Elément de Module

« Génétique Fondamentale »

Chapitre :

Structure et fonction du génome humain

Pr. Abdallah BADOU

Laboratoire de
Pathologies Cellulaires et Moléculaires
Faculté de Médecine et de Pharmacie-Casablanca
 QUELQUES DATES CRUCIALES :
La génétique moléculaire est une discipline relativement récente.

➢ En 1869 Miescher (biologiste suisse) découvre la « nucléine » : une

substance riche en phosphate dans le noyau des cellules, plus tard
nommée ADN.

➢ En 1944 Avery (médecin américain d’origine canadienne) découvre,

en menant un travail de recherche sur des bactéries, que l’ADN est le
support de l’information génétique.

➢ En 1953, Watson (généticien et biochimiste américain), Crick

(biologiste britannique) et Wilkins (physicien britannique d’origine
néo-zélandaise) découvrent la structure en double hélice de l’ADN :
Prix Nobel de physiologie ou médecine en 1962.
QUELQUES DATES CRUCIALES (II) :
➢ Années 70 = révolution méthodologique :
- Les endonucléases servent à découper l’ADN
- Les ligases servent à intégrer (lier) l’ADN
- La transcriptase inverse sert à la transcription de l’ARN en ADN
- Les sondes et l’hybridation servent à « voir ou détecter » l’ADN
- Le séquençage sert à « lire » l’ADN

➢ Années 80 = commercialisation de réactifs prêt à l’emploi.

➢ En 1978, premier gène cloné et identifié : l’hémoglobine, puis

premier diagnostic prénatal (drépanocytose), puis première localisation
de la chromatine.

➢ Première banque d’ADN génomique.

QUELQUES DATES CRUCIALES (III) :
➢ Années 80-90, clonage positionnel (génétique inverse : découverte de
gènes impliqués dans des pathologies comme la myopathie de Duchenne
ou la mucoviscidose).

Génétique Génétique inverse

Phénotype mutant Séquence d’une protéine

Allèle mutant Séquence d’ADN

Séquence d’ADN Allèle mutant

Séquence de la protéine Phénotype mutant ?

QUELQUES DATES CRUCIALES (IV) :

➢ Années 2000, changement d’échelle : augmentation du nombre

de techniques pour étudier les gènes :

- Micro-arrays (chips ou puces à ADN) : analyse du niveau

d’expression des gènes (transcrits).

- Séquençage à haut débit : cartographie du génome humain. En

2004, 99% du génome humain a été séquencé.
QUELQUES DATES CRUCIALES (V) :

- Séquenceurs très haut débit (NGS ou Next Generation sequencing)

: ils permettent de séquencer plusieurs gigabases en quelques jours
pour faire la carte d’identité des tumeurs (une pathologie), de l’exome
ou d’un génome complet.

- En 2003, projet ENCODE (Encyclopedia of DNA elements ou

encyclopédie des éléments de l’ADN) visait à étudier les fonctions
des gènes humains.

- En 2007, ADN intergénique (ou junk ou poubelle) = 75% du

génome, importance fonctionnelle.

- En 2012, > 80% du génome humain fonctionnel.

 QUELQUES DATES CRUCIALES (VI) :
Emmanuelle Charpentier (à
gauche), chercheuse française
en microbiologie, génétique et
biochimie et Jennifer Doudna
(à droite), professeur
américaine de chimie et de
biologie moléculaire et
cellulaire. Toutes les deux
lauréates du prix Nobel 2020
de chimie.
Découverte de la technique « CRISPR, Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats », une technique
d’édition du génome d’un organisme donné.
Schématiquement, la technique consiste à « modifier
spécifiquement » les gènes d’un organisme pour que ce dernier
puisse exprimer les caractéristiques recherchés.
 Génétique Moléculaire et applications
en médecine :

➢ La connaissance du génome et des gènes sert pour le diagnostic, le

traitement, et la prévention des pathologies.

➢ La génétique moléculaire consiste en la compréhension des

mécanismes de fonctionnement de la cellule au niveau moléculaire :

- Etude des molécules porteuses du message héréditaire (ADN,

ARN)

- Etude de leur structure, leur synthèse, leur altération, leur

fonction et leur expression.
 Génétique Moléculaire et applications
en médecine (II) :
➢ Un nombre considérable d’articles apparait dans la littérature
clinique.

➢ Ces articles contiennent souvent une description perplexe et confuse

de techniques moléculaires de base :

- Technique d'hybridation pour identifier une nouvelle maladie

auto-immune.
- RT-PCR en temps réel et la technique microarray pour le
diagnostic d’un lymphome.
- Western Blot pour la détection d’une infection par le VIH.
- Animaux (souris) knock-out utilisées pour évaluer un nouveau
trouble d'immunodéficience primaire.
 Génétique Moléculaire et applications
en médecine (III) :

➢ Ces exemples, et bien d’autres, illustrent l'importance d'une

compréhension globale de la génétique moléculaire pour une
meilleure interprétation des résultats d’un diagnostic se basant sur la
biologie moléculaire.

➢ La technologie qui a propulsé le succès du « Human Genome

Project », et qui a lancé le séquençage complet du génome humain,
révolutionne et décrit d’excellentes applications en médecine et
continuera à le faire dans les années à venir.
 Partie (I)
STRUCTURE DU GENOME
 Génome : Ensemble du
matériel génétique d'un
individu ou d'une espèce
Constitué d’ac. nucléique
(ADN ou ARN).

- Génome nucléaire

- Génome mitochondrial

- Génome chloroplastique
 Génome
génome procaryote
génome viral * chromosomique = 1 molécule
= 1 molécule d'ADN simple d’ADN
ou double brin ou d'ARN * extrachromosomique
(plasmides, épisomes)

génome eucaryote
* nucléaire et mitochondrial
* chloroplastique (chez les plantes)
 Génome (II)
- Le génome est réparti sur plusieurs molécules d’ADN linéaires.

- Lorsqu'on observe une cellule en division, on remarque des

petits filaments dans son noyau, des chromosomes. Ces derniers
s'individualisent de plus en plus au cours de la division cellulaire.
 Génome (III)
Génome humain :

- Il est diploïde : 2 exemplaires du génome par cellule;

un hérité du père et un hérité de la mère.
- Les deux exemplaires (dits chromosomes homologues) sont
très similaires mais pas strictement identiques.

N.B. D’autres organismes peuvent comporter un génome :

- Haploïde : un exemplaire du génome par cellule (ex. levure).
- Tétraploïde : 4 exemplaires du génome par cellule
(ex. quelques plantes).
 ADN génomique
Gènes codant pour la protéine

Zone intergénique
Gène d'ovalbumine vu en microscopie électronique.
 TRANSMISSION ET EXPRESSION DES CARACTERES
HEREDITAIRES

❖ Nos caractères (couleur des yeux, des cheveux,

groupes sanguins…) sont héréditaires et se transmettent
des parents aux enfants.

❖ Dans chaque cellule, les paires de chromosomes sont

formés d’un exemplaire paternel et un maternel.

❖ les gènes sont donc présents en deux copies qui peuvent

être de différentes formes appelées « allèles ».
 Au cours de la transmission des chromosomes,
se produit un brassage (recombinaison) génétique
des allèles

Répartition au hasard Crossing-over : échange de

des chromosomes portion(s) de chromatides entre 2
homologues au cours de la chromosomes homologues, au
Méiose début de la méiose

POLYMORPHISME
Ce brassage permet aux individus d’être
tous différents les uns des autres

macromolécule constituée
de 2 chaînes linéaires de
nucléotides,
enroulé en double hélice
(Watson et Crick., 1953).
GENOME HUMAIN
STRUCTURE
•constitué d'environ
• 3,5 milliards de paires de
nucléotides
• 30.000 gènes dont à peu près
L’ADN est constitué de
la moitié n'a pas codantes
parties encore de
et de
parties non codantes.
fonction connue.
•90% de régions non codante
Bases
STRUCTURE DE L’ADN (II)

p
y
p
r
u
i
r
m
i
i
n
d
e
i
s
n
e

sucre

P
NOTION DE GENE
Représentation schématique des trois principales étapes impliquées
dans la synthèse protéique : transduction / transcription / traduction

Bellanti, Immunology IV
Qu’est ce qu’un gène ?
Qu’est ce qu’un gène ? (II)
Qu’est ce qu’un gène ? (III)
 Séquence d’un gène (ex. apoA-II) :

• Ecrire à la suite les lettres A, C, G et T dans l’ordre où l’on rencontre

les nucléotides sur l’un des brins de l’ADN de l’extrémité 5’ à
l’extrémité 3’ aboutit à un texte indéchiffrable (voir l’image).

• Pourtant sur cette diapositive le texte ainsi transcrit contient toute

l’information nécessaire pour la synthèse d’une protéine,
apolipoprotéine A-II.

• On appelle ce brin d’ADN le brin « sens ». L’autre brin est le brin

complémentaire ou brin « antisens ».
 STRUCTURE D’UN GENE
• Pour permettre la biosynthèse d’une
protéine, il doit y avoir dans la structure
d’ADN d’un sujet, une séquence de
nucléotides qui constitue le gène de cette
protéine.
• Dans la séquence du gène on distingue
des séquences en amont (promoteur, et
éléments régulateurs), un site Schéma simplifié d’un
d’initiation de la transcription, gène eucaryote.
une suite variable d’exons et d’introns (comportant
éventuellement d’autres séquences régulatrices) et enfin la fin de
la transcription à la fin du dernier exon.
• L’ensemble des mécanismes qui à partir de la séquence du gène
conduit à la production d’un acide ribonucléique ou d’une
protéine est désigné sous le terme d’expression de ce gène.
 STRUCTURE D’UN GENE (III)

Initiation de la
transcription

5’ 3’

Le gène est orienté de 5 ’ vers 3 ’ :

• un début = Promoteur
• une fin = Fin du dernier exon
 5’ 3’

❖ Le gène est organisé de façon discontinue :

Exons : Séquences codantes et conservées dans l'ARNm. Ce sont des
séquences transcrites et traduites.

Introns : Séquences non codantes éliminées au cours du processus de

transcription. Il s’agit de séquences transcrites mais non traduites.

❖ Les introns n'existent pas chez les virus, les bactéries et l'ADN
mitochondrial.
❖ Le nombre d'exons et d'introns est variable d'un gène à l'autre.
 STRUCTURE D’UN GENE (V)

Initiation de la
transcription

5’ 3’

Promoteur
• Situé en amont du gène en 5', il couvre environ 800 pb à
1 kb.

• C’est une séquence d'ADN qui est position et orientation-

dépendante. Elle est adjacente au site d'initiation de la
transcription.
 PROMOTEUR

• Constitué de nombreuses séquences régulatrices de

l'expression d'un gène soit spécifique d'un ou plusieurs

tissus soit ubiquitaire dans l'organisme.

• De nombreux facteurs protéiques appelés facteurs de

transcription interagissent avec ces séquences régulatrices

modulant ainsi l'expression d'un gène.

 STRUCTURE D’UN GENE (VI)

Initiation de la
transcription

5’ 3’
Exon

Le début du gène commence par une séquence

d'ADN, l'exon (exon 1) au niveau du site

d'initiation de la transcription. Ce site intervient

dans le début de la transcription.

 Initiation de la
traduction

5’ 3’

En aval de ce site, à une distance variable (quelques dizaines à

centaines de bases), se trouve le site d'initiation de la traduction

(ATG initiateur) qui correspond au début de la partie codante du

gène. Ce site d'initiation de la traduction peut se trouver sur le

premier exon ou sur un autre exon.

Sur un même gène, peuvent coexister plusieurs ATG initiateurs

(codant pour des isoformes protéiques).

 5’ 3’

* En 3' du gène, sur le dernier exon, un des 3 codons stop TAG, TGA ou

TAA signale l'arrêt de la traduction.

* En aval du codon stop, dans la zone non traduite du dernier exon, en 3', se
trouve une séquence appelée signal de polyadénylation AATAAA =
correspond au site d’ajout de la séquence polyA sur l'ARNm (situé à
environ 50 à 100 pb en aval et signifiant la fin du gène).
*A noter que plusieurs signaux de polyadénylation peuvent coexister (et
être tissu-spécifique).
 Introns

Introns = séquence non codantes situées à l'intérieur des

gènes

90% de certains gènes = introns

Ex. gène du collagène contient 50 introns!
Taille des introns varie de 31 à 210 000 bases
Qu’est ce qu’un gène ?
 Combien de gènes ?
Génome humain = environ 25 000 gènes (selon l’équipe
qui a procédé au séquençage).

un nématode en contient 19 000

C. elegans

La drosophile, 13 600
 REMARQUES

• Un gène peut coder pour la synthèse d'une

protéine
• Un gène peut coder pour la synthèse d'un ARNr ou
ARNt (ces gènes existent en des milliers de copies
dans le génome)

DONC, gène = brin d'ADN qui est copié en ARN

 PSEUDOGÈNE
❖ Structure = Similaire à un gène fonctionnel mais qui
n’engendre pas de protéine.

❖ Sa séquence est proche de celle de l'ARNm codant pour

le gène normal correspondant.
❖ Il présenterait de nombreuses mutations : ponctuelles,
insertions, délétions, codons stop ne permettant pas la
transcription.
❖ Dans de rares cas, il peut être transcrit, mais non traduit.
Par conséquent, aucune protéine fonctionnelle n'est
synthétisée.
 ADN MITOCHONDRIAL :
L'AUTRE "GÉNOME HUMAIN"

La mitochondrie fournit • C'est un ADN circulaire

l'énergie à la cellule en
fabriquant son "carburant", • double brin de 16.5 kb
l'ATP par un processus
complexe, la • codant pour des sous-
phosphorylation unités protéiques et des
oxydative. ARN (ARNt et ARNr),
Chaque cellule contient un
• ces derniers étant
nombre de mitochondries
indispensables à la
(variable selon le type de
traduction intra-
cellule). La mitochondrie
mitochondriale des
contient son propre ADN
protéines.
différent de celui de la
cellule.
 ADN MITOCHONDRIAL (II)

• L'ADN mitochondrial est indépendant de celui du

noyau : réplication, transcription et traduction sont

indépendantes.

• L'ADN du noyau de la cellule code pour des protéines

intervenant dans la phosphorylation oxydative et des

protéines nécessaires aux fonctions et structures

mitochondriales.
• Il existe une inter-relation étroite entre ADN nucléaire et
mitochondrial.

• Cet ADN ne contient pas d'introns. Il est de transmission

maternelle.

• Ne recombine pas et présente un taux élevé de mutations.

• Chaque mitochondrie contient 2 à 10 copies de molécules

d'ADN, avec coexistence ou non de l'ADN muté et non
muté (on parle alors d'hétéroplasmie ou d'homoplasmie).
 Partie (II)
FONCTION DU GENOME
I/ REPLICATION
 REPLICATION
Elle correspond à la synthèse d’acide
désoxyribonucléique qui reproduit avec
précision le génome d’une cellule au
cours du cycle cellulaire afin de préparer
la division de cette cellule.
 REPLICATION

During replication, both strands of the DNA

double helix act as templates for the new
DNA strands. DNA is unraveled by the
enzyme helicase, resulting in the 3' strand
and the 5' strand. The 3' strands and the 5'
strands are both replicated by a DNA
polymerase enzyme but in different ways.
Au cours de la vie de la cellule (cycle
cellulaire), l’ADN doit être dédoublé

Chaque cellule fille reçoit un génome

complet dans son noyau
 I.1. Cycle cellulaire :

La réplication se
produit au cours de la
phase S du cycle
cellulaire grâce à
l’activité de la DNA
polymérase δ et α

D’autres DNA-polymérases :
- Réparation du DNA : DNA-polymérase β.
- Réplication du DNA mitochondrial : DNA-polymérase γ.
• La vie de la cellule se déroule entre deux mitoses. Chez
les mammifères, cette période dure en moyenne 30
heures.

• Durant cette période, la cellule traverse quatre phases :

Phase G1 :

- Génome diploïde (2n).

- La chromatine est
accessible aux ARN
polymérases qui
transcrivent les gènes en
ARNm.
Phase S : vers la moitié du cycle commence la réplication de l’ADN :
les ADN polymérases vont mettre environ 8 heures (phase S) pour
recopier en double l’ADN de chaque chromosome. Durant cette
phase la transcription est inhibée.

Phase G2 : En phase G2 chaque gène est représenté en quatre

exemplaires. La chromatine est à nouveau accessible aux ARN
polymérases qui recommencent à transcrire.

Phase M : enfin survient la mitose, qui donne naissance à deux

cellules filles. Chacune recevra une des copies identiques de l’ADN
de chaque chromosome.
I.2. Chromatine et ADN
• La chromatine est la forme sous laquelle se présente le DNA
dans le noyau. Elle représente la substance de base des
chromosomes eucaryotes correspondant à l'association de l'ADN,
d'ARN et de protéines (protéines histones et protéines non-
histones).

• Au cours des phases du cycle cellulaire les chromosomes

évoluent pour préparer les mitoses.

• Pendant la phase G1 la chromatine est décompactée et les

gènes peuvent s’exprimer. Chaque chromosome ne contient
qu’une chromatide.
• Pendant la phase S, les bulles de réplication s’ouvrent et la
réplication commence.

• Pendant la phase G2 les deux chromatides issues de la

réplication sont liés par leurs centromères : il y a deux
chromatides par chromosome.

• Pendant la mitose le centromère se lie au fuseau achromatique

et prépare la séparation. La chromatine est compactée au
maximum.

• Après la mitose, la chromatine est décompactée et les gènes

peuvent s’exprimer dans chacune des deux cellules filles.
I.3. ADN polymérase

• Les DNA polymérases agissent en phase S du cycle pour doubler

systématiquement l’ensemble du génome diploïde.

• D’autres DNA polymérases interviennent dans la synthèse des

amorces RNA/DNA, dans la réplication du génome mitochondrial
ou dans la réparation du DNA.

• Elles ne peuvent démarrer la condensation des nucléotides que

sur la fonction alcool en 3’ du ribose du dernier nucléotide d’une
amorce.
• Elles utilisent comme substrats des désoxyribonucléosides
triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des amorces de RNA et
de DNA synthétisées par une primase (RNA polymérase capable de
synthétiser un brin de RNA complémentaire d’un brin de DNA sur 10
nucléotides) suivie d’une DNA polymérase α (qui prolonge l’amorce
de RNA de 20 désoxyribonucléotides environ).

• Elles synthétisent le DNA nouveau par fragments. Après excision

des amorces, ces fragments sont liés entre eux par une DNA-ligase.

• Elles ont aussi une activité exonucléasique, qui leur permet en

particulier d’hydrolyser le dernier nucléotide en 3’ du brin synthétisé
si celui-ci ne s’apparie pas correctement avec le nucléotide
complémentaire du brin modèle.
• Les DNA polymérases ont à la fois une activité de polymérase pour
ajouter des nucléotides au nouveau brin de DNA, et une activité de
3’→5’ exonucléase pour hydrolyser le dernier nucléotide incorporé.

• Si le nucléotide incorporé est complémentaire du nucléotide du

brin modèle et donc que l’hybridation des bases se fait
normalement, l’activité de polymérase est plus rapide que celle
d’exonucléase et le nucléotide suivant va être incorporé.

• Si le nucléotide incorporé n’est pas complémentaire du nucléotide

du brin modèle et donc qu’il y a mésappariement, l’activité
d’exonucléase est plus rapide que celle de polymérase et ce
nucléotide sera hydrolysé.
I.4. Boucle de réplication
• Les DNA-polymérases commencent leur synthèse en de nombreux
points d’initiation. Suite à la liaison de protéines spécifiques, la
double hélice s’ouvre pour permettre le démarrage.

• La synthèse du DNA commence sur des amorces de RNA/DNA

constituées par la primase et la DNA polymérase a. L’amorce sera
constituée d’un brin mixte comprenant RNA (10 nt) et DNA (20 nt)
sur 30 nucléotides environ. Le dernier désoxyribonucléotide de
l’amorce, lié avec le brin de DNA qui sert de modèle, servira de point
d’initiation à l’activité de la DNA polymérase δ.

• La réplication se poursuit dans une direction : dans ce sens l’un

des deux brins du DNA (brin « direct ») est parcouru par l’enzyme
dans le sens 3’ → 5’ ce qui permet la synthèse d’un autre brin dans
le sens 5’ → 3’. Les DNA-ligases assurent ensuite la liaison entre les
différents fragments du DNA nouveau.
• La synthèse de l’autre brin (brin « retardé ») est plus complexe
parce que l’enzyme parcourt ce brin de 5’ → 3’. La primase et la DNA
polymérase α synthétisent des amorces de 30 nucléotides en avant
de la zone de réplication, et la DNA polymerase construit à la suite de
petits fragments de DNA dans le sens 5’ → 3’ (environ 200
nucléotides ; fragments d’Okazaki). Des ribonucléases détruisent les
amorces de RNA/DNA du fragment précédent et les fragments sont
ensuite reliés entre eux par la DNA-ligase.

• Il existe une dizaine d’isoenzymes de DNA polymérases :

- La DNA polymérase α (associée à la primase) est responsable de la

synthèse des amorces.
- La DNA polymérase δ est la principale enzyme de réplication.
- Autres DNA polymérases interviennent dans la synthèse du DNA
mitochondrial ou dans les processus de réparation du DNA
génomique.
I.5. Fourche de réplication
• La réplication commence par la séparation des deux brins du DNA
par l’hélicase. Chacun des deux brins est stabilisé par des protéines
SSB (single strand bound).

• Sur le brin direct, en remontant de 3’ vers 5’, une DNA polymérase

δ synthétise un brin complémentaire en ajoutant des dNTP à
l’extrémité 3’OH libre. Une nouvelle double hélice se forme entre le
brin modèle direct et le nouveau brin synthétisé.

• Sur le brin retardé, une DNA polymérase δ progresse de 5’ vers 3’.

Pour pouvoir synthétiser un brin complémentaire, il faut que la
primase et la DNA polymérase α fabriquent des amorces assez
rapprochées à quelques centaines de nucléotides de distance sur le
brin modèle au fur et à mesure que celui-ci est détaché du brin
direct.
• A partir de l’extrémité 3’OH d’une amorce (amorce 2 de l’image) la
DNA polymérase δ synthétise un fragment d’Okazaki jusqu’à ce
qu’elle rencontre l’extrémité 5’-triphosphate de l’amorce précédente
(amorce 1 sur l’image).

• Cette amorce est ensuite hydrolysée par une nucléase, ce qui

permet à la DNA polymérase δ d’achever la synthèse du fragment
d’Okazaki que la DNA ligase va lier définitivement avec le DNA du
fragment précédent. Une nouvelle double hélice se forme entre le
brin modèle et le nouveau brin synthétisé.
I.6. Réplication et cancérogenèse :

• L'instabilité génétique est une caractéristique importante des

cellules tumorales et se trouve associée au processus de
cancérogenèse chez l'homme.

• L’instabilité se produit, dans de nombreux cas, pendant la phase

S en affectant notamment le « réplisome » (la machinerie
enzymatique de la réplication) qui est soumis en principe à de
nombreux systèmes de contrôle.

• La réplication peut alors être dérégulée aboutissant à un

ralentissement, un arrêt temporaire ou un blocage complet du
réplisome.
• Les facteurs qui peuvent entraver l'avancement des fourches de
réplication peuvent être de différentes origines :

1) Structures secondaires de l'ADN;

2) Complexes DNA-protéine;
3) Modifications de la chromatine;
4) Lésions de l'ADN.

• Ceci peut engendrer des réarrangements chromosomiques

(translocations, inversions ou délétions) et contribuer aux stades
précoces de la cancérogenèse chez l’Homme.
 SYNTHÈSE
DES PROTÉINES
Représentation schématique des trois principales étapes impliquées
dans la synthèse protéique : transduction / transcription / traduction

Bellanti, Immunology IV
II/ MECANISMES DE LA
TRANSCRIPTION
 EXPRESSION D’UN GÈNE (II)
• L’expression d’un gène est une suite de synthèses
chimiques et de réactions aboutissant à la production d’un
acide ribonucléique ou d’une protéine.

• Dans un premier temps a lieu la synthèse d’un acide

ribonucléique, dont la séquence est complémentaire d’un des
deux brins du gène donc identique à celle de l’autre brin : c’est
la transcription.

• La séquence d’ARNm est « identique » à celle du brin sens

et orientée dans le même sens. Elle se construit de 5’ vers 3’
en complémentarité de celle qui est « lue » sur le brin
antisens.
 EXPRESSION D’UN GÈNE (III)
• Après des réactions de maturation, le transcrit primaire (ARN)
devient ARNm et sort du noyau vers le cytoplasme.

• Dans le second temps, l’ARNm est « lu » par groupe de trois

nucléotides (lettres) grâce à un ARN complémentaire qui porte
l’acide aminé correspondant.

• La « lecture » de l’ARNm se fait de 5’ vers 3’ et la synthèse

de la protéine se fait en même temps de l’extrémité NH2
terminale vers l’extrémité COOH terminale.

• Après des réactions de maturation, la protéine « mature » est

prête à remplir sa fonction dans la cellule.
 Notion Gène Protéine
❖ En 1957, Vernon M. Ingram a établi la relation précise

entre une mutation bien caractérisée dans une protéine

spécifique l’hémoglobine S (Hb S) : lien avec une

maladie héréditaire (l’anémie falciforme).

❖ L’Hb A (forme la plus commune) est composée de 4 sous unités, 2a et

2b.

L’Hb S, forme exprimée chez les sujets atteints est

également composée de quatre sous-unités mais diffère

de l ’Hb A notamment par sa mobilité électrophorétique.

 Notion Gène Protéine (II)
❖ Le séquençage protéique, a montré que l’Hb S diffère de

l ’Hb A par un seul aa, en position 6, dans les chaines ß-

globine.

❖ Ceci avait montré que la structure Iaire de toute protéine est

directement liée à une séquence d’ADN précise, un gène.

 Transcription
Information :dans le
noyau (forme ADN)
Synthèse des
protéines : dans le
. cytoplasme (au
niveau des
Noyau ribosomes du RE)
L'ADN ne sort pas
du noyau.
L'information passe
Cytoplasme au cytoplasme sous
forme d'une copie :
l'ARN :
Acide RiboNucléique
 Transcription (II)

ARN diffère de l'ADN :

• Sucre des nucléotides =
ribose
• Thymine (T) remplacée par
Uracyl (U)
(U peut s'apparier à A)
• Une seule chaîne de
nucléotides
• Molécules plus courtes et plus
instables que l'ADN
 Transcription (III)
La transcription est conduite par plusieurs enzymes :

❖ ARN polymérase I qui synthétise les RNA cytoplasmiques : RNA

ribosomiques (18 S - 5,8 S - 28 S).

❖ ARN polymérase II qui synthétise les RNA messagers qui

contiennent l’information destinée à la traduction et certains des
snRNA.

❖ ARN polymérase III qui synthétise les petits RNA (tRNA, rRNA
5 S, snRNA, 7SL RNA, une composante du « signal recognition
particle RNA »).
 TRANSCRIPTION

The transcription process begins when an enzyme called

RNA polymerase attaches to the template DNA strand and
begins to catalyze production of complementary RNA.
Polymerases are large enzymes composed of
approximately a dozen subunits, and when active on
DNA, they are also typically complexed with other factors.
In general, these factors signal which gene is to be
transcribed.
Brins sens et anti-sens
 Brins sens et anti-sens (II)

• Les gènes sont situés sur les deux brins du DNA, de gauche à droite
ou de droite à gauche, indifféremment. Ainsi les gènes des
apolipoprotéines A-I et C-III qui sont voisins sont orientés en sens
opposés. Le début du message (exon 1) est à gauche pour l’apoA-I et
à droite pour l’apoC-III. Le message codé doit être lu en commençant
par le début donc dans un sens différent pour ces deux gènes.

• Pour servir de modèle, la transcription doit faire la copie de la

séquence d’un brin d’ADN, qualifié de brin « sens » ; l’autre brin en
est le complémentaire, c’est l’ « antisens ». La transcription se fait en
synthétisant un ARN complémentaire de la séquence du brin antisens,
donc identique à celle du brin sens.
Eléments Cis et trans régulateurs
Eléments Cis et trans régulateurs (II)
• Les séquences de nucléotides du promoteur (facteurs cis-régulateurs)
sont reconnues par une classe de protéines spécifiques (facteurs trans
régulateurs) dont la structure permet une liaison avec l’ADN (DNA
binding proteins).

• Les facteurs trans-régulateurs ont des effets sur la vitesse de la

transcription, activateurs ou inhibiteurs. Leur liaison avec l’ADN
dépend le plus souvent de circonstances physiologiques qui induisent
ou répriment l’expression du gène.

• Il existe des éléments essentiels et présents dans la plupart des gènes :

— élément principal comme la boîte TATA.
— éléments de base comme l’octamère reconnu par le facteur OCT-1
présent dans presque toutes les cellules.
Eléments Cis et trans régulateurs (III)
• Il existe des éléments qui répondent à des facteurs dont la présence
dépend des signaux qui parviennent à la cellules, principalement les
hormones comme l’insuline ou les second messagers comme l’AMP
cyclique.

• Il y a encore des éléments spécifiques d’un type cellulaire

permettant l’expression différentielle des gènes dans chaque tissu.

• Ainsi, le promoteur de la lipoprotéine lipase contient la boîte TATA,

des éléments du promoteur de base, des éléments de réponse aux
hormones et des éléments d’expression tissulaire spécifique. Dans le
promoteur des gènes il y a souvent 20 ou 30 sites de fixation pour
des facteurs trans-régulateurs dont beaucoup ont un effet inducteur
ou répresseur sur l’expression du gène.
DNA binding proteins
 DNA binding proteins (II)
• Les protéines qui reconnaissent et se lient au DNA
(DNA binding proteins) sont des enzymes, des protéines
de structure, des facteurs de transcription et des éléments
trans-régulateurs.

• Dans la structure spatiale de ces protéines, on reconnaît

des domaines propres à cette liaison spécifique :

1) Le domaine hélice-boucle-hélice permet le lien

spécifique des hélices α avec les nucléotides sur une
longueur de 10 paires de bases environ.
 DNA binding proteins (III)
2) Les doigts de Zinc sont des domaines formés d’un ion
Zn++ tétracoordonné avec deux histidines (H) et deux
cystéines (C) de la protéine. Chaque doigt de Zinc se lie à
cinq nucléotides sur le DNA. Il y a souvent plusieurs
doigts de Zinc à la suite dans la même protéine.

3) Certaines protéines ont un domaine riche en acides

aminés basiques (K, R) qui se lie aux phosphates des
nucléotides. Ces protéines se lient à des séquences répétées
inverses sur le DNA, lorsqu’elles sont associées en dimères
par la liaison hydrophobe de deux domaines riches en
leucine (fermeture « Eclair » à leucines).
Régulation de l’ARN polymérase
Régulation de l’ARN polymérase (II)
• Les activateurs ou inhibiteurs de la transcription (facteurs trans-
régulateurs) sont des protéines produites par d’autres gènes qui
interviennent pour activer ou inhiber l’ARN polymérase II et par
suite induire ou réprimer l’expression du gène à transcrire.

• Ces facteurs trans-régulateurs se lient au DNA (DNA binding

proteins) dans la région du gène située en amont de la partie
transcrite. Les sites de fixation de ces facteurs trans-régulateurs
sur le DNA sont des séquences spécifiques appelées éléments cis-
régulateurs.

• Le couple élément cis-régulateur plus facteur trans-régulateur lié

entre en contact avec le complexe d’initiation de l’ARN polymérase
par l’intermédiaire d’un ensemble de protéines appelé médiateur.
Régulation de l’ARN polymérase (III)

• La RNA polymérase peut donc démarrer la transcription

lorsqu’elle est activée par les facteurs de transcription dont
certains sont liés à ces éléments comme les boîtes TATA ou
CAAT et lorsque par l’intermédiaire du médiateur elle
reçoit un signal d’activation. Ce signal dépend de la
présence d’un facteur trans-régulateur lié à un autre
élément du promoteur. La liaison du régulateur et du
médiateur nécessite un repliement de l’ADN du promoteur.
Elongation de la transcription
 Elongation de la transcription (II)
• Chaque nucléoside triphosphate est choisi spécifiquement pour être
complémentaire de la base du brin antisens qui va lui faire face. La
liaison riche en énergie entre le premier phosphate estérifiant le carbone
5’ du ribose et les deux autres phosphates est hydrolysée, libérant un
pyrophosphate qui sera hydrolysé ensuite par une pyrophosphatase. Le
phosphate restant est lié par une liaison ester au carbone 3’ libre du
dernier nucléotide du transcrit en cours de synthèse.

• L’ARN polymérase construit un ARN hybridé avec le brin antisens du

DNA, dont la séquence primaire est la « copie » du brin sens mais
composée de ribonucléotides au lieu de désoxyribonucléotides
et d’uraciles à la place de thymines.
 Elongation de la transcription (III)

• Au cours de cette élongation l’ARN polymérase II est accompagné

d’une série de facteurs d’élongation qui modifient la chromatine pour
permettre l’avancée de l’enzyme, empêchent la formation d’obstacles
comme des épingles à cheveux ou facilitent l’avancée de la
polycondensation.
Elongation de la transcription (IV)
 Elongation de la transcription (V)

• La transcription commence au point d’initiation par l’hybridation et

la condensation des premiers ribonucléotides du transcrit primaire
(futur mRNA).

• La double hélice est ouverte en une boucle où se place la RNA

polymérase II.

• Le transcrit primaire reste hybridé sur quelques nucléotides avec le

brin antisens puis s’en détache pour permettre à la double hélice de se
reformer après le passage de la polymérase. L’extrémité 5’ du
transcrit primaire libérée se condense en diverses structures
secondaires (épingles à cheveux).
 Elongation de la transcription (VI)

• Les substrats de la RNA polymérase sont les quatre ribonucléosides

triphosphates.

• La polymérase lit le brin antisens en allant dans le sens 3’ → 5’. Elle

poursuit la synthèse du transcrit primaire en condensant les
ribonucléotides jusqu’à ce qu’elle rencontre les signaux de
terminaison.

• A la rencontre des signaux de terminaison, la polymérase se détache

de l’ADN, libère le transcrit primaire et la double hélice se referme.
 Fin de la transcription

❖ La transcription du gène de l’apoA-II par exemple se poursuit

durant 1329 nucléotides.

❖ Vers la fin du gène, des facteurs liés à l’ARN polymérase

reconnaissent sur le brin antisens une séquence 3’-TTATTT-5’ (suivie
dans la plupart des gènes d’un autre signal 3’-ATACAAAC-5’) qui
libèrent l’ARN polymérase. La transcription s’arrête en effet peu
après le premier signal.

❖ L’ARN polymérase libère ainsi l’ADN et le transcrit primaire.

Modifications du transcrit
 Coiffe d’un messager

L'addition d'une coiffe en 5‘ de l’ARN a lieu

dès le début de la transcription avant même
que la chaîne ne compte plus de 30
nucléotides. Elle consiste en l’insertion d'un
nucléotide à guanine sur l'extrémité 5' de
l'ARN suivi de sa méthylation sur l'azote 7 de
la base, ainsi que de la méthylation en 2' du
ribose des un ou deux premiers nucléotides du
transcrit primaire.
 Coiffe d’un messager (II)

Résultat de cette modification : L'extrémité 5' de l'ARN n'est pas

porteuse des trois acides phosphoriques libres habituels, mais d'un
GMP, ce qui limite la réactivité de cette extrémité et sa
reconnaissance par les exonucléases : protection contre la
dégradation. Cet action sert de coiffe protectrice à l'extrémité 5' de
l'ARNm. Elle est également nécessaire à l'exportation de l'ARNm
vers le cytoplasme et à la liaison de ce dernier avec la petite sous-
unité du ribosome lors de l'étape d'initiation de la traduction.
 Coiffe d’un messager (III)

Chapeau ou Cap ou Coiffe :

Enzymes impliqués : Guanylyl transférase, ajoute un nucléotide à

guanine sur les phosphates du Carbone 5’ du premier nucléotide du
transcrit.
La méthylase assure le transfert d’un méthyle sur ce nucléotide. Ces
modifications font un début commun à tous les transcrits primaires.
 Queue polyA

Queue poly A : une enzyme coupe le transcrit environ 10 à 20

nucléotides au delà de la séquence AAUAAA et synthétise sur le
Carbone 3’ libre du dernier nucléotide du transcrit restant une longue
chaîne de 500 à 2000 nucléotides à Adénine polycondensés.
 Rôle du « Cap » et du Poly A

• Les ARNm sont détruits par des ribonucléases dans le cytoplasme.

Leur hydrolyse libère des nucléotides qui seront réemployés à la
synthèse de nouveaux acides nucléiques.

• Pour protéger les RNA messagers de ce catabolisme, une structure

particulière dissimule l’extrémité 5’ terminale de ces RNA aux
exonucléases spécifiques de cette partie d’ARN. Cette
structure est appelée coiffe du messager (cap).

• La queue polyA assure également un rôle de protection contre les

ribonucléases. Elle est aussi indispensable à la maturation de
l’ARNm qui la porte.
 Edition / Excision - épissage

❖ Edition : Des enzymes peuvent « éditer » (au sens anglais du

terme) la structure primaire du transcrit en modifiant certaines
bases (exemple : C→U par une cytosine désaminase spécifique).

❖ Excision - épissage : les parties non codantes de la structure

primaire du transcrit sont coupées et les parties codantes
réassemblées.
Excision - Epissage
 Excision – Epissage (II)
• Les introns, parties non codantes des gènes des eucaryotes, sont
coupés (excision) de la structure primaire des ARN au cours de la
maturation des messagers.

• Les exons, parties codantes, sont ensuite liés entre eux bout à bout
(épissage), pour établir la séquence primaire de l’ARNm.

• L’excision et l’épissage représentent donc l’action d’enzymes et de

ribozymes qui catalysent la coupure d’ARN (endoribonucléase) et la
fermeture de la brèche (RNA ligase).

• L’épissage peut être alternatif, c’est à dire peut conduire à plusieurs

structures d’ARNm : les ARNm alternatifs ont chacun en propre
certains exons ainsi que des exons en commun.
Excision – Epissage (III)
 Excision – Epissage (IV)
• L’excision des introns et l’épissage des exons est l’étape la plus
importante de la maturation du transcrit.

• Elle fait appel à des facteurs spécifiques : ribonucléoprotéines

contenant des petits RNA (snRNP), ribozymes (ARN ayant des
propriétés catalytiques), enzymes spécifiques (maturases)...

• La structure secondaire du transcrit met en contact trois séquences

de l’intron : la séquence du début de l’intron (extrémité 5’ ou site
donneur), la séquence de la fin de l’intron (extrémité 3’
ou site accepteur) et un nucléotide à adénine (A du branchement)
environ 40 nucléotides avant le site accepteur d’épissage.

• L’intron, libéré sous forme de lasso, est détruit par des nucléases.
Le transcrit perd successivement tous ses introns et les exons épissés
constituent la séquence codante du messager.
 Excision – Epissage (V)

N.B. Environ 20% des maladies génétiques seraient

dues à des erreurs d'épissage.
 Excision – Epissage (VI)
Remarques :

- Au moins 70% des quelques 25 000 gènes du génome

humain subiraient un épissage alternatif. Chacun de ces
gènes donnerait 4 variants. Ceci aboutirait à environ 100 000
protéines différentes.

- Le lasso de l’épissage ne comprend pas toujours un seul

intron. Le lasso formé peut comprendre (pour les gènes ayant
plusieurs exons) 2 introns et 1 exon au lieu d'un seul intron.
On assistera alors à des exons non représentés dans l'ARNm
mature, et donc absents dans la protéine correspondante.
Epissages alternatifs
 Epissages alternatifs (II)

• Du fait de la présence de protéines régulatrices sur le transcrit

primaire, l’épissage peut quelque fois se faire de façon différente
d’une cellule à l’autre.

• Il est possible de garder alternativement soit l’exon 3 soit l’exon 4

du gène de la troponine T (exemple n°2). Si l’exon 3 est conservé on
obtient l’α-troponine T et si l’exon 4 est conservé on obtient la β-
troponine T.
 Epissages alternatifs (III)

• Il est aussi possible (exemple n°1) de faire dépendre l’expression

d’un gène de deux promoteurs différents, répondant à des
régulations différentes. Chacun de ces promoteurs est lié à un exon
1 ou 1bis qui seront épissés alternativement avec la suite du
transcrit.

• On peut encore (exemple n°3) avoir plusieurs exons à la fin du

gène contenant des codons stop en phase. Dans ce cas l’épissage
alternatif donnera des protéines de longueurs différentes.
Régulation de l’expression
 Régulation de l’expression (II)

• La régulation de toute voie métabolique se fait principalement à la

première réaction pour ne pas synthétiser d’intermédiaires inutiles.

• Pour l’expression d’un gène, la régulation a lieu à quatre niveaux :

1. lors de la transcription
2. lors de la maturation du transcrit
3. lors de la traduction
4. lors de l’activation de la protéine mature.

• Le point de contrôle principal est la transcription : l’ARN

polymérase est l’enzyme-clé de l’expression d’un gène.
Hybridation ARNm épissé - ADN génomique
du gène correspondant :
III/ MECANISMES DE LA
TRADUCTION
Représentation schématique des trois principales étapes impliquées
dans la synthèse protéique : transduction / transcription / traduction

Bellanti, Immunology IV
 TRANSLATION

The process of translation describes how the

genetic code is used to make amino acid chains.
Here, we will explore the mechanisms involved in
polypeptide synthesis. We will learn about the
three major steps of translation as we study how
tRNA, mRNA, and ribosomes go to work.
 TRADUCTION (II)
Synthèse des protéines (assemblage des acides aminés)
se fait au niveau des ribosomes
TRADUCTION (III)
 CODE GENETIQUE
❖ Le « langage » nucléique s’écrit avec 4 lettres.

❖ Le « langage » protéique s’écrit avec 20 termes

correspondant aux 20 acides aminés.

❖ Si une lettre nucléique se traduisait par un acide aminé, il

ne pourrait y avoir que 4 acides aminés.

❖ En groupant les lettres nucléiques en « mots » de 2 lettres

on pourrait avoir 16 mots, mais cela ne permettrait de coder
que 16 acides aminés.
 CODE GENETIQUE (II)
❖ En groupant les lettres nucléiques en « mots » de 3
lettres on peut avoir 64 mots, ce qui permet d’exprimer les
20 acides aminés et des ponctuations.

❖ Le code génétique est donc fondé sur des mots de trois

lettres : les codons.

❖ Il y a plus de codons dans le code génétique que d’acides

aminés, il y aura donc plusieurs codons traduits par le
même acide aminé (homonymes). Ces homonymes
représentent une perte d’information entre le langage
nucléique (64 signifiants) et le langage protéique (20
signifiants), on dit alors que le code génétique est dégénéré.
CODE DEGENERE :

❖ En écrivant le code génétique dans l’autre sens, de

l’acide aminé vers les codons, on montre que beaucoup
d’acides aminés ont des codons homonymes.

❖ Certains ont six codons différents, d’autres quatre, trois

ou deux.
CODE GENETIQUE (III)
 CODE GENETIQUE (IV)
❖ La séquence codante est une suite de codons dont chacun
permet d’incorporer spécifiquement un acide aminé dans la
synthèse d’une protéine.
❖ Le code génétique est le même pour tous les êtres vivants,
on dit qu’il est universel. Il existe quelques variations
(codons propres à la biosynthèse des protéines dans les
mitochondries).

❖ Cette caractéristique permet le transfert de gènes

d'une espèce à l'autre = génie génétique.
❖ Introduction de gènes dans une bactérie.
❖ Introduction de gènes dans un organisme
pluricellulaire.
CODON
Pour synthétiser la protéine, il faut :

❖ ARNm = information (la recette)

❖Ribosome = machine à assembler les acides aminés

❖Acides aminés = pièces de construction

❖ARNt (ARN de transfert) = molécules qui

transportent les acides aminés du cytoplasme au
ribosome où ils sont assemblés en protéine.
 RIBOSOME
❖ Les ribosomes du cytoplasme des cellules eucaryotes sont des
complexes multienzymatiques qui associent 82 protéines et 4 ARN.
Ces molécules sont associées entre elles pour former deux particules
distinctes : la sous-unité 60S (Large = 2800000 daltons) et la sous-
unité 40S (Small = 1400000 daltons) qui peuvent se dissocier
facilement.

❖ Ces molécules ont des sites de fixation pour la séquence de

l’ARNm, pour les ARNt qui portent l’acide aminé à incorporer (site A)
et le peptide en cours de synthèse (site P), un site catalytique pour
former les liaisons peptidiques, des sites de fixation pour les cofacteurs
protéiques de l’initiation (eIF2, eIF3), de l’élongation et de la
terminaison et des sites de régulation.
RIBOSOME (II)
Polyribosome
 Polyribosome (II)
❖ Sur le même messager plusieurs ribosomes effectuent la traduction
de la même protéine les uns après les autres : le tout constitue un
polyribosome.

❖ L’initiation est un phénomène permanent à l’extrémité 5’ d’un

ARNm et les ribosomes se succèdent sur le messager à raison d’un
tous les 100 nucléotides environ.

❖ A l’extrémité 3’, en arrivant au codon de terminaison, les sous-

particules du ribosome se séparent et libèrent la protéine synthétisée.

❖ Les polyribosomes présentent un aspect différent selon la

régulation des différentes étapes de la traduction. Ex. plus l’initiation
est active plus les ribosomes sont nombreux sur le messager.
Initiation de la traduction
 Initiation de la traduction (II)
❖ L’initiation de la traduction est l’étape limitante de la traduction.

❖ Les sous-unités des ribosomes sont dissociées dans le cytoplasme.

Une cascade d’événements va former un complexe d’initiation.

❖ Au repos, le facteur eIF2 (eucaryotic initiation factor 2) est

porteur d’un GDP. En présence du facteur eIF2B, un nouveau GTP
est substitué à ce GDP. Le facteur eIF2 ainsi activé, peut alors lier le
tRNA chargé d’une méthionine. En présence du cofacteur eIF4C, la
petite sous-unité va fixer le facteur eIF3 et le facteur eIF2 activé qui
porte le tRNA chargé de la méthionine initiale. L’énergie de la
formation de ce complexe a été fournie par l’hydrolyse de la liaison
riche en énergie du GTP porté par le facteur eIF2.
 Initiation de la traduction (III)
❖ La séquence 5’ non traduite de l’ARNm est reconnue par les
cofacteurs eIF4A, eIF4B et eIF4F qui s’y fixent. Grâce à l’hydrolyse
d’un ATP pour fournir l’énergie, le messager est alors transféré sur
la petite sous-unité, en regard du site P, de façon à hybrider les
nucléotides du codon d’initiation avec ceux de l’anticodon de
l’ARNt de la méthionine initiale.

❖ En présence du dernier cofacteur eIF5, le complexe va se lier à

une grande sous-unité pour constituer un ribosome fonctionnel. Les
cofacteurs d’initiation sont libérés et la traduction commence. Le
cofacteur eIF2 toujours porteur de son GDP, se libère pour
recommencer un nouveau cycle d’initiation.
Cadre de lecture
 Cadre de lecture (II)
• Le positionnement du messager par rapport à l’ARNt de la
méthionine initiale détermine le cadre de lecture de la traduction du
messager.

• L’ARNt de la méthionine occupe un des deux sites de fixation des

ARNt sur le ribosome : site P (ou peptidique, car il contiendra le
peptide en cours de synthèse). Le codon AUG du messager, en
s’hybridant dans le site P avec l’anticodon CAU de l’ARNt de la
méthionine, place le messager de telle sorte que le codon suivant
(N1N2N3) apparaisse dans l’autre site de fixation : site A (ou acide
aminé, car il servira à la fixation des nouveaux acides aminés
incorporés).

• Le nucléotide N1 sera toujours le premier de chaque codon.

Elongation de la traduction
 Elongation de la traduction (II)
❖ Les ribosomes initiés ont leur site A vacant. Le facteur d’élongation
eEF1B catalyse l’échange du GDP par un GTP sur le facteur eEF1A.
Celui-ci, activé, va recevoir un ARNt chargé qu’il viendra fixer sur ce
site A, en hydrolysant le GTP en GDP. Ensuite, le facteur eEF1A est
libéré avec son GDP.

❖ Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situé sur l’ARNt

du site P sur l’acide aminé de l’ARNt du site A. Il utilise pour cela,
l’énergie de l’hydrolyse de la liaison riche en énergie entre le peptide
et l’ARNt du site P.

❖ Enfin, grâce au facteur eEF2 et à l’hydrolyse d’un autre GTP,

l’ARNt du site P est libéré. L’ARNm, l’ARNt restant et le peptide en
cours de synthèse sont alors déplacés (translocation) du site A vers le
site P, sans qu’il y ait de séparation entre le codon et l’anticodon.

❖ Le site A est à nouveau libre pour recevoir l’ARNt de l’aa suivant.

Translocation des codons
 Translocation des codons (II)
❖ L’ARNt libre du site P quitte le ribosome.

❖ L’ARNm, l’ARNt restant et le peptide en cours de synthèse sont

alors déplacés (translocation) du site A vers le site P.
Terminaison de la traduction
 Terminaison de la traduction (II)

❖ Lorsque le site A se trouve en regard d’un codon stop annonçant

la fin de la traduction, le complexe va se dissocier de l’ARNm en
présence d’un dernier cofacteur eRF.

❖ Les deux sous-unités du ribosome se dissocient, la protéine

synthétisée est libérée, ainsi que le dernier ARNt.
Signal-peptide
 Signal-peptide (II)
• Lorsqu’une protéine est synthétisée, sa structure secondaire ou
tertiaire se construit au fur et à mesure de la traduction et elle est
libérée dans le cytoplasme.

• Lorsque cette protéine est destinée à être incorporée dans les

membranes ou les organites de la cellule, la partie codante de l’ARNm
commence par une séquence de quelques acides aminés qui sert
d’adresse pour l’incorporation de cette protéine dans la membrane.

• Ces peptides orientent la destinée de la protéine : incorporation dans

les membranes (reticulum endoplasmique, appareil de Golgi,
membrane plasmique, lysosomes...), entrée dans les mitochondries,
excrétion hors de la cellule via l’appareil de Golgi, etc...

• Le signal-peptide est un peptide d’adressage situé à l’extrémité NH2-

terminale des protéines concernées.
Modifications post-traductionnelles
Modifications post-traductionnelles (II)
• Protéolyse : Hydrolyse d'une protéine « en morceaux » sous l'action
d'une enzyme.

• Glycosylation : Un processus biochimique dans lequel un

glucide est ajouté à une protéique. On distingue la N-glycosylation et
la O-glycosylation. La N-glycosylation a lieu dans la lumière du
réticulum endoplasmique. Un oligosaccharide est transféré d'un
dolichol (un terpénoïde) au groupement NH d’une asparagine de la
protéine, transfert catalysé par une oligosaccharyl transférase. La O-
glycosylation a lieu dans l'appareil de Golgi. Les glucides sont ajoutés
sur le groupement OH d'une thréonine ou d’une sérine. Le transfert
est catalysé par une glycosyltransférase.

• Acylation : Addition d’un groupement acyle transféré depuis un

agent acylant. Ceci correspond à la formation d’une liaison covalente
entre un acide gras et un acide aminé d’une chaîne peptidique.
Modifications post-traductionnelles (III)
• Hydroxylation : Addition d’un ou des groupement(s) hydroxyle (-
OH) à une protéine. Les acides aminés hydroxylés sont la proline (qui
devient hydroxyproline), la lysine (qui devient hydroxylysine), en plus
de l'acide aspartique.

• Méthylation : Addition d’un ou plusieurs groupement(s) méthyle (-

CH3). Exemples de protéines méthylées : la calmoduline, la myosine,
l'actine, la calcineurine. Les acides aminés méthylés sont : l'histidine,
l'alanine, la lysine, la méthionine, l'asparagine, l'acide aspartique ou
glutamique, l'arginine et les groupes NH2 et COOH terminaux.
La méthylation est impliquée dans des processus biologiques tels que :
les interactions protéine-protéine, la localisation cellulaire, la
transduction du signal, la régulation de la transcription des gènes via la
modification des protéines histones.
Modifications post-traductionnelles (IV)
• Carboxylation : Addition d’un groupement carboxylique (-COO-)
Les acides aminés modifiés sont :
- la lysine (exemple : la β-lactamase)
- l'acide aspartique (exemple : le facteur de coagulation IX)
l'acide glutamique (exemple : la γ-glutamyl carboxylase)

• Désamination : Consiste en l’élimination d'un groupement amine

(NH2) d’un acide aminé d’une protéine.

• Phosphorylation : Addition d’un groupement phosphate : rôle

majeur dans le processus de la transduction du signal.

• Liaison d’un cofacteur : Un composé chimique non protéique ou

un ion métallique nécessaire à l'activité biologique d'une protéine.
Modifications post-traductionnelles (V)

• Blocage des extrémités : L'extrémité N-terminale de quelques

protéines est parfois notée « pyro-glu ». Il s’agit de l’acide
pyroglutamique, issu de la cyclisation (formation d’un cycle
d’atome) du résidu d’acide glutamique.
Modifications post-traductionnelles (VI)
❖ Ces modifications chimiques se produisent après l’incorporation
des acides aminés dans la structure primaire de la protéine
(traduction) ; on les appelle modifications post-traductionnelles.

❖ On distingue des modifications co-traductionnelles qui se

produisent alors que la traduction se poursuit encore et que le
peptide naissant est encore attaché au ribosome qui l’a construit,
des modifications post-traductionnelles proprement dites qui ont
lieu dans la cellule, dans les organites ou hors de la cellule.

❖ On appelle protéine mature la forme chimique définitive que la

protéine montrera au moment où elle remplira sa fonction dans
l’organisme.
III/ EVÉNEMENTS GÉNÉTIQUES
ET PATHOLOGIES
• la transmission du message génétique de cellule à cellule,
d’individu à individu se fait avec des modifications
notamment ponctuelles de la structure primaire de l’ADN,
qui sont transmises héréditairement si elles sont
compatibles avec la reproduction.

• Plusieurs de ces événements génétiques pourraient

engendrer des pathologies humaines. On note l’exemple de
mutations ponctuelles, délétions (avec ou sans décalage du
cadre de lecture), épissage défectueux, répétitions de
triplet.
Ces modifications sont de trois types :

- Substitution : remplacement d’un nucléotide par un autre.

- Délétion : suppression d’un ou de plusieurs nucléotides
- Insertion : addition d’un ou de plusieurs nucléotides.

• Les substitutions de purine à purine ou de pyrimidine à pyrimidine

sont nommées « transitions ». Ce sont les modifications les plus
fréquentes :
A → G, C → T, G → A et T → C

• Les autres substitutions sont des transversions :

A → C, A → T, C → A, C → G, G → C, G → T, T → A et T → G
 Modification somatique et germinale :

• Lorsqu’une mutation se produit au niveau d’une cellule

somatique, les cellules issues de cette cellule mutée forment un
clone de cellules mutées qui présente des caractères différents de
ceux du tissu d’origine. De tels clones constituent souvent des
tumeurs cancéreuses. Ces mutations somatiques ne sont pas
transmises à la descendance.

• Lorsque la mutation se produit au niveau de la cellule germinale,

cette mutation sera transmise par les gamètes et apparaîtra dans la
descendance : la mutation est alors héréditaire.
 Substitution Faux-sens, non-sens
• Selon sa position par rapport au cadre de lecture, une
substitution peut aboutir à des résultats très différents après la
traduction.

• Une substitution dans un codon peut engendrer le même acide

aminé : on dit qu’elle est synonyme. Il n’y aura pas de modification
de l’acide aminé traduit.

• Elle peut engendrer un acide aminé différent : on dit qu’elle est

faux-sens. Elle sera d’autant plus délétère pour les fonctions de la
protéine que le nouvel acide aminé sera différent de celui qui
aurait du être traduit.

• Elle peut engendrer un codon de terminaison : on dit qu’elle est

non-sens. La protéine traduite sera tronquée.
Substitution Faux-sens, non-sens (II)
 Marqueur génétique
- Correspond à une modification structurale de l’ADN qui est
statistiquement liée à un caractère héréditaire sans en être la cause.

- La recherche diagnostique d’un tel marqueur (polymorphisme de

fragments de restriction, amplification d’une séquence répétitive,
etc...) permet de conclure à la probabilité de l’existence d’un
caractère lié statistiquement à ce marqueur : mutation inconnue ou
pathologie dont l’origine génétique n’est pas expliquée.

- Le diagnostic de la présence d’un marqueur génétique chez un

sujet n’est habituellement pas une certitude de la survenue de la
pathologie liée à ce marqueur. On parle alors de facteur de risque.
 MUTATIONS ET PATHOLOGIES
1) Substitution : Ex. Mutation Arg 3500 → Gln de
l’apolipoprotéine B-100
 1) Substitution : Ex. Mutation Arg 3500 → Gln de
l’apolipoprotéine B-100 (II)

• La mutation 3500 de l’apolipoprotéine B-100 résulte d’une

substitution G→A non synonyme, qui à la traduction code pour le
3500e acide aminé de l’apoB-100, Glutamine au lieu d’Arginine.

• La présence de cette mutation, retrouvée en France chez une

personne sur 500, est un facteur de risque vis-à-vis de l’athérome
(dépôt de différents éléments; graisse, sang, tissu fibreux, dépôt
calcaire; sur une partie de la paroi interne d'une artère), et des
maladies cardio-vasculaires, parce qu’elle perturbe la liaison de
l’apolipoprotéine B-100 avec le récepteur cellulaire des
lipoprotéines de basse densité (LDL).
2) Délétion :

Les délétions représenteraient une importance variable selon leur

longueur :

- Des délétions de 1 ou 2 nucléotides : Décalent le cadre de lecture

(codons).

- Des délétions de 3 nucléotides : Aboutissent à la suppression d’un

acide aminé dans la protéine exprimée.

- Des délétions de grande longueur : Peuvent supprimer

l’expression d’un ou de plusieurs exons, voire d’un gène entier.
2) Délétion (II) :
2) Délétion (III):
- Le cadre de lecture, déterminé une fois pour toute la traduction,
est essentiel à la synthèse exacte d’une protéine donnée.

- Une délétion (*), emportant le premier nucléotide du codon 59

décale d’une lettre le cadre de lecture et aboutit à la synthèse de 5
acides aminés faux, suivis d’un codon Stop. La protéine
produite est tronquée (63 aa au lieu de 77).

- De même si l’on retire les deux premiers nucléotides (**) du

codon 59 on aboutit, encore une fois, à une protéine tronquée (60
aa au lieu de 77). Dans les deux cas, on parle d’un « décalage du
cadre de lecture ».

- Si l’on retirerait trois nucléotides, il y aurait un aa inexact mais le

cadre de lecture resterait le même et la traduction se poursuivrait
normalement avec un acide aminé en moins (76 aa).
2) Délétion (IV): Ex. Phe 508 de CFTR :
2) Délétion (V): Ex. Phe 508 de CFTR :

• La mutation ΔPhe508 du gène CFTR (cystic fibrosis

transmembrane conductance regulator) résulte d’une délétion qui
fait disparaître les nucléotides 1653 à 1655 de l’ARNm (CUU).

• Le gène CFTR code pour un transporteur d’anions (chlore) qui

régule les transsudations à travers les épithéliums et la peau.

• La délétion n’entraîne pas de décalage du cadre de lecture. La

seule conséquence est l’absence de l’aa 508 (phénylalanine). Ceci
suffit pour assister à une inhibition de l’activité du transporteur.

• La présence de cette délétion est une des causes les plus

fréquentes de la mucoviscidose (cystic fibrosis).
2) Délétion : Ex. de la délétion de l’exon 9 de la lipoprotéine-lipase
2) Délétion : Ex. de la délétion de l’exon 9 de la lipoprotéine-lipase (II)

• Une délétion large entraîne souvent l’inactivation du gène. Dans le

cas présent la délétion s’étend depuis l’intron 8 jusqu’à l’intron 9 du
gène de la lipoprotéine lipase, et par conséquent supprime la
totalité de l’exon 9 de ce gène.

• On constate chez un sujet porteur de cette délétion sur ses deux

chromosomes 8 (homozygote), une absence d’expression du gène et
par conséquent, l’absence de la lipoprotéine lipase « la forme
protéine », ainsi que son activité enzymatique dans le plasma
sanguin.
3) Insertion :

Les insertions sont d’une importance variable selon leur longueur :

- L’insertion de 1 ou 2 nucléotides : décale le cadre de lecture

(codons).

- L’insertion de 3 nucléotides : aboutit à l’addition d’un acide aminé

dans la protéine en question.

- L’insertion de grande longueur : peut modifier complètement la

traduction des exons.

- dans les introns ou dans les exons non-traduits, on rencontre

souvent de longues insertions de structures variables qui sont sans
effet apparent sur l’expression du gène.
Cytogénétique
I – Introduction

II – Cytogénétique conventionnelle

III – Cytogénétique moléculaire

IV – Applications : Détection de translocations

chromosomiques
 I – Introduction
Génétique

❖ Etude de la transmission des caractères héréditaires

• Génétique formelle, classique (1866, Gregor Mendel)
- Transmission de caractères
- Récessivité, dominance, codominance

❖ Support de l’information héréditaire

• Rôle du chromosomes dans l’hérédité (1915, Thomas
Morgan)
• Structure de l’ADN (1953, Watson et Crick)
 Génétique

❖ Etude des pathologies génétiques chez l’Homme :

Génétique Médicale (1940-50, Victor McKusick et autres)

Génération du zygote à 46 chromosomes

Gènes paternels Gènes maternels

23 chromosomes 23 chromosomes
n ADN n ADN

Fécondation
Zygote 46 chromosomes
2n ADN

Couples de gènes Fonctions cellulaires

 Classification des maladies génétiques

– Anomalies chromosomiques
• Excès ou défaut de gènes, non mutés, contenus dans 1
chromosome ou 1 segment chromosomique
• Environ 0,7 % des naissances
– Maladies monogéniques
• Mutation d’un gène ou de ses séquences régulatrices
• Gène nucléaire ou mitochondrial
• Environ 1% des naissances
– Maladies à composante génétique
• Maladie à gène majeur de susceptibilité (BRCA1,2,…) : 15%
des naissances
• Maladies multifactorielles (maladies auto-immunes,…)
 Génétique Médicale

❖ Étude des variations et de la transmission des traits chez

l’Homme en rapport avec la pathologie.

❖ Domaines « classiques » :
• Génétique clinique => phénotype => Examen clinique

• Cytogénétique => chromosomes => caryotype

• Génétique moléculaire => ADN / génotype => PCR, …

 Génétique Médicale

❖ Nouveaux domaines :
• Cytogénétique moléculaire :

=> anomalies submicroscopiques des chromosomes

=> FISH; CGH-array / puce à ADN

• Épigénétique :

=> modification de l’expression des gènes sans

modification de la séquence de l’ADN (conformation
de la chromatine et accessibilité à l’ADN)

=> méthodes de génétique moléculaire

 Chromatine et Chromosome
❖ Le noyau des cellules en interphase contient le matériel
génétique : chromatine = ADN + nucléoprotéines.

❖ Compaction de la chromatine pendant la mitose donnant de fins

bâtonnets visibles en microscopie optique : chromosomes.

❖ Chromosomes : structures microscopiques issues de la

spiralisation de la chromatine pendant la mitose. Ils sont constitués
de molécules d’ADN, de protéines histones et non-histones.
 Chromatine et Chromosome (II)

Le nucléosome est l’unité de

base de la chromatine. C’est le
premier niveau de compaction
de l’ADN.
Il contrôle l’accessibilité du
double brin d’ADN : donc
implication dans la régulation
de plusieurs processus
nucléaires : transcription,
réplication ou réparation d’ADN.
 Chromosomes - Gènes - nucléotides

Cytogénétique = supragénique

>>> Maladies chromosomiques

Génétique moléculaire = intragénique

>>> Maladies géniques

 Cytogénétique
(définition)

❖ La Cytogénétique une science qui étudie les chromosomes

et leurs anomalies.

❖ Elle a pour objet l’étude de la structure et du

fonctionnement normal et pathologique des chromosomes
(condensation, recombinaison, réparation, ségrégation,
transmission) et de la chromatine (organisation et rôle dans la
régulation de l'expression des gènes).
 Cytogénétique médicale

Elle a pour but de détecter les anomalies chromosomiques

constitutionnelles ou acquises grâce à des techniques
microscopiques ou de biologie moléculaire afin d’établir un
diagnostic biologique et d’assurer un conseil génétique.

Ces anomalies peuvent être de nombre (plus ou moins de 46

chromosomes), de structure (modification dans la succession de
plusieurs locus) ou de réparation (cassures chromosomiques).
 Cytogénétique
(types)

❖ Cytogénétique constitutionnelle : étude de la constitution

d’un individu avant (prénatal) ou après (postnatal) la naissance.

❖ Cytogénétique acquise : étude des anomalies

chromosomiques acquises (ex. cellules cancéreuses).
 Cytogénétique constitutionnelle

Anomalie du génome

Retard mental, anomalies du développement, …

Cytogénétique constitutionnelle pré/postnatale

 Cytogénétique acquise

Anomalies acquises du génome

(Cas de cancers)

Hémopathies malignes Tumeurs solides

Diagnostic ?

Pronostic ?
II- Cytogénétique conventionnelle :
– Etude morphologique des chromosomes au
microscope optique.
– Après traitement chimique ou enzymatique.
II- Caryotype : Techniques conventionnelles.

❖ Le caryotype permet l'observation et la classification des

chromosomes présents au cours de la métaphase de la mitose.

❖ La résolution de la cytogénétique classique est celle de la

microscopie photonique et ne dépasse pas environ 5 Mb.
II- Caryotype :
1) Matériel cellulaire :

❖Lymphocytes sanguins ++++

❖Cellules amniotiques (du liquide
amniotique) ++
❖Cellules trophoblastiques (couche cellulaire de
fibroblastes limitant l'œuf devenu
blastocyste au 6e jour après la fécondation) +
❖Fibroblastes cutanés
II- Caryotype :

1) Matériel cellulaire : culture cellulaire

❖ Les lymphocytes sanguins sont très souvent

utilisés.

❖ Incubation (48 à 72 heures) dans un milieu de

culture contenant une lectine à fort pouvoir
mitogène (phytohémagglutinine ou PHA).

❖ Les fibroblastes demandent une culture

cellulaire d’une à trois semaines.
II- Caryotype :
2) Technique d ’obtention des métaphases :

❖ Obtention de métaphases nombreuses et de bonne qualité.

❖ Accumulation des cellules en métaphase par traitement à la

colchicine qui perturbe les fuseaux mitotiques et bloque les cellules
en métaphase de la mitose.

❖ Dispersion chromosomique dans le cytoplasme par l'action d'une

solution hypotonique.

❖ Fixation (conservation des cellules dans un état proche du

physiologique.
 II- Caryotype :
2) Technique d ’obtention des métaphases (II)

– Choc hypotonique

– Fixation

– Etalement sur lame

II- Caryotype :
3) Technique d’ Identification des chromosomes :

❖ Coloration au Giemsa : permet de compter et de classer les chromosomes

en fonction de leur taille et de leur indice centromérique.

N.B. Le giemsa est un colorant spécifique des chromosomes. Il s’agit d'un

mélange de deux colorants (azure de méthylène et éosine) donnant une
coloration « rose violacé ».

❖ Les méthodes de marquage révèlent le long des chromosomes une

alternance de bandes transversales, faiblement ou fortement colorées, dont
la séquence est spécifique de chaque paire chromosomique. les deux
chromosomes d'une même paire auront la même topographie de bandes).
II- Caryotype :
3) Technique d’ Identification des chromosomes (II) :

❖ Les bandes G (Coloration par le Giemsa) marquent des régions

d’ADN riches en liaisons A-T et correspondent à des centres de
condensation précoces pauvres en gènes actifs.
Inconvénient : télomères mal colorés.

❖ Les bandes R (5-bromodésoxyuridine (BrdU/Giemsa)) sont riches

en liaisons C-G, en gènes actifs à réplication précoce.
Avantage: télomères bien colorés.

❖ Ces deux marquages sont complémentaires. Ils révèlent

notamment l'euchromatine c'est à dire les régions chromosomiques
où l'ADN est transcrit.
II- Caryotype :

3) Technique d’ Identification des chromosomes (III) :

❖ Concernant les bandes T : marquage des télomères.

❖ La coloration aux bandes C permet la mise en évidence des

centromères, des constrictions secondaires et de la partie distale
du chromosome Y. Ces régions chromosomiques ont de l’ADN
répétitif (ADN satellite), à réplication tardive. Il représentent 10 à
15% du génome avec un polymorphisme très marqué.
 II- Caryotype :
4) Observation et analyse
– Nombre et structure des chromosomes
– 46, XX
– 46, XY
 4) Observation et analyse (II)
METAPHASE

Low power x100 High power x1000

4) Observation et analyse (III)

High power (1000x) view. Next

stage of analysis involves
locating each chromosome
pair and comparing them band
for band.

Random distribution of
chromosomes can hinder the
accuracy and efficiency of the
band comparison.
II – Caryotype : Trisomie 21

❖ Première aberration chromosomique décrite chez l’Homme.

❖ Une cause de retard mental.

1) Clinique (voir cours de la génétique médicale)

– Dysmorphie : - Malformation du crâne : Brachycéphalie
- Cou court / excès de peau
- Face ronde
– Hypotonie axiale (diminution du tonus musculaire).
– Malformations associées : cardiaques, digestives.
– Retard mental.
– Risque tumoral : Leucémies.
 II- Caryotype :

4) Observation et analyse (III)

II – Caryotype : Trisomie 21
 Comment localiser un gene ?

How do geneticists indicate the location of a gene?

Geneticists use maps to describe the location of a particular gene on a
chromosome. One type of map uses the cytogenetic location to describe a
gene’s position. The cytogenetic location is based on a distinctive pattern of
bands created when chromosomes are stained with certain chemicals. Another
type of map uses the molecular location, a precise description of a gene’s
position on a chromosome. The molecular location is based on the sequence
of DNA building blocks (base pairs) that make up the chromosome.

A- Cytogenetic location
Geneticists use a standardized way of describing a gene’s cytogenetic location.
In most cases, the location describes the position of a particular band on a
stained chromosome: 17q12
It can also be written as a range of bands, if less is known about the exact
location: 17q12-q21
The combination of numbers and letters provide a gene’s “address” on a
chromosome. This address is made up of several parts:

The chromosome on which the gene can be found. The first number or
letter used to describe a gene’s location represents the chromosome.
Chromosomes 1 through 22 (the autosomes) are designated by their
chromosome number. The sex chromosomes are designated by X or Y.

The arm of the chromosome. Each chromosome is divided into two sections
(arms) based on the location of a narrowing (constriction) called the
centromere. By convention, the shorter arm is called p, and the longer arm
is called q. The chromosome arm is the second part of the gene’s address.
For example, 5q is the long arm of chromosome 5, and Xp is the short arm
of the X chromosome.

The position of the gene on the p or q arm. The position of a gene is based
on a distinctive pattern of light and dark bands that appear when the
chromosome is stained in a certain way.
The position is usually designated by two digits (representing a region and a
band), which are sometimes followed by a decimal point and one or more
additional digits (representing sub-bands within a light or dark area). The
number indicating the gene position increases with distance from the
centromere. For example: 14q21 represents position 21 on the long arm of
chromosome 14. 14q21 is closer to the centromere than 14q22.

Sometimes, the abbreviations “cen” or “ter” are also used to describe a

gene’s cytogenetic location. “Cen” indicates that the gene is very close to the
centromere. For example, 16pcen refers to the short arm of chromosome
16 near the centromere. “Ter” stands for terminus, which indicates that the
gene is very close to the end of the p or q arm. For example, 14qter refers to
the tip of the long arm of chromosome 14. (“Tel” is also sometimes used to
describe a gene’s location. “Tel” stands for telomeres, which are at the ends
of each chromosome. The abbreviations “tel” and “ter” refer to the same
location.)
Location of the CFTR gene.
B- Molecular location
The Human Genome Project, an international research effort completed in
2003, determined the sequence of base pairs for each human chromosome.
This sequence information allows researchers to provide a more specific
address than the cytogenetic location for many genes. A gene’s molecular
address pinpoints the location of that gene in terms of base pairs. It describes
the gene’s precise position on a chromosome and indicates the size of the gene.
Knowing the molecular location also allows researchers to determine exactly
how far a gene is from other genes on the same chromosome.
Different groups of researchers often present slightly different values for a
gene’s molecular location. Researchers interpret the sequence of the human
genome using a variety of methods, which can result in small differences in a
gene’s molecular address.

Genetics Home Reference presents data from NCBI for the molecular location
of genes.

Ref: Genetics Home Reference, U.S. National Library of Medicine, NIH, USA.
III – Cytogénétique moléculaire

La cytogénétique moléculaire se base sur l’utilisation de la

spécificité de l'appariement base à base de la molécule
d‘ADN pour identifier précisément un chromosome entier
ou même un simple fragment.
Notion de Sondes
 Notion de Sondes (II)
❖ Pour pouvoir détecter spécifiquement une séquence d’ADN, on utilise
au laboratoire un petit morceau d’ADN synthétisé (sonde) dont la
séquence correspond au moins en partie à celle d’un des brins d’ADN
étudié.

❖ Parce qu’elle est complémentaire de l’autre brin d’ADN, la sonde est

capable de se fixer spécifiquement sur l’un des brins à l’endroit où se lit la
séquence complémentaire.

❖ En marquant cette sonde par un atome radioactif ou par une molécule

fluorescente liés covalentiellement à un des nucléotides de la sonde, on
peut détecter la sonde et le morceau d’ADN complémentaire qui lui est
hybridé.
Sonde spécifique d’allèle
 Sonde spécifique d’allèle (II)
❖ La drépanocytose ou anémie falciforme est une maladie des globules
rouges qui sont déformés par une cristallisation anormale de
l’hémoglobine. Cette cristallisation résulte d’une substitution A→T dans le
sixième codon.

❖ Cette substitution s’exprime par une mutation Glu6→Val de la chaîne β

de la globine.

❖ L’électrophorèse de l’ADN du gène HBB (hemoglobin, beta), qui code

pour la chaîne β des globines est révélée par deux sondes : l’une
spécifique de la séquence normale, l’autre de celle de la protéine mutée
(ASO = Allele Specific Oligonucleotide).
 Sonde spécifique d’allèle (III)
❖ L’ADN d’un sujet est révélé par :
- La seule sonde normale s’il possède deux gènes HBB normaux
(homozygote normal).
- Par la seule sonde de la protéine mutée s’il possède deux gènes
HBB responsables de la mutation (homozygote muté).
- Par les deux sondes s’il possède un gène normal et un gène de la
protéine mutée (hétérozygote).

❖ Les sujets homozygotes mutés sont atteints d’anémie falciforme et

sujets à des crises graves. Les sujets hétérozygotes sont porteurs du «
trait drépanocytaire », ils n’ont que peu de troubles mais ils transmettent
le gène à leurs descendants.
III – Cytogénétique moléculaire

1- Hybridation in situ fluorescente (FISH)

2- Technique de CGH-array (caryotype moléculaire)

3- Test de PCR quantitative

1) Hybridation in situ fluorescente : FISH
Principe de la technique:

❖ Technique rapide basée sur l'hybridation de l'échantillon en

question avec une sonde fluorescente spécifique d'une région
particulière d'un chromosome.

❖ Cette technique permet de mettre en évidence des

remaniements chromosomiques ou des réarrangements de
petite taille, non détectables au caryotype standard. Elle permet
ainsi la détection d’anomalies chromosomiques de « nombre »
ou de structure : délétion, inversion, duplication,
isochromosome (chromosome anormal formé de deux bras
courts ou deux bras longs avec perte de l’autre bras),
translocation chromosomiques.

❖ Résolution de 50 kb à 2 Mb.
1) Hybridation in situ fluorescente : FISH (II)

- Le principe repose sur l'utilisation d'une sonde moléculaire, c'est-à-

dire une petite séquence d'ADN dont l'emplacement normal est
connu dans le génome et qui est marquée chimiquement de façon à
pouvoir être repérée par la suite.

- Cette sonde est mise en contact avec les chromosomes d'une

mitose et va s'hybrider (se fixer) spécifiquement au niveau de sa
séquence complémentaire.

- On peut alors visualiser la sonde au microscope dont

l'emplacement identifie précisément la région chromosomique dont
elle est complémentaire.
1) Hybridation in situ fluorescente : FISH (III)

- Les sondes sont marquées soit avec une molécule fluorescente,

soit avec une molécule qui peut être reconnue par un anticorps.

- Dans le premier cas, la sonde est directement visible au

microscope à fluorescence, tandis que dans le second, une étape
supplémentaire de révélation avec un anticorps fluorescent est
nécessaire.
1) Hybridation in situ fluorescente : FISH (IV)
1) Hybridation in situ fluorescente : FISH (V)
 1) Hybridation in situ
fluorescente : FISH (VI)

Y
18 18
X
Y 18
Y 18 X Y
18
X Y

X 18 X 18
18 X
Y X

Devillard et al. 2002

2) Technique de CGH-array (caryotype moléculaire) :

❖ La CGH array (Comparative Genomic Hybridization array) est

appelé aussi "caryotype moléculaire" est une nouvelle méthode
d’exploration des chromosomes, automatisable qui s’affranchit des
cultures cellulaires et a un pouvoir de résolution de 100 à 1000 fois
supérieur à celui du caryotype.

❖ La CGH array permet la détection de déséquilibres

chromosomiques (délétions, duplications ou remaniements
complexes) dont la taille varie avec la résolution de la puce utilisée.

❖ La CGH-array présente une résolution pangénomique de 1 Mb à

quelques kb pour la détection d’anomalies quantitatives. Elle permet
la détection d’anomalies infracytogénétiques (cryptiques) et constitue
déjà l’examen incontournable de diagnostic pangénomique en
génétique clinique.
2) Technique de CGH-array (II) :
Principe de la technique:

La technique de CGH array consiste à cohybrider la même quantité

d’ADN d’un patient et d’un témoin, marqué chacun par un
fluorochrome différent, sur une lame de verre (puce à ADN) sur
laquelle sont fixées des séquences d’ADN (appelées sondes).
Après avoir hybridé les deux ADN sur la puce à ADN, un rapport de
fluorescence est calculé au niveau de chaque fragment d’ADN fixé
(comparaison du ratio ADNpatient / ADNtémoin).

Les puces CGH array permettent la détection des microdélétions ou

des amplifications pour des segments d'ADN à partir de 5 à 10 kb
(milliers de paires de bases).
Principe de la technique :
2) Technique de CGH-array (III) :
Principe de la technique (suite):

Un traitement statistique des données est ensuite réalisé grâce à des

logiciels dédiés et les résultats sont donnés sous forme de
représentation graphique. L’existence d’un gain ou d’une perte d’un
segment génomique du patient sera détectée par une variation du
rapport d’intensité de fluorescence au-delà d’un seuil déterminé.
La résolution de la puce (c’est-à-dire sa capacité à détecter un
déséquilibre génomique) dépend du nombre de sondes et de leur
localisation sur le génome.
Exemple : la technologie Agilent = résolution 180K (pour 180.000
sondes).
 3) Test de PCR quantitative : détection rapide
d’ anomalies chromosomiques:

Rappel sur le PCR

 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

❖ La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR est une technique de

réplication ciblée in vitro.

❖ Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu

abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique
et de longueur définie.

❖ L'ordre de grandeur à retenir est celui du million de copies en

quelques heures. C'est généralement suffisant pour une utilisation
ultérieure.
 Principe et conditions expérimentales de la PCR :

❖ Il s'agit de réaliser une succession de réactions de

réplication d'une matrice double brin d'ADN.

❖ Chaque réaction met en oeuvre deux amorces

oligonucléotidiques dont les extrémités 3’ pointent l'une vers
l'autre.

❖ Les amorces ou «primers» en anglais définissent alors, en

la bornant, la séquence à amplifier.
Principe et conditions expérimentales de la PCR (II) :

❖ L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de

synthèse comme matrices pour les étapes suivantes, au lieu de les
séparer afin de ne réutiliser que la matrice originale. Au lieu d'être
linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle.

❖ Imaginée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel dès 1993), la

technique connaît un essor considérable à partir de la
commercialisation (vers 1988), d'une ADN polymérase résistante aux
températures élevées (la Taq polymérase), qui permet une
automatisation de la technique.
PCR : étapes d’un cycle
 PCR : progression des cycles

Au final, on obtient un très grand nombre de copies

du gène d’intérêt, visualisables sur gel.
PCR classique : dépôt des échantillons sur gel
➢ Gel d’agarose = maillage
➢ Plus solide et moins toxique que l’acrylamide
➢ ADN chargé négativement, migre selon sa taille (ADN linéaire)
➢ Plus % agarose est élevé, plus on sépare les petits fragments

➢ Visualisation avec du Bromure d’Ethidium (agent intercalant)

- Ajouté lors de la préparation du gel
- En solution dans laquelle le gel est plongé après migration

M échantillons
 PCR en temps réel

➢ A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou

d’amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent.
➢ Suivi de la cinétique complète = quantification absolue de la
quantité initiale d’ADN cible.

2 techniques :
- agents se liant à l’ADN (ex: SYBR Green)
- sondes fluorescentes (ex: Taqman)
 PCR en temps réel : Exemple de résultats

control treated
Target gene

Target gene
Control gene

Control gene
 PCR en temps réel vs PCR classique

➢ Quelques ng d’ADN suffisent

➢ Rapidité du run (~ 1 h vs 2h30)
➢ Sensibilité
➢ Quantification précise (si droite d’étalonnage avec une
quantité connue)
➢ Logiciels d’analyse = exportation des résultats et gain
de temps
 3) Test de PCR quantitative : détection rapide
d’ anomalies chromosomiques :

Amplification d’ADN chromosomique:

❖ Cette analyse est réalisée sur de l’ADN extrait de prélèvement.

❖ Elle est réalisée grâce à l’approche « PCR » notamment

fluorescente quantitative.

❖ Elle permet, par exemple, d’amplifier des séquences hautement

polymorphiques d’ADN appelées STR (short tandem repeats).
 3) Test de PCR quantitative : détection rapide
d’ anomalies chromosomiques (II) :

Amplification d’ADN chromosomique (2) :

❖ Des marqueurs autosomaux sont utilisés afin de détecter, à

titre d’exemple, les 3 trisomies viables les plus courantes :
trisomie 21 (syndrome de Down), trisomie 18 (syndrome
d’Edwards) et trisomie 13 (syndrome de Patau).

❖ D’autre part, des marqueurs sur les chromosomes X et Y

permettent de diagnostiquer des aneuploïdies (nombre anormal
de chromosomes) des chromosomes sexuels.
 3) Test de PCR quantitative : détection rapide
d’ anomalies chromosomiques (III) :

Amplification de cDNA (ou ADNc « ADN complémentaire ») :

❖ Ce test est réalisé après le processus de transcription inverse

(ou « Reverse Transcription » ou RT).

❖ Le processus de RT permet d’obtenir un ADNc à partir d’un

ARNm.

❖ Cette technique permet de quantifier les taux de transcrits

(ARNm) dans un prélèvement.
 Transcription inverse (ou reverse)

ARN >>> ADN complémentaire (ADNc)

➢ Molécule moins fragile

➢ Conservation à -20°C
➢ Sélection des ARNm
➢ Matrice pour la réaction d’amplification

Enzyme → Transcriptase inverse isolée de

rétrovirus à ARN
 Transcription inverse
Possibilité d’utiliser des kits commerciaux contenant :
- Enzyme + tampon d’activité
- dNTPs en quantité suffisante
- DTT >>> élimination des structures 2aires des
ARNs
- Amorces polydT >>> sélection des ARNm
10 min à AAAAAAAA

AAAAA
70°C TTTTTTTTT
Amorce oligo dT
DTT
ARNm 1h à 37°C
15 min à 70°C
TTTTTTTTT
ADNc
 3) Test de PCR quantitative : détection rapide
d’ anomalies chromosomiques (III) :

Amplification de cDNA (ou ADNc « ADN complémentaire ») (II):

Exemple pratique : Quantification du transcrit bcl/abl

Philadelphia chromosome formation