amplification d'un fragment d'ADN = nombreuses copies Sang total / Cellules en culture / Trophoblaste / Liquide amniotique / -
Méthode simple, rapide, sensible,nécéssitant des ingrédients simples et taches de sang séché
quelques heures de travail. Biopsies tissulaires / taches de sang séché
Outil de base à différentes techniques Pièces de musées (animaux) / plantes séchées / prélèvement de
Cycle PCR momies égyptiennes
Étape 1: Dénaturation : Cassure des liaisons hydrogène par la En théorie une copie ADN recherchée est suffisante
chaleurEtape2: Hybridation : Les paires de primers hybrident aux pour avoir une amplification (sauf probabilité…..)
extrémités de la séquence cible En pratique plusieurs copies sont nécessaires !!!
Étape 3: Élongation : l’ADN Polymérase Taq catalyse l’extension des Attention, la mauvaise qualité et/ou une quantité ++
amorces (incorporation des nucléotides complémentaires)) - amplification non spécifique
Fin du 1er cycle PCR : Obtention de deux copies de la séquence - inhibition polymérase (due aux réactifs et contaminants).
ciblePCR à 30 cycles®2n Paramètres affectant la PCR
En théorie et seulement en théorie! Dénaturation :
il y a un facteur d’amplification de l’ordre de 230 températures de 91 à 97°C.
soit un facteur d'un milliard 109 Complementarité des bases G® C et A® T ou U
En pratique : Préparation du Mix = mélange de: (Tampon; dNTP, Mg, Liaisons hydrogènes
Mn, Taq et amorces Formation d’hybride : double liaison stable / anti-parallèle
Ajout de l’ADN ( Cible) au Mix Taq polymerase demie-vie 30 min à 95°C
programme du cycle Temps à température de dénaturation
Dénaturation initiale 5 min à 94˚C 1 min à 94°C ( 30 sec )
Dénaturation; 93°C - 95°C 30 secs – 1min Innis and Gelfand (1990) ® 96°C pendant 15 sec.
Hybridation; 37°C - 65°C 30 secs – 1min
Extension; 70°-75°C 1min Amorces ou oligonucléotides
X 25-35 cycles Le choix des oligonucléotides
Extension finale 2-10 min ® Complémentarité / Spécificité
Stockage à + 4 ° C
® Tm* ou « melting temperature »
Thermocycleur:
Programme informatique « logiciel OLIGO 4.0 »
appareil automatique assurant la variation de température rapide entre
- composition équilibrée en GC / AT
des plateaux programmés le nombre de fois requis - peu d’écart entre les Tm des 2 amorces
Juger les échantillons par électrophorèse sur gel.
- pas de complémentarité entre amorces / en 3’
PCR®Electrophorése sur gel d’Agarose®Visualisation en UV ® Température d’hybridation Tm :
produit final Elle dépend directement de la Longueur et de la séquence
Dans des conditions expérimentales Tm = 4°C x (nombre de bases G, C) + 2°C x (nombre de bases A, T)
Au début de PCR - excès d’amorces Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C
- excès de dNTP La température d'hybridation est choisie généralement égale ou
- concentration ADN est très faible. supérieure de 2 à 3°C à la température de fusion de l'oligonucléotide.
Difficulté : probabilité de rencontre des amorces avec l’ADN. (5°C de la Tm la plus basse pour Innis and Gelfand, 1990).
Evolution de PCR Temps d’hybridation : 30 sec ou moins
- Copies d’ADN s’accumulent. ®modification du milieu réactionnel. Les nucléotides dNTP (3) DésoxyNucléotides-Tri-Phosphates
- Viscosité du milieu réactionnel augmente, § dATP 100 mM
- Diminution des Amorces et des dNTP. § dCTP 100 mM
R° polymérisation = R° phosphodiester® [PPi] ++®inhibition § dGTP 100 mM
polymérase § dTTP 100 mM
 § La Taq polymérase Les mutations
ADN polymérase thermostable 1987 Thermus aquaticus (Taq) ou Délétions : 60%
enzyme produite dans E. coli (génie génétique) Duplications : 5%
fonctionne de manière optimale à 72°C (68°C) ;résistante à 95°C. Mutations ponctuelles : 35 %
peut être ajoutée au début de la réaction 1 à 2,5 U Survenue de novo : 30 %
Vitesse 1000 bases/minute PCR+Digestion enzymatique Diagnostic de la Drépanocytose
Activité ADN polymérase thermostable Drépanocytose
activité 5'®3' polymérase et 5'®3’exonucléase, Anémie falciforme dûe à Hb S
pas d'activité 3®5' exonucléase (ne corrige pas) Mutation ponctuelle unique (GAG®GTG)
A une activité terminal transférase (ajoute un A) en 3'-OH Responsable du changement de : Glu (HbA) ®Val (HbS)
Problèmes de la PCR Détection par Southern blot (MstII/sonde)
1/ Contamination ASO (Allele Specific Oligonucleotide) Saiki, 1985
2/ Fidélité Hybridation classique Southern
3/ Amplifications parasites En pratique
1/ Contamination : Ê Amplification par PCR
• ADN génomique + Ê Dépôts sur 2 membranes de nylon (2 allèles)
• Produits PCR +++ Ê Dot blot - Slot blot5 ml ( 33 ng) produit PCR
• Manipulation (pipettages, ouverture tubes…) Ê 2 Sondes marquées (pour l’allèle normal et anormal)
Solutions Ê Hybridation / 5x Denhardt / 0,5x% SDS
1-Organisation: Séparation de pièces : Extraction / réaction PCR / Ê Autoradiographie
Amplification RT PCR : Reverse Transcriptase PCR,
2-Manipulation: utiliser les ARN comme matrice d'amplification de la PCR.
- Aliquoter les réactifs détecter les ARNm et éventuellement les quantifier
- Utiliser des pipettes différentes pour PCR et produits PCR souvent réalisée in situ (PCR in situ) utilisée aussi
- Porter des gants, utiliser des pointes stériles…. ® pour la construction de banques d'ADNc,
3-Réaction: - Utiliser un contrôle négatif ® le tri d'ARNm (Differencial Display RT-PCR)
-Ajouter l’ADN en dernier ® ainsi que la construction de sondes d'ADN.
2/ Fidélité : 1/ A partir de l'extrémité 3' et grâce à une amorce poly(T), la
Erreurs :fréquence de 2/10.000 nucléotides par cycle. transcriptase réverse synthétise un brin de DNA complémentaire du
taux d'erreur après 30 cycles de l'ordre de 0,25 %. messager.
Solutions 2/ on dégrade le RNA par une base forte ou par une ribonucléase
Diminuer la concentration en nucléotides, en ADN spécifique.
Utiliser de nouvelles polymérases : Vent, pfu…. 3/ Le brin de DNA fabriqué forme spontanément à son extrémité 3' une
3/ Amplifications parasites boucle en épingle à cheveux en s'hybridant sur lui-même.
Souvent non détectables car non exponentielles 4/ L'extrémité 3' de cette boucle va servir de site de démarrage pour la
Solutions DNA polymérase , qui va synthétiser un brin de cDNA du premier.
Augmenter la stringence (t°C) 5/ Une ribonucléase spécifique du DNA simple brinsupprimera la
Ajouter du DMSO, du formamide … boucle de l'extrémité:
Hot start Techniques de recherche de nouvelles mutations :
Mise au point technique +++
Applications de la PCR : Techniques de mise en évidence de variants de séquences
La PCR a été adaptée à la mise en évidence et à l'analyse des mutations
dans de l'ADN eucaryote
Stratégie :
Ces mutations peuvent être :
soit des délétions, Technique d’orientation / screening®permet de révéler la présence
soit des insertions, d’un variant de séquence !! Sans connaître sa nature !!
soit des substitutions de nucléotides (mutations ponctuelles). Technique de confirmation de la nature du variant de séquence ®
détectées en testant la taille du produit PCR Séquençage
Si on veut mettre en évidence une mutation ponctuelle, il faut choix des techniques
généralement séquencer le produit PCR puisque cette mutation ne va 1- Méthodes qui reposent sur des différences de mobilité
pas changer la taille du produit obtenu, ou bien mettre au point des électrophorétique générées par les variants de séquence
techniques alternatives pour leur détection. Polymorphisme de conformation : SSCP, DGGE, dHPLC hétéroduplex
Applications de la PCR dans la détection de mutations : 2-Séquençage
® PCR et détection de « délétions »
® PCR multiplex Polymorphisme de conformation simple brin
® PCR + restriction enzymatique SSCP selon Orita et al. 1989 C’est une méthode d’électrophorèse
® ASO (Allele Specific Oligonucleotide) qui révèle des polymorphismes de conformation
détection de délétions Principe :
2 molécules simples brins issues de la dénaturation d’un ADN
La mise en évidence de délétion par PCR Sur gel d’agarose 1-2%
Fonction de : bicaténaire adoptent chacune en se renaturant une conformation
en fonction de leurs séquences .
-Taille de délétion
Protocole :
- Résolution du gel
1-PCR (dCTP-a32P) / amorce marquée)
PCR multiplex : PCR patient / PCR témoin
Myopathies de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD) Dénaturation /Refroidissement brutale
CLINIQUE Dystrophies musculaires progressives 2-Maintenir les produits dans une solution limitant la renaturation et
Mode de transmission: Récessive, liée à l'X donc favorisant l’adoption d’une conformation particulière.
- DMD : 3-Electrophorèse en gel d’acrylamide non dénaturant (apprécier le
- BMD : « shift » ou glissement des bandes)
GENETIQUE DMD & BMD : Deux maladies, un seul gène en Xp 21 4- Séchage et Autoradiographie
Pénétrance complète Avantages:
Incidence : 1 / 3 500 naissances de garçons Simple et rapide
Le gène 2400 kb / 79 exons ARNm: 14 kb Ne nécessite pas d’équipement spécifique
 Avantages:
Limites: - Grande sensibilité et spécificité
Taille limitée du fragment à analyser (200 à 400 bp) - Réduction des risques de contaminations ( tubes fermés)
Ne détecte pas toutes les substitutions - Capacité de multiplexage ( analyse d’un grand nbr Ech/PCR)
- Rapidité de l’amplification ( 30 à 60 min pour 30cycles)
Polymorphisme de conformation en gradient dénaturant - Capacité d’analyse quantitative et qualitative des AN
- Analyse à haut débit
selon Myers et al. 1987
Les différentes chimies utilisées en PCR en temps réel
Basée sur la séparation des fragments d’ADN double brin en fonction
Les agents intercallantsL SYBR-Green)
de leur composition et de leur séquence au sein d’une région donnée.
Les sondes d’hybridation:
Notion de dénaturation
Sondes Taq-Man ( Sonde à structure linéaire)
-Ou transition d’hélice en pelote statistique, consiste en la séparation
de bases appariées A//T et G///C.
-On peut suivre la dénaturation de l’ADN en mesurant la DO260nm
Notion de Température de Fusion
Tm = 50% de liaison H rompues
Tm : varie en fonction de la composition en GC + conditions
expérimentales.
Tm propre à chaque séquence.
DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
(Acrylamide + Formamide)
Basée sur la séparation des fragments d’ADN double brin, obtenus par
PCR, en fonction de leur composition et de leur séquence au sein d’une
région
Approche
1- L'A.D.N migre dans un gel d'acrylamide où il rencontre des
conditions de plus en plus dénaturantes (gradient dénaturant).
2- La dénaturation du double brin d’ADN se fait progressivement et de
façon discontinue de domaine en domaine, qui s'ouvrent plus ou moins
rapidement, en fonction de leur composition en bases AT et GC.
Mise au point technique de DGGE :
Ê Analyse informatique du fragment d’intérêt : MELTMAP
1-courbe de fusion doit avoir 2 domaines de fusion
2-choix des amorces
3-détermination des conditions d’électrophorèse
Ê PCR
Ê Dénaturation / renaturation®formation Hétéroduplexes
Ê Electrophorèse en gradient dénaturant
Analyse des résultats :
• Après migration, démouler et colorer au BET
• Lecture
HZ normal®1 bande (homoduplexe normal)
HZ variant ou muté®1 bande (homoduplexe muté)
Htz simple® 4 bandes -- homoduplexe normal
-- homoduplexe muté
-- 2 hétéroduplexes possibles
Htz composite ®4 bandes -- 2 homoduplexes mutés
-- 2 hétéroduplexes possibles
WAVE® System – Définition

1Extraction 2PCR 3 Seq. réaction

La DHPLC est une méthode de pré-analyse pour la recherche de
variations génétiques (insertion, délétion, substitution).

Cette technique est utilisée pour la recherche de mutations inconnues

(Screening), ou connues (Scoring).
Principe
Les produits amplifies de deux différents allèles, substitution A G,
sont dénaturés et renaturés progressivement pour favoriser la
formation d’Hétéroduplexes.
Les espèces présentes dans le mélange PCR ont la même tailles. Elles
différent l’une de l’autre par leur stabilité en température.
Marqueur du chromosome Y, sY81 (DYS271) avec une mutation A-
vers-G en position 168 d’un fragment de 209-pb
Les Hétéroduplexes sont élués plus tôt que les Homoduplexes pour des
températures comprises entre 54 to 58oC.
PCR en temps réel
Principe:
Technique fondée sur la détection et la quantification du signal
fluorescent émis par un fluorophore dont l’intensité de l’émission est
proportionnelle à la quantité du produit amplifié au cours de la PCR