Génie enzymatique

M1 Biotechnologie Microbienne

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Chapitre 2: Cinétique Michaelienne

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2022/2023
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1.Comment fonctionnent les enzymes?

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 1.Comment fonctionnent les enzymes?

Energie d’activation

C’est l’énergie libre qu’une molécule de complexe

Enzyme-Substrat doit recevoir du milieu environnant
pour que la réaction se produise à une vitesse donnée.

La vitesse de la réaction sera proportionnelle à

l’énergie captée par le système.
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 1.Comment fonctionnent les enzymes?

Pour convertir une molécule de substrat en une

molécule de produit un niveau d’énergie est
requis = Energie d’activation

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1.Comment fonctionnent les enzymes?

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1. Comment fonctionnent les enzymes?

* En présence d’enzymes
spécifiques de la réaction donnée,
l’énergie d’activation de la
réaction est abaissée

* Les enzymes sont des

catalyseurs, non consommés
pendant la réaction

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2. Qu’est ce que la cinétique enzymatique?

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 2. Qu’est ce que la cinétique enzymatique?

La cinétique enzymatique a pour objet d’identifier et de décrire les

mécanismes des réactions enzymatiques, en étudiant leur vitesse,
c’est-à-dire leur évolution en fonction du temps

-Détermination des paramètres cinétique;

- Analyse des facteurs influençant cette vitesse

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Introduction
Au début du XXe siècle, Michaelis et Menten ont proposé un mécanisme
réactionnel pour la transformation d’un substrat S en un produit P par une
enzyme E.
Ce mécanisme comporte deux étapes et fait intervenir un intermédiaire
réactionnel (ES) appelé « complexe enzyme-substrat ».
Le modèle de base de la cinétique des enzymes michaeliennes s’écrit ainsi:

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2.1. Les différentes phases de la réaction enzymatique

Phase pré-stationnaire -Combinaison ES très rapide

- Imperceptible en réalité
Entre T0 et T1
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Phase stationnaire - Correspond à une partie linéaire et croissante, la quantité de
produit formé est proportionnelle au temps.
Entre T1 et T2
- Toutes les molécules de l’enzyme sont occupées par des molécules du
substrat, la ES est maximale et constante

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 Phase
post- stationnaire - La disponibilité du substrat baisse pour l’enzyme;

Entre T2 et T3
- La réaction inverse/retour commence à concurrencer celle qu’on
mesurait
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2.2. La vitesse d’une réaction enzymatique

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A quel moment peut-on déterminer la vitesse de
la réaction enzymatique?

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2.2.1. Notion de vitesse initiale (Vi)

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Pourquoi calculer la Tangente ?
Cette tangente représente la portion de la cinétique que l’on
estime linéaire, Elle représente ainsi la vitesse de la réaction à
calculer:

côté opposé = ∆P tangente = la vitesse

côté adjacent = ∆t

Exemple: Comment calculer la tangente?

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3. Cinétique Michaelienne

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3.1. Définition de la vitesse d’une réaction chimique

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3.2. Modèle de Michaelis-Menten

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3.3. La détermination de la constante de Michaelis Km

Constante catalytique Kcat= K

C’est le nombre de molécule de substrat convertie en
produit par site actif de l’enzyme et par seconde

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3.3. Détermination de l’équation de Michaelis-Menten

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Si Km=[S]
V = f([S])
On a donc
Km =1/2Vmax

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Ainsi, la constante Michaelis, Km a deux significations:

1. Km est la concentration de substrat à laquelle la moitié

des sites sont remplis. Ainsi, le Km fournit une mesure de
la concentration du substrat nécessaire à une catalyse
importante.
2. Km est une mesure de l’affinité d’une enzyme pour son
substrat

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3.4. Linéarisation de l’équation de Michaelis
3.4.1. Méthode de Lineweaver-Burk

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3.4. Linéarisation de l’équation de Michaelis
3.4.1. Méthode de Lineweaver-Burk

La fonction Y = aX+b
Y=1/Vi
a= Km/Vmax
X= 1/[S]
b = 1/Vmax
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 3.4.1. la linéarisation de Lineweaver-Burk

Abscisse à l’origine Y=0 X= -1/Km

Ordonné à l’origine X=0 Y= 1/Vmax

Les points d’intersections entre:

- la courbe et l’axe des abscisses = -1/Km
- La courbe et l’axe des ordonnées = 1/Vmax
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 3.4.2. Méthode d’Eadie Hofstee

Abscisse à l’origine Y=0 X= Vm/Km la fonction (Y=b-ax)

Ordonné à l’origine X=0 Y= Vmax
Y=Vi
b= Vmax (Vm)
X= Vi/[S]
a = Km

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4. Définition de l’activité enzymatique

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Exercice N°4 (suite de la série 1)
La β -galactosidase hydrolyse le lactose en galactose et glucose. On
mesure la vitesse d’hydrolyse du lactose dans les conditions initiales. On
introduit dans le milieu 1 ml de solution enzymatique dont la teneur en
protéines est de 2.85 g/l. il apparait 0.672 10-2 moles de glucose en 10
minutes.
1/ Calculer l’activité de la préparation enzymatique en UI/ml d’enzyme et
en Kat/ml d’enzyme.
2/ Déterminer l’activité spécifique de l’enzyme en UI/mg de protéines et
en Kat/mg de protéines.
3/ Calculer l’activité molaire spécifique en considérant que l’on a travaillé
avec une enzyme pure dont la masse molaire est de 153 000 g/mol.
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