BIOLOGIE MOLECULAIRE I

M. ADA MBEZELE Bertin

 A- BIOLOGIE MOLECULAIRE ET GENETIQUE

Objectifs pédagogiques

Ce cours est conçu pour donner aux étudiants TAM 2 des connaissances sur la synthèse, les propriétés
structurelles et fonctionnelles des acides nucléiques d’une part de fournir des connaissances sur les
aspects fondamentaux de l'immunologie de base et son application dans le diagnostic et la gestion d'une
variété de maladies humaines d’autre part.

Ainsi à la fin de cet enseignement, l’étudiant doit pouvoir maitriser :

La structure, propriété et caractéristiques moléculaires des acides nucléiques (ADN et ARN). La

biosynthèse des acides nucléiques. La biosynthèse des protéines. L’introduction à la génétique. La
génétique classique. Le gène et transmission de l’information génétique. L’utilisation de l’information
génétique. Le mécanisme de réplication, mutations. L'immunologie de base et son application dans le
diagnostic et la gestion d'une variété de maladies humaines.

GENERALITES

La biologie moléculaire est une discipline scientifique au croisement de la génétique, de la biochimie et

de la physique, dont l'objet est la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la cellule au
niveau moléculaire. La biologie moléculaire est apparue au XX e siècle, à la suite de l'élaboration des
lois de la génétique, la découverte des chromosomes et l'identification de l'ADN comme support
chimique de l'information génétique. Depuis la fin des années 1950 et le début des années 1960, les
biologistes moléculaires ont appris à caractériser, isoler et manipuler les composants moléculaires des
cellules et des organismes. Ces composants incluent l'ADN, support de l'information génétique, l'ARN,
et les protéines, molécules structurelles et enzymatiques les plus importantes des cellules. La variété des
organismes vivants est extraordinaire, on estime qu'il ya de nos jours plus de 10 millions d'espèces.
Chaque espèce est différente des autres. Cette différence est due au contenu en information génétique de
chaque espèce. Les généticiens ont envisagé que des molécules spécifiques étaient porteuses de cette
information génétique. Les êtres vivants sont subdivisés en deux groupes: les eucaryotes et les
procaryotes, se différencient par la présence ou non d'un noyau.

La génétique est définie comme la "science de l'hérédité". On y ajoute qu'elle a pour objet l'étude de la
transmission des caractères des parents aux enfants (transmission à la descendance).
La transmission des caractères héréditaires est possible essentiellement parce que les caractères
héréditaires présentent les deux propriétés suivantes, apparemment contradictoires :

➢ les caractères héréditaires sont stables puisqu'ils peuvent être transmis de génération en
génération, de manière évidente à travers la reproduction végétative, de façon plus complexe à
travers la reproduction sexuée. A l'origine de cette stabilité : la reproduction conforme par
réplication du matériel génétique, le plus souvent l'ADN, qui permet d'obtenir, à partir d'une
cellule unique, deux cellules identiques entre elles et, au fil des générations, un clone de
cellules.

➢ les caractères héréditaires sont aussi variables puisque, au-delà des ressemblances basées sur
des caractères communs à l'ensemble des individus d'un groupement donné, il existe des
différences entre les individus d'un groupe. La génétique est l'étude des gènes à travers leurs
variations.

Chaque individu contient un programme génétique (ses gènes). Ce programme génétique lui vient de
ses parents il le transmettra en partie à ses enfants: c’est la base de l’hérédité.

I- RAPPELS DES QUELQUES NOTIONS DE BASE

La cellule :

La cellule est l'unité du monde vivant et les millions de types différents d'organismes qui peuplent la
Terre ont tous un dénominateur commun : ils sont constitués de cellules. Les êtres vivants possèdent au
sein de leurs cellules un "programme génétique" (donnant les caractéristiques de leur espèce + leurs
caractéristiques individuelles) contenu, chez les Eucaryotes, dans le noyau. Ce programme se transmet
de génération en générations sous forme de chromosomes, supports des caractères héréditaires.

Les ribosomes : situés sur la face du réticulum endoplasmique se trouve de nombreux petits grains qui
sont faits des protéines et de l’ARN. Ils interviennent dans le processus de synthèses des protéines.

La chromatine est une matière granuleuse et hétérogène contenu dans le noyau et constitué d’un
mélange de deux types de molécules:

• des protéines

• de l’acide désoxyribo-nucléique (ADN ou DNA).

Un chromosome contient donc une molécule d’ADN (les chromosomes ne se forment que lorsqu’une
cellule se divise).

Les gènes (les phrases de l'ADN)

Un gène correspond donc à un morceau d’ADN portant une séquence particulière de nucléotides (une
série de nucléotides (mots d'ADN)) correspondant à un ou plusieurs caractères héréditaires. NB : Tous
les gènes ne sont pas « actifs » en même temps.

Une définition plus précise du gène : région d'ADN qui est transcrite

L'ADN :

La structure de l’ADN a été découverte en 1953 par J. Watson, F. Crick et R. Franklin. L’unité de base
de l'ADN est le nucléotide comportant:

• un sucre (désoxyribose)

• du phosphate (H3PO4)

• une des 4 bases azotées suivantes: cytosine (C), thymine (T), adénine (A)
guanine
(G)

Les acides désoxyribonucléiques sont de très grandes molécules composées de deux chaines
polynucléotidiques enroulées l'une autour de l'autre pour former une double hélice régulière. Chaque
brin est formé d'une chaîne de nucléotides reliés par des liaisons covalentes (solides). Un brin peut
donc être décrit comme une suite de nucléotides. Les deux brins sont liés par des liaisons “faibles”
(fragiles, type liaisons hydrogène) qui unissent les bases azotées deux à deux: A est toujours reliée à T
et C’est toujours reliée à G. Les liaisons hydrogène et les interactions hydrophobes qui maintiennent la
structure en double hélice sont des forces faibles et des quantités relativement petites d'énergie peuvent
séparer les deux brins, un processus appelé dénaturation.

On a constaté un certain nombre de faits:

– dans l'ADN, la quantité d'A = la quantité de T; [C] = [G]. Par conséquent on a l'égalité de
concentration entre les bases Puiriques et les bases pyrimidiques.
– Le rapport des [A+T] / [C+G] est caractéristique d'une espèce. Il est supérieur à 1 chez les animaux et
végétaux.

– sous sa forme native, l'ADN présente une viscosité est une densité plus élevée que ne le laisserait
supposer une fibre unique,

– à pH physiologique, les fonctions aminés -NH2 et les groupements -CO-NH- sont masqués et ne
réagissent que pour 5 < pH < 1 1, ce qui laisse supposer la présence de liaisons faibles,

– l'ADN natif présente une absorption dans l'UV < l'absorption théorique calculée d'après l'absorption
des nucléotides qui le composent
– les études de diffraction aux rayons X suggèrent une forme hélicoïdale.

Modèle de la double hélice (Watson et Crick, 1953)

W et C se sont servis des résultats précédents pour proposer leur modèle :

- La molécule d'ADN est formée de 2 chaînes de polydésoxyribonucléotides enroulées pour former
une double hélice. Les bases azotées sont dirigées dans le centre de l'hélice et les plans formés par les
cycles des bases sont parallèles les uns aux autres et perpendiculaires à l'axe de l'hélice.
L'ADN est dit ainsi bicaténaire.

Le pas de l'hélice est de 3,4 nm, avec 10 plans par pas (soit une distance de 0,34 nm entre 2 plans).
L'hélice est droite. Il existe 2 sillons de taille inégale, le petit et le grand sillon, qui permettent
l'accessibilité de l'ADN aux protéines (enzymes de la réplication et de la transcription,...)

- Les 2 brins sont complémentaires : les bases A et T, ainsi que C et G sont dites complémentaires
sont liées entre elles par des liaisons hydrogène (2 entre A et T, 3 entre C et G). La connaissance de la
séquence de l'un des brins permet de déterminer celle du brin opposé qui lui sera complémentaire.

- Les 2 brins sont antiparallèles, càd qu'ils "vont" dans des directions opposées : orientation tête-
bêche 3'-5' pour l'un et 5'-3' pour l'autre La double hélice représente la structure seconde de l'ADN. Rq:
il existe une forme plus rare de l'ADN, dite forme Z, caractérisée par une hélice gauche, il semble que
chez les eucaryotcs, certaines régions sont sous forme Z, mais leur rôle exact est mal connu. Ainsi, de
même qu'une protéine est caractérisée par son nombre d'acides aminés, une molécule d'ADN sera
caractérisée par son nombre de nucléotides, usuellement exprimé en nombre de paires de bases (pb). Par
exemple, un ADN de 1000 pb est formé de 2 brins complémentaires de 1000 nucléotides chacun. A
retenir: MM 1 pb = 600 g. mol-1 environ

L'ARN

L'ARN est l'abréviation d'acide ribonucléique. Tout comme l'ADN, les molécules d'ARN sont
fabriquées dans le noyau de la cellule. Toutefois, contrairement à l'ADN, l'ARN ne se limite pas au
noyau. Il peut migrer dans d'autres parties de la cellule. De l'ARN, appelé ARN messager communique
le message génétique que l'on retrouve dans l'ADN au reste de la cellule afin de favoriser la synthèse de
protéine. La façon dont une séquence de gènes dans l'ADN se traduit par la suite en une protéine
correspondante fait l'objet de la section sur la synthèse des protéines.

Alors que les molécules d'ADN sont formées de deux brins parallèles de nucléotides, une molécule
d'ARN n'en compte qu'un. Par ailleurs, la structure chimique de l'« armature » du nucléotide de l'ARN
est légèrement différente de la structure de celle de l'ADN. L'armature de l'ADN contient des molécules
de sucre désoxyribose (d'où le D dans ADN) et celui de l'ARN des molécules de sucre ribose (d'où le R
dans ARN).

Tout comme l'ADN, les nucléotides de l'ARN peuvent avoir des bases de guanine (G) et de cytosine (C)
et tout comme dans les nucléotides d'ADN, la guanine s'associe (se lie) à la cytosine (G-C). Une
troisième base que l'on retrouve dans l'ARN - adénine (A) - est également la même que dans l'ADN.
Mais au lieu de la thymine (T), l'ARN comporte de l'uracile (U) qui se lie à l'adénine (U-A).

Les enzymes

Un enzyme est un catalyseur biologique.

Un catalyseur est une substance qui accélère la vitesse d'une réaction biochimique sans être altérée dans
le processus. Des centaines de réactions chimiques différentes se produisent sans arrêt dans nos cellules
et dans notre corps.

On appelle substrat la molécule qu'un enzyme aide à réagir.

Structure de l'enzyme : le « modèle clé-serrure »

À l'exception de quelques enzymes composés d'ARN, les enzymes sont des protéines. Souvenez-vous
qu'une protéine est composée d'une ou de plusieurs chaînes d'acides aminés reliées, et que chaque
chaîne d'acides aminés prend une forme tridimensionnelle selon la séquence d'acide aminé et la façon
dont les acides aminés de la chaîne interagissent entre eux et avec la solution environnante.

NB : l’ADN constitue le code, sous forme de suites de triplets de nucléotides. Ce code sert à faire une «
copie-négative » (ARN méssager
 Protéines

• Synthèse des protéines :

L’ADN est confiné au noyau de la cellule et ne peut en sortir car il constitue le réseau enchevêtré de
chromatine. Or la synthèse des protéines se fait dans le cytoplasme. Il existe donc un intermédiaire
(ARNm) qui puisse transporter du noyau au cytoplasme l’information codée dans l’ADN.

Le processus commence par une ouverture de la double hélice au niveau où se trouve le code de la
protéine désirée. Sur une des deux moitiés de la double hélice viennent se fixer t se polymériser des
ribonucléotides qui vont ainsi constituer une simple hélice d’ARN de quelques centaines de nucléotides
de longueur. Cet ARNm nouvellement formé se détache ensuite de son moule d’ADN et se dirige vers
le cytoplasme en passant par les pores de la membrane nucléaire. Dans le cytoplasme, il se fixe aux
ribosomes où la synthèse des protéines peut alors commencer.

• Structure de la protéine

Toutes les protéines sont constituées d'une ou de plusieurs longues molécules appelées polypeptides.
Chaque polypeptide est composé de petites molécules reliées bout à bout et appelées acides aminés.
Les 20 types d'acides aminés utilisés par les cellules vivantes ont tous une structure d'armature
identique, qui sert à lier ensemble les acides aminés en une longue chaîne.

• Les protéines

Ce sont les molécules biologiques qui donnent aux cellules vivantes leurs formes et fonctions diverses.
Ce sont les protéines produites à l'aide de gènes comme matrice, qui sont responsables des
caractéristiques d'une cellule ou d'un organisme particulier. De nombreux gènes codent pour des
chaînes polypeptidiques particulières. Et les protéines comprennent une ou plusieurs chaînes
polypeptidiques.

Transcription :

La transcription est le premier processus de régulation utilisé par les cellules, tissus et organismes pour
faciliter et contrôler les programmes complexes de l'expression génétique, le métabolisme cellulaire, et
le développement des tissus et les organes. L'information génétique est stockée dans l'ADN. Cependant,
l'expression de cette information génétique nécessite le passage de l'ADN à l'ARN, puis aux protéines
(transcription, traduction). On appel transcription la synthèse de brin d'ARN dont la séquence est dictée
par celle de la molécule d'ADN correspondante. Les trois principaux types d'ARN connus sont:

- ARN messager (ARNm) : Spécifie les codons

- ARN de transfert (ARNt): Spécifie les anticodons

- ARN ribosomique (ARNr): Constituant de ribosomes et impliqué dans la synthèse des protéines.

Le gène est l'unité fonctionnelle de l'information génétique. Il est constitué d'un ensemble de
nucléotides qui contient toutes les informations nécessaires pour transcrire un ARNm .

ARNm: Une succession de nucléotides sous forme de long filament a un seul brin. C'est un vecteur du
message dictant la séquence des protéines entre chaque gène et la protéine correspondante.

Promoteur: Site sur l'ADN d'une centaine de bases auquel l'ARN polymérase (ainsi que les facteurs
d'initiation requis) se fixe pour commencer la transcription.

L'ARN polymérase assume de multiples fonctions dans le processus de la transcription:

- Elle cherche les promoteurs

- Elle déroule le fragment à transcrire pour produire une matrice simple brin - Elle sélectionne les
NTPs corrects et catalyse la formation des liaisons phosphodiester.

- Elle détecte les signaux de terminaison.

La transcription permet donc de copier l'ADN en ARN messager (ARNm). Elle se déroule dans le
noyau chez les eucaryotes comme suit :.

Tout d'abord, les enzymes (l'hélicase) déroulent une partie de l'hélice d'ADN bicaténaire et rompent les
liaisons entre les paires de base complémentaires dans la section non déroulée. Pour commencer, l'ARN
polymérase reconnaît et se fixe sur une région particulière de l'ADN déroulé, située en amont d'une
région codante d'un gène : le site promoteur et synthétise un brin d’ARN complémentaire appelé
ARNm à l’ADN. Elle nécessite des Nucléosides Triphosphates et progresse dans le sens 5'-3'.

• Le promoteur est la zone de l'ADN sur laquelle se fixe initialement l'ARN polymérase,
avant de démarrer la synthèse de l'ARN. Les séquences promotrices sont en général
situées en amont du site de démarrage de la transcription.

• L'ARN polymérase est un complexe enzymatique responsable de la synthèse de l'acide

ribonucléique, ou ARNm, à partir d'une matrice d'ADN.
Ensuite, un brin complémentaire d'ARN messager est synthétisé, utilisant comme matrice l'un des brins
de l'ADN non déroulés. Par exemple, si une partie d'un brin de l'ADN non défait lit GATCAT, la
séquence d'ARN messager complémentaire lira CUAGUA.

Contrairement aux molécules d'ADN, les molécules d'ARN messager sont libres de sortir du noyau par
les pores de la membrane nucléaire pour voyager dans le reste de la cellule (appelé cytosol). C'est dans
le cytosol que prend place la traduction.

➢ Traduction :

La traduction correspond au décodage de l'information portée par l'ARN messager en protéines. Dans
ce cas on passe du langage de nucléotides au langage des acides aminés grâce au code génétique.

La traduction a lieu au niveau des ribosomes et nécessite un grand nombre d'acteurs dont les plus
importants sont :

• l'ARNm ;

• le ribosome ;

• l'ARN de transfert (ARNt) ;

• l'acide aminé.

Mentionnons d'abord que comme l'ADN et l'ARN, les protéines sont des chaînes de petits éléments
reliés entre eux. Dans le cas de l'ADN, ces petits éléments s'appellent nucléotides, et dans le cas des
protéines, on les appelle acides aminés. La séquence de nucléotides dans l'ARN messager est
simplement transformée en une séquence d'acides aminés, selon un code uniforme. Mécanisme de la
traduction

Les codons de l'ARNm, qui sont en fait un triplé de bases nucléotidiques, sont reconnus par l'anticodon
de l'ARNt.

Les acides aminés ne peuvent pas venir se fixer directement sur l’ARNm. C’est là qu’intervient un autre
intermédiaire, l’ARN de transfert. L’ARNt possède à une de ses extrémités un triplé de bases azotées
libres capable de se fixer à un triplé complémentaire sur l’ARNm. Selon la nature de son triplet libre,
une molécule d’ARNt peut reconnaitre l’un des 20 acides aminés et s’y fixer, l’entrainant avec elle sur
l’ARNm grâce à la coplementarité de son triplet codant avec l’un des triplets de l’ARNm.

Chaque séquence de trois bases d'ARN messager code pour un acide aminé particulier. Par exemple, la
séquence d'ARN messager AUG code pour un acide aminé appelé méthionine. Les ribosomes, les «
machines » qui assurent la synthèse des protéines, s'attachent au brin d'ARN messager et descendent, «
lisant » ainsi la séquence de nucléotides et reconstituant la protéine adéquate à mesure qu'ils se
déplacent. La première série de trois nucléotides que lit le ribosome est toujours AUG, et ce parce que
la séquence AUG sert de balise, indiquant au ribosome où il « doit commencer à lire ».

II- BIOCHIMIE DES ACIDES AMINES (AA)

Rôle des protéines dans les processus biologiques

Les protéines sont des macromolécules organiques les plus abondantes dans les organismes vivants ~
50% poids sec des cellules.

Les protéines ont comme rôle essentiel :

➢ ce sont des molécules de structure pour la cellule et les tissus

➢ elles ont des fonctions essentielles dans la vie cellulaire

• Catalyse de réactions biochimiques : les enzymes

• Transport de molécules et d’ions

• Régulation de l’activité d’autres protéines

• Signalisation cellulaire

• Motricité des cellules et des organismes

• Défense immunitaire : les anticorps

• Contrôle de la croissance et de la différenciation cellulaire

Les protéines sont constamment renouvelées car elles sont dégradées et éliminées par l’organisme. Elles
ont une diversité de fonctions mais une seule organisation avec comme unité de base : les acides aminés
(AA).

Les acides aminés: Présentation et structure

Les acides aminés sont l’unité de base des protéines apportés par l’alimentation ou fournis par
l’organisme. Les protéines sont donc une succession ordonnée d’acides aminés. On distingue : ➢
Peptide = < 50 acides aminés

➢ Protéine = > 50 acides aminés

Les AA : Nomenclature et classification

Le code génétique établit une correspondance entre la matrice d'acides nucléiques et le

polypeptide produit (Un acide aminé correspond à un codon). Le code génétique est écris en ARNm
plutôt qu'avec l'ADN. L'aspect le plus intéressant du code génétique est que certains acides aminés sont
codés par plusieurs codons apparentés mais différents. Parmi un total de 64 codons, 4 sont dédiés à
l'initiation et à l'arrêt de la traduction.

On distingue 20 AA

Le code de lecture est le suivant :

Les acides aminés essentiels et non essentiels

On distingue :

AA essentiels

➢ AA indispensables qui doivent être apportés par l’alimentation (non-synthétisables par

l’organisme):

leucine, isoleucine, valine, thréonine, méthionine, phénylalanine, tryptophane, lysine histidine,

arginine : essentiels pour le nourrisson AA essentiels les plus rares : lysine, arginine, tryptophane

AA non-essentiels

Acides aminés pouvant être produits de manière endogène par l’organisme Acide aspartique, Acide
glutamique, Sérine, Alanine

Acides aminés et alimentation

Ration alimentaire : doit apporter assez de chacun des AA essentiels pour couvrir les besoins de
l'organisme.

Tous les AA essentiels sont présents dans les aliments contenant des protéines, qu'ils soient d'origine
animale ou végétale

III- LES PRINCIPAUX DOMAINES DE LA GENETIQUE

Traditionnellement, l’étude de la génétique a été divisée en trois sous-disciplines majeures :

a. la génétique de la transmission des gènes (génétique classique),

 b. la génétique moléculaire et

c. la génétique des populations

La génétique de la transmission (génétique classique) étudie les principes de base de l’hérédité et la

façon dont les caractères sont transmis d’une génération à la suivante. Cette génétique classique
s’intéresse:

d. à la relation entre chromosomes et hérédité,

e. à l’arrangement des gènes sur les chromosomes et à la cartographie des gènes.

Le centre d’intérêt en est l’organisme individuel : comment il hérite de son bagage génétique et
comment il transmet ses gènes à la génération suivante.

La génétique moléculaire s’adresse à la nature chimique du gène lui-même : comment l’information

génétique est encodée, répliquée et exprimée. Elle étudie les processus cellulaires de réplication, de
transcription et de traduction – par lesquels l’information est transférée d’un type de molécule à un
autre – et la régulation des gènes – les processus qui contrôlent l’expression de l’information génétique.
La génétique moléculaire se concentre sur le gène : sa structure, son organisation et sa fonction. La
génétique des populations étudie la composition génétique de groupes d’individus d’une même espèce
(populations) et les changements de cette composition au cours du temps et selon la localisation
géographique. Comme l’évolution résulte du changement génétique, la génétique des populations est
fondamentale dans l’étude de l’évolution.

L’objet d’étude de la génétique des populations est le pool de gènes d’une population.

IV- GENE ET TRANSMISSION DE L’INFORMATION GENETIQUE

Objectifs pédagogiques du chapitre

a. Connaitre les mécanismes de transmission de l’information génétique à l’intérieur d’un

organisme

b. Connaitre les mécanismes de transmission de l’information génétique d’un ascendant à un

descendant

Introduction

Reconnu comme le père fondateur de la génétique le moine et botaniste Tchèque Grégor MENDEL
(1822-1884) est à l'origine de ce qui est aujourd’hui appelé les lois de Mendel, qui définissent la
manière dont les gènes se transmettent de génération en génération.

Les lois de Mendel sont 3 lois concernant les principes de l’hérédité biologique, énoncées par:

La première loi de Mendel : Uniformité de la première génération (F1) :

Les individus de la 1ère génération (F1) se ressemblent (phénotypiquement identiques) et ressemblent à

l’un des parents ayant le caractère dominant (exemple couleur).

c. individu homozygote puisque l’on sait maintenant qu'un individu diploïde de race pure
possède deux allèles identiques pour le même gène

d. individu hétérozygote celui qui, pour un caractère, possède deux allèles différents pour le
même gène.

La deuxième loi de Mendel: loi de la pureté des gamètes :

Lors de formation des gamètes l’allèle dominant A se sépare du deuxième allèle a et chacun des deux
(2) se retrouve dans un gamète différent.

La troisième loi de Mendel : le cas des gènes indépendants

Ségrégation indépendante des caractères : lorsque on croise des individus différents par deux ou
plusieurs caractères ceux-ci sont hérités indépendamment les uns des autres, au moins dans la plupart
des cas.

Les analyses biologiques du début du siècle ont conduit à distinguer deux grands types de cellules,
suivant leur constitution et leur mode de reproduction : les cellules procaryotes et les cellules
eucaryotes.

Les cellules procaryotes

Définition

On les regroupe sous le terme générique de Bactéries. Il en existe deux grands groupes, les eubactéries
et les archées, qui ont des fonctionnements différents au niveau moléculaire. Cependant, les cellules des
deux groupes possèdent une organisation similaire.

Ces cellules sont généralement de petite taille (attention, il existe des exceptions !). Leur structure est
très simple, le plus souvent sans cytosquelette ni réseau de membrane interne. Autour de la cellule, on
note la présence d'une paroi complexe. Dans le cytoplasme, il y a présence des ribosomes et d'une
 masse "plus claire", le nucléoïde qui contient l'ADN. Attention le nucléoïde n'est pas un noyau car il
n'est pas entouré par une membrane (il existe de ce fait un couplage entre transcription et traduction).
L'ADN est présent sous forme d'un ou quelques chromosomes, le plus souvent circulaire.

Division

--Elles se divisent simplement par fission, en général pour donner deux cellules identiques. Il n'y aucune
structure marquante qui semble apparaître.

--Il n'y a pas d'individualisation de chromosomes visibles en cytologie à aucun moment de leur cycle de
vie.

- Il n'existe pas de reproduction sexuée au sens usuel du terme. Il est cependant possible pour des cellules
procaryotes d'échanger de l'ADN grâce aux phénomènes de transformation, de transduction et de
conjugaison.

1. la transformation : incorporation d’ADN nu de l’environnement directement dans la bactérie

2. la transduction : transfert de matériel génétique d’une bactérie à une autre par l’intermédiaire d’un
phage

3. la conjugaison : transfert d’ADN d’une bactérie à une autre par contact direct
Les cellules eucaryotes Definition

Ce sont des cellules qui ont toute la caractéristique d'avoir un noyau, composé d'une double membrane
entourant l'ADN. Le plus souvent, outre le noyau, elles présentent une structure interne complexe avec
un cytosquelette vrai (microtubules, filaments d'actine etc.) et un système de membranes délimitant de
nombreuses organelles (outre le noyau associé au réticulum, appareil de Golgi, mitochondrie,
lysosome / vacuole, peroxisome, etc.). Ces cellules peuvent se différencier et donner naissance à des
organismes pluricellulaires.

Division

Leur processus de division est complexe ce qui résulte en une transmission plus complexe de
l'information génétique au cours des générations. Il en existe deux types : les mitoses et les méioses.

V- REPLICATION DE L’ADN

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Objectifs pédagogiques du chapitre

➢ Connaitre les mécanismes de la réplication

Introduction

La réplication de l'ADN, appelée aussi duplication de l'ADN, est le processus au cours duquel l’ADN
est synthétisé grâce à l’ADN polymérase. Ce mécanisme permet d'obtenir, à partir d'une molécule
d'ADN, deux molécules identiques à la molécule initiale, en vue de leur distribution aux deux cellules
filles pendant la mitose. Puisque les deux chaînes de l'ADN parental se séparent et que deux nouvelles
molécules sont formées, on qualifie ce processus de semi- conservatif.

Mitose

But: Obtenir à partir d’une cellule mère deux cellules filles aux stocks complets de chromosomes.

Principe: Passer d’une cellule de 2n =2 à deux cellules à 2n =2.

Etapes préliminaires de la réplication

Réplication= duplication=copie

Au départ on a un ADN double brin. Les deux brins de la molécule d’ADN se séparent. Chaque brin
sert de matrice sur laquelle les nucléotides viennent s’agencer de façon Complémentaire. On se retrouve
à la fin avec 2 molécules d’ADN identiques à celles du départ. Une même molécule d’ADN est copiée
en plusieurs endroits et ceux simultanément. Le point de départ d’une réplication se nomme ORIGINE
DE REPLICATION. (Origine de réplication: point de départ à partir desquels les 2 brins d’ADN se
séparent). Cette séparation est favorisée par le fait que ces régions sont riches en A et T qui établissent
seulement 2 ponts hydrogènes qui sont plus faciles à briser (contrairement à C-G ont 3 liaisons). Au
fur et à mesure que la réplication s’effectue, les ADN copiés finissent par se rejoindre pour donner une
copie exacte et en un seul morceau de l’ADN original.

Certaines sous unités de protéines reconnaissent les origines de réplications. La liaison de ces sous
unités mène à l’apparition d’une enzyme (l’helicase) dont le rôle est de dérouler l’ADN et de séparer
ses deux brins.

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Initiation de la réplication

L’hélicase sépare les 2 brins d’ADN de façon locale. Mais les 2 brins auraient tendance à vouloir se
réunir après le passage de l’enzyme. Les protéines fixatrices d’ADN monocatenaire viennent donc
empêcher les 2 brins de se réunir après le passage de l’enzyme.

Une enzyme la primase (se déplace dans le sens 3’-5’) vient construire les petites AMORCES d’ARN
complémentaire à chaque brin d’ADN. Le rôle des amorces est de servir d’ancrage à une autre enzyme
ADN POLYMERASE qui élaborera le nouveau brin d’ADN néoformé.

Une autre amorce se fixe sur l’autre brin dans le sens 3’-5’.

L’helicase continue d’avancer pour séparer les 2 brins D’ADN. D’autres protéines fixatrices viennent
empêcher les 2brins de se refermer.

La primase ajoute des amorces supplémentaires sur le 2eme brin d’ADN. L’ADN est maintenant séparé
en 2 brins au niveau de chaque œil de réplication

Elongation ou synthèse de l’ADN

Elle consiste à ajouter des nucléotides d’ADN complémentaire aux nucléotides du brin d’ADN
parent grâce à l’action de l’enzyme ADN polymérase III. L’ADN polymérase III s’accroche d’abord à
l’amorce qui constitue le point de départ de l’enzyme. L’ADN polymérase III glisse sur cette amorce
dans le sens 5’- 3’ de cette amorce. L’ADN polymérase III ajoute ensuite des nucléotides en 3’ de
l’amorce.

On obtient un brin néo formé continu complémentaire du brin d’ADN parent.

Comment se génère le 2ème brin qui comporte plusieurs amorces?

NB : les réactions au niveau des 2 brins se déroulent simultanément.

L’ADN polymérase III se déplace dans le sens 5’-3’ de l’amorce pour ajouter des nucléotides
complémentaires au brin d’ADN parent. Le brin fils discontinu est composé de plusieurs segments
d’ADN (fragments d’OKAZAKI) entrecoupés par des amorces d’ARN.

Rappel: Au cours de la réaction, l’helicase se dirige de deux côtés de l’origine de réplication.

Les mêmes réactions se déroulent dans les 2 sens à la différence que les brins continus et discontinus
sont inversés à cause du sens de progression de l’ADN polymérase III 3’-5’. Les origines de réplication
se trouvent au centre de l’œil en formation. L’helicase qui poursuit son travail de séparation de l’ADN
se retrouve à une jonction appelée fourche de réplication.
Page 18 sur 42
L’ensemble de cette structure qui s’agrandit au fur et à mesure que les enzymes travaillent prend le nom
d’œil de réplication. Plusieurs « œil de réplication » ont été formés en même temps et chacun de ses «
œil de réplication » Prend de l’expansion dans les 2 sens. Au fur et à mesure les « œil de réplication »
finiront par se rejoindre.

Terminaison

Remplacement des amorces d’ARN

L’ADN polymerase I glisse sur le nouveau brin formé dans le sens 5’-3’ élimine et remplace l’amorce
par des nucléotides d’ADN.

Une autre enzyme la ligase va reconnaitre les sites non reliés et se charge de relier les 2 brins voisins.
On obtient 2 molécules d’ADN pleines et entières. Les protéines fixatrices se détachent. On a deux
molécules d’ADN comprenant chacune:

• un brin parental et

• un brin fils néoform

VI- MUTATIONS Objectifs pédagogiques du chapitre

➢ Comprendre les différents mécanismes de mutations

Page 19 sur 42
Introduction

L’apparition d’un nouveau caractère héréditaire dans une espèce animale ou végétale constitue une
MUTATION

Pour qu’une telle mutation soit héréditaire, il faut nécessairement qu’elle affecte l’ADN On distingue
deux types de mutations selon le niveau d’organisation qu’elle affecte:

➢ Les mutations génétiques

➢ Les mutations chromosomiques

Les mutations chromosomiques incluent différents changements structuraux au niveau des

chromosomes:

➢ Pertes

➢ Altérations

➢ Duplication

➢ Inversions

➢ déletions

Les mutations génétiques sont des changements structuraux qui s’opèrent à l’intérieur même des gènes.

Ils impliquent des modifications au niveau des bases azotées donc au niveau du code génétique
luimême.

Les principales anomalies chromosomiques et leurs conséquences cliniques Définition.

On appelle anomalie chromosomique tout remaniement du nombre ou de la structure des

chromosomes.

Ces remaniements peuvent s'observer de manière constitutionnelle (ils sont alors présents dès la
naissance) soit de manière acquise au cours de processus malins (ils ne sont observés alors qu'au niveau
des cellules tumorales).

Ils résultent d'un accident survenant soit au cours de la méiose, soit au cours d'une mitose. Ils peuvent
impliquer un ou plusieurs chromosomes.

On reconnaît par ailleurs

Page 20 sur 42
 ➢ les anomalies dites homogènes (quand toutes les cellules examinées portent l'anomalie) et ➢

les anomalies en mosaïque quand une fraction seulement des cellules est anormale).

Leurs conséquences sont variables en fonction du remaniement considéré. En règle générale,

➢ les remaniements dits équilibrés (c'est-à-dire sans perte ni gain de matériel génétique) n'ont
habituellement pas de conséquence pour le sujet porteur alors que

➢ les remaniements déséquilibrés se traduisent par des manifestations cliniques d'autant plus
graves que la perte ou le gain de matériel est plus important.

Les anomalies de nombre

Elles résultent d'une mauvaise ségrégation des chromosomes au cours de la division cellulaire, les deux
chromosomes d'une même paire migrant tous les deux vers la même cellule fille.

On obtient une cellule fille avec trois copies du même chromosome (soit 47 chromosomes) et une
deuxième cellule fille avec une seule copie (soit 45 chromosomes).

Elles résultent d'une mauvaise ségrégation des chromosomes au cours de la division cellulaire, les deux
chromosomes d'une même paire migrant tous les deux vers la même cellule fille.

On obtient une cellule fille avec trois copies du même chromosome (soit 47 chromosomes) et une
deuxième cellule fille avec une seule copie (soit 45 chromosomes).

Ces malségrégations peuvent s'observer aussi bien au cours de la mitose que de l'une des deux divisions
de méiose. Dans ce dernier cas, un des gamètes formés aura deux copies d'un chromosomes (oeuf
trisomique après fécondation) et son complémentaire une seule (oeuf monosomique après fécondation).

Les malségrégations méiotiques sont habituellement accidentelles, mais elles sont favorisées par
l'accroissement de l'âge maternel et par l'existence de certains remaniements chromosomiques chez l'un
des parents.

Conséquences des anomalies de nombre

Ces anomalies sont bien sûr toujours déséquilibrées, mais certaines sont viables :

- la plupart des anomalies des gonosomes

Page 21 sur 42
- pour les autosomes, les trisomies 21, 13, 18, homogènes ou en mosaïque et les trisomies 8 et 9 en
mosaïque.

Cas particulier : chromosomes marqueurs

On appelle marqueur tout fragment chromosomique dont on ne peut identifier l'origine. Le déséquilibre
porte dans ce cas uniquement sur une fraction d'un chromosome

LES ANOMALIES DE STRUCTURE

Elles sont la conséquence d'un réarrangement du matériel chromosomique.

➢ Si le réarrangement ne s'accompagne ni de perte ni de gain de matériel génétique, il est dit

équilibré et n'a habituellement pas de traduction clinique ;

➢ dans le cas contraire, on parle d'anomalie déséquilibrée, qui s'accompagne le plus souvent
de manifestations cliniques d'autant plus marquées que le déséquilibre est important.

Page 22 sur 42
Ces réarrangements peuvent concerner un seul chromosome ou plusieurs. Elles sont la conséquence d'un
réarrangement du matériel chromosomique.

➢ Si le réarrangement ne s'accompagne ni de perte ni de gain de matériel génétique, il est dit

équilibré et n'a habituellement pas de traduction clinique ;

➢ dans le cas contraire, on parle d'anomalie déséquilibrée, qui s'accompagne le plus souvent de
manifestations cliniques d'autant plus marquées que le déséquilibre est important.

Ces réarrangements peuvent concerner un seul chromosome ou plusieurs.

Réarrangements touchant un seul chromosome

Inversion péricentrique : deux cassures sur le chromosome, une de chaque côté du centromère.
Recollement après inversion du fragment centromérique. Conséquence : modification de l' indice
centromériquedu chromosome le plus souvent

Inversion paracentrique : deux cassures sur le même bras chromosomique et recollement après
inversion du fragment. Pas de modification de l'indice centromérique, cette anomalie ne peut être
détectée que par la modification des bandes chromosomiques.

Délétion : perte d'un fragment de chromosome. Il s'agit toujours d'une anomalie déséquilibrée. La délétion
est dite

➢ interstitielle quand il y a perte d'un fragment intermédiaire (deux points de cassure comme dans
l'inversion),

➢ terminale quand l'extrémité d'un bras chromosomique est concernée (un seul point de cassure)

Cas particuliers : les microdélétions :

Il s'agit, comme leur nom le suggère, d'une catégorie particulière de délétions de toute petite taille dont
la caractéristique principale est de ne pas être visibles sur le caryotype standard.

Ces pertes de matériel chromosomique concernent en effet au plus une sous-bande chromosomique
et ne sont dépistées qu'avec les techniques de haute résolution ou actuellement par hybridation in
situ fluorescente avec des sondes moléculaires spécifiques.

Cette dernière approche est à la fois plus sensible et plus spécifique que le caryotype haute résolution, mais
elle n'est applicable que quand la clinique est suffisamment évocatrice de tel ou tel syndrome pour orienter le
choix de la région chromosomique à explorer et donc de la sonde à utiliser.

23
Duplication : présence en double exemplaire d'une région chromosomique. Cette anomalie est toujours
déséquilibrée.

La duplication est dite

➢ directe si le fragment dupliqué conserve la même orientation que le fragment d'origine, et ➢

inversée si le fragment dupliqué a une orientation inverse.

Anneau : comme son nom l'indique, il s'agit d'un chromosome de forme circulaire.

Une telle image résulte d'une cassure sur chacun des deux bras du chromosome, suivie d'une fusion des
extrémités libres du bras court et du bras long ; les deux fragments distaux sont perdus.

Il s'agit donc toujours d'une anomalie déséquilibrée.

Réarrangements touchant plusieurs chromosomes Translocation

réciproque:

il s'agit d'un échange de matériel entre deux chromosomes non homologues après cassure sur chacun des
chromosomes impliqués.

Si cet échange s'accompagne d'une perte de matériel génétique, il est déséquilibré, sinon la translocation est
dite équilibrée.

Dans certains cas exceptionnels, une translocation réciproque peut impliquer trois voire quatre chromosomes
différents. Translocation robertsonienne :

cas particulier de translocation impliquant deux chromosomes acrocentriques (chromosomes 13, 14,
15, 21 et 22) dont le bras court de très petite taille ne code que pour des gènes répétés.

La translocation consiste en une fusion des chromosomes avec perte des bras courts, sans aucune conséquence
clinique directe pour le sujet porteur.

Insertion :

autre cas particulier de translocation ou un fragment de chromosome est inséré au sein d'un autre.
Cette anomalie nécessite trois points de cassure.

24
Conséquences des anomalies de structure

Les conséquences de ces anomalies sont variables en fonction du remaniement considéré.

. Si l'anomalie est équilibrée (ni perte ni gain de matériel génétique), il n'y a pas de conséquence clinique
pour le sujet porteur.

Toutefois, cette anomalie peut entraîner une diminution de la fécondité et/ou induire l'apparition
d'une anomalie dans sa descendance (anomalie chromosomique déséquilibrée ou disomie
uniparentale ) en favorisant les non-disjonctions méiotiques.

Si l'anomalie est déséquilibrée, les conséquences cliniques dépendent en règle générale du

nombre et de l'importance fonctionnelle des gènes impliqués dans le segment chromosomique en
excès ou en défaut.

Quand on considère le pourcentage du génome en déséquilibre, on constate en règle générale que

les déséquilibres en excès sont plus compatibles avec la vie que les déséquilibres en défaut pour un
segment donné.

VII- UTILISATION DE L’INFORMATION GENETIQUE Objectifs pédagogiques du

chapitre

25
 ➢ Connaitre en quoi l’utilisation de l’information génétique est important dans la pharmacologie, le
diagnostic biologique

Banques d’ADN

La recherche en génétique nécessite souvent la collecte d’échantillons d’ADN.

Il existe maintenant plusieurs banques d’échantillons d’ADN qui ont été bâties à partir
d’échantillons recueillis pour le dépistage néonatal ou pour des projets de recherche maintenant
terminés.

Diagnostic prénatal, reproduction assistée et sélection d’embryons La

reproduction assistée sert :

➢ aux couples infertiles,

➢ aux couples qui désirent éviter que leur enfant soit atteint d’une maladie héréditaire,

➢ à obtenir un bébé donneur optimal pour un frère ou une sœur en attente de greffe de moelle osseuse.

La possibilité de procéder à un diagnostic prénatal de conditions génétiques

➢ par biopsie des villosités choriales ou

➢ amniocentèse sous-entend que l’avortement thérapeutique est une des options qui s’offrent au couple
dont le fœtus est atteint de l’une de ces maladies. la reproduction assistée sert à éviter les maladies
héréditaires

➢ Drépanocytose

➢ Albinisme

➢ Beta thalassemie

Rôle en sante publique

➢ Dans la reproduction

• dépistage prénatal,

• dépistage de porteurs de maladies récessives) ou

• sur les nouveau-nés (dépistage néonatal),

➢ Au niveau de la pharmacogénétique

26
Reproduction

• dépistage prénatal,

Acide folique et anomalies du tube neural

• sur les nouveau-nés (dépistage néonatal) Le dépistage néonatal de la phénylcétonurie

Maladie génétique autosomique récessive (chromosome 12)

Technique permettant de mesurer le niveau de phénylalanine dans un échantillon de sang récolté sur
papier buvard.

SIGNES CLINIQUE: Retard spychomoteur, retard mental, epilepsie

Technique d’amplification des acides nucléiques

Principe de la PCR
Le principe consiste à amplifier un fragment d'ADN ou d’ARN servant de matrice,
obtenu après extraction à partir de prélèvements de nature diverses (sang, biopsies,
27
liquide céphalo-rachidien…), délimité par des amorces spécifiques (ou primer). Celles-ci
sont constituées d'un segment d’environ 20 paires de bases. Leur association à l'ADN
cible est suivie d'une élongation par la Taq-polymérase, aboutissant à la synthèse d'un
ADN double brin de longueur habituelle d’environ 1000 pb. Cette amplification est
répétée un certain nombre de fois afin d'obtenir une quantité d'ADN suffisante pour être
détectée et analysée. Les trois étapes, constituant un cycle de PCR (réaction par chaine de
polymérase), sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler
l’activité enzymatique :

• l’étape de dénaturation, est réalisée à environ 95°C, pour une dissociation

complète des deux brins d’ADN.
• l’étape d’hybridation se fait à une température qui sera définie selon la nature
des amorces (cette température varie de 50 à 60°C). Cette température va
déterminer la stabilité des hybrides une fois que l’appariement amorces /
matrice est réalisé.
• l’étape de polymérisation est à environ 72°C, température de « travail » de
l’ADN polymérase thermorésistante utilisée. Au cours de cette étape, les brins
complémentaires d’ADN sont synthétisés à partir des extrémités 3’OH libre
des amorces hybridées.
TAF : Citez les différents types de PCR et leurs applications.

28
Le séquençage du génome

Le séquençage d’ADN est devenu un outil essentiel en biologie moléculaire tant en médecine que
dans de nombreuses autres disciplines des sciences de la vie. Le séquençage a été décrit il y a
environ 30 ans et n’a cessé d’évoluer depuis cette période. Cette méthode est devenue une
technique courante dans les laboratoires de biologie moléculaire. Les connaissances acquises grâce
à cette méthode et la possibilité de séquencer des génomes de grande taille, tel que le génome
humain, ont amené les chercheurs à développer des techniques de séquençage de plus en plus
sophistiquées. Ce cours, composé de deux parties, présente les techniques actuellement utilisées
pour séquencer l’ADN, qu’il soit humain ou d’autre origine, et les méthodes de séquençage en
développement. Ces dernières constituent un réel bouleversement. Le séquençage à l’échelle
individuelle n’est plus loin. En dehors des problèmes éthiques qu’elle soulève, cette révolution
pose de nouvelles questions, par exemple : comment interpréterons-nous les nombreuses variations
génétiques observées chez un individu, quelles en seront les conséquences sur ses prédispositions
génétiques aux maladies et autres risques, quels en seront les retentissements sur le phénotype ? De
nombreuses études en cours cherchent les réponses. Dans tous les cas, la révolution est en marche.

Le séquençage de l'ADN :
Introduction :

La séquence d’ADN contient l’information nécessaire aux êtres vivants pour survivre et se
reproduire. Déterminer cette séquence est donc utile aussi bien pour les recherches visant à savoir
comment vivent les organismes que pour des sujets appliqués. En médecine, elle peut être utilisée
pour identifier, diagnostiquer et potentiellement trouver des traitements à des maladies génétiques
et à la virologie. En biologie, l'étude des séquences d'ADN est devenue un outil important pour la
classification des espèces.

Historique :
Les premières techniques de séquençage ont été développées en parallèle au milieu des années
1970. Les méthodes de Sanger (Grande-Bretagne) et Gilbert (Etats-Unis) ont toutes deux étés
récompensées d'un prix Nobel de chimie en 1980.

29
Le premier organisme a été séquencé en 1977. Il s'agissait du virus bactériophage φX174,
possédant un ADN simple brin ne nécessitant donc pas l'étape de dénaturation utilisé dans les
méthodes de Sanger et Maxam et Gilbert.
Depuis une trentaine d'année, l'amélioration de la technique de production des amorces, de
l'amplification des brins et la généralisation des traceurs fluorescents ont permis d'améliorer
considérablement les techniques de séquençage. L'apparition des séquenceurs automatiques a
notamment permis l'automatisation de ces technologies et ont contribué à la finalisation du
génotypage humain en 2003.

1.1 Définition de séquençage :

Le séquençage de l'ADN est une technique d'analyse de l'ADN, consiste à déterminer l'ordre
d'enchaînement des nucléotides pour un fragment d’ADN donné. Actuellement la technique de
séquençage repose majoritairement sur la méthode enzymatique de Sanger.

1.2 Les différents acteurs du séquençage :

• l'ADN provient des organismes dont on souhaite séquencer le génome. L'ADN, le plus
souvent sous la forme double-brin, est dénaturé afin de séparer les deux brins. Celui qui
sera séquencé s'appelle le brin « matrice »

30
 • les nucléotides, ou plutôt désoxynucléotides, sont les bases de l'ADN (A, C, G ou T). Ils
sont attachés les uns aux autres grâce à des liaisons chimiques nécessitant la présence
d'un groupement OH particulier (sur le carbone 3' du ribose)
• les didésoxynucléotides sont des nucléotides privés du groupement OH en position 3'.
Leur incorporation dans une chaîne d'ADN interrompt définitivement la synthèse de
l'ADN (voir figure 1).
• une amorce est un brin d'ADN très court (une vingtaine de nucléotide), qui peut
s'hybrider à une séquence complémentaire spécifique
• l'ADN polymérase est une enzyme qui a pour rôle de copier l'ADN, en synthétisant un
brin complémentaire au brin matrice. L'ADN polymérase ne fonctionne qu'en ajoutant
des nucléotides à une amorce déjà présente, en fonction de la succession de nucléotides
du brin matrice (un A est toujours positionné en face d'un T et un C toujours en face
d'un G).

1.3 Méthode de Sanger :

Figure 1 : les différentes formes des nucléotides.

Dans le ddATP, le groupement 3'-OH est remplacé par un hydrogène. Cette modification empêche la
poursuite de la synthèse de l'ADN qui continue normalement sur le 3-OH

Principe du séquençage par la méthode de Sanger :

Le principe de cette méthode consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l'aide d'un petit
oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer.
L’élongation de l’amorce est réalisée par une ADN polymérase I dépourvue d’activité exonucléase 5’→3’
et maintenue par des ADN polymérases thermostables, celles qui sont
31
utilisées pour la PCR. On utilise quatre tubes séparés contenant les quatre
désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), ainsi qu’une faible
concentration de l'un des quatre didésoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP,
ddGTP ou ddTTP).
Ces didésoxyribonucléotides agissent comme des « poisons » terminateurs de
chaîne : une fois incorporés dans le nouveau brin synthétisé, ils empêchent la
poursuite de l’élongation. Cette terminaison se fait spécifiquement au niveau des
nucléotides correspondant au didésoxyribonucléotide incorporé dans la réaction.
Pour le séquençage complet d'un même fragment d'ADN, on répète cette réaction
quatre fois en parallèle, avec les quatre didésoxyribonucléotides différents. Par
exemple, dans la réaction où on a ajouté du ddGTP, la synthèse s'arrête au niveau
des G. Le mélange réactionnel contenant, à la fois du dGTP et un peu de ddGTP,
la terminaison se fait de manière statistique suivant que l'ADN polymérase utilise
l'un ou l'autre de ces nucléotides. Il en résulte un mélange de fragments d’ADN
de tailles croissantes, qui se terminent tous au niveau d'un des G dans la
séquence. Ces fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur un gel de
polyacrylamide, ce qui permet ainsi de repérer la position des G dans la séquence
(voir figure 1).

Figure 1: Séquençage de l'ADN par la méthode de Sanger

La détermination de l'enchaînement des nucléotides dans un fragment d'ADN simple

brin par la méthode de Sanger comporte deux étapes:

33
 1- Synthèse du brin complémentaire d'un brin matrice à l'aide d'une polymérase à partir
d'une amorce, en présence des 4 dNTPs et d'un ddNTP qui joue le rôle de terminateur de
chaîne (absence de 3'-OH). Quatre réactions en parallèle sont nécessaires, chacune avec l'un
des
terminateurs présents en faible quantité.
2- Séparation par électrophorèse des fragments synthétisés, le nombre de ces fragments
dépend du nombre de résidus nucléotidiques. Donc la position des terminateurs dans la
séquence (figure 2).
La détection des fragments ainsi synthétisés se fait en incorporant un traceur dans
l'ADN synthétisé. Initialement ce traceur était radioactif ; aujourd'hui, on utilise
des traceurs fluorescents, attachés soit à l'oligonucléotide, soit au
didésoxyribonucléotide.

Principe de la Méthode de Maxam & Gilbert (1977)

Cette méthode utilise des échantillons d’ADN double brin et ne nécessite donc pas le
clonage de l’ADN dans un vecteur pour produire de l’ADN simple brin comme c’est le cas
pour la méthode de Sanger. Cette méthode est basée sur une dégradation chimique de l’ADN
et utilise les réactivités différentes des quatre bases A, T, G et C, pour réaliser des coupures
sélectives. Les réactifs sont résumés dans le tableau 1. En reconstituant l’ordre des coupures,
on peut remonter à la séquence des nucléotides de l’ADN correspondant.

Résumé: La biologie analytique a connu depuis quelques années une grande révolution en
conséquence des progrès technologiques de la biologie moléculaire appliquée au séquençage
des génomes. En effet, connaître l’enchaînement complet des bases nucléotidiques qui
constituent un génome, c’est connaître toute l’information nécessaire à la vie (du moins en
théorie). Ce n’est que récemment, avec la mise en place des Programmes Génome, que de
nombreux génomes, dont celui de l’être humain, sont aujourd’hui séquencés, et que d’autres
génomes sont en voie de l’être dans des délais de plus en plus raccourcis. Ces réalisations
spectaculaires, sont rendues possibles grâce aux développements extraordinaires des
techniques de séquençage que nous essayons de passer en revue dans ce cours. Nous avons
parlé du principe de base et l’évolution des techniques traditionnelles de Sanger et il ya aussi

34
les techniques de Maxam et pyroséquençage. Chaque approche a les avantages et les
inconvénients. Cependant il existe déjà une nouvelle génération de séquenceurs automatisés.

Technique d’hybridation

▪ L’hybridation moléculaire est la propriété que présente une molécule d’acide

nucléique monobrin de s’associer spontanément et de façon spécifique et réversible à
une autre molécule monobrin qui lui est complémentaire.
▪ L’hybridation moléculaire est permise par les liaisons hydrogènes que peuvent
établir les bases puriques et pyrimidiques qui constituent les deux brins d’acides
nucléiques.
▪ La force de liaison entre les deux brins d’ADN (ou d’ARN) dépend du nombre de
liaisons hydrogène qui lient les deux brins entre eux.

▪ La force de liaison entre les deux brins d’ADN (ou d’ARN) dépend du nombre de
liaisons hydrogène qui lient les deux brins entre eux.
L’hybridation moléculaire est :

Spécifique : sous certaines conditions expérimentales, un monobrin ne peut s'apparier

qu’avec un autre monobrin de séquence complémentaire.
Réversible : l’expérimentateur peut, en jouant sur les conditions expérimentales
(essentiellement la température du milieu réactionnel et sa composition) réaliser ou au
contraire supprimer (dissociation) l’hybridation de deux molécules.
▪ Détecter une molécule que l’on appellera « cible » (ADN, ARN ou une protéine)
dans un mélange en contenant des millions similaires ✓ Rechercher si un gène est
présent chez une personne donnée.
✓ Rechercher si un ARN est présent dans un type tissulaire donné (muscle).
✓ Rechercher si la protéine particulière est présente dans le sang d’une personne.

On veut identifier une molécule cible dans un ensemble de molécule similaire mais non
identique.
Pour cela on utilise une molécule appelée sonde qui va se fixer/hybrider spécifiquement
au type moléculaire recherché.

▪ On appel hybridation une association spécifique entre une sonde et une cible.

35
 Différents types de cibles
1. ADN:

- Rechercher si un gène est présent ou absent dans une cellule.

- Identifier un réarrangement d’un gène.

2. ARN:

36
 - Étudier l’expression d’un gène dans des conditions différentes.

- Détecter l’expression d’un gène dans un tissu donné.

3. Protéines:

- Rechercher la présence d’une protéine dans des conditions différentes.

- Détecter la présence d’une protéine dans un tissu donné.

Différents types de sondes

1. Les différents types de sondes :

- ADN : simple brin, pas de sonde double brins

- ARN appelé ribosonde
- Protéines: ces sondes sont dans la très grande majorité des cas des anticorps
2. Les propriétés d’une sonde:

- Reconnaître de manière spécifique la cible recherchée (notion de stringence).

- Émettre un signal (détection).
3. Les différents types de signaux portés par les sondes : -
Les signaux dits «chauds» →Émission de radioactivité
- Les signaux dits «froids » →Émission d’un signal lumineux

Principe de l’hybridation

•
Hybridation: Fixation spécifiques de la sonde au niveau de sa cible.

•
Lavage: Élimination des sondes qui ne sont pas fixées de façon
spécifique.

37
•
Détection: On recherche si du signal est encore présent dans l’échantillon après le lavage.

NB : Un signal = la cible est présente

Concepts clés
• Dans l’hybridation des acides nucléiques, des populations d’acides nucléiques ou
d’oligonucléo- tides bien caractérisées (sondes) sont utilisées afin d’identifier des
séquences apparentées dans un mélange complexe et souvent mal compris
d’acides nucléiques à tester.
• L’hybridation des acides nucléiques repose sur la spécificité de l’appariement des
bases. Les acides nucléiques de la sonde et du mélange complexe à tester sont
sous forme de simples brins et mélangés pour permettre la formation
d’hétéroduplex entre la séquence de la sonde et toute séquence de l’échantillon à
tester qui serait en partie ou en totalité (cible) complémentaire. • La stabilité d’un
hétéroduplexe dépend du nombre de bases appariées. Elle est affectée par cer-
tains paramètres comme la longueur du segment présentant des bases appariées,
la température, et la force ionique de l’environnement.
• Les sondes ADN ou ARN sont constituées en général de centaines de nucléotides
et utilisées pour identifier des séquences cibles présentant un haut degré de
similitude avec la sonde.
• De courtes sondes oligonucléotidiques (moins de 20 nucléotides de long) peuvent
être utilisées pour différencier des cibles qui ne diffèrent que par la position d’un
seul nucléotide.
• Les acides nucléiques sont marqués par incorporation de nucléotides porteurs
d’un isotope radioactif ou de radicaux modifiés chimiquement pouvant être
détectés par dosage approprié.
• De nombreuses techniques d’hybridation impliquent la liaison des acides
nucléiques contenant la cible à une surface solide, puis son exposition à une
solution contenant la sonde marquée. L’ADN immobilisé peut être isolé ou être
présent dans des cellules ou des chromosomes immo- bilisés.
• L’hybridation sur micropuces permet de faire de nombreux essais d’hybridation
simultanés. On fixe à la surface d’un support solide, sous forme d’une grille à
forte densité, des milliers d’ADN ou de sondes oligonucléotidiques non marqués
et on les utilise pour cribler des échantillons com- plexes en solution contenant un
mélange d’ADN ou d’ARN marqués.
• Les principales applications de l’hybridation sur micropuces sont celles qui
permettent d’établir un profil d’expression des gènes et d’analyser des
modifications de l’ADN.

38
Purification et quantification de l’acide nucléique

L'extraction de l'ADN et de l'ARN est une technique de base de la biologie moléculaire. Un

grand nombre d'applications de recherche et d'applications cliniques ont besoin d'acides
nucléiques de grande qualité et de haute pureté. La purification des acides nucléiques constitue la
première étape de nombreuses procédures en biologie moléculaire et génomique.

Les échantillons d'ADN ou d'ARN sont souvent obtenus à partir de préparations brutes. L'ADN
génomique, l'ADN plasmidique et l'ARN total peuvent être extraits et purifiés à partir d'une
diversité de sources : cellules bactériennes, cellules de mammifères, tissus végétaux, tissus
fongiques, tissus de mammifères, sang, plasma, sérum, virus, écouvillons nasaux et buccaux,
matrices de gel, PCR et autres réactions enzymatiques, par exemple. Isoler l'acide nucléique de
ces échantillons consiste souvent la lyser les membranes cellulaires ou à homogénéiser
l'échantillon, puis à éliminer les protéines, les enzymes, les détergents, les sels et les lipides.

Parmi les techniques couramment utilisées :

• Extraction alcaline
• Extraction au phénol-chloroforme
• Centrifugation en gradients de densité de chlorure de césium (CsCl)
• Chromatographie sur oligo(dT)-cellulose
• Matrice de silice
• Chromatographie d’échange d’anions
• Chromatographie d'exclusion stérique

La meilleure technique de purification sera dictée par l'application finale. Les applications en
aval comprennent la PCR, la qPCR, les digestions par enzymes de restriction, la ligature, le
clonage, le génotypage, l'analyse de l'expression génique, le séquençage de nouvelle génération
(NGS), ainsi que les analyses par northern blot et Southern blot.

39
Méthodes de quantification de l'ADN
Pièges et solutions
L'ADN est couramment quantifié par spectrophotométrie dans de nombreux laboratoires, mais
cette méthode présente certaines limites et n'est pas assez spécifique ou sensible pour certaines
applications. Les alternatives sont nombreuses et chacune a ses propres avantages et
inconvénients, mais aussi un volume d'échantillon et un équipement différents, ainsi que des
exigences différentes. Dans ce qui suit, nous allons examiner les méthodes de quantification de
l'ADN disponibles.

Spectrophotométrie UV utilisant l'absorbance à 260 nm

L'absorbance est la méthode de choix pour la quantification de routine de l'ADN et de l'ARN
depuis des décennies. Elle est simple et pratique à utiliser car aucun autre traitement de
l'échantillon (autre que l'extraction de l'ADN) ou réaction avec d'autres substances n'est
nécessaire. Cependant, elle n'est pas très spécifique (elle mesure tous les acides nucléiques dans
leur ensemble) et présente une sensibilité aux contaminants, de sorte qu'elle exige un ADN très
pur pour être précise. En savoir plus sur la pureté de l'ADN, la façon de la mesurer et son
incidence sur la quantification.

L'absorbance des échantillons d'ADN à 260 nm est actuellement le plus souvent mesurée à l'aide
d'un spectrophotomètre à microvolume, mais il est également possible d'utiliser un
spectrophotomètre à cuvette ou un lecteur de microplaques.

Dans cette méthode, la concentration d'une substance est calculée selon la loi de Beer-Lambert
en fonction de son absorbance. La formule suivante peut être obtenue à partir de la formulation
originale de la loi:

Où A = absorbance à une longueur d'onde donnée, ε = coefficient d'extinction, b = longueur du

trajet du spectrophotomètre, c = concentration de l'échantillon.

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Ainsi, pour une longueur de trajet de 1 cm, la concentration est égale à l'absorbance à 260 nm (le
pic d'absorption des acides nucléiques), divisée par le coefficient d'extinction.

Les techniques d'amplification des acides nucléiques utilisent l'extraction d'infimes quantités
d'ADN ou d'ARN et les répliquent de très nombreuses fois, permettant ainsi de détecter des
traces minimes d'un microrganisme dans un prélèvement, sans avoir à recourir à une culture.

Absorption de la lumière ultraviolette

La propriété d'absorption des purines et pyrimidines dans l'UV à 260 nm, et les
protéines à 280nm permet de doser les acides nucléiques (C: concentration), et aussi
bien d'estimer la contamination par les protéines lors de la purification des acides
nucléiques.
C = A260*DF*100 (unité: µg/µl A: Absorbance, DF: facteur de dilution)

P (pureté) = A260 /A280 (Une solution d'ADN est considérée pure si 1.7 ≤ P ≤ 2)

Précipitation des acides nucléiques

Elle se fait le plus souvent par addition répétée des solutions d’alcool qui suffisent à
débarrasser l’acide nucléique des protéines contaminantes et enzymes. Elle a pour but de
récupérer les acides nucléiques sous forme solide. Ainsi protégés, ils pourront après séchage
être résolubilisés à la concentration souhaitée.

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En présence d’alcool, les brins d’ADN se regroupent et forme une pelote non soluble favorisant
ainsi l’interaction ADN-Alcool au dépend de l’interaction ADN-ADN. Diverses solutions
alcooliques peuvent être utilisées pour la précipitation. On a par exemples :

✓ Précipitation à l’alcool éthylique à haute force ionique. L’éthanol à forte concentration

précipite presque totalement les acides nucléiques. Récupérer le précipité par
centrifugation

✓ Précipitation à l’isopropanol : même principe que précédemment sauf que le sel n’est pas
nécessaire et que les petits fragments d’ADN sont éliminés car non précipités. La solution
d’ADN, portée à haute force ionique par addition de NaCl 3 M (1/10 du volume), est
additionnée d’un large excès d’éthanol absolu à -20°C. Au bout de quelques minutes au
maximum, on voit apparaître un précipité blanchâtre, translucide et filamenteux (la «
méduse
») constitué de longs filaments d’ADN précipité. On recueille ce précipité par centrifugation à
10000 g pendant un quart d’heure environ. Pour laver l’ADN on resuspend le précipité dans de
l’éthanol à 75 % toujours à -20°C. puis on centrifuge à nouveau. Le culot de cette dernière
centrifugation est égoutté, puis séché sous vide. On peut conserver l’ADN à sec ou le
redissoudre immédiatement soit dans de l’eau pure stérile, soit dans un tampon Tris-EDTA.

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