Frebourg cours 1

Rappel :

Nous sommes dans la génomique, un domaine qui recouvre l'ensemble des génomes. Il aura fallu 10
ans (1993-2003), 2.4 Milliards de dollars pour séquencer le génome. A partir de 2003 les technologies
se dve, et deux grandes techniques sont rentrés dans la vie quotidienne : CGH et séquençage de
nouvelle génération (lecture complète de la variabilité du génome).
Ce sont des analyses globales et non pas focalisées.

Les analyses génomiques permettent d'appréhender en 3.10^9 paires de bases, et env 23000 gènes

La CGH
Le CGH (comparative génomique hybridation)

Elle porte souvent le nom de puce ADN. C'est la première méthode d'analyse génomique, sa finalité
est qu'elle permet de déterminer pour n'importe quel segment génomique, le nombre de copies.

Principe et outils :

L'outil essentiel est une lame de verre, qui est percée de puits (bcp )c'est une lame de CGH (10000,
100 000 ou 1 million de puits). Dans chacun de ces puits, on trouve des oligo nucléotides (simple brin,
dont la taille est variable (aux alentour de 60 nucléotides). Chaque nucléotide représente une
séquence de notre ADN génomique L'oligonucléotide dans le puits n'est pas marqué.
Dans chaque puits on a une version pointillée de notre génome.
Plus on aura de puits, plus la résolution sera bonne, car les pointillées seront proches les uns des
autres.

LE deuxième composant est l'ADN a analyser. On va faire une analyse comparative : on va comparer
le résultat de l'analyse de l'ADN que l'on va analyser, à un ADN contrôle ("normal", souvent des
mélanges d'ADN). Ce sont ces ADN que l'on va analyser comme sonde (fragment d'ADN marqué). On
transforme ces ADN en sonde, chaque ADN dans 2 tubes diff sont fragmenter, et coloriées avec un
fluoroforme. Les fragments de d'ADN analysé seront marqués par exemple en rouge, alors que l'ADN
contrôle sera coloré en vert.
Avant de réaliser l'hybridation moléculaire, il sera nécessaire que ces sondes soient chauffées pour
être prête a l'emploi

Le principe de base de la CGH est donc de déposé dans la lame de puits la même quantité de sonde
verte et rouge. On va réaliser sur un support solide une hybridation. (une fois lames lavées) resteront
sur la lame uniquement les sondes spécifiques des oligonucléotides. SI pour une séquence
génomique le nbr de copies de l'ADN a analysé est identique aux nombre de sonde contrôle, la force
sera la même, on aura le même nombre et la résultante sera orangée. Mais si sur un segment
génomique, on a une délétion de l'adn rouge, on a moins de sonde rouge, et donc lors de
l'hybridation il y a plus de couleur verte. A l'inverse si le patient a un excès de copies, on a un excès
de sonde rouge, et on aura sur le puits une déviation de la couleur vers le rouge

Donc le principe de la CGH est de faire une comparaison de la force d'hybridation en utilisant un ADN
analysé et un Adn sondé, en déposant dans des puits avec des oligonucléotides non appariés. Le
résultat sera la couleur, lue par un scanner. Sachant que chaque puits est identifiable avec une
séquence que nous connaissons, on peut aisément savoir par l'analyse des couleurs savoir si il y a un
nombre de copies normales, une délétion ou un excès de copies dans l'ADN a analysé.
Cette technologie très puissante, a pu se dvée grâce à des ingénieurs, qui ont eu l'idée de détourné la
technologies des imprimantes jet d'encre.

A partir de chaque zone d'hybridation (puits) la lecture est automatisée. Le scanner ressort l'image :
après mes résultat CGH on a un caryotype virtuelle, et sur chaque chromosome virtuelle on a un
résultat de l'analyse comparative.
La lecture du scanner : on a un point médian ou chaque rond correspond a une hybridation, donc si
on a une hybridation orange, un point est sur la ligne médiane, mais si on a un excès, le signal est
décalé vers le vert ou le rouge. (image) (excès de vert, délétion sur le segment, excès de rouge, excès
de copies).

La CGH va détecter les variations du nombre de copies

Détection des CNV

Pourquoi ces technologies sont essentiels ?

Cette méthode permet de détecter un nombre variable de copies : CNV (copies number variation).
Toutes les variations de notre patrimoines génétiques ne sont pas obligatoirement délétère. La
technologies de CGH a commencé réellement a s'implanter en 2004. La variabilité du nombre de
copies est une forme de polymorphisme, et dans certains cas c'est normal, dans d'autre cas c'est
patho, a cause de la tolérance génomique.

On a appris depuis 2004 c'est quil existe dans les génomes (surtout humains) pour un grand nombre
de segment génomiques un nombre variables de copies. Auj on estime par individu en moyenne
1000 CNV (région variables de copies).
Ce n'est pas parce que on trouve chez un sujet un nombre variable de copies que c'est forcément a
l'irigine de maladie.

La taille de la CNV est très variables (de Kb a Mb). Parfois c'est de petite taille et ne concerne un seul
gène, mais des fois c'est de grande taille et concernent plusieurs gènes.

Caractérisations des maladies génomiques

Ces CNV correspondent des délétions ou insertions génomiques dues a des crossing over inégaux.
C'est une source très importante d'adaptation à l'env.
On sait que les CNV peuvent joués dans l'alimentation, l'immunité … Ils peuvent participer a des
maladies multifactorielles complexes.

Ils peuvent être à l'origines de maladies génomiques (touche un segment génomique). Elles sont
intermédiaires entre chromosomiques et génique (plusieurs gènes). Ces maladies génomiques sont
sources de bcp de soucis, c'est une cause majeur de déficience intellectuel. A partir de 2016, on fait
systématique une CGH pour déterminer les causes de déficience intellectuel.

On sait auj que bcp de maladies génétiques font appel a des maladies de nature oligogéniques (on
peut avoir 2 CNV touchants des gènes diff a l'origine de maladies génétique).
Analyse génomique : NGS (New Generation Sequency)
C'est l'évolution technologique la plus importante de ces 100 dernières années. Cela permet depuis
la première fois d'avoir une vision globale du génome humain.
Ces techniques ont commencées a être dvée en 2009. Elle est a l'origine d'une nouvelle médecine : la
médecine génomique, qui est l'utilisation lors des diagnostiques, du traitement, des prévention des
variations génétiques individuelles.

Ces techniques ne concernent pas uniquement l'espèce humaine, mais toutes les espèces. Exemple
avec ébola : on peut disposer d'appareil de séquençage qui permet de séquencé ébola en une
journée.

Révolution :

La génétique classique a été basée du la PCR et le séquençage. Et donc avant la NGS le séquençage
était ciblée (une région). Avec la NGS on est passé depuis 2009 avec des technologies ciblées (env
500 paires de bases) a des technologies globales (facteurs de 1 000 000).

Ces technologies en 2016, permettent essentiellement d'analyser l'ensemble des régions codantes
des gènes (exons) = Exome. L'exome c'est env 160 000 exons= 30 Mb (1.2% du génome humain). Si
en théorie ces technologies permettent d'analyser le génome, en pratique on analyse l'exome. Le
NGS est essentiellement utilisé pour l'exome, ou un ensemble de gènes.
Le principe de ce séquençage est de séquencer chaque nucléonique plusieurs fois (profondeur de
lecture). La profondeur de lecture est de 100 fois. Donc 3000 Mb= 3Gb (génome humain =3 Gb).

Permet de passer d'une analyse ciblée a une analyse globale. Cette analyse auj reste basé sur
l'exome. On est rentré dans les mondes des Gigas bases.

Tout cela n'aurait pas pu se dve si il n'y avait pas eu en même temps un dve de l'informatique. Auj les
données médicales a analyser sont très sensible et donc problème pour les stockées.

Prochaines étapes de la révolution du NGS:

Il y a une sur enchère pour séquencer son génome.

Des appareils portables sont en études pour pouvoir aller analyser le génome sur le terrain.
Fascination technologiques mais ce qui est essentiel c'est l'interprétation de ces analyses.

Principe :

Etapes :

- 1 : constitution d'une librairie de fragments d'ADN

On analyse globalement. Soit on analysera l'ensemble du génome, soit on prendra uniquement les
exons

- 2 : Amplification clonale de tous les fragments

On va réalisé pour chacun des segments un amplifications. Mais on la fait en parallèle, donc chaque
amplification de segment se fait sectorisée (=clonale) ,pendant que les autres sont amplifié en même
temps.
On va séquencer l'ensemble.

- 3: Séquencage parallèle en masse (didesoxyrybonucléoides)

 - 4 : Analyse bioinformatique

Mot a retenir : librairie, Amplification ciblée en masse, et clonale, en parallèle, analyse

bioinformatique.

 Fabrication d'une librairie

On part de l'ADN génomique que l'on souhaite analyser. On va faire une fragmentation, la plus
classique est faite par sonication (par les ultra sons pour les cassés). On peut aussi utilisé des
enzymes. A ce stade des fragments d'env 200 paires de bases.
On achève cette partie en ajoutant des adaptateurs, ce sont des séquences artificielles d'ADN , qui
vont se placer a la fin et au début de chaque fragments

Dans un deuxième temps, on réalise un enrichissement. L'enrichissement est pour sélectionner tous
les gènes du génome = Exome, ou pour sélectionner l'ensemble des gènes impliqués dans une
maladie = Capture ciblée
Cette capture est commandée auprès de fournisseurs, on peut acheter des hameçons (ce sont des
molécules d'arn particulier qui résiste). Ces hameçons reproduisent les séquences des régions
manquantes. Ces hameçons vont être incubés dans un tube avec l'ADN génomique fragmenté, la
capture est réalisée par hybridation. Après la phase d'hybridation, les fragments d'intérêt auront été
capturés par l'hameçons, et recouvert d'une molécule. Quand on aura fait l'hybridation, on aura donc
dans le tube les hameçons recouverts par la molécule d'une part, et d'autre part le fragment d'ADN.
ON va alors ajouté des billes entourés d'une molécule a forte affinité avec la molécules fixées sur
l'hameçons. Les billes vont descendre sur du nylon, entrainer les hameçons, et avec eux ls fragments
d'ADN fragmentés.

Il y a une deuxième stratégie possible : on peut préparer la librairie par PCR.

1e étape d'une opération NGS : préparer la matrice a analyser. On peut de façon massive avec de
multiples amorces d'amplifier certaines régions

 Amplification clonale

Se fait avant le séquençage.

Pour amplifier en parallèle et de facon massive des fragments d'ADN (préparé avant) ils faut qu'il
soient séparé de facon physique. On a schématiquement deux grands principes de séparations
physique :

- Amplification en émulsion dans micro réacteurs :

Séparer chaque fragments dans un micro réacteurs qui est une gouttelette d'huile dans de l'eau.
Dans chacune des gouttelettes ont va essayer d'avoir chaque fragments d'ADN séparé.

- Amplification en ponts sur phase solide :

Méthode la plus utilisée. : Chaque fragments d'ADN préparé sera séparé sur un support solide.
On a une lame qui est irisée de pics, qui sont des oligonucléotides de synthèse. On en a deux types :
les rouges et les bleus, qui correspondent aux séquences d'adaptateurs utilisé dans l'étape 1.
On déposera la librairie après l'opération de capteurs sur ces syst, mais avant on les dénature pour
que les amorces au bout de chaque amorces de fragments d'ADN s'hybride avec les pics. Le but est
de construire des ponts, qui vont fixer la molécule d'ADN et la séparer de l'autre molécule avant de
séparer faire l'amplification. Chaque pont sera amplifié plusieurs fois.

hybridation sur des grilles, réaction de PCr, construction de pont pour séparer chacune de
molécules

 Séquençage parallèles

La spécificité du séquençage utilisé dans le NGS est d'utiliser des désoxyribonucléotides fluorescents
qui vont arrêter l'élongation, mais qui vont faire un arrête TRANSITOIRE ET REVERSIBLE.
Chaque fois qu'on aura un désoxyribo qui s'intègre, on a points qui s'allument, chaque fois qui va
être enregistré. Succession dynamique de signaux lumineux qui en fonction de la couleur
permettront de connaitre la séquence

 Analyse bioinformatique

Auj, les bio informaticiens sont des pièces maitresse sans les quelles on ne pourrais pas analyser les
résultats.