GENIE ENZYMATIQUE

Pr NADIA MESKINI
Descriptif du Module

- Rappel de la cinétique enzymatique en milieu homogène

- Techniques de dosage enzymatique

- Méthodes d’immobilisation des enzymes

- Propriétés et caractéristiques des enzymes immobilisées

- Cinétique enzymatique hétérogène

Effet de la partition sur la cinétique des enzymes

immobilisées
Effet de la diffusion des solutés sur la cinétique des
enzymes immobilisées
- Réacteurs enzyma0ques et applica0ons biotechnologiques

- introduc0on aux réacteurs enzyma0ques

réacteurs discon0nus « batch»
réacteurs con0nus « parfaitement mélangé CSTR,
piston »

- Biocapteurs enzyma0ques (caractérisa0on des électrodes à

enzymes, applica0ons des biocapteurs enzyma0ques
 Enzyme: catalyseur biologique

Catalyseur : substance qui favorise et accélère une réaction

sans en modifier le rendement et qui n’est pas consommée au
cours de la réaction
Mode d’action des enzymes

DG de la réaction n’est pas affectée par l’enz ; DG<0 la R: S P

Le catalyseur V en Ea
Principales propriétés des catalyseurs biologiques: Les enzymes

- Elles augmentent la vitesse des réac6ons catalysées par une

diminu6on de l’énergie d’ac6va6on ;

- Agissent en très faible quan6té

- Elles ne modifient pas l’état d’équilibre de la réac6on catalysée;

elles se retrouvent inchangées à la fin de la réac6on ;

- Elles sont de nature protéique, thermolabiles

grande importance de la structure spa6ale na6ve pour
assurer la fonc6on de catalyse.
La configura6on des enzymes condi6onne l’ac6vité
enzyma6que
Les enzymes (catalyseurs biologiques) diffèrent des catalyseurs
chimiques classiques:
1. Vitesses de réactions plus grandes
2. Conditions de réaction plus douces
Enzyme : température aux alentours de 37°C, pression atmosphérique et pH proche de
la neutralité),
Catalyseur chimique:souvent des températures et des pressions élevées ainsi que des
pH extrêmes.
3. Sélectivité : une réaction précise nécessite une enzyme précise.

4. Répétitivité: l’enzyme peut effectuer un grand nombre de cycles sans être modifiée
5. Spécificité de réaction plus grande : spécificités beaucoup plus
grandes vis-à-vis de leurs substrats (réactifs) et de la réaction catalysée.

6. Possibilités de régulation : Les enzymes peuvent subir une régulation

fine de leur activité. La phosphorylation ou l’allostérie (changement de
conformation) en sont des exemples.
La fonc(on des enzymes est liée à la présence dans leur structure d'un site par(culier
appelé le site ac(f.
• Structure du site ac(f comprend deux par(es
Site de liaison qui reconnaît la complémentarité de forme avec un substrat spécifique à l'enzyme
Site cataly(que qui agit sur le substrat pour lui faire subir la réac(on chimique (S P)

Site de liaison

SITE ACTIF

Site cataly(que
Schématiquement: forme d'une cavité ou d'un sillon dans lequel vont se fixer les
substrats grâce à plusieurs liaisons chimiques faibles.
 Structure des enzymes

Les enzymes peuvent être structuralement classées en deux catégories:

* Soit d’enzymes entièrement protéiques (constituées uniquement

d’acides aminés)

*Soit d’holoenzymes : enzymes constituées de deux parties : une

partie protéique appelée « apoenzyme » et une partie non protéique
appelée « cofacteur »
. Les cofacteurs
Petites molécules organiques ou ions métalliques liés à la protéine
enzymatique (apoenzyme) et indispensables à l’activité enzymatique.

* ils interviennent pour transporter le substrat, pour recevoir le

produit ou comme participant à la structure de l’enzyme.

*Ils sont essentiellement des transporteurs de certains groupes

chimiques (acetyl, carboxyle ou methyle, …) d’électrons ou des
protons
*L’enzyme reconnaît spécifiquement le cofacteur dont elle a
besoin.
*Ils ne sont consommés lors de la réacFon mais conFnument
recyclés
Le cofacteur peut être :

Un ion métallique. Il contribue au maintien des structures tertiaires en

créant des liaisons ioniques ou il participe au mécanisme.
Exemple: Fer: les cytochromes
Zn2+: alcool déshydrogénase
metalloenzymes

Une molécule organique appelée coenzyme

La plupart des coenzymes sont des dérivés des vitamines amenées par
l’alimentation chez l’homme et les organismes supérieurs

-Ne sont pas spécifiques : plusieurs enzymes différentes peuvent avoir le

même coenzyme ;
-Participent de manière stœchiométrique aux réactions ;
-Ne sont pas transformés définitivement à la fin de la réaction ;
-Permettent le transfert d’une entité x d’une molécule à une autre
(électrons, protons, groupement phosphate, …) ;
-N’interviennent pas dans la spécificité de la réaction enzymatique.
- Participent en général au mécanisme
Les coenzymes peuvent être liés à l’enzyme par liaison faible ou liaison
covalente:
1-Un coenzyme lié par liaison forte est dit « groupement prosthétique » ou
coenzyme liée.
- Il reste toujours fixé sur l’enzyme (exemple du coenzyme flavinique : flavine
adénine dinucléotide FAD) dont la caractéristique principale est de faire
partie intégrante de l’enzyme

2-Un coenzyme lié par liaison faible est dite coenzyme libre ou cosubstrat.
-Il s’associe à l’enzyme au moment de la réaction et qui s’en détache après la
réaction (cas du coenzyme NAD : nicotinamide adénine dinucléotide).

-Le coenzyme n’est pas spécifique: plusieurs enzymes différentes

peuvent avoir le même coenzyme.

-Certaines enzymes ont besoin à la fois d’un ion métallique et d’un

groupement prosthétique.
 Classification des coenzymes :
On distingue deux sortes de coenzymes :
-Les coenzymes d’oxydo-réduction
-Les coenzymes de transfert de groupement

Dans les coenzymes d’oxydoréduction, on trouve : Coenzymes pyridiniques

-Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+)
-Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP+).
Ils fonctionnent avec les déshydrogénases, enzymes appartenant au groupe des
oxydoréductases. Ils sont composés de deux nucléotides reliés entre eux par un
groupement pyrophosphate.

Nicotinamide Adénine
H- (ion hydrure)
NH2 NH2 H
H H
O O O N CONH2 CONH2
N H+ e-
+ + H+
N O P O P O N N + H+ e- ..
O O N N
OH OH R R

NAD+ + MH2 NADH + H+ + M

OH OH OH OH

Structure chimique du Nicotinamide Adénine Mécanisme d’action du NAD+

Dinucléotide oxydé (NAD+)
Le NAD+/(NADH + H+) est un coenzyme d’oxydation, de dégradation de
métabolites ; la forme physiologiquement intéressante est NAD+.
Le NADP+/(NADPH +H+) est un coenzyme d’hydrogénation, de biosynthèse.

Les coenzymes flaviniques

- Flavine mononucléotide (FMN)
- Flavine Adénine dinucléotide (FAD).

Ce sont des coenzymes d’oxydoréduction intervenant dans le transport

d’électrons dans la chaîne respiratoire.

Principaux autres coenzymes :

PLP (phosphate de pyridoxal): coenzyme du métabolisme des acides aminés.

TPP (thiamine pyrophosphate): coenzyme intervenant, entre autres dans la

décarboxylation des acides α-cétoniques.

Biotine: coenzyme de carboxylation (fixation d’une molécule de CO2 sur une

molécule organique).
 Méthodes instrumentales de détermina1on de l’ac1vité enzyma1que
Dosage Enz= AE, elle se fait de manière indirecte, on choisi de suivre soit la disparition de sub
ou l’apparition de produit en fonction des propriétés moléculaires de S ou P

Ez à doser
S + S’ P + P’

- Colorimétrie
Spectrophotométrie
- Fluorimétrie
- Titrimétrie
- Radioactivité
- Dosages immunologiques
Types de dosage

Selon la nature de l’élément dosé, on distingue deux types de dosages :

-Les dosages d’enzymes par détermination de leur concentration catalytique ;

-Les dosages de substrat par méthode enzymatique en point final.

Et, selon la longueur d’onde à laquelle la molécule absorbe, on distingue deux

cas de figure

Dosage enzymatique colorimétrique

le dosage est réalisé dans le domaine du visible (entre 400-800 nm). On

suit alors directement l’apparition ou la disparition d’une molécule colorée
absorbant dans ce domaine à l’aide d’un spectrophotomètre.

S +E P
Incolore coloré
- Dosages enzymatiques UV :

Dans ces méthodes enzymatiques, les réac utilisées sont NADH ou NADPH dépendantes.
Elles font donc intervenir l’apparition ou la disparition de ces coenzymes d’oxydo-réduction
dans la réaction qui présentent un maximum d’absorption à 340 nm

Substrat + coenzyme a ¾¾enzyme¾® produit + coenzyme a'

Chaque molécule inconnue est alors dosée selon un principe simple : les
variations d’absorbances du coenzyme lié à la réaction permettent de
déterminer proportionnellement la concentration de celui-ci et donc également
celle de la molécule dosée.

Notion d’activité enzymatique
Principe
La mesure de l'activité enzymatique dans les conditions où [S] >> [E] et
[S] >> KM , T , pH….permet de doser la quantité d'enzyme présente
dans la solution. La vitesse mesurée est la vitesse maximale exprimée en
mol.L-1.sec-1. Elle est proportionnelle à [E0].

Mesure de Vmax; expression en UI.L-1 ou en nkat.L-1.

La mesure de l’ac<vité enzyma<que se fait soit par méthode ciné<que soit

par la méthode en deux points.
 Méthode cinétique
Consiste à suivre l’évoluEon de la réacEon en foncEon du temps

On vérifie la linéarité détermine

vmax.

On suit l'apparition du produit P ou la

disparition de S
V= D [P]/ D t partie rectiligne(linéaire ) de
ou =D [S]/ D t la courbe

!
 1. Méthode cinétique

Principe :

Détermination de la vitesse initiale dans des conditions où [S] << KM ([S] << 0,1 KM)
alors V
v i = max [S]
KM

proportionnalité entre vi et [S]

 Ex: dosage de l’amoniaque (NH4+) plasma9que

Glutamate déshydrogénase
NH4 + Acide a cétoglutarate acide glutamique + H2O

NADH, H+ NAD+

V de R enz = Vi d’oxydation enzymatique

DO DO avec l’oxydation NADH

340nm

temps
Méthode en 2 points

Consiste à laisser l’enzyme catalyser la réaction pendant une durée fixe, à arrêter
son action puis évaluer la quantité de substrat transformé ou de produit apparu

On admet la linéarité : on admet que l’on est dans les conditions initiales sans le
vérifier. On mesure la quantité de produit formé au bout d'un temps t.

On prend alors la mesure en Dt et en DAbs en espérant être en Vmax. La pente

obtenue permet alors de déterminer l’acDvité enzymaDque recherchée
 Dosage de substrat
Soit la réaction S P

La concentration en substrat dans un milieu peut être mesurée de deux façons

Méthode en point final

Principe :

En condition d’excès d’enzyme, on dose un substrat une fois que celui-ci aura
été entièrement transformé (suivre la DDO entre le temps de démarrage de la
réaction et le temps de la fin de réaction)

épuisement du
P substrat

temps
La concentration initiale de S est égale à la concentration en produit à la fin
de la réaction (si réaction irréversible et stœchiométrique).
 Si ni le sub ni le P de la réa/on ne possèdent de propriétés spectrales spécifiques

Réac couplée= réac indicatrices

Si l’enz dont on mesure l’activité n’est pas une déshydrogénase à NAD+ ou NADP+,
on couple la 1ère reac par pas une déshydrogénase dont le P est le sub

E1 E2
S P PH 2
NADH,H+ NAD+

Réaction principale Réaction indicatrice

1 DO/ min à 340 nm Ac/vité de l’Ez E1

S E1 P1 E2 P2 E3 PH 2

NADH,H+ NAD+

Réac principale Reac auxillaire Réaction indicatrice

 -Unité d’activité enzymatique ou activité catalytique

1- Unité d'activité enzymatique (UI ou UE) (ancienne Unité Internationale)

= la quantité d'enzyme permettant la transformation d'une micromole de substrat par

minute (µmol.min-1) dans les conditions optimales ( température, pH, [S], temps, ….)

2- Nouvelle unité interna<onale de l’ac<vité enzyma<que : katal

Le katal (kat) : quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de

substrat par seconde. 1 Katal= 1 mole Sub/ sec nkat= 10-9 Katal
1 UI = 1 µmole Sub/ min = 16,67 nKat

Cette activité est classiquement ramenée :

A l’unité de volume de la solution enzymatique : concentration d’activité catalytique ou

CAC en UI par litre de solution ou katal par litre de solution.
 Activité spécifique AS
Activité enzymatique par mg de protéine: (AE (UI ou Kat/ mg de Pr)
L’activité spécifique d’une solution enzymatique est le rapport entre l’activité
enzymatique totale et la quantité de protéine totale de cette solution.

Activité enzymatique µmol 1 L µmol 1

AS = = . . = .
mg de protéine L min mg min mg
le maximum de AS est atteint qd l’enz est pure

Activité enzymatique molaire AEM ou AM

AcFvité enzymaFque par mole d’enzyme pure
QuanFté de sub transformée (mole/sec) par mole d’enzyme pure: (1/sec)

= la constante catalytique ou kcat (ou k2): constante de vitesse (unité sec-1).

= taux de roulement ou turnover number = mole sub/sec/ mole d’enzyme

pure
 Taux de Purification

Le taux de purifica.on d’une enzyme ou taux d’enrichissement ou degré de

purifica.on ou facteur de purifica.on

Taux de purification = AS après une étape / AS avant cette même étape

Taux de purifica.on globale = AS de l’étape n / AS étape de départ

Rendement
Le rendement de purification ou pourcentage de récupération

Rendement = UE récupérées après une étape / UE avant cette même étape

Il est exprimée en %

Rendement global = UE récupérées de l étape n / UE étape de départ

1. Cinétique enzymatique Michaelienne

La cinétique d'une réaction enzymatique est l’étude de la variation en fonction du

temps de la quantité (donc de la concentration) d'une molécule : le produit, le
substrat ou le coenzyme de la réaction.

1.1 Phases de la réaction

Evolution de la concentration du produit en fonction du temps

 Evolution de la réaction enzymatique au cours du temps

Au cours de la réaction, on distingue trois phases

- t<t1, très brève (ms) : phase préstationnaire : les molécules de

substrat se lient avec l’enzyme : phase de formation de ES (ES)
- la vitesse de la réaction est croissante

- t1<t<t2: phase stationnaire. toutes les molécules de l’enzyme sont

occupées par des molécules du sub([S] saturante) (ES) constant
- la vitesse de la réaction est maximale et reste constante tant que la
concentration du substrat est grande
- (P) évolue linéairement

- t>t2 : phase post stationnaire la majorité de sub étant consommée

(ES) v
 1.2 Notion de vitesse initiale

C’est la vitesse d’une réaction enzymatique au cours de la phase stationnaire.

Dans ces conditions, la concentration du complexe enzyme-substrat est
constante et la concentration en produit évolue linéairement en fonction du
temps : la vitesse est constante : on l’appelle vitesse initiale notée vi ou vo.

Conditions initiales
(zone de linéarité)
1.3 Effet de la concentration en enzyme [E]

vi = k [E] : vi est proportionnelle à la concentration d’enzyme.

vi

[E]

Evolution de la vitesse initiale en fonction de la

concentration en enzyme
 1.4 Effet de la concentration de substrat sur la vitesse initiale (Loi de
Michaelis-Menten)

vi = f ([S0] qui est une hyperbole équilatère.

[S]

Evolution de la vitesse initiale en fonction de la concentration en sub

1.5 Equation de Michaelis-Menten

k1 k2
E + S ES P + E
k-1

V= K2 [ES]

VM= K2 [ET]
 Vi
Vmax

Vmax/2

[S]
Km
 Equation de Michaelis

- [S] << KM →

- [S] = KM → vi = VM/2
- [S] >> KM → vi = VM = kcat [ET] → vi indépendant de [S]

VM = kcat [ET]
Vitesse maximale

(Constante de Michaelis)
Signification de KM

- constante indépendante [E]

- constante de dissociation du complexe enzyme-substrat ES
- [S] pour laquelle vi = VM/2 (motié de moles d’Enz sont
complexés par le sub

- inverse de l’affinité de l’enzyme pour le substrat.

1/KM: L'affinité de l'enzyme pour le substrat est d'autant plus

grande que KM est petite.

KM a la dimension d’une concentraKon, s’exprime mole/L

 Signification de VM
VM: est la vitesse initiale maximale atteinte par la réaction à saturation
en sub [S0] >> 10 KM et [ES] = [ET]
VM = k2 [ET] = kcat [ET]

Signification de constante de vitesse

K2 ou Kcat est constante de vitesse dont l’unité est temps-1, Kcat= V/[ET]

= fréquence à laquelle l'enzyme accomplit l'acte catalytique "turn over

number (nombre de réactions catalysée par l’enz par unité de temps)
= mesure l’efficacité catalytique maximale de l’enzyme sur le S
= Nbre mole de sub transformés par sec et par mole d’enz (AEM)

Le rapport kcat/KM (M-1.s-1) mesure l’efficacité catalytique de l’enzyme

 Constante de spécficité L’efficacité enzymatique (peut etre calculée qd
[S0]<< KM)
Kcat/KM: Représente un critère d’éfficacité globale de l’enz
kcat/KM
Enzyme Substrat KM (mM) kcat (s-1) (M-1·s-1)
Acétylcholinestérase Acétylcholine 0.095 14 000 147 368 421
Anhydrase carbonique CO2 12 1 000 000 83 333 333
HCO3- 26 400 000 15 384 615
Catalase H2O2 1100 40 000 000 36 363 636
Chymotrypsine N-acétylglycine éthyl ester 440 0.051 0.1
N-acétylvaline éthyl ester 88 0.17 1.9
N-acétyltyrosine éthyl ester 0.66 190 287 878
Fumarase Fumarate 0.005 800 160 000 000
Malate 0.025 900 36 000 000
Uréase Urée 25 10 000 400 000
Lysozyme hexa N acetylglucosamine 0.006 0.5 83 333

On peut remarquer pour le lysozyme que malgré un mauvais Kcat, l'enzyme est efficace grâce un
bon KM.
De même l'anhydrase carbonique et la catalase ont une très mauvaise affinité pour leur substrat
mais une très bonne constante catalytique. Ce qui en font les enzymes parmi les plus efficaces
. Détermination graphiques des paramètres cinétiques

Les paramètres cinétiques KM et VM : grâce à la

représentation de linéarisation en doubles inverses de
Lineweaver et Burk 1/vi = f(1/[S]).
 Autres méthodes de linéarisation de l’équation de Michaélis

Représentation de Eadie-Hofstee
vi= f(vi/[S])
vi
VM
V
Vi = −Km +VM
- Km
[S ]

vi/[S]
Représentation de Hanes Woolf

[S]/vi= f([S])
S 1 Km
= [S ] +
V V max V max
S/V

1/VM

KM/VM

- Km S
Signification physiologique de la cinétique enzymatique

Utilisation des résultats in vitro pour rédire le comportement du

système biologique in vivo

Ex: La phophorylation du glucose en glucose 6P

1- Toutes les cellules qui utilisent le glc, le catalyse par l’Hexokinase (HK) dont le
Km = 50 µmoles/dm3

2- Cellules de foie disposent d’un autre enzyme= glucokinase (GK), dont le

Km= 10 mmoles/dm 3
HK
Glucose glucose 6P
HK
(-) Si glc 6P
Dans un organisme à jeûn, [glc]= 4 mmoles/dm 3
HK est donc saturéé en sub ([S]est 80>> Km)

HK travaille à Vmax jusqu’à [glc6P] produit atteint une concentartion où il

inhibe en retour l’Enz

Immédiatement après un repas riche en glc, [glc] dans le sang s’élève rapidement à
8 mmole/dm3= valeur de Km de GK hépatique, La V peut avec [glc]

HK avec son faible Km (V=Vmax) est incapable d’exploiter cette oportunité et le glc va
donc s’accumuler dans le foie
GK
Foie glc6P glycogène

1 excès de glc est rapidement retiré de la circulation et mis en reserve dans le foie par le
Seul effet des caractéristiques cinétiques des 2 enzymes

Lors d’1 déficit en glc (hypoglycémie) le faible Km de l’HK garan[t que les organes
(tel le cerveau) qui dépensdent du glc pour la produc[on d’énergie en serait correctement
approvisionnés.
 EFFECTEURS DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE

1- Effecteurs physico-chimques

Effet de la température

V avec T jusqu’à T optimale

T > T optimale v (dénaturation )

perte des strucures tertiares , quaternaires

de l’enz ( L . H2, L hydrophobe, L. electrosatique
- Activation thermique

d LnK/ dT= Ea/ RT2 loi d’Arrhénus

Ln K = - Ea / R 1/T + Ln A K = A e (-Ea / RT)

Ea énergie d’activation
k constante de vitesse
R constante de gaz parfait
T température absolue en kelvin
A constante
L’étude des variations de vitesse de
réaction dans un intervalle restreint
Ln K de température permet de mesurer
l’énergie d’activation «Ea» d’une réaction

-Ea/ R

1/T
1/T faible T élevée courbe s’infléchit (inactivation thermique de l’enz)
 - Dénaturation par la chaleur liée à la nature protéique des enzymes
Kd
En Ed

La dénaturation est une réaction du premier ordre d’où :

d [E]n d [E]n
= -k d x [E]n [E]n
= -k d x dt
dt

Ln [E]n = - kd x t + ln [E0] [E]n = [E0] e-kd x t

[E0] : concentration d’enzyme active au temps 0. [E]d : concentration d’enzyme dénaturée

kd : constante de vitesse de dénaturation thermique (t-1) [E]n : concentration d’enzyme active au temps t.

Pour une enzyme, l’activité résiduelle U ou activité restante Ar s’exprime selon :

U = U0 e-kd xt
Þ ln U = ln U0 – kd x t U
ln = -k d x t
U0

Le tracé de ln U/U0 en fonction du temps permet de déterminer la valeur de kd.

Activité (ln U/U0)

Evolution de l’activité restante 62

en fonction du temps de chauffage
à une température dénaturante
63
64
temps (min)
 Effet de pH
Le pH du milieu réactionnel détermine la charge
électrique des CL des Aa de la Pr
Il existe donc un pH où les charges électriques des radicaux du
site actif de l’enz seront les + favorables à la liaison de sub et à l’acte catalytique

pH optimum est caractéristique d’enz et d’1 sub donné

Le pH peut agir sur plusieurs facteurs

1- Influence sur l’état d’ionisation du substrat,

permet la liaison ou non du sub à l’enz (formation ES)

2- Influence sur l’état d’ionisation des résidus Aa de l’enz

Donc la structure IIaire et III aire et donc la stabilité de l’enz(modification de conformation

3- modifiant la charge électrique des radicaux du site actif

La liaison du substrat à l’enz (Km)
L’activité catalytique de l’enz (Kcat
 Influences des Effecteurs
Effecteur :corps chimique capable de se lier avec l’enz et d’en
modifier la vitesse
Soit en l’accelérant : Activateurs
Soit en la ralentissant : inhibiteurs

inhibiteurs interagissent avec l’enz , formant un cx E-I (EI), ne sont

pas modifiés par l’enz,
Inhibiteurs peuvent etre reversible ou irreversibles

Inhibition des enz rôle important dans dans la régulation

des voies métaboliques
L'étude de l'effet d'inhibiteurs permet :

•d'affiner le mécanisme catalytique d'une réaction enzymatique

•de mieux connaître la spécificité d'une enzyme

•d'obtenir des données physiques et chimiques concernant le site actif

 2- Inhibiteurs de l’activité enzymatiques

Inhibition Compétitive
- Il y a compé,,on entre l’I et le sub pour le site ac,f de l’enz
- I et S ont analogie structurale
- La fixa,on du sub et celle de l’I sont mutuellement exclusive

- La proportion d’enz mobilisée par l’I n’est pas disponible pour le sub
modifie le KM (Km apparent)
- Le Cx EI est reversible, peut se redissocier pour regénérer l’Ez libre
- I’inhibition est levée par excès de substrat
- [ET]= [E] + [ES] + [EI]

Schéma réactionnel de Michaélis

Inhibition Compétitive
L’ Inhibition compétitifs est une stratégie souvent adoptée dans le développement de
médicaments et d’antibiotiques

a) Traitement des AB

certains AB agissent en inhibant le fonctionnement de certaines Enz essentielles à la

survie des bactéries ex sulfamides

b) Traitement de la goutte (maladie inflammatoire au niveau des articulations)

L’allopurinol est un inhibiteur compétitif puissant de la xanthine oxydase

xanthine oxydase
Xanthine Acide urique

Quand l’a urique est synthétisé en excès et les urines ne peut les éliminer, il se dépose
au niveau des articulations causant l’inflammation
 Inhibition Non Compétitive NC

- l’ inhibiteur non compétitif se lie à un site différent du site actif

- l’I peut interagir avec l’Enz libre ou le complexe ES avec la même
affinité
- L’I entraine une modification de la conformation du site actif, ce qui
empêche la transformation du substrat en produit
mais n’influe pas sur la reconnaissance entre l’Enz et le sub

[ET]= [E] + [ES] + [EI] + [ESI]

L’inhibition non compétitive "pure", l'inhibition non compétitive où
l'inhibiteur se fixe avec la même affinité à l'enzyme libre E et au
complexe enzyme - substrat ES (KI = K'I)

L’inhibition non compétitive "mixte", l'inhibition non compétitive où

l'inhibiteur se fixe avec des affinités différentes à E et à ES (KI différent K'I).
Inhibition Non Compétitive NC
 Inhibition Incompétitive IIC

L’inhibiteur incompetitif ne se lie pas à l’Enz libre mais uniquement au

complexe ES réduisant ainsi la vitesse de formation de produit
Le cx ESI sont des complexes inactifs

[ET]= [E] + [ES] + [ESI]

Inhibition Inompétitive IIC

Km app= Km/ 1+ [I]/Ki

Inhibi&on par excès de substrat

A très forte [Sub] La loi Michaélienne n’est plus valable

Inactivation partielle et reversible du système

Deux explications possibles

1) l’enz possède un second site de fixation capable de fixer une 2ème molécule
de S avec une affinité < à celle du centre actif proprement dit mais dont la
saturation provoque une déformation inactivante de l’Enz

E+S ES --> E + P
Ki
ET= E +ES+ ESS Ki= (ES)(S)/ (ESS)
ESS (non productif!)

V max. [ S ]
v= 2

K M + [ S ]. +
[S ]
Ki
2 cas:
La mauvaise posi/on de de sub en posi/on inverse empêche la fixa/on de
d'autres molécules de sub ce qui diminue [ES] et donc diminue également la
vitesse de réac/on
 Régulation de l’activité enzymatique
Les divers système de régulation permettent à la cellule de coordonner ses réactions
chimiques, le flux des matériaux est ajusté aux besoins de l’organisme
La régulation peut s’envisager à 2 niveaux
1- la quantité d’enz, régulation du niveau de synthèse protéique (contrôle génétique)
2- le niveau de l’activité enzymatique
Contrôle de l’activité enzymatique : 2 catégories
1- Modification covalente (structure de l’enz)
2- Fixation de ligand (modif non covalente)

I/ Régulation par modification covalente: modif réversibles et irreversibles

Modifications irréversibles
Régulation par protéolyse partielle, certaines Enz (digestion, coagulation)sont synthétisées
sous forme de précurseurs inactifs= proenzyme ou zymogènes. Leur activation
nécessite 1 protéolyse limitée
perte d’1 partie de la séquence primaire et un réarrangement conformationnel Enz active

Site actif non visible( non coforme) Site actif visible (réarrangement
conformationnel site actif devient adéquat au sub et à la catalyse
Entéropeptidase
Trypsinogène trypsinogène
Pepsinogène pepsine
HCl
 Modifications réversibles
Régulation par liaison ou élimination d’un groupement, il s’agit d’1 interconversion
Entre 2 formes de l’enz possédant des propriétés catalytiques différentes
Leur mécanisme est réversible et catalysé par deux systèmes antagonistes

L’un fixe un groupement sur l’enz et l’autre l’enlève Enz devient actif par
fixation ou enlèvement du groupement
phosphorylation / déphosphorylation sur sites ser, thr , tyr
méthylation / déméthylation sur site Asp et glu
acétylation / déacétylation sur Lys
a) Phosphorylation/déphosphorylation
Catalysées par des Pr kinases et Pr phosphatases= Pr convertisseurs
Kinase
Enz-Ser-OH +ATP Enz-O-P + ADP
Phosphatase
Ex régulation de l’utilisation du glycogène: 2 voies différentes pour la dégradation et
la synthèse de glycogène:
glycogène phosphorylase
(Glycogène)n + Pi (glycogène)n-1 + glucose 1-P
Deux formes de cette enz : phosphorylase a phosphorylée active
phosphorylase b non phosphorylée inactive
 II/ Régulation allostérique: modification non covalente et réversible
C’est l’inhibition ou l’activation spécifique d’1 enz par un métabolite (effecteur ou modulateur allostérique)
Le métabolite: possède une structure différente de celle de sub ou de produit de l’enz
se fixe sur un site différent du site actif = site régulateur ou allostérique

Le + souvent, la 1ère enz d’1 chaine métabolique est rétroinhibée par le produit final de la chaine

Ex 1: régulation allostérique: chaine biosynthèse de L-isoleucine

Thréonine désaminase

L-thréonine X Y Z L-isoleucine

(- ) Rétrocontrôle négatif
L-isoleucine est l’inhibiteur allostérique de la 1ère enz de sa chaine de biosynthèse

Ex2: Régulation du métabolisme cellulaire lors de la glycolyse

[ATP] forte PFK inhibition de la voie de la glycolyse
rétrocontrôle négatif
Principe des enz allostériques et coopérativité
L’allostérie désigne un changement de conformation de l’enz à la suite de la fixation
d’un sub ou d’1 molécule effectrice en dehors du site catalytique
Enzyme allostériques
1) ont 1 structure quaternaire, oligomèrique (cons5tuées de plusieurs
sous unités possédant chacune un site ac5f (fixe le sub et catalyse la réac enzyma5que)
et un site régulateur ou allostérique (fixe l’effecteur allostérique)

2) Ces sites ac5fs peuvent avoir 2 conforma5ons dis5nctes

1 favorable R (relachée)à l’ac5vité cataly5que = Forme ac5ve de l’enz
1 défavorable T (tendue) à l’ac5vité cataly5que= Forme peu ac5ve de l’enz

Conformation T peu d’affinité pour le sub

Conformation R forte affinité pour le sub

3) Adoptent un comportement cinétiques différent des enz Michaéliennes

courbe stigmoide au lieu d’hyperbole
Fixation d’O2 par l’hémoglobine et la myoglobine

La fixation de l’O2 par l’Hb témoingne est 1 stigmoide donc le comportement des 4 Ss U
n’est pas indépendant Il y a 1 coopérativité entre elles
La fixation de la 1ère mlc d’O2 facilite la fixation de la 2 ème mlc coopérativité positive
 Inhibition non compétitive « mixte »

Ki est l’affinité de l’inhibiteur pour la forme libre de l’enzyme

(K’i) est l’affinité pour la forme de l’enzyme complexée au substrat
Quand Ki > Ki’, KM diminue quand Ki < Ki’, KM augmente

Ki < Ki’ Ki > Ki’

1/vi 1/vi

1/[S] 1/[S]

Graphique Lineweaver-Burk d’inhibition non compétitive « mixte »