Cours Effec de R Enzym-2

Génie enzymatique
M1 Biotechnologie Microbienne
Dr. Mataoui H./ université Djilali Bounaama/ khemis-Miliana /

1
Ain defla
Chapitre 3:
Effecteurs de la réaction enzymatique
(Facteurs influençant la cinétique enzymatique)
Dr. Mataoui H./ université Djilali Bounaama/

khemis-Miliana / Ain defla
2022/2023 2
Les enzymes sont des protéines qui catalysent des réactions
chimiques qui ont lieu dans les systèmes biologiques. Ces
catalyseurs déterminent le profil de certaines
transformations chimiques. La cinétique enzymatique a le
même objectif que la cinétique chimique qui peuvent être
soumis à un environnement qui influence
le déroulement de la réaction chimique/enzymatique
Dr. Mataoui H./ université Djilali Bounaama/ khemis-miliana/

Ain defla
Qu’est ce qui influence l'activité enzymatique?
Qu’est ce qui influence la réaction enzymatique?
Qu’est ce qui influence la cinétique enzymatique?

Ain defla
De nombreux facteurs et effecteurs modulent l’activité des enzymes
Le substrat, le produit, l’enzyme, les ions, le pH, la température, les

coenzymes et l’énergie sont les facteurs indispensables à la réaction
enzymatique.
Les autres molécules (les ligands) qui se fixent par des liaisons spécifiques
avec l’enzyme et qui ont un effet sur la cinétique de la réaction enzymatique
sont les effecteurs

Ain defla
I/ Les facteurs qui influencent la réaction enzymatique
1. L’activité des enzymes dépend la concentration d’enzyme
2. L’activité des enzymes dépend de leur environnement
2.1. Effet de la concentration de substrat
2.2. Les facteurs physico-chimiques
2.2.1. Effet du pH
2.2.2. Effet de la température
Ain defla
II/ Les effecteurs qui influencent la réaction enzymatique
3. L’activité des enzymes dépend des inhibiteurs
3.1. Inhibition compétitive

3.2. Inhibition non compétitive
3.3. Inhibition incompétitive ou anticompétitive (IAC)
3.4. Exemple d’application

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4. L’activité des enzymes dépend des activateurs
4.1. Les ions métalliques

4.2. La protéolyse limitée (Pro-enzyme)
4.3. Modifications covalentes

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1. Effet de la concentration d’enzyme
Plus la concentration en enzyme est élevée plus la vitesse de la réaction augmente donc la vitesse de la
réaction est proportionnelle à la concentration en enzyme. Pour trois concentrations différentes en même
enzymes nommées [E1] ˂ [E2] ˂ [E3] nous remarquons que la vitesse initiale lorsque la concentration de
l’enzyme est grande (par exemple E3) est plus grande que lorsque la concentration de l’enzyme est petite
(par exemple E1).

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En représentant les vitesses initiales en fonction des concentrations
[E1], [E2] et [E3] de l’enzyme.
Il apparaît que les vitesses mesurées sont linéairement
proportionnelles aux concentrations de l’enzyme utilisées.

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Cette constatation est le fondement du dosage enzymatique :
en effet, la vitesse initiale d’une réaction enzymatique dans un
milieu où la concentration de l’enzyme est inconnue est
proportionnelle à cette concentration.

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On peut mesurer ces vitesses initiales en calculant la différence de concentration de

produit au cours d’un temps donné, pour chaque concentration du substrat.
Lorsque la concentration du substrat est grande la vitesse initiale est plus grande que
lorsque la concentration du substrat est petite.
Mais à partir de certaines concentrations en substrats >> Km, la vitesse de la réaction
reste stable. La relation entre la vitesse de la réaction et la concentration en substrat
n’est plus linéaire.
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2.1.1. Effet du pH

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3. Effet du pH
Parmi les facteurs qui interviennent il y a aussi des facteurs physiques et
chimiques : Le pH intervient de deux manières différentes :
soit en modifiant la structure secondaire ou tertiaire de l’enzyme,
soit en modifiant les charges électriques des radicaux des acides aminés du site
actif.

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Lorsqu’une enzyme est conservée dans un milieu dont le pH est défavorable au
maintien de sa structure, elle va subir une dénaturation.
Le milieu dans lequel se produit la réaction enzymatique détermine la charge
électrique des radicaux des acides aminés de la protéine.
(e) efficacité enzymatique

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• Aux pH très acides la plupart des fonctions ionisables de ces radicaux sont sous la forme
protonée c’est à dire COOH pour la fonction acide carboxylique et NH3+ pour la fonction
amine.
• Aux pH les plus alcalins les fonctions ionisables de ces mêmes radicaux sont sous la
forme déprotonée c’est à dire COO- pour la fonction acide carboxylique, et NH2 pour la
fonction amine.
• A pH voisin de la neutralité, une très grande majorité de ces radicaux à fonctions
ionisables sont chargés ce qui facilite les liaisons enzyme-substrat ou enzyme-coenzyme de
type électrostatique.
• Il existe donc un pH du milieu réactionnel où les charges électriques des radicaux du site
actif de l’enzyme seront les plus favorables à la liaison enzyme-substrat : on appelle ce pH
le pH optimum de la réaction enzymatique.

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2.1.2. Effet de la température

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4. Effet de la température
Le graphe représente les quantités de substrat transformées par une enzyme en

fonction de la température (θ) du milieu d’incubation.
Nous observons une courbe ascendante jusqu’à une température optimale (ici 45°C.) où
l’activité de l’enzyme est la plus grande, puis rapidement descendante.
• Au-dessus de la température optimale, la chaleur dénature les structures secondaires
et tertiaires de l’enzyme et l’activité tend rapidement vers zéro.
• Pour les températures inférieures à la température optimale, la chaleur du milieu
apporte un supplément d’énergie qui facilite la réaction enzymatique.
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Généralement, la dénaturation est négligeable en dessous
de 30°C et commence à être appréciable au-delà de 40°C.
Quelques enzymes gardent une activité importante à des

températures bien supérieures à 40°C cas des enzymes des
bactéries thermophiles.

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II/ Les effecteurs qui influencent la réaction enzymatique
Les effecteurs sont des molécules qui ont deux propriétés:
• elles se fixent spécifiquement sur l'enzyme,
• elles ont un effet sur la cinétique de la réaction.
Peuvent avoir un effet positif ou négatif. Ils peuvent favoriser ou

au contraire contrarier le déroulement de la réaction.
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On dit que M1 est un activateur car pour une même concentration
en Substrat ([S]), la vitesse de réaction (Vi) augmente également.
On dit que M2 est un inhibiteur.
Les effecteurs qui accélèrent la réaction sont les activateurs.

Ceux qui la ralentissent sont les inhibiteurs.

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5. Effet des inhibiteurs
Dans le cas des enzymes michaeliennes nous distinguons trois

types d’inhibiteurs :
* compétitif,
* non compétitif
* et anti-compétitif.

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Les inhibiteurs sont des substances qui inactivent les enzymes; Il existe deux
principaux types d’inhibition:
Inhibition réversible des enzymes: l’activité enzymatique peut être retrouvée

en enlevant l’inhibiteur .
Inhibition irréversible des enzymes: l’inhibiteur lie l’enzyme de manière

covalente, inactivant ce dernier de façon irréversible.

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L’inhibition réversible
• Compétitive
• Non Compétitive
• InCompétitive

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5. Effet des inhibiteurs Inhibition compétitive

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Lorsque la liaison d’un inhibiteur sur l’enzyme a pour effet

d’empêcher la liaison enzyme-substrat, on parle d’inhibition
compétitive vis à vis de ce substrat.
Ain defla
Concurremment à la liaison enzyme-substrat il y a une liaison enzyme-
inhibiteur qui aboutit à un complexe EI inactif.
L’inhibiteur compétitif est un analogue structural de substrat qui ne
peut se fixer que sur l’enzyme libre et ne pourra jamais se lier à
l’enzyme complexée avec son substrat (ES).
Donc impossible d’avoir un complexe ternaire ESI. L’inhibiteur

compétitif ne modifie pas la vitesse maximale de réaction (Vmax reste
constante) par contre cet inhibiteur diminuera l’affinité de l’enzyme vis-
à-vis de son substrat.
Donc Km en présence de l’inhibiteur est supérieur au Km en absence de
l’inhibiteur.
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5.2. Inhibition non compétitive :
L’inhibiteur non-compétitif se fixe sur un site totalement
différent du site actif de l’enzyme → pas de compétition
entre le substrat et l’inhibiteur.
Il se produit une diminution de la vitesse maximale sans aucune
modification du Km car il n’y a pas de compétition entre le
substrat et l’inhibiteur pour le site actif

Ain defla
L’inhibiteur en se liant rend la molécule d’enzyme incapable de catalyser

la réaction : on parle alors d’inhibition non compétitive.

Ain defla

Ain defla
Toutes les molécules d’enzyme (complexées ou non avec le substrat)
peuvent entrer en liaison avec l’inhibiteur. Le complexe enzyme- substrat
donne un complexe enzyme-substrat-inhibiteur inactif.
L’enzyme libre en s’associant avec l’inhibiteur donne un complexe

enzyme-inhibiteur qui peut lui-même lier une molécule de substrat, en
donnant un complexe ESI, identique à celui obtenu à partir du complexe
ES et bien sûr inactif.

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La constante Km de l’enzyme vis à vis du substrat représente
toujours la constante de dissociation du complexe ES mais aussi
celle du complexe ESI en EI et substrat libre.
Les constantes Km en absence et en présence de l’inhibiteur

sont égales, par contre la Vmax diminue en présence de
l’inhibiteur comparant au Vmax en absence de l’inhibiteur.

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5.3. Inhibition incompétitive ou anticompétitive(IAC):

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L’inhibiteur anticompétitif ne se fixe j’amais
sur l’enzyme libre. Il ne peut se fixer que sur
le complexe ES, la fixation de S sur E permet
la fixation de I et empêche la formation du
produit.
La liaison du substrat sur l'enzyme
entraîne une modification de l'enzyme,
révélant ainsi un site de fixation pour
l'inhibiteur. L'inhibiteur, en retour, modifie
la conformation du site actif de l'enzyme, et
empêche la réaction.

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Comme l’inhibiteur anticompétitif ne peut se fixer qu’après fixation de
substrat, dans ce cas la présence de cet inhibiteur favorise la fixation de
substrat.
L’affinité de l’enzyme vis à vis du substrat augmente en présence de

l’inhibiteur (donc Km diminue= 1/const affinité).
Une partie de ES reste bloquée sous forme ESI, donc Vmax est diminuée

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5.4. Exemple d’application
On a étudié le mécanisme cinétique d’une enzyme en mesurant les

vitesses initiales de la réaction, exprimées en micromoles de produit
formé par min par gramme d’enzyme, à différentes concentrations de
son substrat (exprimées en mM). La même étude a été réalisée en
présence de son inhibiteur I.

Ain defla
En absence En présence
d’inhibiteur d’inhibiteur
1/ vmax 0.1 0.17
(µmole/min/g)-1 (µmole/min/g)-1
vmax 10 5.88 µmole/min/g
µmole/min/g
1/Km 0.02 mM-1 0.02 mM-1
Km 50 mM 50 mM

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La figure suivante représente la courbe linéarisée de Lineweaver-Burk (1/Vi = f (1/[S])

Ain defla
Quel type d’inhibiteur est utilisé dans
cette réaction?

Ain defla
En étudiant les paramètres cinétiques de cette réaction en
absence et en présence de son inhibiteur, nous constatons que :
Vmax(en absence d’inhibiteur) ˃ Vmax’ (en présence d’inhibiteur)
Km(en absence d’inhibiteur) = Km’ (en présence d’inhibiteur)
Donc cet inhibiteur est non compétitif

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Les inhibiteurs irréversibles
Ils se lient de façon covalente au site important de
l’enzyme entrainant une inhibition définitive, l’inhibiteur
est dit inhibiteur suicide.

Ain defla
Ref L3 l’introduction au génie
enzymatique
Ain defla
4. Effet des activateurs
Définition
Toute molécule ayant pour une action positive sur la vitesse de la

réaction.

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4.1. Les ions métalliques
Les activateurs les plus courants sont des ions métalliques comme le
Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ et Co (Cobalt), Zn, Mo (molybdène) qui sont des
oligoéléments.
Leur rôle est de favoriser une bonne configuration de l'enzyme pour

une meilleure fixation de substrat ou bien de participer directement à
la catalyse.
ex : l’ADN polymérase nécessite le Mg2+ .

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4.2. Modifications covalentes
Modifications covalentes: l’enzyme peut exister entre deux

formes interconvertibles, l’une active et l’autre non-active,
ex : phosphorylation et déphosphorylation.

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A = activateur
k'3 > k3
On a Vi = k'3 . [EAS]
ce qui a pour
conséquence d'augmenter
Vi.

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Ici on note que -1/k M
ne varie presque pas.
Donc l'activateur
n'intervient pas dans la
fixation du substrat

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4.3. La protéolyse limitée (Pro-enzyme)
Définition
Une proenzyme, ou zymogène, est un précurseur

inactif d'une enzyme, c'est-à-dire qu'elle ne catalyse
aucune réaction comme le font les enzymes. Pour
l'activer, il faut un changement biochimique dans la
structure par clivage spécifique de liaisons
peptidiques, permettant l’apparition du site actif, ex :
la chymotrypsine.
Ain defla
Par exemple:
Les enzymes coagulants (ex coagulation du lait) d’origine animale
sont des protéases gastriques. Les plus employés sont la présure
(constitué principalement de chymosine), les pepsines; bovine,
porcine et de poulet.
Ces protéases sont formées à partir d’un précurseur (zymogène),

forme inactive, secrété par la muqueuse gastrique. Le zymogène
de la pepsine est appelé pepsinogène alors que celui de la
chymosine est appelé prochymosine.

Ain defla
Comparé à l’enzyme actif, le zymogène possède un segment
peptidique supplémentaire liée de la partie N-terminal de
l’enzyme actif.
Au niveau de la structure tridimensionnelle, cette chaîne
peptidique, souvent nommée pro-segment, occupe le site actif et
sert à bloquer l’entrée du substrat.
Ainsi l’activation du pro-enzyme nécessite la libération du pro-
segment et la dissociation de ce dernier du site actif.
Les zymogènes gastriques, stables à pH neutre, sont convertis en
enzyme actif sous l’effet de l’acidité naturelle du milieu stomacal.
La conversion à lieu à des pH inférieur à 5.

Ain defla
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Qu’est ce qui influence la cinétique enzymatique?

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Le substrat, le produit, l’enzyme, les ions, le pH, la température, les

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1. L’activité des enzymes dépend la concentration d’enzyme

2. L’activité des enzymes dépend de leur environnement

2.1. Effet de la concentration de substrat

2.2. Les facteurs physico-chimiques

3. L’activité des enzymes dépend des inhibiteurs

3.1. Inhibition compétitive

3.4. Exemple d’application

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2.1. Effet de la concentration de substrat

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On peut mesurer ces vitesses initiales en calculant la différence de concentration de

2.2. Les facteurs physico-chimiques

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2.1.2. Effet de la température

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Quelques enzymes gardent une activité importante à des

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• elles se fixent spécifiquement sur l'enzyme,

• elles ont un effet sur la cinétique de la réaction.

Peuvent avoir un effet positif ou négatif. Ils peuvent favoriser ou

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5.1. Inhibition compétitive

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Les constantes Km en absence et en présence de l’inhibiteur

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