Volume numéro 259,213-2161, FEB 07985 Décembre 1989

Une mutation ponctuelle unique confère une insensibilité à la

tétrodotoxine et à la saxitoxine sur le canal sodium II

Masaharu Noda *0, Harukazu Suzuki+0 **, Shosaku Numa0 et Walter Stiihmer+.
0
Départements de chimie médicale et de génétique moléculaire, Faculté de médecine de l'Université de Kyoto, Kyoto, Japon 606,et
+ Max-Planck-lnstitutfur biophysikalische Chemie, D-3400 Gottingen, RFA

Reçu en novembre 131989

Une mutation ponctuelle unique du canal sodique II du rat réduit sa sensibilité à la tétrodotoxine et à la saxitoxine de plus de trois ordres de grandeur. La
mutation remplace l'acide glutamique par387 une glutamine et n'a que de faibles effets sur les propriétés macroscopiques du courant, mesurées
sous voltage-clamp dans des ovocytes de Xenopus injectés avec l'ARNm correspondant dérivé de l'ADNc.

Mutagenèse dirigée ; expression d'ADNc ; canal sodique ; tétrodotoxine ; saxitoxine ; (ovocyte de Xenopus)

1. INTRODUCTION La transformation du résidu d'acide 387 en glutamine

Le canal sodique dépendant du voltage est une
protéine membranaire essentielle à la génération de
potentiels d'action dans les cellules excitables [1]. Les
structures primaires de plusieurs types de canaux
sodiques ont été obtenues par clonage et séquençage
d'ADNc [2- 7]. L'injection d'ARNm dérivés des ADNc
clonés dans des ovocytes de Xenopus conduit à
l'expression fonctionnelle des canaux sodiques. Les
courants sodiques enregistrés à partir des oocytes
injectés se sont révélés similaires à ceux enregistrés à
partir de cellules excitables (8-10).
Il est bien connu qu'un grand nombre de toxines
biologiques modifient les propriétés des canaux
sodiques. Jusqu'à quatre sites de liaison de toxines ont
été postulés pour le canal sodique [11], dont l'un est le
site de liaison de la TTX et de la STX. L'occupation de
ce site, que l'on pense être situé près de l'embouchure
extracellulaire du canal, bloque le flux d'ions sodium.
On a supposé que le site de liaison de la TTX et de la
STX contient des groupes fonctionnels chargés
négativement en raison de l'inhibition de la liaison des
toxines par des réactifs modificateurs de carboxyle [12-
16], certains cations monovalents, des ions métalliques
divalents et des protons [17]. Nous rapportons ici qu'une
mutation ponctuelle unique du canal sodique II du rat,
qui modifie le groupe glutamique du site de la toxine, a
permis d'obtenir des résultats positifs.
Adresse de correspondance : W. Stuhmer, Max-Planck-lnstitut fur
biophysikalische Chemie, Postfach D-34002841, Gottingen, RFA.
• Adresse actuelle : Max-Planck-Institut fiir Entwicklungsbiologie, D-
7400 Ttibingen, RFA
-- Adresse actuelle : Institut Shionogi des sciences médicales, Settsu
Shi, Osaka Japon566,
Abréviations :
TTX,tétrodotoxine ;STX ;saxitoxine ;
TMO, triméthyloxonium
(E387Q) rend le canal insensible aux concentrations de
TTX et de STX jusqu'à 10 µM, alors qu'elle n'affecte
que légèrement les propriétés macroscopiques du
courant.
2. MATÉRIAUX ET MÉTHODES
Les codons pour les résidus de glutamine 86 et 88 dans le gène de
la ,6'-lactamase [18] de pBSMl3( +) et ( - ) (Stratagene) ont été convertis
en codons ambrés en remplaçant le fragment Dde I I HpaII de 37 paires de
bases par de l'ADN synthétique pour obtenir les vecteurs pKMN( +) et
( - ), respectivement. Les vecteurs pKMN( +) et ( - ) peuvent exprimer
le phénotype résistant à l'ampicilline uniquement lorsque des souches
portant des suppresseurs sup£ sont utilisées comme bactéries hôtes.
Ils sont donc utiles pour la mutagenèse dirigée par oligonucléotide
par l'approche de l'ADN duplex gapped [19]. Le fragment
XbaI(541)/Smal(1898) de pRII-2 [8] a été sous-cloné dans pBSM13(
+) et pKMN( +) pour donner pBSRIIXS et pKMNRIIXS, respectivement.
L'ADN simple brin ( +) a été préparé à partir de pKMNRIIXS en
utilisant le phage auxiliaire R408 [20]. Le fragment de pBSRIIXS
contenant le vecteur Tthl 111(1038)/Ncol(l275) de 4,3 kilobases
paires (kb) a été isolé sous forme d'ADN double brin. Le résidu
d'acide glutamique 387 du canal sodique II de rat a été muté en
glutamine (E387Q) en utilisant l'oligonucléotide synthétique 5'-
ATAAAGGTTTT GCCAGAAGTCTTGAGTCATGAG-3' comme
décrit dans [19]. Le fragment Apal(721)/Xmal(l896), isolé d'un
plasmide portant cette mutation, a été substitué au fragment
correspondant de pRII-2A [21] pour donner pRIICM-1. Les ARNm
spécifiques du type sauvage (pRII-2A) et du canal sodique mutant ont
été synthétisés in vitro en utilisant des plasmides clivés par Sa/I
comme modèles [8,21].
Des oocytes de Xenopus laevis ont été injectés avec l'ARNm de type
sauvage (0,2 µg/µI) ou l'ARNm mutant (0,3-0,5 µg/µl) et incubés
pendant 4-7 jours [22]. Les mesures des courants macroscopiques
dans les plaques de membranes attachées aux cellules ont été faites
comme décrit précédemment [9] et analysées comme détaillé dans (21).
La sensibilité aux toxines a été évaluée en perfusant une solution externe
contenant du TTX ou du STX et en mesurant les pics de courant
entrant dans les cellules entières à l'aide d'une pince à tension à deux
électrodes (8,9). Le bain externe et la solution de la pipette avaient la
composition suivante (en mM) : NaCl KC115, ! 2.5, CaCh Hepes
(1.8,10pH7.2 ). Le TTX a été
de Sigma, et STX de Calbiochem.
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1
3. RESULTATSA
200
Enregistrements actuels pour le canal sodium II de type sauvage i
(A) et le mutant E387Q (B) sont présentés dans la fig. I. 100 - 0

Des impulsions de dépolarisation à partir d'un potentiel

V {mV) B◊
-60◊ 30 O
de maintien de - 100 mV jusqu'à des potentiels de test 6090
entre - 60 et + 90 mV ont provoqué des courants de 0 °o
0 -100 0 ◊
sodium avec des propriétés similaires. La principale 0 .j. ◊
différence entre les canaux de type sauvage et mutant ◊◊◊
est le courant sortant plus important par rapport au -3001
courant entrant chez le mutant. Les relations courant-
tension à l'échelle du type sauvage et du mutant B
permettent une comparaison plus détaillée (fig.2A). La
dépendance en tension de l'activation du mutant est 100 _j
2040
décalée vers la gauche d'environ 15 mV par rapport au 80 100
type sauvage ; cependant, le potentiel d'inversion des
courants de sodium est proche du potentiel d'équilibre
de Nernst attendu. Ceci indique que la sélectivité pour
les ions sodium n'est pas grandement affectée par la
mutation. La figure 2B compare les relations courant-
tension pour les courants de queue du type sauvage et -500
des canaux mutants. La relation courant-tension de
queue instantanée est moins courbée pour le mutant que Fig.2. (A) Relations courant-tension de pointe pour le canal sodium II
de type sauvage (diamants) et le mutant E387Q (cercles). Les
pour le type sauvage, alors que le potentiel d'inversion amplitudes de courant pour le type sauvage ont été réduites d'un
n'est pas affecté. Dans des expériences telles que celles facteur cinq pour permettre une meilleure comparaison. (B) Relations
montrées dans la fig.1B, des traces de courant courant-tension pour
biphasiques ont été observées près du potentiel courants de queue après une impulsion de dépolarisation de 0,5 ms à +
mV30. Les courants sauvages
d'inversion. Nous attribuons ceci à une réduction du
Les amplitudes des courants de queue de type ont été réduites d'un
courant ionique qui rend le courant de gating plus facteur de sorte 1.2que les courants sortants deviennent comparables.
évident. Une estimation approximative de la densité des Toutes les données ont été obtenues à partir de macro-patchs.
canaux peut être dérivée de la taille des courants de
gating mesurés près du potentiel d'inversion. Sur la base de 50% (/Cso) dans le type sauvage était de 18 nM
de cette estimation, une diminution d'environ quatre fois (fig.4A), en accord étroit avec les valeurs obtenues
du courant entrant peut être obtenue. Ces résultats précédemment [8,23,24]. La sensibilité au STX, qui
soutiennent l'hypothèse que la conductance entrante est entre en compétition avec le TTX pour le même site de
réduite dans le mutant E387Q. liaison, a également été essentiellement abolie dans le
La différence la plus spectaculaire entre le type mutant E387Q (fig. 4B). La mutation a réduit la
sauvage et le mutant E387Q est une perte virtuelle de sensibilité à la fois au TTX et au STX de plus de trois
sensibilité au TTX et au STX résultant de la mutation. ordres de grandeur.
La figure 3 montre que 1 µM de TTX appliqué en
externe n'a eu aucun effet sur les enregistrements de
courant obtenus à partir du mutant (même après min4). A
La concentration de TTX qui a réduit le

500pA
B
2ms

= 15°C.

Fig.1. Réponses du courant aux étapes de dépolarisation entre - et 60+

90mV, par étapes de 10 mV à partir d'un potentiel de maintien de - 100
mV (A) Canal sodium II de type sauvage (moyenne des
enregistrements4). (B) Mutant E387Q (moyenne des
enregistrements16). Les courants indiqués ont été obtenus à partir de
macro-patchs dans la configuration attachée à la cellule après
soustraction des courants linéaires de fuite et capacitifs. Température
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de dépolarisation étaient entre

A - et60 + mV30, par pas de mV10 à partir d'un1µ potentiel de maintien
de - mV80. Température = 23°C. (A) Contrôle. (B) Quatre minutes
après per- fusion avec une solution extracellulaire
1ms contenant µM1 de
TTX.
Fig.3. Réponses en courant de la cellule entière du mutant E387Q
enregistrées avec une pince à tension à deux électrodes. Les étapes

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1
A Les canaux sodiques modifiés chimiquement ont une
100
petite conductivité monocanal avec une relation
courant-tension instantanée plus linéaire que celle des
canaux sodiques non modifiés [28]. Cependant, les
canaux chimiquement modifiés conservent leur
perméabilité sélective aux ions sodium [15]. Nos
résultats ressemblent à ces observations et suggèrent
donc que l'effet inhibiteur des réactifs modificateurs de
carboxyle sur la liaison de la toxine peut impliquer la
modification du résidu acide glutamique. 387.
Les canaux sodiques insensibles au TTX présents

.....
dans certaines lignées cellulaires de neuroblastomes
B [29] ou dans des cellules musculaires de rat dénervées
[30] présentent la même sélectivité élevée pour les ions
100
sodium que les canaux sodiques sensibles au TTX. Il a
\ été démontré que les canaux sodiques insensibles au
TTX dans les myoblastes ont une conductance
monocanal inférieure à celle des canaux sodiques
sensibles au TTX et peuvent être activés à des potentiels
plus hyperpolarisés [31], comme c'est le cas pour le mu
0 I\IO....o.,.. O LJ
tant E387Q. Il est intéressant de noter que l'isoforme
1

putative du canal sodique du cœur de rat résistant au

-11
10 9-7-5
101010
[Sax,toxine] (MI
Fig.4. Courbes dose-réponse pour le type sauvage (cercles ouverts) et
le mutant E387Q (cercles remplis) au TTX (A) et au STX (B). Les
lignes lisses sont ajustées aux cercles ouverts selon l'équation
suivante
y = (1 + (T//C50)" )- 1, où T est la concentration de la toxine et n la
concentration de la toxine.
Coefficient de Hill. Les barres d'erreur sont ± SD et ne sont indiquées
que lorsqu'elles sont plus grandes que la taille du symbole. (A) Pour
le type sauvage, la valeur /Cso pour le TTX est de 18 nM avec un
coefficient de Hill de 1. 1. La moyenne des données a été calculée à partir
de 8 expériences (7type sauvage) et (mutant). (B) Pour le type
sauvage, la valeur ICso pour STX est de nM2.7 avec un coefficient de
Hill de Les données1.1. ont été moyennées à partir d'expériences (4type
sauvage) et (7mutant).
TTX, dont la séquence d'acides aminés a été récemment
rapportée [7], présente des substituts de la protéine
E387Q.
tion d'un résidu arginine pour l'asparagine conservée à
côté de l'acide glutamique correspondant à cette
neutralisé dans le mutant E387Q. Cette substitution peut
provoquer un effet similaire à celui de la neutralisation de
l'expression
potassique voltage-dépendant est impliqué dans la liaison
de la charybdotoxine [27].
Il a été suggéré qu'un oxygène carboxyle chargé
négativement est essentiel pour la liaison de la TTX et de
la STX au canal sodique, en partie parce que la
méthylation 0- d'un tel groupe par TMO réduit
considérablement la sensibilité à la toxine [15,16].
Modifié par TMO, résistant au TTX

4. DISCUSSION
Les résultats présentés ici montrent que le
remplacement du résidu d'acide glutamique 387 par de
la glutamine réduit fortement la sensibilité du canal
sodique II de rat au TTX et au STX. Ce résidu d'acide
glutamique, qui est conservé dans tous les canaux
sodiques dont la séquence est connue, est situé entre les
segments S5 et S6 de la répétition I. Selon les modèles
actuels de la topologie transmembranaire du canal
sodique [2,3,25], la région entre les segments S5 et S6
est assignée au côté extracellulaire de la membrane. Nos
résultats confirment cette attribution puisque le site de
liaison du TTX et du STX est connu pour être situé sur
le côté extracellulaire [26]. Dans ce contexte, il a été
récemment rapporté qu'un résidu d'acide glutamique
situé dans la région correspondante d'un canal
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charge négative du résidu 387 de l'acide glutamique
dans le canal sodium II du rat.
On pense que le site de liaison de la TTX et de la
STX est situé près de la bouche du canal sodique [26].
Puisque l'affinité pour la liaison des toxines peut être
modifiée sans affecter la sélectivité ionique, il est peu
probable que les mêmes charges négatives soient
impliquées à la fois dans la liaison de ces toxines et
dans la sélectivité ionique du canal. Néanmoins, on
pense que les sites de liaison de la toxine et de
sélectivité sont proches puisque les modifications
chimiques qui affectent la liaison de la toxine réduisent
le courant entrant [28]. Cette réduction du courant
entrant peut être attribuée à la plus faible concentration
extracellulaire d'ions sodium près du pore ionique qui
résulterait de la diminution localisée de la charge
négative. Le courant sortant serait alors moins affecté
que le courant entrant. C'est le cas pour le mutant
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E387Q, dans lequel le courant sortant semble augmenter
par rapport au courant entrant. Les données suggèrent
donc que la région entre les segments S5 et S6 dans la
répétition I du canal II de sodium est à proximité de la
bouche du canal.
Remerciements : Nous remercions les Ors Keiji Imoto et Michael
Cahalan pour leur lecture critique du manuscrit. Cette étude a été
soutenue en partie par des subventions de recherche du Ministère de
l'éducation, de la science et de la culture et de l'Agence des sciences
et de la technologie du Japon, de la Fondation Mitsubishi et de la
Fondation japonaise du métabolisme et des maladies.
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