Mémoire Abdelmoumen Et BENALI

République Algérienne Démocratique et Populaire
‫وزارة التعليم العالي والبحث العلمي‬

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
‫جامعة أبو بكر بلقايد– تلمسان‬
Université ABOUBEKR BELKAID – TLEMCEN
‫ وعلوم األرض والكون‬،‫كلية علوم الطبيعة والحياة‬
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, et Sciences de la Terre et de l’Univers
Département de BIOLOGIE
MÉMOIRE
Présenté par
Abdelmoumene Hafsa
Benali medjahed Yamina
En vue de l’obtention du
Diplôme de MASTER
En biologie moléculaire et cellulaire
Thème
Le 4-terpinéol, activateur potentiel de la stathmine au

cours de la prolifération tumorale : Etude in silico
Soutenu le 21 juin 2023 devant le jury composé de :
Président Dali-Sahi Majda Professeur Université de Tlemcen
Encadrant Tabet-Helal Sana Maître de conférences A Université de Tlemcen
Examinateur Cherrak Sabri Maître de conférences A Université de Tlemcen
Année universitaire 2022/2023

Remerciements
Tout d'abord, nous remercions » Allah », qui nous a aidés et nous a donné la force et la volonté
pour réaliser ce travail.
Nous tenons à remercier notre encadrante, Mme Tabet-Helal Sana, pour son soutien, sa grande
disponibilité, ses encouragements, ses précieux conseils.
Nous tenons également à remercier Mme Dali-Sahi Majda d’avoir accepté d’évaluer ce travail,
leurs remarques et critiques me seront précieuses et enrichissantes.
Nous tenons également à exprimer notre reconnaissance à Mr CHERRAK Sabri, pour nous
avoir guidés durant la réalisation du travail avec une disponibilité permanente et nous avoir fait
bénéficier de ses connaissances dans le domaine de Docking moléculaire, aussi d’avoir la
gentillesse d’accepter d’examiner ce travail.
Nous remercions également tous nos enseignant(e)s du département de biologie à la faculté des
sciences de la Nature et de la Vie, des sciences de la Terre et de l’Univers, Université Abou-
Bakr Belkaid Tlemcen.
Dédicace
Avec l’expression de ma reconnaissance, je dédie ce modeste travail à ceux qui, quels que soient
les termes embrassés, je n’arriverais jamais à leur exprimer mon amour sincère.
A l’homme, mon précieux offre du dieu, qui doit ma vie, ma réussite et tout mon respect : mon
cher père Ben Moussa.
A la femme qui a souffert sans me laisser souffrir, qui n’a jamais dit non âmes exigences et qui
n’a épargné aucun effort pour me rendre heureuse : mon adorable mère B. Fatima.
À la personne la plus chère à mon cœur, mon grand-père B. Mohammed, que Dieu ait pitié de
lu
A mes chères sœurs Omayma, Malek, Hind et Hiba, A mon cher frère Abd el wadoude.
A toute ma famille A mes chères amies : B.Dounia, H.merieme et A.Hanane a tous mes
aimables amis.
A toute personne qui a participé de loin ou de près dans la réalisation de ce travail.
Hafsa
Dédicace
Je dédie ce travail à mes chers parents, pour leur sacrifice, leur soutien, leur aide et leur amour
pour moi, je leur souhaite une longue et heureuse vie.
Je remercie mes sœurs, Asmaa et Hanane, pour leur amour et leur soutien moral durant mes
cinq années d'études, et mon cher frère Tarik pour tous ses efforts.
A tous les amis et les copines.
A tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail.
Yamina
‫الملخص‬
‫الستاثمين هو بروتين فسفوري بقدرة ‪ 17‬كيلو دالتون يتحكم في ديناميكيات األنابيب الدقيقة )‪ (MTs‬عن طريق عزل‬
‫التوبولين في مركب غير قابل للبلمرة يتكون من اثنين من مغاير التوبولين لجزيء واحد من الستاثمين( مجمع ‪T2S).‬‬
‫إنه أحد المنظمين الرئيسيين للمغزل االنقسامي ‪ ،‬وهو شديد الفسفرة في وقت االنتقال من المرحلة ‪ S‬إلى الطور ‪G2 / M‬‬
‫من دورة الخلية ‪ ،‬مما يجعل من الممكن تثبيط نشاطه المزعزع لالستقرار لـ ‪ MTs‬ويشكل لذلك هدف عالجي محتمل يهدف‬
‫إلى منع المغزل االنقسامي للخاليا السرطانية المتكاثرة ‪.‬‬
‫تشكل مونوتربين أكبر مجموعة من المستقلبات الثانوية للنباتات العطرية الطبية ‪ ،‬فهي تظهر نشا ًطا مضادًا للورم في العديد‬
‫من السرطانات ‪.‬‬
‫تم إجراء التفاعل بين ستاثمين (مستقبالت) ومونوتربين دوري (ليغاندات) عن طريق التحفيز الجزيئي عبر برنامج اإلرساء‬
‫الجزيئي من أجل تغيير موضع أفضل أحادي التربين مع تقاربات التفاعل مع ستاثمين ومحاولة تثبيط الفسفرة ‪.‬‬
‫استقرارا ‪ ،‬حيث كشف االلتحام الجزيئي‬

‫ً‬ ‫من بين ‪ 287‬مونوتربين الدورية التي تم اختبارها ‪ ،‬يبدو أن ‪-4‬تربينول هو األكثر‬
‫عن تقارب ربط بين هذا ‪ ligand‬و ‪ Wild Type‬ستاثمين ‪ ،‬وتقارب ارتباط أعلى مع الستاثمين المتحور ‪S16E /‬‬
‫‪A15R / K9RA10R / S25A.‬‬
‫أخيرا ‪ ،‬من الضروري إجراء مزيد من تحليالت المحاكاة الجزيئية ودراسة في الجسم الحي لتأكيد التفاعل وتأثير التنشيط‬
‫ً‬
‫المحتمل لـ ‪-4‬تربينول على ستاثمين ‪.‬‬
‫الكلمات المفتاحية‪ :‬السرطان ‪ ،‬االلتحام الجزيئي ‪ ،‬االنتشار ‪ ،‬الستاثمين ‪-4 ،‬تربينول‪.‬‬

Résumé
La stathmine est une phosphoprotéine de 17 kDa qui contrôle la dynamique des microtubules
(MTs) en séquestrant la tubuline dans un complexe non polymérisable formé de deux
hétérodimères de tubuline pour une molécule de stathmine (complexe T2S).
C’est l’un des principaux régulateurs du fuseau mitotique, la stathmine est hautement
phosphorylée au moment de la transition de la phase S à la phase G2/M du cycle cellulaire, ce
qui permet d’inhiber son activité déstabilisatrice des MTs et constitue donc une cible
thérapeutique potentielle visant à bloquer le fuseau mitotique des cellules cancéreuses en
prolifération.
Les monoterpènes constituent le plus grand groupe de métabolites secondaires des plantes
aromatiques médicinales, ils présentent une activité anti-tumorale dans plusieurs cancers.
L’interaction entre stathmine (récepteur) et monoterpènes cycliques (ligands) a été faite par e
par des logiciels de Docking Moléculaire afin de repositionner le meilleur monoterpène
présentant des affinités d’interaction avec la stathmine et tenter d’inhiber sa phosphorylation
Parmi les 287 monoterpènes cycliques et leurs homologues structuraux testés, le 4-terpinéol
semblent être le plus stable, puisque le Docking moléculaire a révélé une affinité de liaison
entre ce ligand et stathmine Wild Type, et une affinité de liaison plus importante avec les
stathmines mutées S16E/A15R/K9RA10R/S25A.
Enfin, des analyses de simulation moléculaire plus poussées, et une étude in vivo sont
nécessaires pour confirmer l’interaction et l’effet activateur potentiel du 4-terpinéol sur la
stathmine.
Mots clés : Cancer, Docking moléculaire, prolifération, stathmine, 4-terpinéol.
Abstract
Stathmin is a phosphoprotein of 17 kDa which controls the dynamics of microtubules (MTs) by

sequestering tubulin in a non-polymerizable complex formed of two heterodimers of tubulin
for one molecule of stathmin (T2S complex).
It is one of the main regulators of the mitotic spindle; stathmin is highly phosphorylated at the
S phase transition to the G2/M phase of the cell cycle, which makes it possible to inhibit its
destabilizing activity of MTs.
Stathmin therefore constitutes a potential therapeutic target aimed at blocking the mitotic
spindle of cancer cells during proliferation.
Monoterpenes constitute the largest group of secondary metabolites of medicinal aromatic
plants; they exhibit antitumor activity in several cancers.
The interaction between stathmine (receptor) and cyclic monoterpenes (ligands) was made by
Molecular Docking software in order to reposition the best monoterpene with interaction
affinities with stathmine and attempt to inhibit its phosphorylation
Among the 287 cyclic monoterpenes and therir structural homolgues tested, 4-terpinéol seems
to be the most stable, since molecular Docking revealed a binding affinity between this ligand
and Wild Type stathmin, and a higher binding affinity with mutated stathmin S16E/
A15R/K9RA10R/S25A.
Finally, further molecular simulation analyzes and an in vivo study are necessary to confirm the
interaction and the potential activating effect of 4-terpinéol on stathmin.
Keywords: Cancer, molecular docking, proliferation, stathmine, 4-terpinéol.
Table des matières
Remerciements
Dédicace
Résumé
Introduction générale .............................................................................................................01
Synthèse bibliographique ......................................................................................................04
Chapitre Ⅰ : Stathmine ........................................................................................................05
Ⅰ.1.Introduction ......................................................................................................................06
Ⅰ.2. Présentation de la protéine stathmine ..............................................................................06
Ⅰ.2.1. Extension N-terminale de stathmine .........................................................................07
Ⅰ.3. Structure de la stathmine .................................................................................................07
Ⅰ.3.1. Structure primaire ......................................................................................................07
Ⅰ.3.2. Structure secondaire ..................................................................................................08
Ⅰ.4. Expressions de la stathmine ............................................................................................08
Ⅰ.4.1. Au cours de prolifération cellulaire ..........................................................................08
Ⅰ.4.2. Expression et régulation au cours de développement embryonnaire .......................09
Ⅰ.4.3. Expression tissulaire .................................................................................................09
Ⅰ.5. Phosphorylation de stathmine .........................................................................................10
Ⅰ.6. Régulation de phosphorylation ........................................................................................11
Chapitre II : Stathmine et cancer .........................................................................................12
II.1. Introduction ......................................................................................................................13
II.2. Définition du cancer ........................................................................................................13
II.3. Cancérogénèse ..................................................................................................................13
II.3.1. Etapes de la cancérogénèse .......................................................................................15
II.3.1.1. Phase d’initiation ................................................................................................15
II.3.1.2. Phase de promotion ............................................................................................15
II.3.1.3. Phase de progression ..........................................................................................15
II.4. Altération génétique dans le cancer .................................................................................15
II.4.1. Deux catégories d’altérations ....................................................................................16
II.5. Stathmine et cancer ..........................................................................................................17
II.5.1. Expression au cours du cancer ....................................................................................18
II.5.1.1. Expression dans le cancer colorectal ..................................................................19
II.6. Phosphorylation de la stathmine au cours du cancer .......................................................19
Chapitre Ⅲ : Les monoterpènes ...........................................................................................21
III.1. Généralités .......................................................................................................................22
III.2. Classe et la structure des monoterpènes .........................................................................22
III.3. Activités biologique des monoterpènes ...........................................................................24
III.3.1 Activités antibactérienne ................................................................................................24
III.3.2.Activités antifongique ....................................................................................................24
III.3.3 Activités antioxydante ...................................................................................................25
III.3.4.Activités anti-tumorale ..................................................................................................25
III.4. Monoterpènes et protéines Kinases .................................................................................26
Chapitre Ⅳ : Matériels et Méthodes ....................................................................................28
Ⅳ.1. Screening virtuel .............................................................................................................29
Ⅳ.2. Docking moléculaire .......................................................................................................29
Ⅳ.2.1. Récepteur ...................................................................................................................29
Ⅳ.2.2. Ligand ........................................................................................................................29
Ⅳ.2.3. Processus de docking ................................................................................................31
Chapitre V : Résultats et Discussions ...................................................................................38
V.1. Résultats du criblage moléculaire .....................................................................................39
V.2. Résultats du Docking moléculaire ....................................................................................39
Conclusion & perspectives.....................................................................................................50
Références bibliographique ...................................................................................................52
Liste des abréviations
ADN : Acide désoxyribonucléique
ADT : AutoDock Tools
AID : Cytidine désaminase induite par l'activation
CCR : Cancer colorectal
CDK : Kinase dépendante du cycle
ERK : Kinases extracellulaires régulier par le signal
Glu : Glutamate
HE : Huiles essentielles
KDa: Kilo-Dalton
Leu : Leucine
MAPK : Protéine kinase activée par les mitogènes
MTs : Microtubules
N-ter : N-terminal
PARP: Enzyme polymérase
PDB: Protein Data Bank
Phe: Phenylalanine
PKA: Protéine kinase A
PKC : Protéine kinase C
PLIP : Protein-Ligand Interaction Profiler
RMSD : Root Mean Square Deviation
RT-PCR : Tests quantitatifs en temps réel dans un certain nombre de tissus humains normaux
SCG 10 : Ganglion cervical supérieur à 10
Ser : Sérine
SLD : Stathmin Like Domain
STMN1 : Stathmine 1
TTO : Huile essentielle d'arbre à thé
Liste des figures
Figure 1 : Schéma représentatif des protéines de la famille Stathmine . .................................. 6

Figure 2 : Séquence en acides aminés de la stathmine humaine. .............................................. 8
Figure 3 : Expression des gènes de la famille des stathmines chez l’humain . ....................... 10
Figure 4 : Etapes de cancérogenèse......................................................................................... 14
Figure 5 : Schéma représentant les différentes caractéristiques acquises par les cellules après
mutations génétiques. ............................................................................................................... 17
Figure 6 : Analyse IHC de la stathmine dans le cancer du poumon et les tissus pulmonaires
normaux (IHC×400). ................................................................................................................ 18
Figure 7: Structure des monoterpènes antitumoraux présents dans les huiles essentielles….23
Figure 8 : Structure 3D de Stathmine 1. .................................................................................. 29
Figure 9 : Représentation schématique de la stathmine humaine et du peptide I19L dérivé du
domaine N-terminal d'interaction de stathmine avec la tubuline décrit par. ............................ 32
Figure 10 : Structure de l’interaction I19L/tubuline obtenue par analyse structurale RMN (A),
résidus impliqués dans l’interaction et la stabilisation de la structure (B). .............................. 32
Figure 11 : Résultats des scores donnés par UCSF Chimera. ................................................. 40
Figure 12 : Modèles 3D d’interaction de stathmine 1 tronquée dans 2 parties N terminale
structure en « β-harpin » (1-24aa), N-terminal structure en « loupe » (24–46aa) et hélice α
(résidus 47-141) avec 4-térpineol. ............................................................................................ 40
Figure 13 : Modèles 2D d’interaction stathmine 1 tronquée avec 4-terpinéol. ....................... 41
Figure 14 : Modèles 2D d’interaction stathmine 1 tronquée et mutée S16A avec 4-terpinéol.
.................................................................................................................................................. 42
Figure 15 : Modèle 2D d’interaction stathmine 1 tronquée et mutée S16E avec 4-terpinéol. 42
Figure 16 : Modèle 2D d’interaction stathmine 1 tronquée et mutée K9R avec 4-térpineol. . 43
Figure 17 : Modèle 2D d’interaction stathmine1 tronquée et mutée A15R avec 4-térpineol. 44
Figure 18 : Modèle 2D d’interaction stathmine 1 tronquée et double mutée K9A15R avec 4-
térpineol. ................................................................................................................................... 44
Figure 19 : Modèle 2D d’interaction stahmine 1 tronquée et mutée S25A avec 4-terpinéol. . 45
Figure 20 : Modèle 2D d’interaction de stathmine 1 tronquée et mutée S25E avec 4-térpineol.
.................................................................................................................................................. 46
Liste des tableaux
Tableau 1 : Structures 3D et 2D de ligands. ............................................................................ 30

Tableau 2 : Meilleurs ∆G révélés par le screening moléculaire. ............................................. 39
Tableau 3 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée avec 4-terpinéol. ........................... 41
Tableau 4 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée S16A avec 4-terpinéol. .. 42
Tableau 5 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée S16E avec 4-terpinéol. .. 43
Tableau 6 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée K9R avec 4-terpinéol. ... 43
Tableau 7 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée A15R avec 4-terpinéol. . 44
Tableau 8 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et double mutée K9A15R avec 4-
terpinéol .................................................................................................................................... 45
Tableau 9 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée S25A avec 4-terpinéol. .. 45
Tableau 10 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée S25E avec 4-terpinéol. 46
Introduction générale
La stathmine, également appelée Op18 (Hailat et al., 1990), est une petite phosphoprotéine
ubiquitaire cytosolique d’un poids moléculaire 17 kDa, composée de 149 acides aminés, qui
sont organisés en partie N-terminale, domaine régulateur de la stathmine, cette région comporte
quatre domaines de phosphorylation, et la partie C-terminale qui est le domaine d'interaction
de la stathmine, qui comprend une structure hélicoïdale susceptible d'interagir avec d'autres
protéines (Transl, 2016).
Cette protéine est un régulateur de la dynamique des microtubules (MTs), en séquestrant la
tubuline dans un complexe composé de deux hétérodimères de tubuline par molécule de
stathmine (complexe T2S) (Jourdain et al., 2004). Qui subit une phosphorylation importante
au cours du cycle cellulaire ainsi qu'en réponse à divers facteurs extracellulaires ; quatre résidus
de sérine sont des cibles pour les protéines kinases : Ser-25 et Ser-38 pour les kinases dirigées
par la proline telles que la protéine kinase activée par un mitogène et la protéine kinase
dépendante de la cycline, et Ser-16 et Ser-63 pour la protéine kinase dépendante de l’AMPc
(Paulo et al., 1997).
La phosphorylation de la stathmine a un rôle important dans le remodelage du réseau des MTs
et la formation du fuseau mitotique pendant la progression de la mitose (Biochem et al., 1998).
Son activité déstabilisatrice des MTs est désactivée au début de la mitose par phosphorylation
pour permettre la polymérisation des MTs et l'assemblage du fuseau mitotique. La stathmine
phosphorylée doit être réactivée par déphosphorylation avant que les cellules ne sortent de la
mitose et n'entrent dans une nouvelle interphase (Lancu Rubin et al., 2004).
La famille des protéines Stathmines est constituée de phosphoprotéines hautement conservées
chez les vertébrés et dont on pense qu'elles sont impliquées dans le développement et la
régulation fonctionnels de divers organes, notamment le système nerveux. Cette famille
comprend la stathmine, SCG10, SCLIP, RB3 et ses deux variants d’épissage RB3’ et RB3’’,
phosphoprotéines apparentées par des homologies structurelles et fonctionnelles (Poulain,
2007).
A noter, la surexpression de la stathmine a été accordée à plusieurs cancers chez l’homme,
notamment le cancer colorectal, le cancer du sein et le cancer gastrique (Bioaxure et al., 2016);
ce qui suggère qu’elle pourrait avoir un rôle dans la progression tumorale (Curmi et al., 2000)
et à la formation des métastases pour plusieurs types de cancers (Zheng et al., 2010).
Il est possible que cette surexpression soit liée à une altération de la protéine p53. En effet, des
travaux ont montré que l’induction de la protéine p53 induit une inhibition de la prolifération
2
et une répression de l’expression de la stathmine par une régulation au niveau transcriptionnel

impliquant les histones désacétylases (Murphy et al., 1999).
Une étude récente a montré que sa surexpression est associée à un mauvais pronostic dans le
cancer de l’ovaire, et pourrait présenter une bonne cible thérapeutique pour ce type de cancer
(Nie et al., 2022).
Les monoterpènes se trouvent dans les huiles essentielles (HE) des nombreuses plantes
aromatiques, ils empêchent le processus de cancérogenèse aux stades d’initiation, de promotion
et de progression. Ainsi, ils sont efficaces dans le traitement des cancers précoces et avancés
(Gould et al., 1997).
A partir de ces données, on avait tenté par une approche in silico, en utilisant les logiciels de
Docking moléculaire, d’étudier les interactions du récepteur (Stathmine Wild Type et mutées)
avec les ligands monoterpènes cycliques (α-thujène, α-pinène, β-pinène, α-phellandrène, p-
cymène, 4-terpinéol, α-terpinéol), les plus abondants dans les plantes médicinales utilisées en
phytothérapie notamment le “Thymus vulgaris” et l’arbre de thé “Melaleuca alternifolia”, afin
d’approfondir les connaissances sur l’implication de la stathmine sur l'activité de séquestration
de tubuline et confirmer l’importance du domaine N-terminale sur l’activation de la stathmine,
une nouvelle approche d’améliorer rationnellement l’efficacité des médicaments dérivés des
monoterpènes cycliques au cours de la prolifération tumorale.
3
Synthèse
Bibliographique
Chapitre I :
Stathmine
Synthèse bibliographique Chapitre I : Stathmine
I.1. Introduction
L’Op 18/stathmine est une protéine d’un poids moléculaire de 17 kDa (Sobel, 1991). Il s'agit
d’une protéine déstabilisatrice des microtubules (MTs) et qui favorise la dépolymérisation des
MTs en séquestrant les hétérodimères de tubuline α et β en induisant le phénomène
‶catastrophe″ des MTs (Charbaut et al). Il s’agit d’une protéine cytosolique dont la
phosphorylation est corrélée à l'action de multiples stimuli extracellulaires régulant la
prolifération et la différenciation (Marklund et al., 1994).
Cette protéine est exprimée dans une variété de types de cellules et de tissus, y compris les
neurones, où elle est très abondante au cours du développement (pour une revue, voir Sobel,
1991). Malgré un intérêt considérable pour l'expression et la phosphorylation de la stathmine
dans les neurones, à ce jour, il n'y a eu aucune preuve directe impliquant cette protéine dans des
fonctions neuronales spécifiques.
I.2. Présentation de la protéine stathmine
C’est une petite phosphoprotéine réglementaire intégrant diverses voies de signalisation
intracellulaire. C’est aussi l’élément générique d’une famille des protéines comprenant les
protéines neurales SCG10, SCLIP, RB3 et ses deux variantes d’épissage RB3′ et RB3″ (figure
1) (Anderson et Axel, 1985).
Figure 1 : Schéma représentatif des protéines de la famille Stathmine (Anderson and Axel,
1985).
Les protéines apparentées : SCG10, SCLIP, RB3, RB3′et RB3′′ sont exprimées dans les
neurones et diffèrentes de l'Op18/stathmine par des extensions N-terminales qui sont
susceptibles de s’ancrer sur les membranes des organites (Ozon et al., 1997). La région N-
terminale de stathmine contient une hélice polyproline II (boîte verte dans la figure 1) tandis
que le reste de l'extrémité N-terminale n'est pas structuré (Redeker et al., 2000). La majeure
6
partie de la protéine restante est prédite comme ayant une structure en hélice α (Wallon et al.,
2000), représentée en rouge dans la figure 1.
Lorsqu'elle n'est pas liée à la tubuline, cette région présente également une structure
désordonnée (Steinmetz et al., 2000). Les positions des sites de phosphorylation de la sérine
dans stathmine sont indiquées. Les positions conservées des résidus de sérine présents dans les
autres membres de la famille sont également indiquées (figure 1).
Le nombre de résidus codés par les ADNc de chaque protéine est indiqué à droite, c : cystéine,
les pourcentages indiqués dans les extensions N-terminales correspondent au degré d’identité
de séquence du sous domaine A par rapport à celui de SCG10, les pourcentages portés dans le
domaine SLD (Stathmin Like Domain) indiquent le degré d’identité de séquence entre la
stathmine (100%) et les domaines SLD des autres protéines.
La stathmine possède quatre sites de phosphorylation en sérine (Ser) (Ser-16,25, 38, et 63) à
son extrémité N-terminale, qui peut à elle seule s’opposer à la polymérisation des MTs (Tabet-
Helal and Curmi, 2014).
Le domaine C-terminale de sthatmine, peut lui aussi interagir avec des protéines candidates
comme : KIS, une nouvelle kinase avec un motif de reconnaissance d'ARN inhabituel, les
protéines de la famille des chaperons Hsp70 (Li et Cohen, 1996).
I.2.1. Extension N-terminale de stathmine
Tous les membres de cette famille possèdent un "domaine semblable à la stathmine" (SLD :
Stathmin Like Domain) et à l'exception de la stathmine, ont des extensions N-terminales
variables qui les orientent vers les membranes vésiculaires de Golgi (Charbaut et al., 2001).
Cette organisation structurelle globale indique qu'en plus de leurs fonctions uniques, elles
partagent certaines propriétés fonctionnelles communes (Di Paolo et al., 1997).
Ⅰ.3. Structure de la stathmine
Ⅰ.3.1. Structure primaire
La structure primaire de la stathmine suggère qu’elle est organisée en deux domaines : NH2
terminal « régulateur » contenant les quatre sites de phosphorylation identifiés in vivo, et un
Domaine d’interaction COOH-terminal contenant une structure hélicoïdale α, formant
potentiellement une bobine enroulée pour des interactions avec d’autres protéines (Doye and
coll, 1989).
7
Ⅰ.3.2. Structure secondaire

La structure secondaire en solution a été analysée par différentes méthodes.
Les expériences de centrifugation sur gradient de sucrose et de filtration sur gel ont permis
d’identifier le coefficient de sédimentation (1,4 S) et le rayon de Stokes de la stathmine
recombinante (33Å). La stathmine est une protéine monomérique de forme allongée et
légèrement asymétrique (Schubart et al., 1987 ; Curmi et al., 1994).
Des expériences de dichroïsme circulaire réalisées à 20°C ou à plus basses températures, ont
permis d’obtenir des spectres conformes à la présence d’un contenu en hélice α d’environ 45%,
ce qui représentait environ les 2/3 de stathmine (environ 90 résidus) (Steinmetz et al., 2000).
Ces expériences ont aussi indiqué que le niveau d’hélicité de la stathmine est inversement
dépendant de la température, la stathmine se dénature à 40°C (figure 2) (Steinmetz, 2007).
Le microscope électronique en transmission montre une population hétérogène de particules
avec un aspect en forme mince et flexible, suggérant ainsi que les structures hélicoïdales sont
en équilibre avec des structures moins ordonnées (Steinmetz et al., 2000).
L’ensemble de ces données permettent de découper la chaine polypeptidique de la stathmine en
deux régions distinctes : une région N-terminale relativement non structurée et une région C-
terminale hélicoïdale (Schubart et al., 1987 ; Sobel et al., 1989). L’hélice α est une région
riche en proline qui peut être divisée en deux hélices α séparées par une courte séquence
(Redeker et al., 2000). La 1ère hélice α est la région la plus structurée et c’est elle qui
conditionnerait l’hélicité du reste de la stathmine (Steinmetz et al., 2000).
Figure 2 : Séquence en acides aminés de la stathmine humaine (Steinmetz, 2007). Rouges petits
police : résidus polaires. Rouge grande police : sites de phosphorylation.
Ⅰ.4. Expressions de la stathmine

Ⅰ.4.1. Au cours de prolifération cellulaire
Au niveau cellulaire, une importante phosphorylation de stathmine se produit au cours de la
mitose (Bratta et al., 1992). Ce qui semble essentiel à la progression du cycle cellulaire, comme
le révèle le fort blocage du cycle cellulaire consécutif à la surexpression de divers mutants du
8
site de phosphorylation de la Stathmine (Larsson et al., 1995), suite à la surexpression de divers

phosphoryles de la stathmine (Brattsand et al., 1994).
L'expression de la Stathmine est augmentée lorsque les lymphocytes T sont induits à proliférer
(Luo et al., 1991). Ou dans les cellules leucémiques aiguës par rapport à leurs homologues
normaux (Melhem et al., 1991).
Ⅰ.4.2. Expression et régulation au cours de développement embryonnaire
L'expression de la stathmine est également régulée tout au long du développement normal :
Expression plus élevée dans les cellules multi potentielles de la masse cellulaire interne et
diminue dans les premières couches embryonnaires différenciées (Doye et al., 1992). Cette
régulation précoce du développement est suivie d'un autre pic d'expression de la stathmine, dans
tous les tissus au stade néonatal (Koppel et al., 1990). La stathmine est fortement exprimée et
constitue un substrat de phosphorylation majeur dans les neurones embryonnaires en culture
(Chneiweiss et al., 1989). Chez l'organisme adulte également dans le cerveau est le tissu où la
stathmine est la plus abondante (Chneiweiss et al., 1989).
Ⅰ.4.3. Expression tissulaire
L'expression des protéines de la famille Stathmine dans les tissus humains a été examinée par
des tests RT-PCR quantitatifs en temps réel dans un certain nombre des tissus humains normaux.
Les niveaux d'expression normalisés de l'ARNm de la stathmine, SCG10, RB3 et SCLIP sont
présentés sur la figure 3. La stathmine est exprimée de manière ubiquitaire dans les tissus
humains, transcrit de la stathmine apparaît comme l'espèce la plus abondante de la famille des
stathmines dans tous les tissus examinés (Ivan et al ., 2002).
9
Figure 3 : Expression des gènes de la famille Stathmine chez l’humain (Bieche et al., 2003).
ARNm des protéines de la famille Stathmine ont été mesurés par RT-PCR quantitative dans des tissus
humains adultes (sauf le cerveau fœtal).
Ⅰ.5. Phosphorylation de stathmine

Dans l’ensemble, les résultats démontrent in vivo la conservation fonctionnelle du domaine
stathmine au sein de chaque protéine de la famille stathmine, avec une activité déstabilisante
des MTs très probablement essentielle pour leur(s) fonction(s) biologique(s) spécifique(s)
(Manceau, 1998).
La stathmine est variablement phosphorylée sur quatre résidus sérine (Ser) distincts dans les
cellules intactes, à savoir, Ser-16, -25, -38 et -63 (Labdon et al., 1992)Les quatre résidus Ser
sont phosphorylés à une stœchiométrie élevée pendant la mitose. Les kinases dépendantes du
cycle (CDK), principalement CDK1 associée à la cycline B, ont été identifiées comme le
système de kinases qui phosphoryle Ser-25 et Ser-38.
Au cours du cycle cellulaire, stathmine est phosphorylée par des membres de la famille des
protéines kinases activées par les mitogènes sur Ser-25 (Leighton et al., 1993).
Par la famille des protéines kinases activées par la kinase IV/Gr dépendante de la
Ca21/calmoduline (CaMK IV/Gr) sur Ser-16 (Marklund et al., 1994). Et par la protéine kinase
(PKA) dépendante de l'AMP cyclique sur Ser-25 (Marklund et al., 1993). Kinase dépendante
de l'AMP cyclique (PKA) sur Ser-16 et Ser-63 (Beretta et al., 1993).
10
Ⅰ.6. Régulation de la phosphorylation de stathmine

La stathmine est phosphorylée à un faible niveau basal en interphase et devient très
phosphorylée en interphase par les kinases cycline-dépendantes (Larsson et al., 1997), et une
kinase polo-like (Budde et al., 2001). Lors de l'entrée en mitose, la progression dans le cycle
cellulaire nécessite la phosphorylation des quatre sérines (Ser-16, -25, -38 et -63). Le niveau de
phosphorylation est régulé par la protéine phosphatase 2A pendant la mitose (Tournebize et
al., 1997). Et la déphosphorylation se produit à la fin de la mitose (Mistry et al., 2001).
En conclusion, la stathmine est une phosphoprotéine ubiquitaire déstabilisatrice des MTs, et qui
est régulée négativement par phosphorylation au cours de la mitose au niveau des résidus sérine
et cela par différentes kinases.
C’est l’élément générique d’une famille des protéines stathmines qui présentent un domaine en
commun, le domaine SLD (Stathmin Like Domain) et qui interagissent différemment avec la
tubuline.
La surexpression de la stathmine sauvage (Wild Type) et mutée dans les cellules cancéreuses
pourrait être exploitée comme un champ antiprolifératif de la cellule cancéreuse.
11
Chapitre II :
Stathmine & Cancer
Synthèse bibliographique Chapitre II : Stathmine & Cancer
II.1. Introduction
Le cancer est une maladie à risque élevé, sa morbidité est fréquente dans le monde entier. Ainsi,
les facteurs la causant sont nombreux et très variés, chacun d'entre eux a un mécanisme de
cancérisation bien déterminé. L'évolution du cancer suit plusieurs étapes, depuis la
transformation maligne jusqu'aux métastases. Au cours de cette évolution, la cellule cancéreuse
acquière plusieurs caractéristiques (perturbations de la prolifération cellulaire, angiogenèse),
qui lui permettent de réussir à coloniser le corps humain.
Le diagnostic joue un rôle essentiel dans la réussite du traitement, dont la chirurgie et la
radiothérapie interviennent dans des stades précoces (Khelfallah et al., 2007).
La stathmine souvent surexprimée dans le cancer et associée à une invasion métastasique
(Singer et al., 2007). Les modifications des cellules cancéreuses seules ne suffisent pas pour
favoriser la métastase (Kopfstein et al., 2006), le microenvironnement tumoral joue également
un rôle central dans la progression tumorale et les métastases (Pollard, 2009). Dans le cancer
humain, des niveaux élevés de stathmine, sont presque invariablement associés à une
augmentation de la malignité, à la formation de métastases et à une diminution de la survie des
patients, ce qui suggère qu'il pourrait servir d’un bon marqueur pronostique pour identifier les
patients atteints d'une maladie plus agressive (Belletti, 2011).
II.2. Définition du cancer
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d’un
tissu de l’organisme. Ces cellules dérivent toutes d’un même clone, cellule initiatrice du cancer
qui a acquis certaines caractéristiques lui permettant de se diviser indéfiniment, en échappant
aux mécanismes normaux de différenciation et de régulation de sa multiplication. Au cours de
l’évolution de la maladie, certaines cellules peuvent migrer de leur lieu de production et former
des métastases (Bouksil, 2019).
Un cancer c’est la perte de contrôle accidentelle de la régulation des cellules qui aboutit à leur
prolifération anarchique. Une tumeur est le résultat de la multiplication désordonnée des
cellules d’un tissu ou d’un organe qui envahissent les tissus voisins en détruisant les capsules
de séparation provoquant ainsi des métastases (Morel, 2008).
II.3. Cancérogénèse
La cancérogenèse est un processus complexe, caractérisée par l’accumulation progressive
d’altérations génétiques et épigénétiques, qui résultent de l’instabilité du génome et qui
conduisent à la dérégulation de l’expression de toute une cascade de gènes et de voies de
signalisation. Ces changements aboutissent à l’obtention de cellules néoplasiques ayant acquis
plusieurs avantages sélectifs (Hanahan, 2000).
13
Il s’agit de l'ensemble de phénomènes pathologiques, conduisant à la transformation d’une

cellule normale en cellule cancéreuse. Deux sortes de gènes, les proto-oncogènes et les gènes
suppresseurs de tumeurs, ont un rôle fondamental dans l’apparition du cancer (Kouloughli,
2013).
De manière générale, le processus de cancérogenèse fait intervenir plusieurs étapes, au cours
desquelles les cellules tumorales acquièrent progressivement de nouvelles propriétés
biologiques, telles qu’une capacité accrue à proliférer et envahir les tissus avoisinants et à se
propager dans tout l’organisme. Un échappement aux processus associés au vieillissement
cellulaire et à l’apoptose, ou encore une capacité à induire la formation de nouveaux vaisseaux
sanguins (figure 4).
Figure 4 : Etapes de la cancérogenèse (D’après Yokota, 2000).
Des agents néfastes affectent une cellule normale et l’initient à la cancérogenèse, la cellule entre
en phase de promotion tumorale, elle subit des lésions au niveau de l’ADN et cela déclenche la
prolifération incontrôlée. Des oncogènes sont activés et des gènes suppresseurs sont inactivés
pour amener les cellules en phase de progression qui peut durer des années. Finalement, le
cancer s’établit et peut être diagnostiqué. En suivant ces stades de développement, les tumeurs
acquièrent des caractéristiques qui définissent leurs changements phénotypiques.
Premièrement, elles deviennent indépendantes des signaux normaux de prolifération cellulaire.
Deuxièmement, elles sont insensibles aux signaux antiprolifératifs. Troisièmement, il s’installe
une résistance à l’apoptose. Quatrièmement, elles adoptent une capacité anormale
d’angiogenèse. Cinquièmement, elles deviennent invasives et mènent à la formation de
métastases. Sixièmement, leur capacité de réplication de l’ADN est illimitée.
14
II.3.1. Etapes de la cancérogénèse

II.3.1.1. Phase d’initiation
Elle est causée par une ou plusieurs altérations irréversibles de l’ADN en réponse par exemple
à un agent mutagène conférant à la cellule la capacité de proliférer de manière autonome. La
cellule initiée, bien que morphologiquement identique aux cellules normales, possède les
altérations génotypiques nécessaires à sa transformation (Basu, 2018).
II.3.1.2. Phase de promotion
Correspondant à la prolifération (multiplication anormale) du clone des cellules initiées
(Barouki, 2014).
II.3.1.3. Phase de progression
Contrairement à l’étape d’initiation, est une phase relativement longue pouvant durer plusieurs
années chez l’homme et caractérisée dans un premier temps par l’expansion clonale de la cellule
initiée. La multiplication cellulaire étant exponentielle, un nombre limité de mitoses est
suffisant pour donner naissance à un nombre considérable de cellules tumorales. Les agents
influençant la progression tumorale ne sont habituellement pas mutagènes et favorisent la
croissance cellulaire via différentes actions : effets pro-inflammatoires, induction de signaux
mitotiques, effet de perturbation endocrinienne. Les déterminants de l’expansion clonale des
cellules initiées sont très nombreux et incluent divers facteurs endogènes (facteurs de
croissance, hormones…), ou exogènes (polluants chimiques, facteurs alimentaires…) (Perrais
et al., 2020).
II.4. Altération génétique dans le cancer
La transformation d’une cellule normale en cellule cancéreuse résulte de l’accumulation
d’altérations génétiques modifiant l’activité de gènes bien spécifiques (Larmarcovai, 2008).
Ces altérations génétiques ont deux conséquences bien différentes. Elles peuvent conduire à
l'augmentation de l'activité de certains gènes favorisant au sens large la croissance tumorale,
ces gènes sont appelés oncogènes. À l'inverse, elles peuvent inactiver d'autres gènes dont
l'activité physiologique s'oppose à la transformation tumorale, d'où leur nom de gènes
suppresseurs de tumeurs. Au niveau de la cellule tumorale, les oncogènes ont une action
dominante : l'activation d'un seul allèle est généralement suffisante à sa contribution au
phénotype tumoral. À l'inverse, les gènes suppresseurs de tumeurs sont récessifs : l'inactivation
des deux allèles est nécessaire. Il faut cependant nuancer ces notions, car d'une part la réduction
d'activité de certains gènes suppresseurs, par exemple par haplo-insuffisance, suffit parfois à
conférer un avantage sélectif vers la malignité. D'autre part, certaines mutations de gènes
suppresseurs de tumeurs ont une action dominante, tout en inhibant la fonction du gène (action
15
dominante négative). L'exemple le plus classique est le gène TP53 dont des mutations
inactivatrices produisent un stabilisateur de la protéine mutante et inhibe de façon dominante le
complexe transcriptionnel tétramérique P53 (Soufir, 2010).
Il est possible d’identifier au moins une altération génétique ou épigénétique somatique dans la
presque totalité des cancers (Versteeg, 2014). Le nombre d’altérations identifiées dans les
cellules tumorales varie énormément d’un type tumoral à un autre, d’un patient à un autre, et
parfois d’une partie de la tumeur à une autre. Si l’on considère les séquences codantes du
génome, une tumeur peut être la conséquence de l’altération d’un seul gène, comme on
l’observe dans certaines tumeurs pédiatriques. Dans la leucémie myélomonocytaire chronique
juvénile par exemple, il n’existe le plus souvent qu’une seule mutation induisant l’activation
constitutive d’une voie de signalisation, en l’occurrence la voie Ras (Muramatsu et al., 2013).
À l’opposé, dans les tumeurs induites par une exposition chronique à des agents mutagènes
(mélanomes dus aux ultra-violets, cancers du poumon dus au tabac), on détecte plusieurs
centaines de mutations géniques par cellule tumorale (Alexandrov et al., 2013 ; Kandoth et
al., 2013 ).
En dépit des progrès spectaculaires de ces dernières années, l’identification des mutations
récurrentes caractérisant un type tumoral donné est encore incomplète, même pour les tumeurs
les plus fréquentes. Un calcul récent suggère qu’il faudra séquencer entre 600 et 5 000 tumeurs
d’un type donné pour avoir une image complète de ses caractéristiques génétiques (Mermel et
al., 2014).
II.4.1. Deux catégories d’altérations
– Gain de fonction : mutation d’oncogènes, stimulation de la prolifération cellulaire, division
cellulaire, survie cellulaire (ou inhibition d’apoptose).
– Perte de fonction : mutation de gènes suppresseurs de tumeurs (Lehmenn, 2021).
16
Les événements mutationnels provoquent un changement irréversible d'une cellule normale en

une cellule au patrimoine génétique définitivement modifié ou cellule initiée (figure 5).
Figure 5 : Schéma représentant les différentes caractéristiques acquises par les cellules après
mutations génétiques (D’après Hanahan and Weinberg, 2011).
II.5. Stathmine et cancer

STMN1 est un gène qui code pour la protéine stathmine (ou Oncoprotein 18) appartenant à une
famille de protéines déstabilisatrices de microtubules (MTs) (Holmfel et al., 2009), qui est
réprimé transcriptionnellement par p53 fonctionnel, une protéine suppressive de tumeur (Rubin
et al., 2004). Stathmine a été identifiée pour la première fois comme une phosphoprotéine
cellulaire et a été surexprimée dans la leucémie en 1983 (Sobel et al., 1983). De nos jours, des
études et preuves ont indiqué que cette protéine est fortement exprimée dans de nombreux types
de cancers, y compris le cancer du foie (Zhang et al., 2016). L'expression élevée de stathmine
associe étroitement plusieurs caractéristiques clinicopathologiques du cancer du foie et
améliore considérablement l'invasion des cellules cancéreuses du foie (Chen et al., 2013).
Des modifications de STMN1 ont été fréquemment rapportées dans le cancer (Jeon et al.,
2010). Pour la première fois une corrélation positive de la surexpression de stathmine avec les
métastases ganglionnaires, foyers de migration et invasion vasculaire, avec un impact négatif
sur la survie sans récidive du type diffus de carcinome gastrique a été prouvée. Le même groupe
de scientifiques a démontré le rôle oncogène de stathmine par la diminution du taux de
prolifération, de la migration et de l'invasion des cellules cancéreuses gastriques in vitro via
l'inhibition de stathmine (Jeon et al., 2010). Désormais, stathmine a été considérée comme une
oncoprotéine régulatrice mitotique qui module la stabilité des microtubules (Rubin et al.,
2004).
17
Le gène STMN1 a été identifié comme étant fréquemment amplifié dans un ensemble de
cancers humains, tels que le cancer du sein, le cancer gastrique, le cancer de la prostate, le
cancer de l'œsophage, le cancer du col de l’utérus et le cancer de l'ovaire, ainsi que le cancer du
foie (Pan et al., 2020). Dans le cancer, le mécanisme d'activation de stathmine le plus courant
et le plus étudié est médié par la phosphorylation par plusieurs kinases de signalisation
intracellulaires, mais il peut également être médié par la séquestration des protéines (Serachi,
2017).
II.5.1. Expression au cours du cancer
La stathmine est surexprimée dans une variété des tumeurs malignes humaines, y compris les
cancers du sein, de l'ovaire, de la prostate et du poumon (Curmi et al., 2000), la leucémie aiguë
(landberg et al., 2003). Lymphomes (Nylander et al., 1995). Divers carcinomes (Ghosh et
al., 1993), adénocarcinomes (Curmi et al., 1999, sous presse) et neuroblastomes.
Elle a été exprimée dans le protoplasme cellulaire, qui a été coloré en brun par
immunohistochimie (IHC) (figures 6A, B, C, D, E, F, G et H). Stathmine était fortement
exprimée dans 31 (38,7%) des 80 tissus cancéreux du poumon, alors qu’elle était faiblement
exprimée dans 12 (15%) des 80 tissus normaux.
Figure 6 : Analyse IHC de la stathmine dans le cancer du poumon et les tissus pulmonaires
normaux (IHC×400) (D’après Shuanying et al., 2016). A. construction de puces à ADN tissulaires; B.
faible coloration de la stathmine dans les tissus pulmonaires normaux; C. coloration modérée de la stathmine dans
les tissus pulmonaires normaux; D. faible coloration de la stathmine dans le LSCC bien différencié; E. faible
coloration de la stathmine dans les ALC bien différenciés; F. coloration modérée de la stathmine dans les LAC
modérément différenciés; G. coloration élevée de la stathmine dans les LAC peu différenciés; H. coloration
modérée de la stathmine dans le LSCC modérément différencié; LAC, adénocarcinome pulmonaire; LSCC,
carcinome épidermoïde du poumon.
II.5.1.1.Expression dans le cancer colorectal

18
Les métastases du cancer colorectal (CCR) sont une cause majeure de mortalité dans le monde,
qui ne peut être contrôlée qu'avec des nouvelles méthodes limitant la dissémination tumorale et
la chimiorésistance. L'expression élevée de stathmine a déjà été établie comme une
caractéristique de la progression du CCR et un prédicteur d'une faible survie. Cependant, le
mécanisme d'action est moins clair. La transition métastatique dans le cancer colorectal est
extrêmement complexe, car des changements importants dans l'expression des protéines et la
diaphonie de signalisation sont nécessaires pour soutenir l'acquisition de la niche métastatique
(Lim et al., 2016). Auparavant, stathmine a été identifié comme un biomarqueur pronostique
du CCR basé sur la comparaison du protéome entre le carcinome du côlon HCT116 et sa lignée
cellulaire variante hépato-métastatique (E1) dérivée de souris nude après inoculation intra-
splénique répétée (Lan, 2010). L'expression élevée de stathmine était également étroitement
corrélée à la progression tumorale clinique du CCR et considérée comme un puissant prédicteur
de mauvais pronostic basé sur l'analyse des données de survie (Tan, 2012). Bien que la perte
phénotypique de la migration cellulaire, l'invasion de la matrice, la formation de colonies et le
renforcement de l'adhésion cellulaire aient été observables après l'extinction du gène STMN1.
Néanmoins, l'implication fonctionnelle de stathmine dans l'initiation et la subsistance
métastatiques demeure mal définie (Lim, 2016).
II.6. Phosphorylation de la stathmine au cours du cancer
La stathmine est une protéine régulatrice des MTs, qui joue un rôle important dans l'assemblage
et le désassemblage du fuseau mitotique (Wang, 2007). Au niveau moléculaire, elle
dépolymérise les MTs en séquestrant des dimères de tubuline libres ou en induisant directement
une « catastrophe » microtubulaire (Wang et al., 2014). Comme mentionné précédemment,
stathmine est codée par le gène STMN1 humain, qui possède 4 sites de phosphorylation de
sérine. La phosphorylation au niveau de Ser16 ou Ser63 réduit fortement ou abolit la capacité
de stathmine à se lier et à séquestrer la tubuline soluble (Manna et al., 2009). Stathmine Ser16
peut être phosphorylée par la protéine kinase C (PKC). PAK1 ou la kinase II/IV dépendante de
Ca2+/calmoduline (Wittmann et al., 2004). Tandis que Ser25 et Ser38 sont ciblées par des
protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) et dépendantes de la cycline kinases
(CDK) (Hayashi et al., 2006).
La surexpression de stathmine dans le cancer humain non seulement perturbe la progression
normale du cycle cellulaire, mais plus important encore facilite la polyploïdie/aneuploïdie des
cellules ciblées (Hsieh et al 2010).
La stathmine a été impliquée dans les points de contrôle G1/S et G2/M de la progression du
cycle cellulaire en influençant la dynamique de la formation des MTS et la progression du cycle
19
cellulaire (Akhtar et al., 2014). A noter qu’une une immunoréactivité aberrante de p53 était
associée à une expression plus élevée de stathmine dans l'adénocarcinome gastrique, suggérant
que la suractivation du gène STMN1 pourrait être partiellement due à l'inactivation du gène
suppresseur de tumeur p53. Batsaikhan et ses collaborateurs ont également démontré que la
cytidine désaminase (AID) induite par l'activation pouvait être l'un des activateurs de
l'expression de la protéine stathmine dans l'adénocarcinome gastrique. La corrélation entre P27
et protéine stathmine était liée soit directement, soit par une autre voie indéfinie (Batsaikhan
et al., 2014).
Matsumoto et ses collaborateurs ont rapporté que l'AID aberrante réduit le nombre de copies
des inhibiteurs de CDK tels que CDKN2A et CDKN2B, (Matsumoto et al., 2010), qui sont
des gènes suppresseurs de tumeurs et des CDK contrôlées négativement. AID pourrait être un
activateur de la protéine stathmine via la voie AID/CDKN2A/CDKs/stathmine (Chen el al.,
2018).
En conclusion, la stathmine est surexprimée dans plusieurs cancers ce qui l’impliquerait dans
la migration et la prolifération tumorales, elle représente une protéine intéressante à étudier
dans le cadre de délimiter le processus cancéreux.
20
Chapitre Ⅲ :
Monoterpènes
Synthèse bibliographique Chapitre III : monotrpénes
III.1. Généralités
Les monoterpènes sont des constituants importants des composés biogéniques formant des
aérosols (Griffin et al., 1999). Malgré de nombreuses mesures sur le terrain de monoterpènes
en phase gazeuse (Roberts et al., 1983 ; Zimmerman et al., 1988). Il existe peu d'études de
terrain dans lesquelles leurs produits d'oxydation ont été mesurés. Les progrès récents des
méthodes analytiques permettent désormais de détecter et d'identifier de tels composants
organiques secondaires d'aérosols, qui possèdent généralement de multiples groupes
fonctionnels oxygénés polaires (Yu et al., 1999).
Les monoterpènes sont des hydrocarbures non azotés, très réactifs et d’une courte durée de vie.
Bien que les terpènes soient essentiellement des hydrocarbures, de nombreux dérivés (alcools,
aldéhydes et cétones), sont également considérés comme des composés terpéniques et
dénommés terpénoïdes. Il n’existe pas une fonction chimique commune aux terpènes, cela
dépend de leur structure et leur biosynthèse. En tant que métabolites secondaires des plantes,
les monoterpènes présentent une diversité chimique très importante, permettent à la plante de
se défendre face aux facteurs de stress biotique et abiotique, constituent des signaux chimiques
à travers lesquels la plante communique avec son environnement (plantes et autres organismes),
n’ont pas de fonction universelle et sont différemment représentés dans les divers familles,
genres et espèces (Lafuente, 2006).
III.2. Classe et structure des monoterpènes
La classe des monoterpènes compte seulement deux unités isopréniques conférant à l’ensemble
de cette classe une structure en C10. Environ 1500 monoterpènes ont été décrits. Ils se divisent
en trois sous-classes : acycliques, monocycliques et bicycliques. Trois squelettes de base
décrivent chacune d’entre-elles : le diméthyl-2,6-octane pour les monoterpènes acycliques, le
para-menthane pour les monoterpènes cycliques, et le carane pour les monoterpènes bicycliques
(figure 7) (Machado et al., 2022).
22
Figure 7 : Structure chimique des monoterpènes antitumoraux présents dans les huiles
essentielles (D’après Machado et al., 2022).
Ces molécules sont synthétisées à la suite du couplage d’au moins deux entités à 5 carbones
dont la structure est celle de l’isoprène ou 2-méthylbuta-1,3-diène (Charlwood et al., 1991).
23
III.3. Activités biologiques des monoterpènes

Les monoterpènes appartiennent à la classe des terpénoïdes des produits naturels et sont
biosynthétisés par la voie de l'acide mévalonique. Leur faible poids moléculaire associé à une
nature non polaire élevée en fait les composants les plus abondants des huiles essentielles (HE)
qui sont souvent considérées comme ayant des effets antibactérienne, antifongique,
antioxydante et antitumorale généraux à des concentrations assez élevées (Habtemariam,
2018).
III.3.1. Activité antibactérienne
Les monoterpènes ont été dosés pour l'activité antibactérienne in vitro contre les bactéries E.
coli et S. aureus. Les résultats ont révélé que tous les composés testés présentaient une activité
antibactérienne in vitro remarquable contre les souches bactériennes testées. Les monoterpènes
alcooliques étaient les agents les plus antibactériens contre les deux bactéries testées par rapport
aux autres groupes. Lorsque l'on considère la susceptibilité des micro-organismes, un autre
point mérite d'être pris en compte, E. coli était plus sensible aux composés testés que S. aureus
(Dorman and Deans, 2000). Les catégories de ces composés présentent des propriétés
bactéricides ou agents bactériostatiques, selon la concentration utilisée. La présence d'une
fonction oxygène dans la charpente augmente les propriétés antimicrobiennes des terpénoïdes
(Naigre et al., 1996).
III.3.2. Activité antifongique
Les composés d'hydrocarbure et de monoterpènes ont été dosés pour l'activité antifongique in
vitro contre le champignon producteur d'aflatoxine Aspergillus flavus en comparaison avec le
carbendazime comme fongicide standard. Les résultats ont révélé que toutes les HE testées
présentaient une activité antifongique in vitro remarquable contre la souche de champignon
testée. Les monoterpènes alcooliques étaient les agents les plus antifongiques contre le
champignon testé par rapport aux autres groupes. Le genre Aspergillus, qui présente des espèces
infestant les plantes vivantes (par exemple A. flavus) et les produits alimentaires stockés, est
responsable de la contamination des aliments dans le monde entier (Kohiyama et al., 2015).
La croissance dans les denrées alimentaires est importante sur le plan toxicologique puisque
certaines espèces sont connues pour produire des mycotoxines lorsqu'elles sont exposées à des
conditions appropriées (Moreira et al., 2010). Plusieurs études de recherche ont rapporté que
les monoterpènes présentaient une activité antifongique contre un large éventail de micro-
organismes (Marchese et al., 2016 ; Santos et al., 2018).
24
III.3.3. Activité antioxydante

Les composés d'hydrocarbure et de monoterpènes ont été dosés pour l'activité antioxydante in
vitro en comparaison avec l'α-tocophérol comme agent antioxydant standard. Les résultats ont
révélé que tous les composés testés présentaient une activité antioxydante in vitro remarquable.
Il ressort clairement des résultats que le potentiel antioxydant des composés est associé à la
structure chimique et à son efficacité contre les ravageurs où les monoterpènes alcooliques
étaient les agents les plus antioxydants par rapport aux autres groupes. Les terpènes, l'un des
composés structuraux les plus étendus et les plus diversifiés de la nature, présentent une gamme
complète d'activités biologiques et de propriétés antioxydantes (Burgos and Serranillos,
2012). En raison de leur comportement antioxydant, il a été démontré que les terpènes
fournissent une protection appropriée dans des conditions de stress oxydatif dans différentes
maladies dont les cancers. Les principales classes de terpènes, à savoir les hydrocarbures
monoterpéniques, les monoterpènes oxygénés, les dérivés du benzène et les composants non
isoprénoïdes dont les alcools, les aldéhydes, les cétones ont été testées pour leur efficacité
antioxydante par rapport à l'α-tocophérol comme composé de référence (Ruberto and Barata,
2000).
III.3.4. Activité antitumorale
Un certain nombre de monoterpènes alimentaires ont une activité antitumorale, présentant non
seulement la capacité de prévenir la formation ou la progression du cancer, mais aussi de faire
régresser les tumeurs malignes existantes. L'huile de graines de carvi et son principal
monoterpène. La carvone, préviennent le développement de carcinomes du poumon et du
préestomac chimiquement induits lorsqu'ils sont administrés avant le carcinogène (Wattenberg
et al., 1989).
A noter, le carvéol (Crowell et al., 1992), et le menthol (Russin et al., 1989), ont une activité
chimiopréventive contre le cancer mammaire du rat lorsqu'ils ne représentent que 1% de
l'alimentation pendant la phase d'initiation. Le géraniol, un monoterpène alimentaire acyclique,
a une activité antitumorale in vivo contre les cellules de la leucémie murine, de l'hépatome et
du mélanome (Shoff et al. 1991 ; Yu et al., 1995). Lorsqu'il est administré avant et après la
greffe de cellules tumorales. De plus, l'alcool périllylique a une activité chimiopréventive en
phase de promotion contre le cancer du foie induit chimiquement chez le rat (Mills et al., 1995),
et est très efficace pour prévenir les récidives tumorales ou les tumeurs secondaires chez les
animaux traités par chimiothérapie (Haag and Gould, 1994).
De plus, des études ont prouvé que parmi les composants du TTO (4-terpinéol, γ-terpinène, 1,8-
cinéole, α-terpinène, α-terpinéol, p-cymène, and α-pinène), le 4-terpinéol est responsable de
25
l'efficacité de l'effet antiprolifératif et dans la sensibilisation à la thérapie ciblée. Dans les

cellules du mélanome humain ou de souris, le TTO et le 4-terpinéol ont provoqué un arrêt du
cycle cellulaire en phase G1, ont montré un effet antiprolifératif, une capacité anti-
migratoire/anti-invasive contre les cellules résistantes à la chimiothérapie, et ont enfin induit
une mort cellulaire nécrotique et apoptotique (Wu et al., 2012).
Il a été démontré que l'α-pinène stimule l'apoptose, ce qui se traduit par une perturbation initiale
de la fonction mitochondriale, la formation de ROS (Reactive Oxygen Species), l'amélioration
des propriétés de la caspase-3, l'agrégation de l'hétérochromatine, la désintégration de l'ADN et
l'exposition de la phosphatidyl-sérine à la surface des cellules (Salehi et al., 2019).
En outre, l'environnement est censé minimiser de manière significative la croissance du cancer,
comme l'ont démontré Kusuhara et ses collaborateurs qui ont déclaré que des rats placés dans
un environnement parfumé avec de l'α-pinène présentaient une diminution de la croissance du
mélanome (Kusuhara et al., 2012).
Quant au β-pinène, il inhibe la prolifération des cellules cancéreuses HeLa en stimulant l'arrêt
du cycle cellulaire par des voies de signalisation de dysfonctionnement mitochondrial médiées
par ROS (Salehi et al., 2019).
Il a été constaté que p-cymène peut prévenir l'apparition du cancer colorectal lié à un régime
riche en graisses et en calories en réduisant l’expression des facteurs pro- inflammatoires tels
qu’IL-1, et en augmentant l'expression des facteurs pro-inflammatoires IL-6 (Jin et al., 2021).
Alpha-terpinéol inhibe la croissance tumorale par un mécanisme impliquant l’inhibition de la
voie NF-KB (Bashir Hassan et al., 2010).
Ainsi, α-phellandrène induit un effet anti-tumoral au niveau des cellules cancéreuses humaines
hépatiques en induisant la production du monoxyde d’azote (NO), ce qui aboutit à une nécrose
induite par un stress, avec un effet efficace à une contraction de 30µM (Hsieh et al., 2014).
Alpha-thujène inhibe la prolifération des cellules tumorales humaines du glioblastome
multiforme et diminue leur viabilité à des concentrations comprises entre 660μM - 3,2 mM
(Pudelek et al., 2019).
III.4. Monoterpènes et protéines kinases
La réponse inflammatoire peut être induite par la production de cytokines et constitue une cible
essentielle dans la gestion des maladies inflammatoires. Les monoterpènes ont montré ce profil
prometteur en tant qu'agents qui réduisent le processus inflammatoire et modulent également
les médiateurs chimiques clés de l'inflammation, tels que les cytokines pro et anti-
inflammatoires. L'intérêt principal porté sur les monoterpènes était de développer les
médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. Les connaissances actuelles sur les
26
monoterpènes produisent des effets anti-inflammatoires en modulant la libération de cytokines,

ainsi que suggéré quelles molécules monoterpénoïdes pourraient être les plus efficaces dans le
traitement des maladies inflammatoires. Plusieurs différents marqueurs inflammatoires ont été
évalués comme cible des monoterpènes. Les cytokines pro-inflammatoires et anti-
inflammatoires ont été trouvées TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-5, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 IL-13,
IL- 17A, IFNγ, TGF-β1 et IFN-γ. La signalisation NF-κB et MAPK sont des voies importantes
pour l'action anti-inflammatoire des monoterpènes. Il y’a 24 monoterpènes qui modulent la
production de cytokines, ce qui semble être le principal mécanisme pharmacologique que
possèdent ces composés en ce qui concerne l'atténuation de la réponse inflammatoire. Malgré
les preuves convaincantes soutenant l'effet anti-inflammatoire des monoterpènes, d'autres
études sont nécessaires pour explorer pleinement leur potentiel en tant que composés anti-
inflammatoires (Heimfarth et al., 2019).
En conclusion, les monoterpènes cycliques sont des composants parfumés des plantes
médicinales, présentant un effet significatif sur la lutte contre la croissance tumorale et
apparaissent donc comme des bons candidats dans le cadre de la thérapie anti-cancéreuse.
27
Chapitre Ⅳ :
Matériels &Méthodes
Les monoterpènes cycliques sont les composants parfumés des huiles essentielles de diverses
plantes aromatiques présentant des effets biologiques bénéfiques surtout l’activité anti-tumorale
dans plusieurs cellules cancéreuses.
L’objectif de cette étude était de tester l’interaction et l’affinité de liaison de certains
monoterpènes cycliques avec la stathmine vie des logiciels de Docking moléculaire afin de
tenter d’inhiber sa phosphorylation ce qui bloquerait la formation du fuseau mitotique durant la
prolifération cellulaire.
Ⅳ.1. Screening virtuel

PubChem est une base de données de chimie ouverte des National Institutes of Health (NIH est
devenu une ressource essentielle d'informations chimiques pour les scientifiques, les étudiants
et le grand public. PubChem contient principalement des petites molécules, mais aussi des
molécules plus grandes telles que des nucléotides, des hydrates de carbone, des lipides, des
peptides et des macromolécules chimiquement modifiées. PubChem est disponible
gratuitement sur https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/search.cgi
Ⅳ.2. Docking moléculaire
Ⅳ.2.1. Récepteur
Premièrement, il faut aller à la base de données UniProt (universelle de protéines) :
https://www.uniprot.org, pour télécharger le récepteur. Uniport est une base de données
de séquences de protéines, c'est une base de données ouverte, stable et accessible en ligne, elle
est issue de la consolidation de l'ensemble des données produites par la communauté
scientifique. Cette base de données fournit des informations sur leur fonction et
leur structure ainsi que des liens vers d'autres bases de données. Concernant la stathmine 1, est
disponible dans la banque de données, la molécule répertoriée sous le code P16949 cid
(Steinmetz, 2007), sa structure a été déterminé par Alphafold (figure 8 plus loin).
Figure 8 : Structure 3D de Stathmine 1.

Ⅳ.2.2. Ligands
29
Les structures des ligands sont obtenues à partir du site PubChem
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/.Parmi les 7 ligands et de chaque ligand leur homologue (en
totale 287 molécules) capables d’interagir avec le récepteur Stathmine 1. La source de
molécules utilisées est dans la base de données PubChem. Ils sont classés dans le tableau 1.
Tableau 1 : Structures 3D et 2D de ligands.

Molécule Analogues Structure en 3D Structure en 2D
naturelle structuraux
Formule moléculaire
C27H34N2
Poids moléculaire
386.6g/mol
α-pinéne COD 101086219
: C19H23NO3
Poids moléculaire
p-cymène
: 313.4g/mol
Cod 16212
C17H24O9
Poids moléculaire
4-terpinéol
372.4g/mol
Cod 5885030
α-phellandrène C20H32
Poids moléculaire
272.5 g/mol
Cod 91747906
α-thujène : C10H12O
Poids moléculaire
: 148.2g/mol
Cod 129631927
30
γ-terpinéne C12H16Cl4
Poids moléculaire
302.1 g/mol
Cod 139086425
β-pinéne C10H16O
Poids moléculaire
152.23g/mol
Cod 93046
Ⅳ.2.3. Processus du Docking moléculaire

Le processus d’amarrage ou Docking moléculaire est utilisé pour générer une liste de
complexes représentant le mode de liaison favorable entre le ligand et le récepteur
macromoléculaire. L’étape suivante consiste à estimer ces complexes, afin de trouver le ou les
complexes plus probables pour reproduire au mieux le mode d’association réel. Les logiciels
PyRx et Chimera étaient utilisés pour tester l’interaction ligand-récepteur.
 PyRx : Est un logiciel libre doté d'une interface utilisateur intuitive et fonctionnant sur tous
les principaux systèmes d'exploitation (Linux, Windows et Mac OS) (Dallakyan et Olson,
2014).
 Chimera : UCSF Chimera est un programme pour la visualisation et l'analyse interactives
des structures moléculaires et des données associées, conçu pour être utilisé par les biologistes
structurels, les chercheurs biomédicaux et autres personnes intéressées par la structure et la
fonction moléculaires. Chimera est une application de bureau dont les racines sont
principalement dans l'analyse visuelle interactive (Huang et al., 2014).
-Afin d’obtenir des résultats plus précis, la protéine stathmine était tronquée en 3 parties :
1ère partie : structure en « β-hairpin » (1-24aa) (où se trouve le peptide d’intérêt I19L et la Ser
16) ; 2ème partie : la boucle (24–46aa), où se trouvent les Ser 25 et 38, 3ème partie en hélice α
(résidus 47–141) où se trouve la Ser 63 (figures 9 et 10).
31
Figure 9 : Représentation schématique de la stathmine humaine et du peptide I19L dérivé du
domaine N-terminal d'interaction de stathmine avec la tubuline décrit par (Clément et al.,
2005 ; Tabet-Helal et al., 2014).
Figure 10 : Structure de l’interaction I19L/tubuline obtenue par analyse structurale RMN (A),
résidus impliqués dans l’interaction et la stabilisation de la structure (B) (D’après Clément et
al., 2005).
 Le processus de coupure (stathmine tronquée) à été effectué par chimera
Le Docking moléculaire sur PyRx se déroule selon les étapes suivantes :
- Téléchargement de PyRx : http://pyrx.sourceforge.net/downloads.
32
- Chargement des molécules dans l'espace de travail PyRx
 Cliquer sur File puis sur Load Molecule et sélectionner le fichier P16949.
 Cliquer sur Open Babel / sélectionner la base de données Pubchem.
 Cliquer droit et sélectionner Minimize All.
 Cliquer Vina Wizard sélectionner Local /start /Add Macromolecule
Sélectionner p16949.
 Cliquer sur Open Babel puis cliquer droit sur les ligands et sélectionner Convert All to
AutoDock Ligand (pdbqt).
 Cliquer sur le premier ligand et sur shift puis sur le dernier ligand pour sélectionner
tous les ligands/et en fin sur Forward/Forward.
33
34
 Ensuite, on transforme le fichier de minimisation pdb en pdb.qt pour entrer dans
un autre programme qui s’appelle Chimera.
 Le Docking moléculaire se poursuit sur Chimera selon les étapes suivantes : Préparation
du récepteur
 Cliquer sur Tools puis sur Surface/Binding Analysis / Dock prep.
 Dans Dock prep sélectionner toute les options sauf « Delte non-complexed » et «
Write Mol2 file » / cliquer sur OK/OK/OK.
35
Ⅳ.2.4.Préparation du ligand pour le Docking
 Cliquer sur File puis Open/ dans notre cas de ligand.

 Cliquer sur Tools/Surface/Binding Analysis/ AutoDock Vina.
 Dans AutoDock Vina cliquer sur Brose/nomer votre complexe/ sélectionner le récepteur et
le ligand / cliquer sur button 1 et sur Resize search volume using.
 Cliquer sur l’écran par la souris clic droit pour mettre le complexe sur une boxe et cliquer
sur ok.
36
37
Chapitre V :
Résultats & Discussions
Résultats & discussion
V.1. Résultats du criblage moléculaire

Le screening moléculaire a permis de ressortir v molécules susceptibles de cibler Stathmine
1 en interagissant avec son extrémité N-terminale. Les meilleurs scores selon ∆G sont
donnés dans le tableau 2. Le ∆G ou enthalpie libre ou encore énergie libre de Gibbs, est
une fonction d'état introduite par Willard Gibbs. Elle correspond à l'énergie disponible dans
une réaction pour effectuer un travail utile et est différente du changement d'énergie total
d'une réaction et principe d’évolution des réactions physico-chimiques (Reichle, 2020).
Tableau 2 : Meilleurs ∆G révélés par le screening moléculaire.
Ligands PubChem CID ΔG (kcal/ml)
α pinéne 101086219 -5.9
P cymene 16212 -5.3
4-Terpineol 5885030 -5.2
α phellandrene 91747906 -4.8
Ɣ terpinéne 139086425 -3.8
ß pinéne 93046 -3.7
α thujène 129631927 -3.6
V.2. Résultats du Docking moléculaire

Après quelques minutes de Docking avec UCSF Chimera, s’ouvrire « ViewDock » et affiche
la liste tabulaire des poses (score, RMSD…etc.) (figure 11).
39
Figure 11 : Résultats des scores donnés par UCSF Chimera.

Pour mesurer les distances inter-atomiques on utilise fréquemment une grandeur appelée
écart quadratique moyen (RMSD - "Root Mean Square Deviation", en Å) entre les
coordonnées spatiales des atomes des acides aminés appariés.
La lecture de fichier pdb par « Discovory studio visualizer » permet la visualisation du mode
et le type d’interaction entre la meilleure conformation de ligand et leur récepteur. La figure
12 représente des modèles 3D d’interaction de stathmine 1 tronquée –ligand 5885030 (4-
terpinéol). Ces interactions engagent plusieurs types de liaisons comme les montre les
diagrammes 2D (figure 12).
A B C
Figure 12 : Modèles 3D d’interaction de stathmine 1 tronquée.A : N terminale structure en «

β-harpin » (1-24aa), B : N-terminal structure en « loupe » (24–46aa) et C : hélice α (résidus 47-
141) avec 4-térpineol.
40
N-terminal : « β-harpin » (1-24aa) « loupe » (24–46aa) hélice α (résidus 47-141)
Figure 13 : Modèles 2D d’interaction stathmine 1 tronquée avec 4-terpinéol.
V.2.1. Interaction stahmine 1 tronquée /4-terpineol

Différentes liaisons entre stathmine 1 tronquée et ce ligand sont établies selon le tableau 3.
Tableau 3 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée avec 4-terpinéol.
Liaisons dans la partie N-terminale « β- Liaisons dans la partie N-terminal structure
hairpin » (1-24aa) en boucle (24–46aa)
Acide aminé Type de liaison Acide aminé Type de liaison
Gln 18 / Ser Carbon hydrogene Ser 25 liaison conventional

hydrogene bond
16
Phe 20 / Gly Unfavorable
17 Acceptor/Acceptor
Ala 19 Pi-alkyl
1- Liaisons Hydrogènes : Concernant ces interactions qui sont et qui jouent le rôle le plus
important en biologie et le domaine du vivant, elles sont classées comme suit :
a- Liaisons hydrogène conventionnelles : H-Bond par
b- Carbone-Hydrogène bond
2-Interactions Hydrophobiques : Les interactions de ce type jouent un rôle essentiel dans la

stabilisation des complexes. Ce sont des interactions non covalentes de type hydrophobique.
a- Pi-alkyl
41
Par la suite, on a eu l’idée d’étudier l’impact de ce ligand 4-terpinéol sur la partie N-terminale
et la boucle de la Stathmine 1. Les mutations ont été faites au niveau des sérines 16 et 25
(S16A/S16E/S25A/S25E) et des mutations proposées K9R/A15R/K9RA15R (travaux Tabet-
Helal and Curmi, 2014), similaires aux mutations K4R/A10R/K4RA10R du peptide I19L
(travaux Clément, Curmi et leurs collaborateurs, 2005) (figures 14-20).
V.2.2. Interaction stathmine 1 tronquée et mutée dans la partie N-terminale « β-hairpin »
S16A
Figure 14: Modèles 2D d’interaction stathmine 1 tronquée et mutée S16A avec 4-terpinéol.
Tableau 4 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée S16A avec 4-terpinéol.
Acide aminé Type de liaison
Val 8 Pi-sigma
Phe 20 Pi-Pi T-shaped
S16E
Figure 15: Modèle 2D d’interaction stathmine 1 tronquée et mutée S16E avec 4-terpinéol.
42
Tableau 5 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée S16E avec 4-terpinéol.
Phe 20 Convetional hydrogene bond
Gln 18 Carbon hydrogen bond
Ala 19 Pi-alkyl
K9R
Figure 16: Modèle 2D d’interaction stathmine 1 tronquée et mutée K9R avec 4-térpineol.
Tableau 6 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée K9R avec 4-terpinéol.
AlA 19 Pi-alkyl
Gly 17 Convetional hydrogene
bond
43
A15R
Figure 17 : Modèle 2D d’interaction stathmine1 tronquée et mutée A15R avec 4-térpineol.
Tableau 7 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée A15R avec 4-terpinéol.
Glu 12 / Ser 16 Conventional hydrogen bond
Ala 19 Pi-alkyl
Phe 20 Pi-sigma
K9A15R
Figure 18: Modèle 2D d’interaction stathmine 1 tronquée et double mutée K9A15R avec 4-
térpineol.
44
Tableau 8 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et double mutée K9A15R avec 4-
terpinéol
Glu 12 / Gly 17 Conventional hydrogen bond
Phe 20 Unfavorable Acceptor-

Acceptor
Phe 20 Pi-sigma
Ala 19 Pi-alkyl
V.2.3. Interaction stathmine 1 tronquée mutée au niveau N-ter structure « en boucle»
S25 A
Figure 19 : Modèle 2D d’interaction stahmine 1 tronquée et mutée S25A avec 4-terpinéol.

Tableau 9 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée S25A avec 4-terpinéol.
Lys 29 /ARG 27 Carbon hydrogen bond
Pro 26 Pi-alkyl
45
S25E
Figure 20: Modèle 2D d’interaction de stathmine 1 tronquée et mutée S25E avec 4-térpineol.
Tableau 10 : Type des liaisons entre stathmine 1 tronquée et mutée S25E avec 4-terpinéol.
Glu 25 Conventional hydrogen bond
Pro 26 Pi-alkyl
2-Interactions Hydrophobiques
Les interactions de ce type jouent un rôle essentiel dans la stabilisation des complexes. Ce
sont des interactions non covalentes de type hydrophobique.
Pi-Sigma (π-σ) Pi-sigma
Pi-alkyl Pi-Pi T-shaped
46
V.3. Discussions
Le cancer est une maladie héréditaire liée à l’acquisition progressive de 5 à 10 mutations dans
une seule cellule (Stratton et al., 2009). Ces mutations s’accumulent au cours de la vie par
l’action combinée de facteurs génétiques héréditaires et agents mutagènes d’origine exogène
ou endogène.
L'évolution du cancer suit plusieurs étapes, depuis la transformation maligne jusqu'aux
métastases. Les protéines kinases sont des médiateurs clés de la signalisation extracellulaire et
intracellulaire et sont souvent impliqué dans les métastases cancéreuses humaines (Li, et al.,
2010). Par exemple, la voie Ras/Raf/MAPK (MEK)/ERK est la cascade de signalisation la plus
importante parmi toutes les voies de transduction du signal MAPK et joue un rôle crucial dans
la survie et le développement des cellules tumorales (Yan-Jun et al., 2020).
Les MTs sont des filaments protéiques composés de sous-unités hétérodimériques de tubuline
α/β qui basculent dynamiquement entre les phases d'auto-assemblage et de désassemblage.
Cette instabilité dynamique est largement régulée par la stathmine (Desai et al., 1996).
La stathmine, une phosphoprotéine qui se lie à l'extrémité des MTs pour séquestrer la tubuline
libre et favorise la dépolymérisation des MTs, ce qui entraîne une augmentation des
phénomènes « catastrophes » et réduit par conséquent leur dynamique (Belmont et al., 1996).
Cette protéine est régulée au niveau post-traductionnel via la phosphorylation au niveau des
sérines N-terminales, S16, S25, S38 et S63 (Daub et al., 2001). La phosphorylation est
essentielle pour inhiber l'activité de la stathmine et donc favorise la dissociation de la tubuline,
ce qui permet la stabilisation des MTs et leur polymérisation (Cassimeris et al., 2002).
Des études suggèrent un modèle d'augmentation de la phosphorylation de la stathmine par
plusieurs kinases pro-mitogènes au fur et à mesure que le cycle cellulaire progresse pour
permettre la formation appropriée du fuseau et mitose (Belletti et al., 2011).
Stathmine, également connue sous le nom de Op18, stathmine 1 ou métablastine est régulée à
la hausse dans certains cancers ( Rana et al., 2008; Nie et al., 2015) et est en corrélation avec
la différenciation, la prolifération et la migration des cellules (Biaoxue et al., 2016).
A ce jour, on ne sait pas si elle est cause ou conséquence du phénotype cancéreux ; son activité
vis-à-vis des MTs est régulée négativement par phosphorylation, cela fait d’elle une protéine
intéressante visant à cibler le fuseau mitotique des cellules cancéreuses en prolifération.
Les monoterpènes sont des métabolites secondaires majeurs dérivés des plantes, largement
présents dans les produits naturels, y compris les fruits, les légumes et les herbes présentant une
puissante activité anticancéreuse (Shapira et al., 2016).
47
Le 4-terpinéol, monoterpène cyclique, est l'un des principaux ingrédients actifs de l'huile d'arbre
à thé, consiste en un mélange de plus de 100 composés différents, que l'on trouve dans une
variété de plantes aromatiques (Pino et al., 2003).
Les effets anticancéreux du 4-terpinéol sont impressionnants sur divers types de cellules
cancéreuses, tant in vitro qu'in vivo.
Cette substance bioactive induit une inhibition significative de la croissance des cellules
cancéreuses colorectales, pancréatiques, prostatiques et gastriques de manière dose-dépendante
(10-90% dans 0,005-0,1%) (Shapira et al., 2016).
Cependant, les mécanismes moléculaires des effets anti-tumoraux du 4-terpinéol demeurent
mal définis.
A partir de ces données, dans ce travail on avait étudié in silico par processus d’amarrage ou de
Docking moléculaire les effets des plus stables monoterpènes cycliques anti-tumoraux : α-
thujène, α-pinène, β-pinène, α-phellandrène, p-cymène, Terpinène-4-ol et α-terpinéol (ligands)
avec la stathmine (récepteur) tronquée en trois parties : N-terminale srtructure « β-hairpin » (1-
24 aa), N-terminal structure en « loupe » (24-46 aa) et hélice-α (47-141 aa).
Les résultats montrent qui ligand 4-terpinéol, est le plus efficace puisque il interagit avec la
stathmine, en particulier au niveau de ses sites de phosphorylation en N-terminal Ser 16
et Ser 25, mais il ne présente aucune liaison avec la stathmine en partie hélice α (47-141aa).
A partir de ces observations, dans la deuxième partie des travaux on a introduit des mutations
au niveau des sites de phosphorylation de la partie N-terminale de stathmine :
mutations S16A/S16E/S25A/S25E.
De plus, pour analyser l’interaction entre 4-terpinéol au niveau de la structure « β-hairpin » en
partie N-terminale, des mutations proposées : K9R/A15R/K9RA15R par Tabet-Helal et
Curmi en 2014, similaires aux mutations K4R/A10R/K4RA10R du peptide I19L (travaux
Clément et al., 2005) ont y été introduites.
Quant à lui, le 4-terpinéol il se fixe au niveau de la Ser 16 de la stathmine mutée A15R, il se
présente des interactions avec la stathmine mutée K9RA15R, mais une affinité d’interaction
plus faible avec la stathmine mutée K9R.
Cette interaction favorable avec la stathmine WT et mutée en partie N-terminale :
A15R/K9RA15R, en particulier au niveau de la Ser 16 pourrait s’expliquer par l’inhibition de
sa phosphorylation par le 4-terpinéol en gardant son activité déstabilisatrice des MTs ce qui
empêcherait la formation du fuseau mitotique.
Ces suggestions sont en accord avec des travaux antérieurs qui ont prouvé que la localisation
péri-nucléaire de la stathmine mutée K9RA15R lui conféré une activité sur des cellules
48
cancéreuses HeLa en mitose plus que sur des cellules HeLa en interphase, ou plutôt que cette
stathmine mutée diminuerait la concentration de la tubuline libre (Tabet-Helal and Curmi,
2014).
La phosphorylation de Ser16 et Ser63 perturbe la formation de la structure « β-hairpin » en
domaine N-terminal et structure hélicoïdale au cours de l’interaction stathmine/tubuline, ce qui
explique le rôle dominant de ces résidus dans la régulation de la progression du cycle cellulaire
(Honnappa et al., 2006). La phosphorylation de la sérine 16 ou la sérine 63 est suffisante pour
inhiber l’activité de la stathmine in vitro (Wittmann et al., 2004).
D’autre part, une étude a montré que 4-terpinéol et α-terpinéol induiraient une dépolymérisation
des MTs du cytosquelette des cellules humaines du mélanome (Bozzuto et al., 2022).
A ajouter que la deuxième mutation faite au niveau du domaine N-terminal (A15R) en
substituant l’alanine (acide aminé hydrophobe neutre) par une arginine (acide aminé
chargé) pourrait changer le site de protéolyse de la stathmine ce qui la garderai active (Tabet-
Helal and Curmi, 2014).
Néanmoins, le 4-terpinéol se fixerait sur d’autres résidus au niveau des stathmines mutées S25A
et S16E, et moins avec les stathmines mutées S16A et S25E, probablement cela n’empêcherait
pas leur phosphorylation, comme l’ont indiqué d’autres travaux montrant que la
phosphorylation des mutants 16A25A et 38A63A sur les sites 38 et 63 ou 16 et 25,
respectivement, était suffisante pour la formation d’un fuseau fonctionnel (Manceau, 1998).
En conclusion, ces résultats permettent de suggérer que le 4-terpinéol se fixerait sur la partie
N-terminal structures « β-hairpin » et « en loupe » en interaction avec la tubuline et surtout au
niveau des sites de phosphorylation (Ser 16 et Ser 25) afin d’empêcher sa phosphorylation par
différentes kinases, ce qui favoriserait son activité vis-à-vis des MTs et bloquerait la formation
du fuseau mitotique des cellules cancéreuses en prolifération, ce qui pourrait présenter un intérêt
pour inhiber la croissance tumorale in vivo et in vitro.
49
Conclusion
&
Perspectives
Conclusion & perspectives
La protéine stathmine déstabilisatrice des microtubules, est surexprimée dans plusieurs types
de cancer, ce qui l’implique dans la prolifération et la migration des cellules tumorales.
Par conséquent, elle constitue une bonne cible thérapeutique dans le traitement des cancers.
Tous les monoterpènes antitumoraux étudiés pourraient jouer un rôle non négligeable dans les
cancers médiés par la stathmine. Cependant, les monoterpènes cycliques composants parfumés
des huiles essentielles de plusieurs plantes aromatiques médicinales semblent être un candidat
optimal dans ce contexte.
Par une approche in silico, on avait identifié 7 monoterpènes cycliques susceptibles d’interagir
avec la stathmine. On en a retenu un, le 4-terpinéol présentant des affinités d’interaction avec
la stathmine, plus précisément dans sa partie N-terminale.
Les résultats reflètent que le 4-terpinéol présente 3 liaisons favorables avec la stathmine, dans
sa partie N-terminale, plus précisément au niveau des résidus formant une structure « β-harpin"
sophistiquée en contact avec la tubuline en solution et responsable de la stabilité du complexe
T2S, et une liaison au niveau de la sérine 25 au niveau du domaine N-terminal structure « en
loupe ».
Des mutations proposées au niveau de ces régions de la stathmine ont été faites afin d’analyser
la stabilité et l’affinité de liaisons entre cette protéine et 4-terpinéol.
D’après le Docking moléculaire, cette molécule bioactive présente des effets efficaces sur la
liaison avec les stathmines mutées A15R/K9RA15R/S25A, mais pas avec les stathmines
mutées K9R/S16A/S25E.
À la lumière des données d'amarrage moléculaire, le 4-terpinéol semble être un candidat

potentiel pour cibler la stathmine et empêcher sa phosphorylation.
Cependant, des analyses de simulation moléculaire restent indispensables pour déterminer la

stabilité de cette interaction au cours du temps. Toutefois, seuls des expériences réalisées in
vitro, pourraient confirmer ou infirmer cette interaction et potentiellement l’effet activateur
notamment si l’on envisage utiliser ce composé naturel à des fins de recherche ou bien pour
aller vers des candidats médicament.
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61
‫الملخص‬
‫( عن طريق عزل التوبولين في مركب غير قابل للبلمرة يتكون من اثنين من مغاير‬MTs) ‫ كيلو دالتون يتحكم في ديناميكيات األنابيب الدقيقة‬17 ‫الستاثمين هو بروتين فسفوري بقدرة‬
T2S). ‫التوبولين لجزيء واحد من الستاثمين( مجمع‬
‫ مما يجعل من الممكن تثبيط نشاطه المزعزع‬، ‫ من دورة الخلية‬G2 / M ‫ إلى الطور‬S ‫ وهو شديد الفسفرة في وقت االنتقال من المرحلة‬، ‫إنه أحد المنظمين الرئيسيين للمغزل االنقسامي‬
. ‫ ويشكل لذلك هدف عالجي محتمل يهدف إلى منع المغزل االنقسامي للخاليا السرطانية المتكاثرة‬MTs ‫لالستقرار لـ‬
. ‫ فهي تظهر نشا ًطا مضادًا للورم في العديد من السرطانات‬، ‫تشكل مونوتربين أكبر مجموعة من المستقلبات الثانوية للنباتات العطرية الطبية‬
‫تم إجراء التفاعل بين ستاثمين (مستقبالت) ومونوتربين دوري (ليغاندات) عن طريق ا لتحفيز الجزيئي عبر برنامج اإلرساء الجزيئي من أجل تغيير موضع أفضل أحادي التربين مع‬
. ‫تقاربات التفاعل مع ستاثمين ومحاولة تثبيط الفسفرة‬
‫ ستاثمين‬Wild Type ‫ و‬ligand ‫ حيث كشف االلتحام الجزيئي عن تقارب ربط بين هذا‬، ‫استقرارا‬
ً ‫تربينول هو األكثر‬-4 ‫ يبدو أن‬، ‫ مونوتربين الدورية التي تم اختبارها‬287 ‫من بين‬
S16E / A15R / K9RA10R / S25A. ‫ وتقارب ارتباط أعلى مع الستاثمين المتحور‬،
. ‫تربينول على ستاثمين‬-4 ‫ من الضروري إجراء مزيد من تحليالت المحاكاة الجزيئية ودراسة في الجسم الحي لتأكيد التفاعل وتأثير التنشيط المحتمل لـ‬، ‫أخيرا‬
ً
.‫تربينول‬-4 ، ‫ الستاثمين‬، ‫ االنتشار‬، ‫ االلتحام الجزيئي‬، ‫ السرطان‬:‫الكلمات المفتاحية‬
Résumé
La stathmine est une phosphoprotéine de 17 kDa qui contrôle la dynamique des microtubules (MTs) en séquestrant la tubuline dans un complexe
non polymérisable formé de deux hétérodimères de tubuline pour une molécule de stathmine (complexe T2S).
C’est l’un des principaux régulateurs du fuseau mitotique, la stathmine est hautement phosphorylée au moment de la transition de la phase S à
la phase G2/M du cycle cellulaire, ce qui permet d’inhiber son activité déstabilisatrice des MTs et constitue donc une cible thérapeutique
potentielle visant à bloquer le fuseau mitotique des cellules cancéreuses en prolifération.
Les monoterpènes constituent le plus grand groupe de métabolites secondaires des plantes aromatiques médicinales, ils présentent une activité
anti-tumorale dans plusieurs cancers.
L’interaction entre stathmine (récepteur) et monoterpènes cycliques (ligands) a été faite par des logiciels de Docking Moléculaire afin de
repositionner le meilleur monoterpène présentant des affinités d’interaction avec la stathmine et tenter d’inhiber sa phosphorylation
Parmi les 287 monoterpènes cycliques et leurs homologues structuraux testés, le 4-terpinéol semblent être le plus stable, puisque le Docking
moléculaire a révélé une affinité de liaison entre ce ligand et stathmine Wild Type, et une affinité de liaison plus importante avec les stathmines
mutées S16E/A15R/K9RA10R/S25A.
Enfin, des analyses de simulation moléculaire plus poussées, et une étude in vivo sont nécessaires pour confirmer l’interaction et l’effet
activateur potentiel du 4-terpinéol sur la stathmine.
Mots clés : Cancer, Docking moléculaire, prolifération, stathmine, 4-terpinéol.
Abstract
Stathmin is a phosphoprotein of 17 kDa which controls the dynamics of microtubules (MTs) by sequestering tubulin in a non-polymerizable
complex formed of two heterodimers of tubulin for one molecule of stathmin (T2S complex).
It is one of the main regulators of the mitotic spindle; stathmin is highly phosphorylated at the S phase transition to the G2/M phase of the cell
cycle, which makes it possible to inhibit its destabilizing activity of MTs.
Stathmin therefore constitutes a potential therapeutic target aimed at blocking the mitotic spindle of cancer cells during proliferation.
Monoterpenes constitute the largest group of secondary metabolites of medicinal aromatic plants; they exhibit antitumor activity in several
cancers.
The interaction between stathmine (receptor) and cyclic monoterpenes (ligands) was made by Molecular Docking software in order to
reposition the best monoterpene with interaction affinities with stathmine and attempt to inhibit its phosphorylation
Among the 287 cyclic monoterpenes and their structural homogues tested, 4-terpinéol seems to be the most stable, since molecular Docking
revealed a binding affinity between this ligand and Wild Type stathmin, and a higher binding affinity with mutated stathmin S16E/
A15R/K9RA10R/S25A.
Finally, further molecular simulation analyzes and an in vivo study are necessary to confirm the interaction and the potential activating effect
of 4-terpinéol on stathmin.
Keywords: Cancer, molecular docking, proliferation, stathmine, 4-terpinéol.

Mémoire Abdelmoumen Et BENALI

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République Algérienne Démocratique et Populaire

‫وزارة التعليم العالي والبحث العلمي‬

Le 4-terpinéol, activateur potentiel de la stathmine au

Soutenu le 21 juin 2023 devant le jury composé de :

Président Dali-Sahi Majda Professeur Université de Tlemcen

Encadrant Tabet-Helal Sana Maître de conférences A Université de Tlemcen

Examinateur Cherrak Sabri Maître de conférences A Université de Tlemcen

Année universitaire 2022/2023

A tous les amis et les copines.

A tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail.

‫استقرارا ‪ ،‬حيث كشف االلتحام الجزيئي‬

‫الكلمات المفتاحية‪ :‬السرطان ‪ ،‬االلتحام الجزيئي ‪ ،‬االنتشار ‪ ،‬الستاثمين ‪-4 ،‬تربينول‪.‬‬

Stathmin is a phosphoprotein of 17 kDa which controls the dynamics of microtubules (MTs) by

Figure 1 : Schéma représentatif des protéines de la famille Stathmine . .................................. 6

Tableau 1 : Structures 3D et 2D de ligands. ............................................................................ 30

et une répression de l’expression de la stathmine par une régulation au niveau transcriptionnel

Ⅰ.3.2. Structure secondaire

Ⅰ.4. Expressions de la stathmine

site de phosphorylation de la Stathmine (Larsson et al., 1995), suite à la surexpression de divers

Ⅰ.5. Phosphorylation de stathmine

Ⅰ.6. Régulation de la phosphorylation de stathmine

Il s’agit de l'ensemble de phénomènes pathologiques, conduisant à la transformation d’une

Figure 4 : Etapes de la cancérogenèse (D’après Yokota, 2000).

II.3.1. Etapes de la cancérogénèse

Les événements mutationnels provoquent un changement irréversible d'une cellule normale en

II.5. Stathmine et cancer

II.5.1.1.Expression dans le cancer colorectal

III.3. Activités biologiques des monoterpènes

III.3.3. Activité antioxydante

l'efficacité de l'effet antiprolifératif et dans la sensibilisation à la thérapie ciblée. Dans les

monoterpènes produisent des effets anti-inflammatoires en modulant la libération de cytokines,

Ⅳ.1. Screening virtuel

Figure 8 : Structure 3D de Stathmine 1.

Tableau 1 : Structures 3D et 2D de ligands.

Ⅳ.2.3. Processus du Docking moléculaire

 Le processus de coupure (stathmine tronquée) à été effectué par chimera

Le Docking moléculaire sur PyRx se déroule selon les étapes suivantes :

- Téléchargement de PyRx : http://pyrx.sourceforge.net/downloads.

 Cliquer sur File puis Open/ dans notre cas de ligand.

V.1. Résultats du criblage moléculaire

Ligands PubChem CID ΔG (kcal/ml)

α pinéne 101086219 -5.9

P cymene 16212 -5.3

4-Terpineol 5885030 -5.2

α phellandrene 91747906 -4.8

Ɣ terpinéne 139086425 -3.8

ß pinéne 93046 -3.7

α thujène 129631927 -3.6

V.2. Résultats du Docking moléculaire

Figure 11 : Résultats des scores donnés par UCSF Chimera.

Figure 12 : Modèles 3D d’interaction de stathmine 1 tronquée.A : N terminale structure en «

N-terminal : « β-harpin » (1-24aa) « loupe » (24–46aa) hélice α (résidus 47-141)

Figure 13 : Modèles 2D d’interaction stathmine 1 tronquée avec 4-terpinéol.

V.2.1. Interaction stahmine 1 tronquée /4-terpineol

Gln 18 / Ser Carbon hydrogene Ser 25 liaison conventional

2-Interactions Hydrophobiques : Les interactions de ce type jouent un rôle essentiel dans la

V.2.2. Interaction stathmine 1 tronquée et mutée dans la partie N-terminale « β-hairpin »

Figure 17 : Modèle 2D d’interaction stathmine1 tronquée et mutée A15R avec 4-térpineol.

Glu 12 / Gly 17 Conventional hydrogen bond

Phe 20 Unfavorable Acceptor-

V.2.3. Interaction stathmine 1 tronquée mutée au niveau N-ter structure « en boucle»

Figure 19 : Modèle 2D d’interaction stahmine 1 tronquée et mutée S25A avec 4-terpinéol.

Lys 29 /ARG 27 Carbon hydrogen bond