MOSTEFA - DELLA - PDF Utiisé

République Algérienne Démocratique et Populaire
‫وزارة التعليم العالى و البحث العلمي‬

Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique
UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE D’ORAN « MOHAMED
BOUDIAF »
Faculté des sciences de la nature et de la vie
Département de biotechnologie
Spécialité : Biotechnologie
Option : Cytochimie, Structure. Modélisation et Simulation des macromolécules à intérêt
agronomique et médical
MEMOIRE
Présenté par
Mme MOSTEFA DELLA Nassima
Pour l’obtention du diplôme de Magister en Biotechnologie
Thème
Contribution à la régénération in-vitro de Lavandula dentata via

le microbouturage, l’organogenèse et / ou l’embryogenèse somatique
et contrôle de la conformité génétique des plantes régénérées
par les Marqueurs RAPD.
Soutenu le : 25/06/2015 devant la commission d’examen composée de :
Qualité Nom et Prénom Grade Etablissement d’origine

Président : Tchouar Noureddine Professeur USTOMB
Rapporteur : Saadi Abdelkader Professeur UHBC
Examinatrice : Kaid Harche Meriem Professeur USTOMB
Examinateur : Djabeur Abderrezak Professeur USTOMB
Année universitaire : 2014/2015

Dédicaces
A mes très chers parents

Jamais je ne saurais m’exprimer quant aux sacrifices et dévouement
que vous avez consacrés, à mon éducation et mes études.
Les mots aussi expressifs soient-ils, restent faibles pour vous énoncer
ma gratitude hautement profonde.
Puisse Dieu vous exaucer de santé, de prospérité et de bien-être
et vous octroyer une longue vie.
A mon très cher mari Abdellah

Tes sacrifices, ton soutien moral et matériel, ta gentillesse sans
égal, ton profond attachement m'ont permis de réussir mes
études.
A mes chers frères, A mes gracieuses sœurs

A ma belle-famille paternelle MOSTEPHA DELLA ;
A ma précieuse famille maternelle NASRI ;
A mon beau père et ma belle mère
A mes belles-sœurs et beaux-frères,
A mes aimables belles-amies
A tous ceux qui me sont chers.
Nassima
III
Remerciements
Ce travail a été réalisé dans le cadre de préparation de mémoire de magistère pour
l’obtention du diplôme de magistère en « Biotechnologie ». Il n’aurait pas pu voir le jour sans
le soutien de nombreuses personnes que je tiens à remercier.
Je tiens à exprimer tous particulièrement ma gratitude à Monsieur Saadi AEK. Professeur à
l’université Hassiba Benbouali, Chlef, pour l’orientation, la confiance, la patience qui ont
constitué un apport considérable sans lequel ce travail n’aurait pas pu être mené au bon port.
J'aimerais également lui dire à quel point j’ai apprécié sa grande disponibilité et son respect.
Enfin, j’ai été extrêmement sensible à ses qualités humaines d'écoute et de compréhension tout
au long de ce travail. Qu’il trouve dans ce travail un hommage vivant à sa haute personnalité.
Je tiens à remercier Monsieur Tchouar N. Professeur à l’université d’USTMB « Oran »
d’avoir fait l’honneur de présider le jury de ce memoire. Merci pour ses conseils, ses
expériences, pour sa sollicitude et ses encouragements. .
Je remercie également Madame Kaid Harche M. et Monsieur Djabeur A. Professeurs à
l’Université d’USTMB « Oran » d’avoir accepté d’examiner ce travail.
J’aimerais adresser un remerciement particulier à Madame Hamdani F.Z., maître assistante
à l’université Hassiba Ben Bouali, pour sa sympathie, sa disponibilité, ses idées et conseils,
ainsi que pour son aide précieuse de tous les jours.
Je tiens à remercier également Madame Mdejahed F., Monsieur Kouidri M., Maîtres
assistants à l’université Hassiba Ben Bouali pour leur aide, leur gentillesse et leur soutien
tout au long de ces années.
J’aimerais également remercier Monsieur Sbaihia M. maître de conférences à l’université
Hassiba Benbouali « Chlef » pour avoir suivi mes travaux pendant la durée de ma thèse. Leur
conseils et remarques, toujours pertinents, m’ont permis de confronter et ajuster mes travaux
à des problématiques pratiques et réelles.
J’ai pu travailler dans un cadre particulièrement agréable, grâce à l’équipe des magistérants
de l’université de Chlef, Option « Préservation et valorisation des ressources
phytogénétique ». Je pense particulièrement à Mme Ziani S., Mr Mdjahed H., Mr Nedjari H.,
Mr Noui A et Mr Merouane A. Merci de m’avoir aidé et encouragé, et pour m’avoir changé les
idées quand j’en avais besoin. Merci à tous pour votre bonne humeur, pour toutes ces séances
de rires et de sourires.
J’exprime ma gratitude envers M elle Gaddouche L., Doctorante et responsable de laboratoire
des biotechnologies végétales pour la liberté qu'elle m'a accordée pour réaliser mes
IV
expériences dans son laboratoire, pour l'intérêt dont elle a fait preuve envers ma recherche,
ainsi que pour son accueil enthousiaste à chaque fois que je l'ai rencontré.
J’adresse mes remerciements à l’équipe des doctorants du laboratoire de biologie moléculaire
et microbienne pour tous les échanges techniques, scientifiques et pour leur sympathie, leur
accueil chaleureux pendant cette période de travail.
Merci à tous les membres du département de biologie de l’université de Chlef et aux
ingénieurs de laboratoires qui m’ont facilité la tâche au quotidien et qui ont contribué à me
rendre le travail plus agréable. Merci pour leurs accueille et leurs confiance.
Merci à ceux qui ont généreusement partagé leur temps et leur bienveillance pour contribuer
à la réalisation du fonds et de la forme de cette thèse.
V
Acronymes
2,4,5-T 2-4 dichlorophénoxyacétique
2,4-D 2-4 dichlorophénoxyacétique
ADN Acide Désoxyribonucléique,
GA3 Acide gibberellique,
AIA Acide indole 3-acétique,
AIB Acide indole 3-butyrique,
ANA Acide α-naphtalène,
Ads Adénine sulfate,
cDNA ADN complémentaire
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
APG Angiosperm Phylogeny Group,
AAD Arbitrary Amplified DNA
AP-PCR Arbitrary Primed PCR
BA Benzyl adénine
B Bourgeons apicaux
CTAB Bromure d’hexadécyltriméthyl ammonium,
BET Bromure d'Ethidium,
CC Culture cellulaire
DO Densité optique,
dNTP Désoxyribonucléide triphosphate,
 Diamètre,
DAF DNA Amplification Fngerprinting
EN Entrenœud
EDTA Ethyle diamine tetra-acétate,
N Explants nodaux
F Fragments de feuilles
H Hypocotyles
ITS Internal Transcribed Spacer,
TB Intervalle de taille des bandes (pb)
KN Kinétine,
L. Lavandula
M Marqueur de taille (DNA Ladder 100pb)
Tm Melting temperature,
MB Milieu avec BA
XII
MK Milieu avec Kénitine,
MZ Milieu avec zéatine,
GD Milieu de Gresshoff et Doy,
MS/2 Milieu de Murashige et Skoog 1962 à moitié,
MS Milieu de Murashige et Skoog 1962,
NBM Nombre de bandes monomorphes
NBP Nombre de bandes polymorphes
NBT Nombre total des bandes
ISO Organisation Internationale de Normalisation,
OMS Organisation Mondiale de la Santé,
O Organogenèse
pb Paires de base,
PAM Plantes Aromatiques et Médicinales,
PGR Plants Growth Regulators,
PCR Polymerase Chain Reaction,
M (%) Pourcentage de monomorphisme
P (%) Pourcentage de polymorphisme
PM Proliferation du méristème
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA,
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
STMS Sequence-Tagged Microsatellite Sites,
STR Short Tandem Repeats,
SSLP Simple Sequence Length Polymorphisms
SSR Simple Sequence Repeats,
SDS Sodium Dodicyl Sulfate
Taq Thermophilus aquaticus,
TDS Thidiazuron,
TE-AFLP Three Endonuclease
Tr/mn Tours par minute,
TAE Tris Acétate EDTA,
TE Tris EDTA,
Tris-HCl Trizma hydrochloride
ZT Zéatine,
XIII
Liste des Figures
Figure 01. Cladogramme des Angiospermes (APGIII, 2009)…………… 07
Figure 02. Les différentes formes de feuilles selon les espèces de lavande
(Lis-Balchin, 2002)………………………………………………….. 12
Figure 03. Variation morphologique des corolles chez le genre Lavandula

(Lis-Balchin, 2002)…………………………………………….. 14
Figure 04. Aire de répartition des espèces de lavandes dans le monde

(Guitton, 2012)………………………………………………… 15
Figure 05. Aspect d’une plante entière (A), de graines, de feuilles et de

plantules issues de la germination (in vitro) de Lavandula
dentata………………………………………………………… 44
Figure 06. Les différentes étapes de microboutures de Lavandula dentata

(A): Les vitroplants utilisés pour prélever les microboutures ;
(B et C): Les zones de section et tailles des microboutures; (D)
Ensemencement des microboutures………………….............. 46
Figure 07. Mise en culture des différents explants obtenus des

vitroplants de 2eme génération (A) : plantules issues de
repiquage des vitrosemis dans le milieu MS dépourvu
d’hormones âgées de 8 semaines, (B) (D): les types
d’explants testés : des entrenœuds de 0.5 à 1 cm de
longueur, des feuilles et des hypocotyles, (C) (E):
ensemencement……………………………………………. 47
Figure 08. L’effet des cytokinines seuls (A, B et C) et des combinaisons

Auxine * Cytokinines (D, E et F) sur le développement des
microboutures obtenues à differents stades…………………… 60
Figure 09. Induction de racines (A et B) et de cals (C et D) sur les

63
boutures de Lavandula dentata dans différents milieux
VIII
d’enracinement…………………………………………………
Figure 10. Néoformation directe (A) et indirecte (B, C et D) de bourgeons,

70
de pousses végétatives (E) et de racines (F et G)……………….
Figure 11. Aptitude à l’enracinement des pousses néoformées…………… 76
Figure 12. Aspect des plantules régénérées in-vitro à différents stades de

développement au cours de la phase d’acclimatation………… 79
Figure 13. Evaluation de la qualité des ADN sur gel d’agarose extraits
de feuilles de pousses régénérées par caulogenèse de L.
dentata (A) : Migration des ADN extraits suivant le protocole
décrit par Doyle et Doyle (1987) modifié, (B) Migration des
ADN extraits suivant le protocole du Kit « Extract-N-AmpTM
Plant PCR Kit »………………………………......................... 83
Figure 14. Diagrammes électrophorétiques RAPD des 5 échantillons (les

plants régénérés et la plante-mère) générés par les deux
amorces (A) : OPA-10 et (B) : OPW-12. P01, P02, P03, P04 :
les différents plants régénérés in vitro ; PM : plante-mère ; M :
marqueur de taille (DNA Ladder 100pb) ; pb : paire de bases…. 86
Figure 15. Diagrammes électrophorétiques RAPD des 5 échantillons (les

plants régénérés et la plante-mère) générés par les trois amorces
(A) : OPA-01 ; (B) : OPA-03 et (C) : OPA-04. P01, P02, P03,
P04 : les différents plants régénérés in vitro ; PM : plante-mère
; M : marqueur de taille (DNA Ladder 100pb) ; pb : paire de
bases…………………………………………………………… 87
Figure 16. Dendrogramme de similarité et de distance génétique entre les

quatre somaclones et la plante mère (PM) régénéré par
CLUSTER ANALYSIS basé sur l’indice de similarité de
JACCARD (Logiciel PAST) en fonction des profils
éléctrophorétiques obtenus par les marqueurs RAPD. P01: 0.5
BA + 0.5 ANA (MB8) ; P02 : 01 Zn + 0.5 ANA (MZ6) ; P03 :
89
0.5 Kn + 0.1 ANA (MK12) ; P04 : 0,5 Zn + 0.1 ANA (MZ1)….
IX
Liste des tableaux
Tableau 01. Taxonomie du genre Lavandula (Upson et Andrews, 2004)……………. 11
Tableau 02. Les principales espèces de Lavandula décrites en Algérie……………….. 16
Tableau 03. Les principaux composés des huiles essentielles des espèces les plus 17
importantes de Lavandula ssp. (Gonçalves et Romano, 2012)……………
Tableau 04. Les principaux ravageurs de lavande et lavandin (Fontaine, 2011)……… 19
Tableau 05. Les différentes voies de micropropagation et la nature des explants, 27

employées chez les lavandes (Gonçalves et Romano, 2012)……………
Tableau 06. Les échantillons ayant servi pour les extractions d’ADN et les analyse 48
PCR-RAPD………………………………………………………………
Tableau 07. Composition du mélange réactionnel pour PCR/RAPD selon le protocole 51

de Belkadi (2003) et celui adapté à Lavandula dentata……………………..
Tableau 08. Programme d’amplification PCR-RAPD………………………………….. 51
Tableau 09. Les caractéristiques des 08 amorces décamères RAPD utilisées

(séquences, température d’hybridation et pourcentage de CG)………….. 52
Tableau 10. Effet des concentrations des cytokinines (BA et KN) et des combinaisons
(BA * ANA) et (KN* ANA) sur le débourrement des bourgeons
axillaires, l’élongation et le nombre de pousses par explant de Lavandula
dentata après 4 semaines de culture……………………………………… 59
Tableau 11. Aptitude à la rhizogenèse des pousses de Lavandula dentata issues

de microbouturage en fonction de la composition du milieu de
culture après 6 semaines de culture.………………………………. 65
Tableau 12. Evolution des taux de caulogenèse selon la composition hormonale des
milieux d’induction (avant transfert ) et de développement (après
transfert) et la nature des explants chez L. dentata. H : hypocotyles ; EN :
entrenoeuds et F : feuilles…………………………………………………. 69
Tableau 13. Aptitude à la rhizogenèse de Lavandula dentata sur les milieux
d’induction en fonction de la nature des explants et la composition du
milieu de culture après 6 semaines de culture……………………………. 72
Tableau 14. Aptitude à l’enracinement des pousses régénérées en fonction de la

nature des explants et la composition du milieu après 6 semaines de
culture…………………………………………………………………….. 75
Tableau 15. Présentation des taux de survie des plantules après 6 semaines
d’acclimatation……………………………………………………………. 78
Tableau 16. Evaluation de la qualité et la quantité des ADN extraits des feuilles de
pousses régénérées par caulogenèse de L. dentata suivant le protocole
classique décrit par Doyle et Doyle (1987) modifié……………………… 82
Tableau 17. Evaluation de la qualité et la quantité des ADN extraits des feuilles de
pousses régénérées par caulogenèse de L. dentata suivant le protocole du
Kit « Extract-N-AmpTM Plant PCR Kit »………………………………… 83
Tableau 18. Analyse des profils RAPD en termes de nombre de bandes amplifiées,
pourcentage de polymorphisme pour les différentes amorces utilisées
avec l’ensemble des plants régénérés in-vitro. P01, P02, P03, P04 : Les
différentes plants régénérés ; PM : Plante-mère.; NBT : Nombre total des
bandes ; NBP : Nombre de bandes polymorphes ; NBM : Nombre de
bandes monomorphes ; TB : Intervalle de taille des bandes (pb) ; P (%) :
pourcentage de polymorphisme (%) ; M (%) : Pourcentage de
monomorphisme (%)……………………………………………………… 85
Tableau 19. Résumé des profils RAPD des 5 échantillons (les plants régénérés et la
plante-mère) générés par l’ensemble des amorces employées. P01, P02,
P03 et P04 : les différents plants régénérés ; PM : Plante-mère………….. 86
Tableau 20. Matrice de similarité et de distance génétique entre les échantillons

analysés (les plants régénérés in-vitro et la plante-mère) (Indice de
JACCARD, Logiciel PAST)………………………………………………. 20
Table de matière
Résumé ……………………………………………………………………………………… I
Abstract ……………………………………………………………………………………... II
Dédicaces ……………………………………………………………………………………. III
Remerciements………………………………………………………………………………. IV
Table de matière…………………………………………………………………………….. VI
Liste des figures …………………………………………………………………………….. VIII
Liste des tableaux…………………………………………………………………………… X
Acronymes…………………………………………………………………………………… XII
Introduction………………………………………………………………………………….. 2
Synthèse bibliographique
Chapitre 1. Généralités sur les lavandes…………………………………………………… 5
1.1. Présentation des Lamiacées…………………………………………………………... 6
1.1.1. Classification botanique des Lamiacées………………………………………… 6
1.1.2. Caractéristiques botaniques des Lamiacées……………………………………... 8
1.1.3. Utilisations des Lamiacées……………………………………………………… 9
1.2. Présentation des lavandes …………………………………………………………… 10
1.2.1. Classification botanique………………………………………………………… 10
1.2.2. Caractéristiques botaniques……………………………………………………... 11
1.2.3. Origine et aire de répartition…………………………………………………….. 14
1.2.4. Chimie du genre Lavandula …………………………………………………………… 17
1.2.5. Importance et applications ……………………………………………………… 18
1.2.6. Maladies et Ravageurs………………………………………………………….. 19
Chapitre 2. Régénération de Lavande……………………………………………………... 20
2. 1. La Multiplication naturelle…………………………………………………………... 21
2.1.1. La multiplication par semis……………………………………………………... 21
2.1.2. La multiplication par bouturage……………………………………………….... 22
2.2. La multiplication par micropropagation……………………………………………… 23
2.2.1. La propagation conforme ………………………………………………………. 25
a. La culture de méristème ………………………………………………………… 25
b. Le microbouturage………………………………………………………………. 26
2.2.2. La propagation par organogenèse ou embryogenèse somatique ………………. 28
a. L’organogénèse…………………………………………………………………. 28
b. L’embryogenèse somatique…………………………………………………….. 29
Chapitre 3. Variation somaclonale et techniques de détection…………………………… 30
3. 1. Définition……………………………………………………………………………. 31
3. 2. Origine et sources de variation somaclonale………………………………………… 32
3. 3. Détection des variations somaclonales………………………………………………. 33
3. 3. 1. Détection morphologique……………………………………………………… 33
3. 3.2 Détection physiologiques et biochimiques……………………………………... 33
3. 3.3 Détection moléculaire…………………………………………………………... 34
3.3.3.1. Méthodes cytologiques…………………………………………………….. 35
3.3.3.2. Les protéines et les isoenzymes……………………………………………. 35
3.3.3.3. Le polymorphisme de restriction (RFLP) …………………………………. 36
3.3.3.4. Techniques basées sur la réaction de polymérisation en chaîne…………… 37
a. Le RAPD ……………………………………………………………………. 37
b. Le AFLP ……………………………………………………………………. 38
c. Marqueurs microsatellites…………………………………………………… 40
Etude expérimentale
Chapitre 4. Matériel et Méthodes………………………………………………………….. 43
4.1 Régénération de lavande……………………………………………………………… 44
4.1.1. Choix et provenance du matériel végétal……………………………………….. 44
4.1.2. Techniques de culture…………………………………………………………… 45
4.1.2.1. Débourrement et croissance des bourgeons axillaires……………………... 45
4.1.2.2. Néoformation des bourgeons et d’embryons somatiques ………………… 45
4.1.3 Conditions de culture …………………………………………………………… 45
4.1.4. Suivie des cultures et expression des résultats…………………………………. 46
4.2. Analyse de la variation somaclonale…………………………………………………. 47
4.2.1. Provenance de matériel végétal ……………………………………………….. 47
4.2.2. Technique moléculaire PCR-RAPD……………………………………………. 48
4.2.2.1. Extraction et purification d’ADN génomique ……………………………... 48
4.2.2.2. Evaluation de la qualité et de la quantité d’ADN extraite…………………. 50
4.2.2.3. Amplification de l’ADN…………………………………………………… 50
4.2.2.4. Séparation des produits PCR-RAPD et visualisation……………………… 52
4.2.2.5. Analyse des données……………………………………………………….. 52
Chapitre 5. Résultats et Discussion………………………………………………………… 53
5. 1. Aptitude à la régénération de Lavandula dentata………………………………………… 54
5. 1.1. Aptitude à la régénération par microbouturage………………………………… 54
5. 1.1.1. Phase de débourrement des bourgeons et élongation des pousses………… 55
a. Action des cytokinines……………………………………………………….. 55
b. Action des combinaisons (auxine - cytokinine)……………………………… 57
5.1.2. Aptitude à la régénération par organogenèse …………………………………… 61
5.1.2.1. Phase d’induction de la callogenèse……………………………………….. 61
5.1.2.2. Induction et développement de la caulogenèse…………………………….. 66
a. L’effet de la composition hormonale………………………………………… 67
b. L’effet de la nature d’explants………………………………………………. 68
5.1.2.3. Induction et développement de la rhizogenèse ……………………………. 71
5.1.3. Aptitudes à l’enracinement des pousses régénérées et leurs acclimatations……. 73
5.1.3.1. Enracinement des pousses ………………………………………………… 73
5.1.3.2. Acclimatation……………………………………………………………… 77
5. 2. Analyse de la conformité génétique des pousses régénérées par Marqueurs RAPD.. 80
5.2.1. Evaluation de la qualité et de la quantité d’ADN……………………………… 80
5.2 .1.1. Evaluation par Spectrophotométrie………………………………………... 80
5.2.1.2. Evaluation par électrophorèse sur gel d'agarose…………………………… 81
5.2.2 Analyse des profils électrophorétiques………………………………………….. 84
5.2.2.1 Par rapport aux amorces……………………………………………………. 84
5.2.2.2 Par rapport aux plants régénérés…………………………………………… 85
5.2.3 Analyse des clusters…………………………………………………………….. 88
Conclusion……………………………………………………………………………………. 92
Références bibliographiques
Annexes
Résumé
Abstract
Introduction
Introduction
Depuis la plus haute antiquité, l’homme s’est toujours servi des plantes que ce soit
pour se nourrir ou pour se soigner. Les plantes aromatiques et médicinales (PAM) font partie
de cette grande panoplie de plantes qui ont toujours séduit l’homme. En effet, toutes les
grandes civilisations anciennes (Chinoise, indienne, Egyptienne, Grec, Romaine, etc.) ont eu
recours à ces ressources pour se soigner, se parfumer ou pour l’utiliser dans des pratiques
rituelles (Viguier, 2006).
La phytothérapie, qui propose des remèdes naturels et qui est souvent associée aux
traitements classiques, connait de nos jours un renouveau exceptionnel dans le monde et
particulièrement en occident. En effet, la mode du « naturel » et des « médecines douces » a
donné un souffle nouveau à trois secteurs distincts : la médecine allopathique, l'industrie
pharmaceutique et la cosmétique (Viguier, 2006). Ce retour au label du naturel s’accentue
sachant déjà que, selon les statistiques de l’Organisation Mondiale de la Santé, 80 % de la
population mondiale a recours aux médecines traditionnelles pour satisfaire des besoins en
soins de santé primaire (OMS, 2003).
On estime à environ 20 000 le nombre d’espèces utilisées dans le monde à des fins
thérapeutiques. Selon l’OMS, près de 6 377 espèces de plantes sont utilisées en Afrique, dont
plus de 400 sont des plantes médicinales qui constituent 90 % de la médecine traditionnelle
(Diallo, 2005).
Dans de nombreux pays dans le monde (en Asie du Sud, en Afrique et en Amérique
latins), les PAM jouent, en plus de leur rôle dans les systèmes de soins de santé traditionnels,
un rôle économique essentiel. En effet, la promotion de la filière des PAM par certains pays a
permis de générer des entrées en devises très importantes. L'Inde est la plaque tournante de
l'exportation des plantes médicinales en Asie du Sud et l'on estime que la cueillette et la
transformation des plantes médicinales produisent au moins 35 millions de jours de travail
d'emploi par année dans ce pays seulement. (OMS, 2002 ; 2003).
2
L’Algérie compte parmi les pays riches en ressources phytogénétiques à intérêt
médicinales et aromatiques dans le bassin méditerranéen. On dénombre à plus de 300 espèces
à usage aromatique et médicinal, existant parmi les 3150 espèces végétales que compte notre
pays (Tetenyl ,1985).
La lavande, appelée Khouzama en arabe, fait partie de la grande panoplie des PAM
existante en Algérie. Le pays compte six espèces (L. multifida, L. saharica, L. antinéa, L.
stoechas, L. dentata, L. coronopifilia). Les lavandes peuvent être utilisées, selon l’espèce
considérée, comme plantes ornementales, mellifères ou productrices d'huile essentielle. Ce
sont surtout les huiles essentielles de ces plantes qui jouent un rôle économique important et
sont utilisées dans de nombreuses industries (pharmaceutiques, alimentaires et du parfum)
( Upson et Andrews, 2004).
La préservation et la valorisation des plantes aromatiques et médicinales (PAM) dont

l’intérêt n’est plus à démontrer, demeurent primordiales pour un pays comme le nôtre. Parmi
ces plantes, figure la Lavande, une plante à forte valeur ajouté. Sa valorisation impose, parmi
d’autre action, un travail d’amélioration et de sélection. L’intégration, des techniques de
micropropagation, dans un programme d’amélioration aura une contribution certaine dans la
réalisation de cet objectif.
C’est dans cet esprit que nous avons entrepris la présente étude qui entre dans le
cadre d’un projet de recherche (CNEPRU) visant la micropropagation de plusieurs espèces de
lavandes sauvages Algériennes. Nous essayons, par le biais de cette contribution, de
multiplier in vitro (micropropager) via le microbouturage, l’organogenèse et/ou
l’embryogenèse somatique, une lavande, poussant à l’état spontané dans notre pays, appelée :
lavande dentée (Lavandula dentata). L’étude en question, consiste à tester, dans une première
partie, plusieurs paramètres capables d’influencer la micropropagation à savoir : la
composition hormonale des milieux, de la nature et l’origine des explants. La seconde partie
de l’étude est consacrée à l’analyse de la conformité génétique des plants régénérés via
l’organogenèse par rapport aux plantes-mères en employant des marqueurs moléculaires
RAPD (ADN polymorphe amplifié au hasard).
3
Synthèse bibliographique
Chapitre 01
Généralités sur les
lavandes
Chapitre 01. Généralités sur les lavandes
1.1. Présentation des Lamiacées
1.1.1. Classification botanique des Lamiacées
L’embranchement des spermaphytes comprend deux sous embranchements : les

gymnospermes (les plantes à ovules nus) et les angiospermes (les plantes à ovules protégés).
Deux principales classes caractérisent les angiospermes à savoir : les monocotylédones
(embryons à un seul cotylédon) et les dicotylédones (embryons à deux cotylédons) (figure 01).
Selon la classification phylogénétique ou classement APG (Angiosperm phylogeny

group) de 1998, modifié en 2009 (APG III), le genre Lavandula fait partie de l’ordre des
Lamiales qui lui appartient aux Eudicots évolués (figure 01) :
Sous classe : Astéridées,

Super Ordre : Euastéridées I ;
Ordre : Lamiales ;
Famille : Lamiacées (ou Labiées) ;
Genre : Lavandula.
6
Figure 01. Cladogramme des Angiospermes (APGIII, 2009)
7
1.1.2. Caractéristiques botaniques des Lamiacées
Les Lamiacées (anciennement appelée Labiées, terme de lèvre « du latin labium » ou

de gueule ouverte « en grec laîmos » en raison de la forme de la corolle) constituent une
importante famille de plantes angiospermes dicotylédones, dans l’ordre des Lamiales (François,
2012). La famille comprend entre 233 à 263 genres, regroupant entre 6 900 à 7 200 espèces
(Heywood et al., 2007 ; Grayer et al., 2003).
Selon Quezel et Santa (1963), les Lamiacées constituent une famille très importante
dans la flore algérienne et comprennent 28 genres et 146 espèces.
Les plantes appartenant à cette famille sont des herbes à tiges quadrangulaires souvent
renflées aux nœuds et se multipliant, en une même saison, à l’aide de rejets aériens : (stolons) ou
souterrains : (rhizomes). Leurs feuilles sont toujours simples et opposées sans stipules, ou
verticillées. Les feuilles, velues, ont un limbe à surface réduite, épais et souvent enroulé par
dessous. Elles possèdent des stomates enfoncés (protection contre l’évaporation) et un
hypoderme collenchymateux très développé (Zaabat, 2010).
Les fleurs sont hermaphrodites, elles sont regroupées à l’aisselle des feuilles
supérieures, en glomérules, eux-mêmes souvent regroupés en épis plus ou moins denses. Leur
calice persistant est formé de 5 sépales diversement soudés et a souvent 2 lèvres. La corolle
possède un tube plus ou moins long et généralement à 2 lèvres, ce qui a donné son nom à la
famille : 2 pétales forment une lèvre supérieure et 3 autres pétales, une lèvre inférieure. Les
étamines sont au nombre de 5, mais l'une d'elles est presque toujours avortée : 2 des 4 étamines
fertiles sont plus longues et 2 plus courtes (l’androcée est dit didyname). L'ovaire est supère ; les
2 carpelles sont profondément lobés, le style sort de la base des lobes (style gynobasique). Le
fruit est le plus souvent un schizocarpe (tétrakène lisse) mais a parfois un aspect charnu ou
drupacé (Zaabat, 2010).
Les Lamiacées ont un épiderme très riche en poils tecteurs et en poils sécréteurs. Ces
deux catégories de poils se retrouvent au niveau de tous les organes aériens. Ce sont des plantes
à essences dont l’odeur se dégage au simple toucher : en effet la localisation des huiles
essentielles est très externe, elles se forment dans des poils à essence et se localisent sous la
cuticule qui se soulève (Zaabat, 2010).
8
1.1.3. Utilisations des Lamiacées
La famille des Lamiacées regroupe un grand nombre d’espèces d’intérêt économique

majeur puisqu’elles sont capables de synthétiser et de stocker des métabolites secondaires qui
peuvent avoir des applications diverses dans la parfumerie, la cuisine, la phytothérapie et
l’aromathérapie (Guignard, 2004).
Comme nous l’avons déjà rappelé, les Lamiacées sont connues pour la grande diversité
des métabolites secondaires qu’elles produisent et notamment les huiles essentielles. Cette
famille est donc une source importante de terpénoïdes (particulièrement les diterpènes comme
les clérodane, kaurane, labdane, pimarane, abiétane et autres) (Menezes et al., 1993). Sont
produits aussi les composés phénoliques qui constituent un groupe d’une extrême diversité et
dont les flavonoïdes font partie. Un grand nombre de composés polyphénoliques a été répertorié
chez les Lamiacées. Plus de 4 000 flavonoïdes ont été identifiés, et parmi eux 70 % des
aglycones appartiennent au groupe des flavones : l’apigénine et la lutéoline sont les plus
fréquemment rencontrées (Thomas-Barberan et al., 1990). Les flavanones sont représentées
particulièrement par la naringénine et correspondent à 10 % des aglycones. Enfin, les flavonols
représentent également 10 % des composés caractérisés (Regnault-roget, 2004).
Les métabolites produits peuvent avoir des applications diverses. En parfumerie, la

parfumerie de luxe continue à utiliser les plantes en les distillant, afin d'en extraire le précieux
parfum qu'elles contiennent et de perdurer la qualité de ses produits: on y utilise les fleurs de la
lavande (Lavandula angustifolia), de patchouli (Pogostemon patchouly), par exemple (Guignard,
2004). En cuisine: de nombreuses herbes aromatiques sont des Lamiacées: basilic, menthe, thym,
romarin, sauge, etc. (Guignard, 2004).
En phytothérapie et aromathérapie: comme nous l’avons signalé, la famille est une

importante source d'huiles essentielles, d'infusion et antibiotiques naturels pour l'aromathérapie.
D’autres huiles sont utilisées également pour leurs propriétés hydratantes en cosmétologie.
Les huiles essentielles possèdent aussi un effet répulsif contre certains insectes
indésirables. C’est le cas, par exemple, de l’emploi de Melissa officinalis contre les moustiques
(Guignard, 2004).
9
1.2. Présentation des lavandes
1.2.1. Classification botanique
Les espèces du genre Lavandula appartiennent à la famille des Lamiaceae. Cette famille
est subdivisée en 7 sous-familles. Le genre Lavandula appartient à la sous-famille des
Nepetoideae du fait du caractère hexaperturé des grains de pollen. La sous-famille des
Nepetoideae est divisée en 3 tribus dont celle des Ocimeae dans laquelle sont placées les
lavandes. Le genre Lavandula a été rattaché à cette tribu sur la base d‘une étude phylogénétique
conduite à partir de l‘étude du polymorphisme de séquences d‘ADN chloroplastique (Paton,
Springate et al., 2004).
L’histoire taxonomique du genre Lavandula a été particulièrement bien décrite dans

« The genus Lavandula » (Upson et Andrews, 2004). Brièvement, dès la renaissance déjà 5
espèces de lavande étaient reconnues. Le nombre d’espèces décrites n’a cessé d‘augmenter au fil
des explorations botaniques dans le Maghreb et l’Asie. Ces études ont conduit à reconnaître
actuellement 39 espèces différentes réparties en trois sous-genres Fabricia, Sabaudia et
Lavandula et huit sections. Cette structuration taxonomique est appuyée aussi par une analyse
phylogénétique du polymorphisme de séquences ITS (Internal Transcribed Spacer –séquence
interne traduite) (tableau 01).
10
Tableau 01. Taxonomie du genre Lavandula (Upson et Andrews, 2004).
1.2.2. Caractéristiques botaniques
La description morphologique des lavandes a été particulièrement détaillée par Upson

et Andrews (2004). Parmi les caractères qui permettent de distinguer le mieux les différentes
espèces appartenant au genre Lavandula nous retiendrons la morphologie des feuilles, la forme
de l’inflorescence, des bractées, du calice, et de la corolle. D’autres caractères moins facilement
visibles peuvent entrer aussi en compte dans la détermination des espèces comme le nombre de
chromosomes, la forme des grains de pollen ou encore celle des graines (Suarez-Cervera et
Seoane-Camba, 1986).
11
La morphologie des feuilles chez les lavandes est très variable (figure 02). Alors que les
feuilles du sous-genre Lavandula et Sabaudia sont simples et allongées, celles du sous-genre
Fabricia sont très diversement lobées et dentées.
Figure 02. Les différentes formes de feuilles selon les espèces de lavande (Lis-Balchin, 2002).
12
A l’opposé des feuilles, la structure de l’inflorescence constitue un caractère commun à
l’ensemble des lavandes. Les fleurs de lavandes sont organisées en une inflorescence composée
mixte ressemblant à un épi de cymes (mais dont les fleurs ont un pédicelle), appelé encore thyrse
spiciforme. L’inflorescence principale ressemble donc à un épi plus ou moins lâche.
L‘inflorescence secondaire est une cyme. Celle-ci est bipare et scorpioïde dans le sous-genre
Lavandula ou uniflore dans les sous-genres Sabaudia et Fabricia (Lis-Balchin, 2002; Upson,
1997).
Dans la majorité des espèces du genre, les bractées et les cymes sont opposées
décussées, ce qui donne à l’épi composé une forme quadrangulaire (Upson et Andrews, 2004).
Les bractées constituent aussi un caractère de détermination facile à observer et dont la forme et
la taille est très variable chez les lavandes. Les bractées sont situées à la base de chaque cyme, et
aussi parfois au sommet de l‘inflorescence, comme dans les sections Dentatae et Stoechas. Ces
dernières sont alors colorées et ont probablement un rôle attractif pour les pollinisateurs
(Herrera, 1997). Les bractées à la base de chaque cyme peuvent être ovales, triangulaires ou
trapézoïdales, la pointe étant plus ou moins effilée.
Le calice des lavandes est tubulaire en raison de la fusion des sépales et s‘ouvre à
l‘extrémité en deux lèvres constituées respectivement de 3 lobes dorsaux et deux lobes ventraux.
La corolle des lavandes est constituée de 5 pétales soudés formant à la base un tube et à
l‘extrémité une structure bilabiée (figure 03). Le sous-genre Sabaudia fait exception à cette
règle. Les fleurs sont alors constituées de 5 pétales soudés en étoile. Dans les autres sous-genres,
la lèvre supérieure est formée de 2 pétales soudés et la lèvre inférieure de 3 pétales formant des
lobes égaux. La plupart des lavandes ont une corolle de couleur qui va du bleu au violet avec
parfois des fleurs roses. Certaines lavandes aux fleurs blanches pourraient être la conséquence de
mutations. Enfin les fleurs des espèces du sous-genre Sabaudia sont jaunes-marrons.
13
Figure 03. Variation morphologique des corolles chez le genre Lavandula (Lis-Balchin, 2002).
1.2.3. Origine et aire de répartition
Les espèces du genre Lavandula sont pour l‘essentiel présentes dans les régions
méditerranéennes avec, au nord de la Méditerranée, des espèces du Portugal jusqu‘au Proche
Orient et, au sud, des représentants du genre à travers les pays d‘Afrique du nord jusqu‘aux pays
du Moyen Orient (des abords de la mer rouge à l‘ouest de l‘Iran. On trouve également des
espèces de lavandes à l‘ouest des côtes africaines sur les iles de la Macaronésie, ainsi qu‘au
nord-est de l‘Afrique tropicale (Somalie, Ethiopie, Erythrée et Soudan). Enfin, il existe deux
espèces de lavandes en Inde qui créent une disjonction du genre à l‘est (Figure 04).
14
Cette aire de répartition ainsi que la position basale du genre Lavandula dans la tribu
des Ocimeae laisse penser que les lavandes dérivent d‘un ancêtre asiatique (Paton, Springate et
al., 2004).
La zone algéro-marocaine est clairement un centre de diversité avec un grand nombre

d'espèces (3 espèces endémiques en Algérie et 4 en Maroc) représentant 3 des 6 sections du
genre Lavandula (Upson et Jury, 1997) (Tableau 02).
Figure 04. Aire de répartition des espèces de lavandes dans le monde (Guitton, 2012).
Les pays sont de la couleur de la section majoritairement présente. Pour certaines sections dont la
répartition est plus restreinte, une zone de couleur indique les principales zones de présence. Jaune :
Section Pterostoechas, Violet : Sections Lavandula Stoechas, Vert foncé : Section Chaetostachys, Bleu
: Section Subnudae. Vert : Section Dentatae, Rouge : Section Sabaudia et Orange : Section Hasikenses.
15
Tableau 02. Les principales espèces de Lavandula décrites en Algérie.
Secti espèc Sous- Caractérisation botanique Aire de Références

on e espèces répartition
Dent L. Var. caractérisée par ses feuilles très découpées (dentées) et ses fleurs Originaire des Upson et
atae dentata L. candicans bleuâtres regroupées en inflorescence de type épis surmontées de bractées de îles de l’ouest de la Andrews, 2004
même couleur. méditerranée et de
l’atlantique.
Stoec L.stoe Subsp Feuilles persistantes très aromatiques, étroites, gris vert. Végétation Le Tell Upson et
has chas L. . stoechas dense formant une boule compacte. fleurs très parfumées, violet pourpre en gros méditerranéen, l’Afrique Jury,2002 ; Bouazza et al.,
épis trapus surmontés d'un toupet de bractées violettes, de mars à mai. du nord, sud-ouest de 2001
l’Asie, l’Afrique
tropicale.
Ptero L. L. Caractérisé par leur feuilles persistantes, vertes, finement découpés, Afrique du Upson et
stoechas multifida L. multifida L. très aromatique atteignent environ 1,5 pouces (3,8 cm) de long. Jeunes pousses très Nord du Maroc à Andrews, 2004 ; Bouazza
densément velue. fleurs bleu violet en Inflorescences ramifiées à l’extrémité de l'Egypte. En Tunisie dans et al., 2001
tige. Les compactes plantes atteignent 2 pieds (60 cm) de hauteur. la zone pré-désertique.
L. L. Plante en touffe rameuse. Fleurs d'un bleu foncé en épis serrés. Plante Algérie : Upson et
saharica Upson saharica dégageant une agréable odeur de lavande. Les feuilles sont petites et découpées, en Tefedest et Tassili des Jury,2002
&Jury général les lobes ne sont pas redécoupés. Ajjers ; Lybie.
Espèce
endémique.
L. Subsp Plante en touffe rameuse. Fleurs d'un bleu foncé en épis serrés. Plante Algérie : Ozenda,1991 ;
antineae Maire . antinea dégageant une agréable odeur de lavande. Les feuilles sont grandes et découpées, Hoggar et Tassili des Boucheneb et Benhouhou,
les premiers lobes étant redécoupés.. Ajjers. Niger :aîr 2012 ;Upson et Jury, 2002
Lavandula saharica Upson et Jury diffère de Lavandula antineae Espèce

Maire par ses branches formant un angle de 45 ° (plus ouvert chez L. antineae), ses
feuilles plus petites et presque pas redécoupées et ses bractées.
endémique.
16
L. Var. Plante en touffe rameuse. dégageant une faible odeur de lavande. Hoggar, Upson et
coronipifolia humbertii Plante de forme très variable en fonction des conditions climatiques, soit en touffe Tassili des Ajjers, Niger Jury,2002 ; Ozenda
Poir. bien verte et dense, soit elle présente des tiges grêles à peine garnies de feuilles à (Aïr). Espèce saharo- 1991 ;Boucheneb et
leur base. Les feuilles sont larges et découpées. Les fleurs sont d'un bleu profond méditerranéenne Benhouhou, 2012
Var. ponctué de taches plus foncées.
subtropica
L.
stricta Delile
17
1.2.4. Chimie du genre Lavandula
Les huiles essentielles de lavande sont produites dans les trichomes glandulaires
spécialisées présentes à la surface des feuilles et des fleurs. Les monoterpènes représentent les
principaux constituants des huiles et ils sont en nombre de 50 à 60 composés à être identifiés.
Le Linalol et l’acétate de Linalol sont les monoterpènes les plus abondants dans les variétés
de lavande populaires (Lane et al., 2010).
L’huile essentielle de chaque espèce de Lavande possède son propre profil

chromatographique qui détermine ses propriétés et son parfum (Demissie et al.,
2011;Woronuk et al., 2011). La composition de l'huile essentielle est principalement
déterminée par le génotype de la plante (tableau 03), bien que les conditions
environnementales peuvent également avoir un impact significatif (Demissie et al., 2011;
Munoz-Bertomeu et al., 2007). Pour une même espèce de lavande la composition de l’huile
peut varier aussi d’un tissu à un autre. la composition peut également varier entre les
différents tissus. L'huile essentielle de Lavandula angustifolia est dominé par le linalol et
acétate de linalol et l'huile essentielle de Lavandula latifolia par linalol, le 1,8-cinéole et de
camphre (D'Auria et al., 2005; Munoz-Bertomeu et al., 2007 ). D'autre part,
Lavandula×intermedia, un hybride de L.angustifolia et L.latifolia, contient linalol, l'acétate de
linalol, le camphre et le 1,8-cinéole comme principaux constituants (Desautels et al., 2009).
La composition relative de chacun de ces monoterpènes dans les huiles essentielles varie
cependant considérablement entre les espèces (Gonçalves et Romano, 2012).
Tableau 03. Les principaux composés des huiles essentielles des espèces les plus importantes
de Lavandula ssp. (Gonçalves et Romano, 2012).
Espèces composé principal Réferences
Lavandula Linalol et linalool

D’auria et al., 2005
angustifolia Mill. acétate
Lavandula latifolia Linalol, 1.8-cineol Munôz-Bertomeu et al.,

Med. et camphor 2007
Lavandula x Linalol, lonalool Desautels et al., 2009
18
intermedia acétate, camphor et 1.8-

cineole
Lavandula Camphor et 1.8-

Zuzarte et al., 2010
pedunculata (Miller) Cav. cineole
Lanvandula pinnata
α et β- phellandrene Figueiredo et al., 1995
L. fil.
Fenchon, camphor,
Lavandula stoechas
myrtenyl acétate et 1.8- Giray et al., 2008
L.
cinéole
Lavandula viridis 1.8- cinéole et Nogueira et Romano,

l’Hér Camphor 2002
1.2.5. Importance et applications
Les lavandes sont largement utilisés comme plantes ornementales et mellifères

(Upson et Andrews, 2004) et peuvent aussi aider à la reforestation des zones endommagées
par le feu (González-Coloma et al., 2011). Toutefois, la valeur économique de Lavandula spp.
se rapporte principalement à la propriété de leurs huiles essentielles, qui sont strictement
réglementés par les normes internationales ISO et sont utilisés à la fois en cosmétique et en
phytothérapie depuis des siècles. Les huiles essentielles de lavande sont largement utilisés
dans la fabrication de savons, parfums, arômes alimentaires et d'autres produits, comme les
parfums agréables ou comme agents antimicrobiens (Cavanagh et Wilkinson, 2002;. Woronuk
et al, 2011). La preuve de l'utilisation thérapeutique des lavandes remonte aux Romains et les
Grecs, mais une augmentation récente de la popularité des médecines alternatives a renouvelé
l'intérêt dans lavandes et leurs huiles essentielles comme des remèdes naturels (Woronuk et
al., 2011).
Les propriétés médicinales des huiles essentielles de lavande ont été récemment
examinés par Woronuk et al. (2011). Ces huiles peuvent être absorbés dans le corps humain
par trois voies: par les voies respiratoires, par contact direct avec la peau et par ingestion orale
(Perry et Perry, 2006). Les huiles essentielles sont largement utilisées en aromathérapie et
massage, et de nombreuses prestations sont demandées pour ces pratiques (Cavanagh et
Wilkinson, 2002). Les huiles des lavandes sont pensées pour favoriser le sommeil (Field et
al., 2008;.. Hallschmid et al., 2004) et sont largement utilisées pour réduire l'anxiété (Bradley
et al., 2007;. Dobetsberger et Buchbauer 2011;. Kritsidima et al., 2009) . les huiles
19
essentielles des lavandes ont été évaluées pour le traitement de la démence (Smallwood et al.,
2001) et plusieurs Lavandula spp. sont utilisées pour produire des huiles ayant des activités
antimicrobiennes, anticholinestérasiques et anti-oxydantes (Costa et al., 2012;..
Hanamanthagouda et al., 2010). En plus des substances volatiles, les lavandes produisent des
métabolites plus actifs tels que les phytostérols, les acides phénoliques et les flavonoïdes, qui
agissent comme antioxydants (Costa et al., 2011;. Georgiev et al., 2009;. Nitzsche et al.,
2004;. Spiridon et al., 2011). Les extraits de lavande ont également été rapportés avec des
propriétés appropriées pour la gestion des troubles du système nerveux central (Alnamer et
al., 2012;.. Costa et al., 2011).
Les extraits de lavande sont également utilisés dans l'industrie alimentaire en raison
de leur promotion de la santé et les effets de la nutraceutique. Hsu et al. (2007) ont constaté
que des extraits aqueux de L.angustifolia, L.vera et L. stoechas contiennent un inhibiteur de la
tyrosinase puissant et étaient utilisées comme agents de blanchiment des produits
alimentaires, alors que Kovatcheva-Apostolova et al. (2008) ont constaté que l'ajout de
l’extrait de Lavandula vera au poulet haché réduit l'oxydation des lipides et la perte d'α-
tocophérol pendant le stockage de la viande cuite, confirmant l'activité anti-oxydante de
l'extrait dans un système alimentaire réel. Les extraits et les huiles essentielles des lavandes
ont également des propriétés phytotoxiques et insecticides qui peuvent être utiles dans
l'industrie agrochimique (Haig et al., 2009 ; Pavela, 2005).
1.2.6. Maladies et Ravageurs
Il y a beaucoup de parasites et de maladies de lavande, ce qui réduit une éventuelle

durée de vie de 15-20 ans à 3 ans. La pourriture des racines due à Armillaria mellea est une
maladie fongique très grave, Thomasiniana lavandulae (diptères) est l'insecte le plus grave
que ses larves se nourrissent sous l'écorce, causant des dommages à la cime des branches.
D'autres maladies sont dues au champignon Rosellinia necatrix, le Homoptera Hyalesthes
obsoletus, Cechenotettix martini, Eucarazza elegans; Coleoptera comprennent Arima
marginata, Chrysolina americana et Meligethes subfumatus; lépidoptères comprend
Sophronia humerella; Argyrotaenia pulchellana, Pyterophorus spicidactyla. (Chaisse et
Blanc, 1990) (Tableau 04).
Tableau 04. Les principaux ravageurs de lavande et lavandin (Fontaine, 2011).
Nom du Classific Dégâts Seuil

ravageur ation occasionnés de nuisibilité
20
Larve :
Arima Coléopt défoliatrice très vorace. 3-4
marginata ou larve ère, adules ou
noire Chrysomelidae Adulte : larves/plante
sectionne les tiges florales
Cochenille Homopt
Les du lavandin ère Enroulement des
principaux 2
feuilles liées à l’injection
ravageurs foyers/Ha
Trionymus Pseudoc d’une toxine
printaniers
multivorus occidae
Hémiptè
re Dessèchement 3-4
Crachat du
des plantes, larves/ plante
coucou, ou cicadelle
affaiblissement, pas de Ou 4-6 larves
écumeuse cercopid montée à fleurs /m2
ae
Chenille de Lépidop Larve : 1

noctuelle tère défoliatrice très vorace chenille/plante
Les
principaux Méligéthe du
ravageurs lavandin Se nourrit du
3
estivaux coléoptè pollen et du nectar des
insectes/
re fleurs, dessèchement des
Meligéthes plantes
épis, chute des fleurs.
subfumatus
21
Chapitre 02
Régénération de
lavande
Chapitre 02 . Régénération de lavande
Chapitre 2. Régénération de Lavande
Les plantes, comme tous les autres êtres vivants, naissent, se développent, se
multiplient et meurent. Dans la nature, les plantes ne se propagent pas de la même manière.
Certaines, possèdent le pouvoir de se multiplier de plusieurs façons. La voie la plus courante
est la génération sexuée, qui fait intervenir un organe de reproduction male (pollen) et une
autre femelle (ovule) qui, après fusion, donneront naissance à un nouvel individu. Il existe
aussi d’autres façons de se multiplier sans faire appel à la fusion de deux gamètes, on parle
alors de multiplication asexuée (Boutherin et Bron, 2002).
La lavande est une espèce qui possède la faculté de se multiplier de différentes

façons. Elle se régénère par semis, par bouturage et également par micropropagation
(nouvelles techniques de multiplication appelées la culture de tissus végétaux ou culture in
vitro).
2. 1. La Multiplication naturelle
La lavande est une plante tempéré et photophiles. Elle peut être cultivée avec succès
en terres arables à très haute altitude. Comme plante, elle est très sensible à l'humidité élevée.
Toutefois, elle résiste à la sécheresse et au gel très bien. La lavande pousse très bien sur les
terres bâclée, elle a un système racinaire très profond aussi. (Baby et al., 2007).
2.1.1. La multiplication par semis
La multiplication par semis est une opération qui consiste à mettre des grains dans un
milieu favorable en vue d’obtenir la germination puis la croissance d’une plantule (Boutherin
et Bron, 2002).
La lavande est une plante qui se multiplie par semis. Les parcelles implantées à partir
de plants de semis sont appelées « lavande de population ou lavande fine» et donnent une
qualité d’huile essentielle dite « fine ». Ce mode de multiplication, qui se réalise durant la
période de printemps, est réservé beaucoup plus aux sélectionneurs et améliorateurs qui
cherchent à obtenir des hybrides pouvant présenter des caractères génétiques intéressants
21
(rendement, qualité des huiles, résistances aux maladies, etc.). En effet, les plantes issues de
semis présentent beaucoup d’hétérogénéité entre elles que ce soit sur le plan morphologique,
vigueur, sensibilité aux maladies et aux insectes et même sur le plan qualité et quantité des
huiles essentielles produites (Guy, 1997).
Généralement, l’opération de semis s’effectue en automne (Novembre – Décembre).

Les graines sont semées dans des lits de 1 m de large en rangées de 10 à 20 cm de distance
pour la culture en pépinière. Les graines, étant petites, sont mélangées avec du sable fin avant
le semis. La profondeur de semis ne doit pas dépasser les 1-2 cm. Les graines sont recouvertes
de fumier mûr stable ou de sable fin et sont laissées pendant tout l'hiver. La germination des
graines se déroule durant le mois d’avril (printemps). La pépinière doit être régulièrement
arrosée et maintenue humide, sans un excès d'eau stagnante (Panda, 2009).
2.1.2. La multiplication par bouturage
La multiplication végétative a depuis longtemps suscité l’intérêt des horticulteurs et

des pépiniéristes. Contrairement au mode de multiplication par semis, la multiplication
végétative via le bouturage (technique de multiplication végétative classique) n’entraine
aucune recombinaison génétique donc aucune variabilité. Le génome de la plante fille est
identique ou conforme à celui de la plante mère (Boutherin et Bron, 2002). La multiplication
végétative est la voie appropriée pour des performances de productivité, de résistance au
stress et aux maladies (Boutherin et Bron, 2002).
La lavande peut être multipliée par la technique du bouturage. Bien que la

multiplication des semences n'est pas cher et rapide, les plantations commerciales sont
établies à l'aide de bouturage (Baby et al., 2007). Les parcelles implantées à partir de ce type
de plants sont appelées « clonales » et donnent une qualité d’huile essentielle dite « clonale »
(Pierre-Yves, 2010).
Les boutures sont obtenues à partir de branches annuelles et bisannuelles de

plantation de pieds mères durant l’automne (Octobre-Novembre) dans les plaines et en
Février-Mars sur les collines. Des lits de pépinière de 20 à 25 cm de haut sont réalisés. Une
couche de 5 cm avec un mélange (1: 1) d'engrais organique et de sable est étalée au-dessus et
enfin recouverte d'une couche de 3 à 4 cm de sable de rivière propre. Des boutures de 8-10 cm
22
de longueur sont plantées sur les lits à une distance de 4 à 5 cm entre eux. Les boutures sont
transplantées dans le domaine principal à un espacement de 1,20 à 1,40 m entre les lignes et
de 35 à 40 cm entre les plants d’une même ligne (Panda, 2009).
La première récolte s’effectue trois ans après la plantation. Les fleurs sont récoltées
lorsque la culture est en pleine floraison. Les inflorescences qui atteignent des longueurs ne
dépassant pas 12 cm sont recueillies pendant le jour (de préférence en temps chaud et
ensoleillé). Généralement la productivité des plantations commence par régresser après 3 à 4
ans de culture et à ce moment il faut penser à la replantation (Baby et al., 2007).
2.2. La multiplication par micropropagation
La technique de culture in vitro (appelée aussi micropropagation) est un mode de

multiplication végétative artificielle des plantes. Il s’agit d’un ensemble de méthodes faisant
intervenir d’une part l’asepsie (stérilisation du matériel, désinfection des explants) et d’autre
part des conditions de culture parfaitement contrôlées (milieux de culture définis pour chaque
type de plante, température, lumière, humidité, etc...).
Théoriquement, n’importe quel type d’organe (bourgeon, feuille, racine…) ou

fragment d’organe, prélever sur une plante peut être cultivé sur milieu nutritif synthétique
approprié et produire une plante identique à la plante mère (celle du départ). (Gaspar, 1976).
La technologie de culture des tissus (ou micropropagation) de plantes est largement

utilisée pour la multiplication de plantes à grande échelle. Outre leur utilisation comme outil
de recherche, les techniques de culture de tissus végétaux sont devenues d'une importance
majeure industrielle dans le domaine de la propagation des plantes, l'élimination de la
maladie, l'amélioration des plantes et la production de métabolites secondaires.
La micropropagation emprunte deux principales voies de multiplication.
La première, utilisant des tissus méristématiques, permet d’obtenir des plantes dites
conformes, identiques à la plantes mère puisqu’elles partent de méristème préexistant dans
laquelle les cellules sont génétiquement très stable (Saadi, 1991 ; Amato, 1977 in Boxus,
1995). La plante est généralement obtenue en deux étapes successives : la production des tiges
23
et leur enracinement. Le microbouturage et la culture de méristème sont deux procédés

de multiplication appartenant à cette voie, ils permettent de produire des clones fidèles aux
plantes mères.
La seconde, emploie tous les tissus différenciés (fragments de tiges, de pétioles, de

feuilles, d’embryons matures ou immatures, d’hypocotyles, etc.) pour aboutir soit à
l’organogenèse (néoformation de bourgeons ou racines) soit la formation d’embryons
somatiques (structure ressemblant aux embryons zygotiques) (Zryd, 1988 ; Margara, 1989).
Cette voie qui induit la néoformation de bourgeons ou d’embryons somatique est

souvent une source de variabilité génétique donc de propagation non conforme. En effet, elle
est considérée comme étant la voie la plus efficace pour l'amélioration des cultures par la
production de variants somaclonaux et gamètoclonaux. Certains types de cultures de cals
donnent naissance à des clones qui présentent des caractéristiques héritées différentes
(rendement élevé, résistance aux maladies, tolérance aux stress,etc.) de celles des plantes
mères en raison de la possibilité d'apparition de la variabilité somaclonale. La
micropropagation peut donc conduire à la mise au point de variétés améliorées
commercialement importantes.
La micropropagation est une technique qui présent d’énormes avantages

comparativement aux méthodes de multiplication classique parmi ces avantages nous pouvons
citer :
L’obtention de plantes sains, indemnes de maladies ;

Le faible encombrement des cultures ;
Son applicable à un large éventail de plantes;
L’intérêt économique: cout d’entretien du pied mère moins important, durée de récolte courte.
La souplesse de la production vis-à-vis de la demande ;
La facilité de contrôle des facteurs environnementaux ;
Ce sont aussi des cultures qui se pratiquent indépendamment des saisons ;
24
2.2.1. La propagation conforme
La micropropagation conforme consiste à multiplier des végétaux au laboratoire à

partir d’organes ou de tissus extrêmement petit qui sont pourvus de méristèmes préétablis
(nœud, apex et méristème). Cette technique, très développée ces dernières années, est utilisée
pour régénérer des populations génétiquement identiques (constitution de clones)
(Auge et al., 1989).
a. La culture de méristème
C’est une autre voie de multiplication conforme des plantes. Elle permet, en se
partant d’explants de méristème d’obtenir des plantes saines indemnes de maladies (virus,
bactéries, etc.). Les méristèmes employés sont de minuscules massifs cellulaires
indifférenciés que l’on rencontre à la pointe d’une racine ou d’une tige ou rameau, formé de
petites cellules qui se divisent activement pendant la mitose. L’apex (partie centrale des
bourgeons) est placé dans un premier milieu de culture, où se développe une cal. Puis on
modifie la composition du milieu périodiquement pour que prolifère un jeune plant, à partir de
cette cal, donnant naissance aux différentes parties de la plantes. L’avantage est que les
cellules de méristème sont indemnes de virus même chez un plant malade, ce qui permet
d’obtenir une population de plantes saines (Tap et Novello, 2005).
L’usage de la culture de méristèmes chez les lavandes date depuis plusieurs années.
Elle est considérée comme «sûre» pour la préservation des caractéristiques clonales (Arie et
Beth, 1998) ce qui est extrêmement important pour la propagation des génotypes sélectionnés
et les espèces chémotypes productrices d'huiles essentielles (Andrade et al., 1999 ; Machado
et al.,2013).
Elle est aussi utilisée pour la préservation et la sauvegarde des espèces menacées par
certaines maladies. A tire d’exemple, la diminution de la longévité et de la production des
cultures de lavandin imputable à l’extension du phénomène de dépérissement a poussé
certains chercheurs à s’occuper de la régénération conforme des espèces cultivées. La
sauvegarde des espèces cultivées (lavandin) surtout en France, était plus qu’urgente surtout
que le dépérissement était attribué à une attaque potentielle de maladies pathogènes de type
mycoplasme (Ciare, 1970). Pour remédier à cela, Maia et al., en 1973, ont développé une
25
méthode de régénération par culture d’apex méristèmatique du lavandin Abrial,

particulièrement sensible au dépérissement.
Depuis cette date, un certain nombre de travaux ont été consacrés, d’une part, à la
multiplication végétative conforme in vitro de lavandins Grosso (Panizza et al., 1997 ;
Chambou et al., 1992), Abrial et super (Chambou et al., 1992) et d’autre lavandes comme
Lavandula dentata et Lavandula stoechas (Touzen et Daoud, 2007) ; Lavandula latifolia
Med. (Nobre, 1996) ; etc. (tableau 2).
b. Le microbouturage
Le mirobouturage in vitro figure parmi les techniques de base les plus développée.
Il permet à partir d’un matériel de départ souvent très restreint pondéralement, d’obtenir en un
temps relativement court et dans un espace réduit, un rythme de multiplication extrêmement
élevé et donc la formation rapide d’un clone. C’est une technique qui peut être programmée et
appliquée indépendamment des saisons (Haicour, 2004).
Le microbouturage est un mode de multiplication conforme qui accélère le

fonctionnement normal des bourgeons formés sur une plante (Montes, 2009). La prolifération
des méristèmes préexistants peut être réalisée en utilisant trois types d'explants:
méristème, apex ou nœuds (unique ou multiple) (Gonçalves et Romano, 2012). Ils sont
cultivées pour régénérer des pousses multiples sans passer par une phase cal (Pati et al.,
2006). De nombreuses espèces appartenant aux lavandes ont été régénérées via le
microbouturage. A titre d’exemple, nous pouvons citer la prolifération de pousses en utilisant
des bourgeons axillaires de tige (nœuds) sur Lavandula dentata (Jordan et al., 1998; 2001;
Echeverrigaray et al., 2005), Lavandula latifolia (Sánchez-Gras et Calvo, 1996 ) et Lavandula
vera (Andrade et al., 1999) (Tableau 2).
26
Tableau 05. Les différentes voies de micropropagation et la nature des explants, employées
chez les lavandes (Gonçalves et Romano, 2012).
Voie de Nature
Espèce a Références
micropropagation d’explant
Lavandula latifolia Med. PM H Calvo et Segura (1989)
Sànchez-Gras et Calvo
Lavandula latifolia Med. PM N
(1996)
Lavandula stoechas L. PM B, N Nobre (1996)
Lavandula dentata L. PM N Echeverrigaray et al.(2005)
Lavandula dentata L. PM N Jordan et al. (1998)
Lavandula vera DC PM N Andrade et al. (1999)
Lavandula vera DC O F Truso et al. (1999)
Lavandula vera DC O F Truso et al. (2000)
Lavandula angustifolia ‘Munstead’ CC F Wang et al. (2007)
Lavandula angustifolia Mill. O F Falk et al. (2009)
Lavandula viridis L’Hér MP N Dias et al. (2002)
Lavandula pedunculata MP N Zuzarte et al. (2010)
Lavandinb O F Dronne et al. (1999 a, b)
(H): Hypocotyls; (B): Bourgeons apicaux; (N): explants nodaux; (F): Fragments de feuilles;
(PM): Proliferation du méristème; (O): Organogenèse; (CC): Culture cellulaire.
(a) (b)
: Les noms, des espèces de lavande, utilisés par les auteurs. : Lavandula X intermedia
Emeric ex Loiseleur.
27
2.2.2. La propagation par organogenèse ou embryogenèse somatique
a. L’organogénèse
L’organogénèse est la base fondamentale de la multiplication végétative in vitro,

laquelle s’appuie toujours sur la néoformation de méristème (Margara, 1989). Elle est souvent
obtenue en trois phases distinctes : la callogenèse, la caulogenèse et la rhizogenèse.
La callogénèse correspond à la fois la reprise des divisions cellulaires (mitose) et à

l’amorce de la différenciation aboutissant à la production d’un tissu relativement homogène et
organisé (Margara, 1989). Quant à la caulogénèse, elle désigne à la fois l’initiation et le
développement des bourgeons adventifs (néoformés) sur un cal ou directement sur l’explant
(Margara, 1989 ; Boxus, 1989). Pour la rhizogenèse, elle signifie la néoformation et la
croissance de racines (Margara, 1989).
La néoformation des bourgeons adventifs est souvent la voie de régénération in vitro

la plus importante pour la réussite des interventions basées sur la biotechnologie des plantes
(Duclercq et al., 2011 ; Montes, 2009). Les cellules sont amenées à devenir dédifférenciées
par les régulateurs de croissance (notamment en contrôlant le rapport entre les cytokinines et
auxines), de sorte qu'elles sont compétentes pour répondre à de nouveaux stimuli
physiologiques et environnementaux. Dans ce cas, la formation de méristèmes se fait au
niveau d’un site inhabituel.
Sous l’influence des substances de croissance et plus particulièrement des

cytokinines, il peut soit y avoir la formation d’un bourgeon néoformé directement à partir de
cellule de l’explant initial (ceci est un événement rare), soit les cellules de l’explant initial se
divisent rapidement et forme un cal primaire qui peut donner des bourgeons néoformés.
Ensuite, les pousses données par les bourgeons sont transférées dans un milieu contenant de
l’auxine pour l’enracinement (Montes, 2009).
La régénération de la lavande par la voie de la néoformation des bourgeons a été

réalisée sur plusieurs espèces : lavande aspic, lavande fine, lavande stoechas et lavandins
(Gommez et al., 1987 ; Quazi, 1989 ; Calvo et Segura, 1989 ; Nobre, 1996).
28
b. L’embryogenèse somatique
L’embryogenèse somatique est la voie de développement par laquelle les cellules

somatiques des explants développent des structures qui ressemblent aux embryons zygotiques
et qui sont appelées embryons somatiques (Zryd, 1988 ; Jimnez, 2001). Ces embryons
peuvent se développer en plantes entières sans subir le processus de la fécondation sexuelle.
L'embryogenèse somatique peut être lancée directement à partir des explants ou indirectement
par la mise en place des cals (Altaf et al., 2012).
Le principe de cette technique est de produire, généralement en milieu liquide ou

solide, des embryons somatiques en grandes quantités, de les stabiliser à un stade déterminé
afin qu'ils puissent supporter des durées de stockage compactables avec une utilisation en
agriculture à grande échelle, puis d'enrober ces embryons de manière à assurer leur protection
et leur nutrition c'est-à-dire simuler le rôle de la graine (Scriban, 1999). Une fois semées, ces
structures artificielles germeraient comme des graines naturelles.
La régénération par la voie de l’embryogenèse somatique s’est réalisée avec certaines

espèces de lavandes comme Lavandula vera et L. angustifolia (Onizel et al., 1999 ;
Kintzios et al., 2002).
29
Chapitre 03
Variation somaclonale
& Techniques de détection
Chapitre 03. Variation somaclonale et techniques de détection
3. 1. Définition
L’expression « variation somaclonale » a été évoquée pour la première fois par

Larkin et Scowcroft (1981) pour désigner la variation génétique découverte dans les
« somaclones » des plantes régénérées à partir de n’importe quel type de tissu cultivé in vitro
(FAO, 1994 ; Leva et al., 2012). Ils démontrèrent que la culture de tissus végétaux induisait
des modifications phénotypiques à une fréquence beaucoup plus élevée que celles observées
naturellement. Depuis, le concept « variation somaclonale » a été élargi à l’ensemble des
altérations génotypiques et phénotypiques intervenant lors des processus de propagation
tissulaire in vitro (Kaeppler et al., 2000 ; Beulé, 2006 ).
La capacité de régénérer un individu entier à partir d'un simple fragment tissulaire

(explant), est caractéristique des cellules végétales. Cette propriété, baptisée « totipotence
cellulaire » (concept proposé en 1902 par le chercheur Autrichien Haberlandt G.), a été
largement employée par l'homme depuis l'apparition de l'agriculture (bouturage, greffage…),
mais la maîtrise des procédés biotechnologiques a permis de l'exploiter sur un très grand
nombre d’espèces jusque-là réfractaires. Cependant, ces techniques, en réorientant la destinée
cellulaire, entraînent des dérèglements d'ordre génétique, cytogénétique ou bien moléculaire
(Peschke et Phillips, 1992), se traduisant généralement par des altérations phénotypiques chez
les individus régénérés ou plus tardivement dans la descendance. (Beulé, 2006).
Souvent, des variations apparaissent dans la culture de tissus végétaux mais elles ne
sont pas toutes de type somaclonal. Elles doivent, pour l’être, posséder quatre caractéristiques
qui sont : la transmissibilité à la descendance par méiose ; l’irréversibilité ; l’aléatoirité et la
capacité de se produire chez les plantes régénérées (FAO, 1994).
Dans un contexte d'amélioration variétale, les variations peuvent, s'ils s'avèrent

stables dans le temps, présenter des caractéristiques nouvelles pouvant intéresser les
sélectionneurs, comme une meilleure adaptation à des conditions environnementales extrêmes
(résistance à certains pathogènes, tolérance à la sécheresse, à la salinité, etc.) (Jain, 2001 ;
Duncan, 1997 ; Leva et al., 2012). Cependant, il y a lieu de souligner que l’emploi des
variations somaclonales, comme source de diversité, reste limitée, du fait de la rareté des
31
variants à performances agronomiques accrues. Au contraire, ces dérives phénotypiques

deviennent dommageables à la diffusion de matériel produit in vitro si leurs effets sont
négatifs par rapport à la plante mère (individu initial) (Beulé, 2006 ; Bhojwani et Dantu,
2013).
De tels phénomènes ont été rapportés chez de nombreuses espèces végétales

régénérées in vitro, comme le café (Etienne et Bertrand, 2003), la pomme de terre (Joyce et
Cassells, 2002), le bégonia (Bouman et De KlerK, 2001), la banane (Peraza-Echeverria et al.,
2001) ou bien encore le pin de Norvège (Fourré et al., 1997) ou le concombre (Filipecki et al.,
2006 ; Ladyzynski et al., 2002).
3. 2. Origine et sources de variation somaclonale
Bien que la variation somaclonale a été largement étudiée, les mécanismes par
lesquels elle se produit restent largement inconnus (Skirvin et al., 1993 ; Skirvin et al., 1994 ).
Le type de tissu, la nature des explants, la composition hormonales des milieux de culture, la
durée de la culture, comptent parmi les principaux facteurs qui sont impliqués dans
l’induction de la variation somaclonale (Leva et al., 2012 ; Kumer, 2002 ; Bairu et al., 2011 ;
Jain et al., 1998).
Les variations induites par des facteurs physiologiques, par exemple l’exposition
prolongée à des substances de croissance (2,4-D, le 2,4,5-T), se traduisent par l’apparition de
variants entre les plantes régénérées. Souvent, ces variations sont épigénétiques et donc ne
suivent pas l’hérédité mendélienne (Rai, 2007 ; Leva et al., 2012 ; Chawla, 2002 ; Suprasanna
et al., 2009 ; Razdan, 2003 ; Kumer, 2002).
Des réarrangements chromosomiques telles que : la suppression, la duplication, la

translocation, l’inversion, la polyploïdie, l’aneuploïdie, ont été signalés à être les principales
sources des variations. Les mutations d'un seul gène dans les cultures donnent également lieu
à des variations qui ne sont pas détectées dans les plantes régénérées in vitro (plantes G0),
mais s’expriment dans les plantules G1 (après autofécondation des plantes G0) (Rai, 2007 ;
Suprasanna et al., 2009 ; Kumer, 2002 ; Jain et al., 1998).
32
3. 3. Détection des variations somaclonales
L’un des problèmes majeurs que rencontre la micropropagation, particulièrement lors

de son emploi à grande échelle (usage commercial), est l’apparition de variants à des taux
élevés. La détection précoce et l'élimination des variants est donc essentiel pour réduire les
pertes. Une détection efficace des variants peut également être utilisée pour repérer les
variants présentant des caractères intéressants (Jain et al., 1998 ; Kumer, 2002 ; Bairu et al.,
2011).
Les variants somaclonaux peuvent être détectées à l'aide de diverses techniques qui
sont largement catégorisées telles que : les techniques (de détection) morphologiques,
physiologiques, biochimiques et moléculaires. Chacune de ces techniques a ses forces et ses
limites (Bairu et al., 2011 ; Leva et al., 2012).
3. 3. 1. Détection morphologique
Les marqueurs phénotypiques sont généralement utilisés pour identifier les espèces,
les genres et les familles (Punesh, 2009). Les variants somaclonaux peuvent être détectées
facilement par des caractéristiques morphologiques, comme la vigueur de la plante, la
morphologie des feuilles, une pigmentation anormale, la densité stomatique, l'activité de la
photosynthèse, la formation de bourgeons floraux, la forme et la couleur du fruit, etc. (Israeli
et al., 1991 ; Leva et al., 2012).
Cependant, il y a lieu de rappeler que les caractères morphologiques sont fortement

influencés par des facteurs environnementaux et peuvent ne pas refléter la véritable
composition génétique d'une plante (Mandal et al., 2001 ; Cloutier et Landry, 1994).
3. 3.2 Détection physiologiques et biochimiques
Comparativement à la détection morphologique des variants, l'utilisation de réactions

physiologiques et / ou des tests biochimiques est plus rapide et peut être effectuée sur des
plantes se trouvant à des stades juvéniles pour réduire la perte éventuelle économique
(israélien et al., 1995). La réponse des plantes à des facteurs physiologiques comme les
hormones et la lumière peut être utilisée comme base pour différencier les somaclones
33
normaux et les variants (Peyvandi et al., 2009). A titre d’exemple, les troubles enregistrées
dans le métabolisme des acides gibbérelliques (acides régulant la croissance et influant sur
divers processus de développement tels que l'allongement des tiges et l'induction
enzymatique) peuvent servir comme indicateur possible de variation somaclonale chez les
plantes supérieures (Phinney, 1985 ; Sandoval et al., 1995).
Les tests biochimiques représentent aussi un moyen très efficace pour détecter des
variants parmi les somaclones régénérées (Kole et Chawla 1993. Thomas et al., 2006). La
synthèse de pigments tels que : les chlorophylles, les caroténoïdes, les anthocyanes, peut être
utilisée comme indicateur pour détecter de variants somaclonaux (Shah et al. 2003).
Toutefois, l'application de la plupart des tests biochimiques semble être complexe et nécessite
une grande expertise. On note par ailleurs, que la plupart des tests biochimiques sont effectués
à petite échelle au laboratoire en utilisant des techniques in vitro. Leur application à grande
échelle (usage industriel) ne semble pas connaitre de grand succès (Daub, 1986).
3. 3.3 Détection moléculaire
Les techniques moléculaires sont des outils précieux utilisés dans l'analyse de la
conformité génétique des vitro-plants. Au niveau moléculaire, les variations dans les plantes
issues de la culture des tissus proviennent des changements dans le nombre de chromosomes,
de la structure ou des changements plus subtils dans l'ADN (Kumer, 2002 ; Gostimsky et al.,
2005).
La variation morphologique visible est connue pour se produire à une fréquence

beaucoup plus faible qu'au niveau de l'ADN. En conséquence, il est nécessaire d'examiner le
potentiel de variation au niveau moléculaire afin de déterminer l'emplacement et l'étendue de
la déviance des somaclones (Cloutier et Landry, 1994). Ceci peut être réalisé à un stade de
croissance précoce, tout en restant dans la culture de tissus (Bairu et al., 2011).
L’étude réalisée par Botstein et al. (1980) sur la construction de cartes génétiques
utilisant le polymorphisme de restriction (RFLP) a été la première à avoir utilisé la technique
des marqueurs moléculaires rapportés dans la détection du polymorphisme de l'ADN.
Actuellement, un certain nombre de techniques moléculaires est disponible pour détecter une
variation de séquence entre les génomes étroitement liées, notamment les différences entre les
34
plantes d'origine et somaclones. Ces techniques impliquent l'utilisation de marqueurs

moléculaires qui sont utiles pour comparer l'ADN de différents échantillons en identifiant les
polymorphismes aléatoires (Cloutier et Landry, 1994 ; Leva et al., 2012).
3.3.3.1. Méthodes cytologiques
La variation du nombre de ploïdie et de la structure chromosomique est une preuve

directe et forte d'une forte probabilité de changement dans la composition génétique d'un
organisme (Kunitake et al., 1995 ; Al-Zahim et al., 1999). L’analyse caryologique et
d'observation, de l'aberration chromosomique utilisant la microscopie optique ou d'autres
techniques de microscopie complexes, a été utilisée avec succès pour la détection de la
variation somaclonale dans les régénérants in vitro (Al-Zahim et al., 1999 ; Raimondi et al.,
2001 ; Mujib et al., 2007. ).
En conséquence, la cytométrie en flux est maintenant largement utilisée pour le

comptage et l'examen des chromosomes (Dolez et al., 2004). Parce que la préparation des
échantillons et l'analyse est pratique et rapide, cette technique a été utilisée pour évaluer la
stabilité de la ploïdie du chêne-liège (Loureiro et al., 2005), Juniperus (Loureiro et al., 2007)
ainsi que la détection de variants somaclonaux chez la fraise (Nehra et al., 1992), la banane
(Gimeénez et al., 2001), la pommes de terre (Sharma et al., 2007) et bien d’autres espèces.
3.3.3.2. Les protéines et les isoenzymes
Les protéines sont des molécules organiques très abondantes dans les cellules avec
des fonctions diverses. Les isoenzymes (ou isozymes) sont des enzymes présentant une
séquence d'acides aminés différente mais catalysant la même réaction chimique. Il est bien
connu que la variation morphologique est le résultat de la variation biochimique qui s’est
exprimée comme la variation des protéines. En conséquence, la propriété discriminatoire des
protéines et des isoenzymes est une fonction du nombre de loci polymorphes qui peuvent être
identifiés et caractérisés génétiquement dans un organisme (Jarret et Gawel, 1995).
Les protéines et les isoenzymes comptent donc parmi les marqueurs moléculaires les
plus largement utilisés pour étudier la variation génétique dans la plupart des organismes
(Weising et al., 2005). Historiquement, les protéines et les isoenzymes telles que la
35
peroxydase, malate déshydrogénase et la superoxyde dismutase ont été largement utilisés pour
étudier la variation de la canne à sucre (Srivastava et al. 2005), les haricots (Gonzalez et al.,
2010) et Musa spp. (Bonner et al., 1974 ; Rivera, 1983).
Les variations somaclonales peuvent être détectées par l'analyse du polymorphisme

des protéines et des enzymes. Bien que les analyses des modèles isoenzymes d'enzymes
spécifiques offrent une méthode pratique pour la détection des modifications génétiques, la
technique est soumise à des variations ontogéniques ainsi que d'autres facteurs
environnementaux. Pour cela, de nombreux chercheurs ne comptent plus sur cette technique
pour détecter les variantes surtout après l’apparition d’autres techniques plus sensibles qui
sont actuellement employées (Bairu et al., 2011).
3.3.3.3. Le polymorphisme de restriction (RFLP)
La technique RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), développée par

Botstein et al. (1980), a été l'une des premières techniques utilisées pour étudier la variation
somaclonale et a été largement utilisée sur de nombreuses espèces. La technique repose sur la
mise en évidence de la variabilité de la séquence nucléotidique de l’ADN génomique après
digestion par des enzymes de restriction à des endroits précis, définis par une séquence de
bases, appelée « site de restriction » (Adam et Dron, 1993).
La modification de certains sites de restriction (substitutions, insertion ou délétion,

réarrangement de séquences nucléotidiques) est détectée par une variation du nombre et de la
longueur des fragments d'ADN (fragments de restriction) obtenus après digestion
enzymatique puis séparation par électrophorèse et visualisation par hybridation avec une
sonde radioactive ou fluorescente (Caterino et al., 2000).
Les marqueurs RFLP sont de bons marqueurs moléculaires. Ils peuvent être mono-
locus ou multi-locus, codominants, bi ou multi-alléliques. Ils permettent une analyse
génétique complète (Helentjaris et al., 1985).
En général, les marqueurs RFLP sont relativement très polymorphe et hautement

reproductible (Agarwal et al., 2008). Bien que cette technique est utile pour l'échantillonnage
des différentes régions du génome et potentiellement illimitée, elle est longue, coûteuse et une
36
grande quantité de tissu végétal est nécessaire pour les analyses (Piola et al., 1999). En outre,
il implique l'utilisation de réactifs radioactifs / toxique et est techniquement difficile. Ces
limitations ont conduit au développement d'une nouvelle série de méthodes techniquement
moins complexes qui sont la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) (Kumer, 2002 ; Bairu
et al., 2011 ).
3.3.3.4. Techniques basées sur la réaction de polymérisation en chaîne
La PCR (Polymerase chain reaction) est une méthode de biologie moléculaire basée
sur l’amplification enzymatique in vitro de l'ADN (Weising et al., 2005). Dans la PCR, une
séquence d'ADN d'intérêt est amplifiée de façon exponentielle à l'aide d'amorces et une ADN
polymérase thermostable. La réaction implique des cycles répétés, chacun consistant en une
dénaturation, hybridation des amorces et des cycles d'allongement. Des techniques d'analyse
basées sur la PCR en utilisant différents marqueurs moléculaires constituent un outil essentiel
nécessaire pour révéler le polymorphisme au niveau de la séquence d'ADN et résoudre les
problèmes d'introgression ainsi que la lignée (Gostimsky et al., 2005 ; Simmons et al., 2007).
a. Le RAPD
L'amplification aléatoire d'ADN polymorphe, plus connue sous le nom de RAPD

(pour random amplified polymorphic DNA), est une technique d'analyse de l'ADN. Elle
implique l'utilisation d'amorces courtes uniques de séquences nucléotidiques arbitraires pour
amplifier de manière reproductible des segments d'ADN génomiques cibles. Ces amorces
courtes appelées marqueurs génétiques sont utilisées pour révéler les polymorphismes parmi
les produits d'amplification qui sont considérés comme des bandes visibles à l'aide
d’électrophorèse (Williams et al., 1990).
Il existe d’autres variantes d’ADN polymorphe amplifié aléatoirement (RAPD)

comme : l’AP-PCR (Arbitrary primed PCR), l’AAD (arbitrary amplified DNA) et le DAF
(DNA amplification fingerprinting). Par exemple, dans l’AP-PCR, une seule amorce (10 à 5
nucléotides de long) est utilisée et implique l’amplification pour les deux premiers cycles à
faible sévérité. Par la suite, les cycles restants sont effectués à stringence plus élevée par
augmentation de la température d’hybridation (Welsh et Mcclelland, 1990). Bien que l’AP-
PCR n’ait pas été largement acceptée parce qu'elle implique l'utilisation d'autoradiographie,
37
elle a été simplifiée et les fragments peuvent maintenant être fractionnés avec l'utilisation de
l'électrophorèse sur gel d'agarose (Agarwal et al., 2008).
Techniquement, le RAPD a été décrit comme la version la plus simple de PCR avec
des amorces arbitraires utilisées pour la détection de variation de l'ADN et pour plus de
commodité (Weising et al., 2005). En plus de fournir une technique efficace pour le
polymorphisme qui permet une identification rapide et isolement des fragments d'ADN
spécifiques de chromosomes, les marqueurs RAPD sont également utiles pour la cartographie
génétique, les empreintes génétiques et l'amélioration des plantes et des animaux
(Venkatachalam et al., 2008). L'utilisation de marqueurs RAPD est particulièrement
bénéfique pour discriminer entre les matériaux qui sont génétiquement semblables, afin
d'évaluer la variabilité génétique au sein d'une collection et de choisir les composants de la
collection de base (Piola et al., 1999).
Les techniques RAPD ont été utilisés avec succès pour évaluer la relation génétique
entre de nombreuses plantes, par exemple, la canne à sucre (Devarumath et al., 2007), Le
sorgho (Singh et al., 2006) et la pomme (Bernardo Royo et Itoiz, 2004). En outre, de
nombreux auteurs ont constaté que les techniques RAPD sont utiles en examinant la variation
induite par la culture de tissus. En effet grace à cette technique de nombreux variant ont été
identifiés chez la pêche (Hashmi et al., 1997), la canne à sucre (Taylor et al., 1995), les
orchidées (Chen et al., 1998) et les bananes (Bairu et al., 2006). On note cependant que
parfois cette technique montre des limites et n’arrive pas à déceler des variants chez certaines
espèces végétales.
La technique a aussi une faible reproductibilité et fiabilité ainsi que moins

d'information par rapport aux marqueurs AFLP limitant son application dans certaines
espèces (Jones et al., 1997). Malgré ces insuffisances, la technique RAPD reste attractive
pour les chercheurs lorsque l'investissement financier est limité parce que le coût d'entrée est
moins cher que d'autres marqueurs moléculaires tels que les AFLP et microsatellites (Weising
et al., 2005).
b. Le AFLP
38
Le polymorphisme de longueur des fragments amplifiés, connu sous le sigle AFLP

(amplified fragment-length polymorphism), est un outil utilisé dans la recherche en génétique
et en transgenèse. La technique a été développée au début des années 1990 pour surmonter la
limitation de la reproductibilité associée à RAPD. Théoriquement, l’AFLP représente la
puissance de la combinaison ingénieuse de RFLP et la flexibilité de la technologie basée sur
la PCR (Agarwal et al., 2008). Il fournit une nouvelle et très puissante technique de
l'empreinte ADN pour les ADN de toute origine ou complexité. En outre, cDNA-AFLP et
three endonuclease AFLP (TE-AFLP), qui sont utilisés pour quantifier les différences dans les
niveaux d'expression des gènes et de détecter la mobilité des éléments transposables, sont
respectivement des variations de la technique AFLP (Weising et al ., 2005).
Dans l’AFLP-PCR, l'ADN génomique est digéré au moyen de deux endonucléases

de restriction, typiquement à une séquence de reconnaissance de six paires de bases
(généralement EcoRI) et l'autre avec un séquence de reconnaissance de 4 pb (généralement
Msel). Par la suite, les adaptateurs de séquence connue sont ligaturés à des adaptateurs double
brin complémentaires des extrémités des fragments de restriction. Un sous-ensemble de
fragments de restriction est ensuite amplifié à l'aide de deux amorces complémentaires à
l'adaptateur et les fragments de sites de restriction pour deux cycles successifs d'amplification
par PCR sélective. Le premier tour de PCR (preselective ou f-1 amplification) utilise des
amorces qui correspondent aux adaptateurs sur la fin EcoRI et fin Msel des fragments plus un
nucléotide supplémentaire. Le second tour (sélectif ou +3 amplification) a deux autres
nucléotides ajoutés aux séquences d'amorces.
Les techniques AFLP génèrent des empreintes digitales de tout ADN à partir de
n'importe quelle source, même sans aucune connaissance préalable de la séquence d'ADN et
une étude récente a montré qu'il peut être utilisé pour distinguer les sujets étroitement liés au
niveau sous-espèces (Althoff et al., 2007). Cela montre que AFLP est une technique de
marqueur très sensible et fiable qui pourrait être utile pour détecter les altérations génomiques
spécifiques liés à la variation de la culture de tissus et d'identifier les différents génotypes.
La technique d’AFLP a été utilisée pour étudier la variation somaclonale induite par
la culture de tissus chez des nombreuses espèces telles que le café (Sanchez-Teyer et al.,
2003), Echinacea purpurea (Chuang et al., 2009), le Chêne-liège (Hornero et al., 2001) et les
bananes (James et al., 2004). Cependant, la technique nécessite souvent plus de travail avec
39
l'optimisation et est relativement plus cher que RAPD (Weising et al. 2005). En outre, la
technique nécessite des échantillons d'ADN de haute qualité qui sont souvent difficiles à
obtenir avec certaines plantes comme les conifères (Piola et al., 1999).
c. Marqueurs microsatellites
Contrairement à toutes les techniques basées sur la PCR expliquées ci-dessus qui
sont arbitrairement amorcées ou non spécifiques, les techniques de marqueurs microsatellites
sont basées sur la séquence cible. Ils sont également connus comme simple sequence repeats
(SSR), short tandem repeats (STR), sequence-tagged microsatellite sites (STMS) et simple
sequence length polymorphisms (SSLP) (Albani et Wilkinson, 1998 ; Hautea et al., 2004). Les
microsatellites sont constitués de courtes séquences d’ADN réitérées (un à cinq) qui sont
abondantes et se produisent comme éléments répétitifs entrecoupés dans tous les eucaryotes
ainsi que dans de nombreux génomes de procaryotes. Les techniques de marqueurs
microsatellites utilisent la variation intra et inter individuelle dans les microsatellites ou dans
les régions à séquences simples répétées pour les analyses d'empreintes génétiques (Agarwal
et al., 2008).
Le polymorphisme résulte des différences dans le nombre d'unités de répétition entre

les personnes à un locus microsatellite particulier et l'on croit être en raison de remaniement
asymétrique ou un glissement de l'ADN polymérase lors de la réplication des secteurs de
répétition. Cependant, la variation du nombre d'unités répétées en tandem a été signalée
comme étant principalement due au glissement des brins lors de la réplication de l'ADN
(Schlotterer et Tautz, 1992). Le glissement dans la réplication est plus probable que des
mutations ponctuelles, les microsatellites ont tendance à être hypervariable et sont impliqués
pour les nombreux polymorphismes de longueur inter individuelles observées dans les
analyses microsatellites (Agarwal et al., 2008). Plus important encore, des études ont montré
que les marqueurs microsatellites amplifiés par PCR sont hérités d'une manière mendélienne
(Litt et Luty, 1989).
Pour le dosage de microsatellite, l'information de séquences répétées flanquant est

utilisée pour concevoir des paires de loci-amorces PCR spécifiques et amplifié. Ces loci-
amorces PCR spécifiques sont soit paires d'amorces non marquées, radio-marquées ou
40
marquée par fluorescence. Par la suite, les produits amplifiés par PCR sont séparés sur gel de
polyacrylamide dénaturant et visualisés par autoradiographie, fluorimétrie ou la coloration
avec de l'argent ou du bromure d'Ethidium (Weising et al., 2005). Bien que relativement cher,
l'utilisation de amorces microsatellites étiquetés par fluorescence et la détection de laser dans
les procédures génotypage a considérablement amélioré le débit et l'automatisation de cette
technique (Wenz et al., 1998).
Les marqueurs microsatellites ont été trouvés extrêmement utiles pour établir la
stabilité génétique de plusieurs plantes micropropagées telles que le sorgho (Zhang et al.,
2010), le peuplier faux-tremble (Rahman et Rajora, 2001), la vigne (Welter et al., 2007), le
blé (Khlestkina et al., 2010) et la canne à sucre (Singh et al., 2008b).
En comparaison avec les AFLP et RFLP, la technique des marqueurs microsatellites

comme ISSR est rentable, surmonte les dangers de la radioactivité, et nécessite des quantités
moindres d'ADN. En outre, ces marqueurs sont hautement reproductible et de plus en plus
populaire en raison de leur nature d'héritage co-dominante, grande abondance dans les
organismes, immense étendue de la diversité allélique ainsi que la facilité d'évaluer la
variation de taille des microsatellites par PCR avec des paires d'amorces flanquant (Li et al.,
2002;. Weising et al., 2005; Agarwal et al., 2008). Cependant, un inconvénient majeur pour
l'utilisation de microsatellites est que le développement d'amorces prend du temps (Squirrell
et al., 2003).
41
Etude expérimentale
Chapitre 04
Matériel & Méthodes
Chapitre 04. Matériel & Méthodes
Chapitre 4. Matériel et Méthodes

La présente étude a été menée dans le laboratoire de biotechnologie végétale de
l’université Hassiba Benbouali de Chlef au cours de la période 2012-2013.
4.1 Régénération de lavande
4.1.1. Choix et provenance du matériel végétal
L’espèce de lavande ayant fait l’objet de cette étude est Lavandula dentata. Les
plantules, ayant servi au prélèvement des explants, sont obtenues par vitrosemis à partir de
graines récoltées en juin 2011 de la région de Ténès (willaya de Chlef) (figure 05).
Le choix des explants a été effectué selon la voie de multiplication empruntée lors de
cette étude. Le matériel végétal destiné à l’établissement du microbouturage est constitué des
segments nodaux (1 à 2 cm de long) contenant un à deux bourgeons axillaires. Quant à la voie
de l’organogenèse et/ou de l’embryogenèse somatique, ce sont les entre-nœuds, les feuilles et
les hypocotyles qui ont servi comme explants.
Figure 05. Aspect d’une plante entière (A), de graines, de feuilles et de plantules
issues de la germination (in vitro) de Lavandula dentata.
44
4.1.2. Techniques de culture
4.1.2.1. Débourrement et croissance des bourgeons axillaires
Les tiges des plantules sont découpées en petites boutures (microboutures) de 1 à 2

cm de long, chacune portant un à deux bourgeons axillaires. Après élimination des jeunes
feuilles à l’aide d’un scalpel, les microboutures sont ensemencées dans des tubes à essai
contenant un milieu de débourrement et de croissance des bourgeons (figure 06). Ce milieu
est composé des sels minéraux et des vitamines de Murashige et Skoog (1962) (MS) (annexe
II), du saccharose à 30 g/L et de l’agar à 7 g/L. Il contient aussi deux cytokinines : la BA (6-
benzyladénine) et la Kinétine (6-furfuryl-aminopurine), apportées seules et à différentes doses
ou en combinaison avec une auxine : L’ANA (l’acide α-naphtaléne acétique) (0,01 – 0,1
mg/L) (Annexe II).
4.1.2.2. Néoformation des bourgeons et d’embryons somatiques
Les explants de feuilles, des entre-nœuds et d’hypocotyles choisis pour induire la

caulogenèse et/ou l’embryogenèse somatique sont prélevés à partir de plantules cultivées in
vitro (vitroplants) et de vitrosemis. Les feuilles, les entre-noeuds et les hypocotyles sont
découpées en petits fragments de 0,5 à 1 cm de longueur puis ensemencées sur milieu de
culture MS (figure 07). Les régulateurs de croissance utilisés lors de cette phase sont des
auxines (l’acide α-naphtalène acétique (ANA) et l’acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-
D) et des cytokinines (6-benzyladénine (BA), la Kinétine (6-furfuryl-aminopurine) et la
Zéatine (Annexe II).
4.1.3 Conditions de culture
Avant la stérilisation des milieux de culture, leur pH est ajusté à 5,7 à l’aide d’une
solution de NaOH (1N) et de HCL (1N), puis solidifié par 7 g/l d’agar. Une fois le milieu est
préparé, il est stérilisé dans l’autoclavage à une température de 120°C pendant 20 minutes et
sous une pression de 2 bars. Après stérilisation, les milieux sont répartis dans des boites de
Pétri (90 mm de Ø) à raison de 20 ml par boite.
45
L’ensemencement se fait à raison de 6 explants par boite et 6 répétitions par

traitement. Les ensemencements et les repiquages se font sous une hotte stérile à flux
laminaire au voisinage de la flamme. L’intervalle d’un repiquage à un autre ne doit pas
dépasser les 30 jours. Les cultures sont exposées à une photopériode est de 16/8 h et une
température de 23 ± 2 °C.
4.1.4. Suivie des cultures et expression des résultats
Le débourrement des bourgeons axillaires, l’organogenèse et l’enracinement des

pousses, sont suivis périodiquement (après 5, 10, 20, 25, 30 et 35 jours), ce qui permet de
calculer le pourcentage de reprise pour chaque répétition.
A B
C D
Figure 06. Les différentes étapes de microboutures de Lavandula dentata (A): Les
vitroplants utilisés pour prélever les microboutures ; (B et C): Les zones de section et tailles
des microboutures; (D) Ensemencement des microboutures.
46
A B
C D
Figure 07. Mise en culture des différents explants obtenus des vitroplants de 2eme
génération (A) : plantules issues de repiquage des vitrosemis dans le milieu MS
dépourvu d’hormones âgées de 8 semaines, (B) (C): les types d’explants testés : des
entrenœuds de 0,5 à 1 cm de longueur, des feuilles, (D): ensemencement.
4.2. Analyse de la variation somaclonale
L’analyse de la conformité génétique a été effectuée en faisant recours à la technique

de biologie moléculaire RAPD. Le but recherché est de vérifier l’existence ou l’absence de
variation au sein des plantules régénérées par organogenèse par rapport aux plantes mères.
4.2.1. Provenance de matériel végétal
Les plantules (vitroplants) ayant fait l’objet de cette étude ont été régénérées par
organogenèse. Les analyses sont réalisées sur de jeunes feuilles prélevées de ces plantules
(vitroplants). Ce sont les plantules régénérées sur les milieux figurant dans le tableau 06 qui
ont été analysées.
47
Tableau 06. Les échantillons ayant servi pour les extractions d’ADN et les analyse PCR-
RAPD.
Milieu de
Echantillon Composition du milieu de croissance
croissance
P01 MB8 0,5 mg/L BA, 0,5 mg/L ANA.
P02 MZ6 01 mg/L ZT, 0,5 mg/L ANA.
P03 MK12 0,5 mg/L KN, 0,1 mg/L ANA.
P04 MZ12 0,5 mg/L ZT, 0,1 mg/L ANA.
PM MS0 MS sans hormones
4.2.2. Technique moléculaire PCR-RAPD
4. 2.2.1. Extraction et purification d’ADN génomique
La quantité et la qualité de l'ADN végétal utilisé pour l'analyse dépendent largement

des techniques d’extraction employées. Ceci est particulièrement important pour les espèces
produisant de grandes quantités de métabolites secondaires (polyphénols, terpènes, résines ou
polysaccharides) qui souvent empêchent une bonne extraction de l'ADN. L'utilisation
d'échantillons frais collectés dans la phase active de croissance de la plante donne
généralement de meilleurs résultats (Black-Samuelsson et al., 1997 ; Ferreira et Grattapaglia,
1998).
Diverses techniques ont été développées par plusieurs auteurs qui sont devenus des
références en la matière (Doyle et Doyle, 1990 ; Edwards et al., 1991 ; Krizman et al., 2006).
Il existe aussi des kits d’extraction commercialisés qui permettent une meilleure utilisation du
temps et augmentent la quantité d'ADN extrait.
Lors de cette étude, nous avons testé deux méthodes d’extraction d'ADN. Une
première, technique classique décrite par Doyle et Doyle (1987) et améliorée par Belkadi
(2003), utilise le mélange Phénol/Chloroforme. La seconde, utilise un kit d'extraction
commercial " Extract-N-Amp TM plant PCR kits"(Tableau 07).Dans notre cas, compte tenu de
l’absence d’un protocole spécifique à l’extraction de l’ADN chez les lavandes, nous étions
amené, après avoir effectué plusieurs essais, à adopter un protocole ayant donné satisfaction
avec d’autres espèces végétales.
48
Lors de cette étude, nous avons testé deux protocoles d’extraction d’ADN.
Le premier, reposant sur un Kit commercial appelé « Extract-N-AmpTM Plant PCR

Kit », contient tous les réactifs nécessaires pour extraire rapidement et purifier l'ADN
génomique extrait. L'ADN est extrait à partir d'un morceau de jeune feuille (un disque 0,5 à
0,7 cm est coupé avec un poinçon de papier standard). Après une incubation dans la solution
d'extraction à 95 ° C pendant 10 mn, un volume égal de la solution de dilution est ajouté à
l'extrait afin de neutraliser les substances inhibitrices.
Le second, est un protocole classique s’inspirant de celui décrit par Doyle et Doyle
(1987). Dans ce protocole nous avons remplacé le détergent CTAB (Bromure
d’Hexadécyltriméthyl Ammonium) par le SDS (Sodium Dodécylsulfate) qui permet de
dissoudre efficacement les sucres et de faire précipiter l’ADN (en présence des bonnes
concentrations de sels).
L’extraction de l’ADN se fait à partir de 0,2 g de feuilles broyées puis mises dans
des tubes à Eppendorf de 1,5 ml. A ce broyat s’ajoute un tampon d’extraction composé de
1,4M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, suivi d’une agitation vigoureuse du
mélange à l'aide du vortex. Puis, après ajout de 33 µl de SDS et agitation, le mélange sera
incubé à une température de 55°C pendant 30 mn. Après refroidissement, la préparation est
soumise à une étape de déprotéinisation en procédant à un lavage avec le mélange
phénol/chloroforme/alcool isoamylique (24: 25: 1), suivi d’un autre lavage avec
chloroforme/alcool isoamylique (24: 1). Ceci permet la neutralisation ou l’élimination, par le
chloroforme, de toutes traces de phénol naturellement présent dans les feuilles. La séparation
entre la phase organique et la phase aqueuse contenant l'ADN se fait après agitation par
centrifugation à 10 000 tr/mn pendant 10 mn.
La phase aqueuse est additionnée d'un volume égal d'isopropanol froid afin de faire
précipiter l'ADN. Le mélange est alors incubé à - 23°C pendant 2 h puis centrifugé à 10 000
tr/mn pendant 10 mn. Le culot d'ADN est lavé avec de l'éthanol à 70 % puis séché à
température ambiante. Une fois séché, il est resuspendu dans 50-100 µl d'eau ou du tampon
TE (Annexe III).
49
4.2.2.2. Evaluation de la qualité et de la quantité d’ADN extraite
La qualité de l’ADN extrait a été d’abord vérifiée sur gel d’agarose (0,8%) puis par
mesure de la densité optique (DO) (de l’extrait) à 260 nm. En effet, 09 µl d’ADN plus 2 µl de
tampon de charge (Proméga) déposé dans les puits du gel, ont été migrés dans le tampon TAE
(Tampon Tris acétate EDTA 0,5x à pH 8), pendant 01 h à 135V. Après sa coloration dans un
bain de Bromure d’Ethidium (BET) à 0,1%, le gel a été visualisé sous UV.
Par ailleurs, la quantité d’ADN extraite a été évaluée par la mesure de la DO à 260
nm. Elle est déterminée selon la formule suivante : Quantité d’ADN (ng/µl) = valeur
d’absorbance à 260 nm x 50 x facteur de dilution. Une autre mesure de la DO à 280 nm a
permis d’évaluer la quantité de protéines contenue dans la suspension d’ADN. Ainsi le
rapport entre ces deux mesures DO260/DO280 constitue un moyen évaluatif numérique
permettant d’apprécier la qualité ou la pureté de notre extrait d’ADN. En effet, plus ce rapport
tend vers 2 plus l’extrait d’ADN est de qualité meilleure ou pure et son utilisation dans
plusieurs techniques d’amplification est vouée au succès.
4.2.2.3. Amplification de l’ADN
Lors de cette étude, nous nous sommes inspirés du mélange réactionnel

préalablement adapté à l’amplification de l’ADN de certaines espèces du blé (Aegilops et
Triticum) par Belkadi (2003). Après avoir testé différentes concentrations de MgCl2, dNTP,
amorces, ADN et Taq polymérase nous avons choisi le protocole présenté dans le tableau 08.
En tout, 08 amorces décamères arbitraires RAPD d’Operon Technologies Inc. ont été
choisies (tableau 09) et utilisées pour l'analyse de la conformité et la stabilité génétique entre
les plantes mères et les plantes filles.
L'ensemble de la manipulation RAPD-PCR s'effectue sous la hotte à flux laminaire.

La réaction d’amplification a été effectuée dans un volume réactionnel de 25 µl. Le Mix est
tout d'abord réalisé en introduisant dans l'ordre et en agitant : 45µl de tampon (loading day
5x), 22,5µl MgCI2, 1,8µl dNTP, 22,5µl d’amorces. 1,8µl de Taq polymérase est sortie du
congélateur à -20°C et ajoutée à la dernière minute. Finalement, 108 µl d'eau est introduite
et le Mix est mélangé doucement grâce au pipetman (Tableau 07).
50
Le Mix est ensuite reparti de façon homogène dans les tubes à Eppendorfs. En
dernier lieu 2 µl de l'ADN est ajouté tube par tube en veillant bien à changer de cône après
chaque opération. Dans chaque tube, le mélange final (Mix + ADN) est recouvert par une
goutte de paraffine liquide afin de limiter l'évaporation.
Le cycle de PCR choisi correspond au cycle classique de PCR (Sambrock et al.,

1989), à l’exception de la température d’hybridation qui est de 29 °C, plutôt faible à cause de
l’amorce très courte (Tableaux 08, 09). Il est à noter que les 45 cycles et l’étape d’élongation
de 2mn permettent d’amplifier efficacement les produits les plus longs. Les amplifications
d'ADN ont été effectuées en utilisant un cycleur thermique (Research PTC 100).
Tableau 07. Composition du mélange réactionnel pour PCR/RAPD selon le protocole de

Belkadi (2003) et celui adapté à Lavandula dentata.
Protocole de Belkadi (2003) Protocole adapté

Eléments du mélange Volume de prise (μl) Eléments de mélange Volume de prise (μl)
Tampon PCR (10X) 2,5 Tampon PCR(5X) 05
MgCl2 (25 mM) 2,5 MgCl 2 (25 mM) 2,5
dNTP (20 mM) 01 dNTP (10 mM) 0,2 (pour chaque DNTP)
Amorce (10µM) 0,5 Amorce (100µM) 2,5
Taq polymérase
Taq polymérase (5U/µl) 0,8 0,2
(5U/µl)
ADN (15 ng/µl) 01 ADN 2
Eau distillée (PCR
Eau distillée (PCR Water) 16,7 12
Water)
Tableau 08. Programme d’amplification PCR-RAPD
Nombre de
Les différentes étapes Température Durée
répétitions
01 Dénaturation initiale 94° C 1mn 01
Dénaturation 94° C 1 mn
02 Hybridation 29° C 1 mn 45 cycles
Elongation 72° C 2 mn
03 Extension finale 72° C 10 mn 01
51
Tableau 09. Les caractéristiques des 08 amorces décamères RAPD utilisées (séquences,
température d’hybridation et pourcentage de CG).
Température
Amorces Pourcentage
Séquences (5’-3’) d’hybridation
décamères de CG (%)
(Tm °C)
OPA-01 CAGGCCCTTC 29 70
OPA-03 AGTCAGCCAC 29 60
OPA-04 AATCGGGCTG 29 60
OPA-05 AGGGGTCTTG 29 60
OPA-08 GTGACGTAGG 29 60
OPA-10 GTGATCGCAG 29 60
OPA-14 TCTGTGCTGG 29 60
OPW-12 TGGGCAGAAG 29 60
4.2.2.4. Séparation des produits PCR-RAPD et visualisation
Les produits amplifiés sont séparés par électrophorèse horizontale en gel d’agarose
(1,5 %) dans du tampon TAE (1X). La taille des produits amplifiés a été déterminée par
comparaison avec un marqueur de taille (100 pb DNA ladder). Après une migration à 135V,
les gels sont plongés dans un bain de bromure d’éthidium (0,1%) qui se fixe sur les acides
nucléiques, pendant 10 à 15 mn. Les gels sont ensuite visualisés sous UV. Les fragments ont
été marqués comme une variable binaire : présence (1) et absence (0) de la bande.
4.2.2.5. Analyse des données
Pour chacun des échantillons et pour chaque amorce, la lecture visuelle des gels a
permis de noter les bandes polymorphes. Ainsi, nous avons attribué la valeur 1 pour les
bandes présentes et 0 pour les bandes absentes. Après saisi des données correspondantes à la
matrice binaire obtenue, le programme ANALYSIS CLUSTER du logiciel PAST, a permis
d’élaborer un dendrogramme et une matrice basée sur l’indice de JACCARD de similarité
génétique entre les différents variants somaclonaux de lavande étudiés.
52
Chapitre 05
Résultats & Discussion
Chapitre 05. Résultats & Discussion
Chapitre 5. Résultats et Discussion
Le premier objectif de cette étude ambitionne de parvenir à régénérer des

plantes entières de Lavandula dentata via le microbouturage, l’organogenèse et
l’embryogenèse somatique. Suite aux résultats préliminaires obtenus, nous avons axé
notre étude beaucoup plus sur les deux premiers modes de multiplication. Les résultats
vont porter donc sur les aptitudes à la régénération de la lavande dentée (Lavandula
dentata) par microbouturage et par organogenèse. Aussi les résultats de l’étude du
polymorphisme entre les plantes mères et les plantes régénérées via la caulogenèse
seront présentés en employant des marqueurs moléculaires. Le but recherché est de
vérifier la conformité (ou la variabilité somaclonale) des plants régénérées in vitro via
l’organogenèse par rapport aux plantes mères.
5. 1. Aptitude à la régénération de Lavandula dentata
5. 1.1. Aptitude à la régénération par microbouturage
Par microbouturage, nous désignons la technique de multiplication végétative

(voie asexuée) qui consiste à prélever des fragments d’une plante donnée et à les
cultiver dans des flacons stériles en verre pour régénérer plusieurs individus. Les
individus obtenus sont génétiquement identiques à la plante dont ils sont issus (individus
conformes à la plante-mère).
Contrairement au bouturage classique, dont le taux de multiplication est

souvent faible, le microbouturage, qui exploite la totipotence des cellules végétales,
apporte un progrès considérable puisqu’il permet d’améliorer ce taux jusqu’à 100 à
1000 fois. Les performances de cette voie ne se limitent pas au seul coefficient de
rapidité de la multiplication, mais il s’est avéré que les plantes autoracinées in vitro sont
plus vigoureuses, saines et plus résistantes aux maladies.
Les microboutures ayant servi comme explants dans nos expériences

provenaient de plantules issues essentiellement de vitrosemis. Des explants provenant
de plantes sauvages ont également été testées mais compte tenu du taux de
contamination élevé, on a préféré abandonner ce matériel végétal.
54
Les paramètres qui influencent le microbouturage sont très nombreux (l’effet
génotypique, la nature des explants, la composition minérale et hormonales des milieux
de culture, etc.). Lors de cette étude, compte tenu des moyens disponibles au niveau de
notre laboratoire, nous nous sommes limités à tester seulement l’effet de la composition
hormonale des milieux de culture sur le taux de multiplication de Lavandula dentata par
microbouturage.
5. 1.1.1. Phase de débourrement des bourgeons et élongation des pousses
Par débourrement, nous désignons le moment où les bourgeons axillaires des

microboutures ensemencées se développent pour laisser apparaître leur bourre (c'est-à-
dire le duvet, les primordia foliaires et ébauches florales enfouies dans les bourgeons).
Quant à l’élongation, nous désignons la croissance des pousses qui démarrent après
débourrement des bourgeons.
Le débourrement débute généralement après une semaine de culture. Puis, c’est

une phase de développement des pousses végétatives feuillées (croissance ou
élongation) qui s’installe au bout de la 4ème semaine. Le taux de débourrement (qui
représente le nombre de microboutures ayant débourrés par rapport au nombre total de
microbouture mis en culture) ainsi que le développement des pousses feuillées restent
tributaires de la composition hormonale des milieux de culture utilisés.
a. Action des cytokinines
Lors de ces expériences, nous avons testé l’effet de l’apport seul de la 6-

benzyladénine (BA) et de la Kinétine (6-furfuryl-aminopurine) (KN), appliquées à
différentes doses, sur le taux de débourrement des bourgeons axillaires. C’est à
cause de leurs bonnes performances, lors des travaux menés par Mostefa Della et
Zitouni, (2010), que ces deux hormones ont été sélectionnées pour conduire cette
expérience.
Généralement, quelle que soit l’hormone employée, les bourgeons des

microboutures connaissent d’abord un léger gonflement au cours des premiers jours
suivant l’ensemencement et finissent par débourrer après une semaine de culture. Cette
55
étape est suivie par l’émergence d’une ou de plusieurs pousses végétatives feuillées à
partir de chaque bourgeon au bout de la quatrième semaine (figure 08 : A, B et C).
Les résultats des expériences montrent qu’il existe, en fonction de la nature de

l’hormone et des doses employées, des réponses différentes vis-à-vis du débourrement
de bourgeons et de l’élongation des pousses. L’analyse des résultats du tableau 10
indique que la BA est plus efficace à l’égard du débourrement des bourgeons que la KN.
En sa présence, le taux de débourrement maximal a pu atteindre les 91,66% avec les
doses de 0,1 et de 0,5 mg/L contre 83,33% obtenu avec l’emploi de 2 mg/L de KN.
De même pour l’élongation des pousses, la BA favorise mieux ce processus

physiologique comparativement à la KN. En effet, l’emploi de 2 mg/L de BA a permis
d’obtenir, après un mois de culture, une moyenne de croissance ou d’élongation de 5,12
cm contre 3, 02 cm avec la KN.
C’est au niveau du nombre moyen de pousses produites par microbouture (ou

explant) où nous n’avons pas noté de différences notables entre les deux cytokinines.
Généralement, les meilleurs rendements ont atteint les 8,20±2,28 pousses par explant,
en présence de 2 mg/L. Cependant, il y a lieu de noter que les pousses régénérées en
présence de BA paraissent bien constitué morphologiquement et sont pourvues de
feuilles chlorophylliennes bien formées contrairement à celles produites en présence de
kinétine (figure 08).
Les cytokinines sont connus pour leur stimulation de la division cellulaire et du

développement des bourgeons axillaires par inhibition de la dominance apical (Auge,
1984 ;Jouanneau, 1975 ;Margara, 1989; Zryd, 1988).
L’efficacité des cytokinines de manière générale à l'égard du débourrement des

bourgeons n’est pas spécifique à la lavande dentée (Lavandula dentata). Certains
auteurs comme Echeverrigaray et al., (2005) ont rapporté l’efficacité de la BA sur la
micropropagation de Lavandula Dentata à partir des bourgeons axillaires. De nombreux
autres auteurs signalent son efficacité sur le microbouturage d’autres espèces de
lavandes comme : Lavandula latifolia (Sánchez-Gras et Calvo, 1996); Lavandula
viridis (Dias et al., 2002) ; Lavandula pedonculata (Zuzarte et al., 2010), Lavandula
stoechas (Nobre, 1996) ou d’autres genres de la famille des lamiacées comme les thyms
56
(Thymus persicus ;Thymus moroderi ;Thymus lotocephalus (Bakhtiar et al., 2014 ;
Marco-Medina et Casas, 2014 ; Coelh, 2012), les Menthes (Mentha Species)
(Banthorpe, 1996) ou les sauges (Salvia brachyodon) (Misic et al., 2006).
Le débourrement des bourgeons axillaires sous l’action des cytokinines est très
fréquent sur de nombreuses autres plantes herbacées telle la pégane (Peganum harmala)
(Kawar et al., 2005) ou ligneuses comme l’olivier (Olea europea) (Bradha et al., 2003),
l’arganier (Argania spinosa L. Skeels) (Ziani, 2014), le chêne (El Kbiach, 2002), le
pistachier (Benmahioul, 2009), etc.
Par ailleurs, il y a lieu de rappeler que, dans notre cas, l’emploi de la BA

surtout à forte concentration n’a pas provoqué l’apparition du phénomène
d’hyperhydricité des pousses régénérées contrairement à d’autres résultats rapportés par
Echeverrigaray et al. (2005) sur Lavandula dentata ; Nobre, (1996) sur Lavandula
stoechas et par Andrade et al. (1999) sur Lavandula vera. Ce phénomène semble, selon
les observations de ces deux derniers auteurs, compromettre sérieusement la
propagation de Lavandula stoechas et Lavandula vera.
Notons par ailleurs que le débourrement des bourgeons ne s’est pas produit
exclusivement sur les milieux à cytokinines, il y a eu même des résultats positifs avec
les milieux témoins M0 (milieux MS dépourvus d’hormones). En effet, les résultats du
débourrement sont très intéressants puisqu’ils ont permis d’obtenir des taux avoisinant
les 90 % (tableau 10). Même observation pour l’élongation, le seul inconvénient
(comparativement aux résultats précédents) que nous avons pu noter concerne le
nombre de pousses régénérées par bouture qui demeure très faible (01pousse par
bouture) comparativement aux résultats obtenus avec les cytokinines.
b. Action des combinaisons (auxine - cytokinine)
D’après les résultats du tableau 10 , les milieux dans lesquels nous avons
mélangé différentes concentrations des cytokinines (BA et KN) avec l’acide naphtalène
acétique (ANA) n’ont pas permis des améliorations notables du taux de débourrement,
de l’élongation des pousses ou du nombre moyen de pousses par explant (microbouture)
par rapport aux résultats obtenus en milieux pourvus de cytokinines seules.
57
Ce sont les combinaisons établies entre (BA * ANA) qui donnent les meilleurs
scores. Les résultats, obtenus après 4 semaines de culture, montrent que la combinaison
(0,5 mg/L de BA * 0,1 mg/L d’ANA) donne un taux de débourrement de l’ordre de
91,66 %. Ce taux est similaire à celui obtenu en employant la BA seule à 0,5 mg/L.
C’est en présence de la combinaison (1mg/L BA * 0,01mg/L ANA) qu’il y a eu une
légère amélioration des résultats du nombre moyen de pousses régénérées par explant
(9,20 ± 1,79 pousses par explant) (figure 08 : D, E et F).
L’effet bénéfique de la combinaison d’une auxine et une cytokinine,

notamment la BA durant la phase de prolifération des bourgeons a été relevée chez
plusieurs autres espèces de lavande : Lavandula latifolia (Calvo et Segura, 1989 ;
Sánchez-Gras et Calvo, 1996), Lavandula dentata (Echeverrigaray et al., 2005).
Dans notre cas, les milieux contenant de l’ANA et la BA stimulent le

débourrement avec toutefois la formation de cals à la base des boutures ensemencées
(Figure 08 : E). Ce genre de résultat corrobore avec celui rapporté par Echeverrigaray et
al., 2005 sur Lavandula dentata. L’induction des cals sur les explants cultivés en milieu
contenant des combinaisons (auxines *cytokinines) est aussi très fréquente et plusieurs
références le confirment : El Kbiach et al., 2002 sur le chêne liège (Quercus suber L),
Saidi et al., 2007 sur le caroubier (Certonia siliqua). La prolifération de cal est induite
par la présence simultanée d’auxine (ANA) et de cytokinine (BA ou KN) (Auge, 1984 ;
Margara ;1989 ;Zrÿd, 1988 ).
En plus du développement de cals, nous avons noté aussi en présence de

certains milieux notamment les M11 et M12 (figure 08 : F) l’apparition du phénomène
d’hyperhydricité des pousses régénérées, phénomène que nous n’avons pas observé sur
les milieux contenant de la BA seule. Ce phénomène, qui semble compromettre
sérieusement la propagation des lavandes, est signalés par de nombreux tels :
Echeverrigaray et al. (2005) sur Lavandula dentata ; Nobre, (1996) sur Lavandula
stoechas et Andrade et al. (1999) sur Lavandula vera. , Lavandula stoechas et
Lavandula vera.
58
Tableau 10. L’effet des concentrations des cytokinines (BA et KN) et des combinaisons
(BA * ANA) et (KN* ANA) sur le débourrement des bourgeons axillaires, l’élongation
et le nombre de pousses par explant de Lavandula dentata après 4 semaines de culture.
Importance des cals: (-): absence ; (+): présence avec Ø ≤ 0,5 cm, (++): 0,5-1 cm,
(+++): 1-1,5 cm.
Taux de Caractéristiques
BA KN ANA
Milieux (mg/L) (mg/L) (mg/L)
débourrement Elongation Nombre de pousses Importance de
(%) (cm) par explant la callogenèse
M0 0 0 0 90,00 1,56 ± 0,75 1,00 ± 0,25 -
M1 0,1 0 0 91,66 2,92 ± 1,13 4,00 ± 1,41 -
M2 0,5 0 0 91,66 2,24 ± 0,21 3,20 ± 1,78 -
M3 1 0 0 83,33 5,12 ± 1,36 3,20 ± 0,83 -
M4 2 0 0 75,00 2,02 ± 0,48 8,20 ± 2,28 -
M5 0 0,1 0 66,66 3,02 ± 1,49 2,60 ± 1,34 -
M6 0 0,5 0 79,16 2,40 ± 0,54 2,40 ± 0,89 -
M7 0 1 0 70,83 0,99 ± 0,13 7,20 ± 2,68 -
M8 0 2 0 83,33 1,08 ± 0,19 8,00± 2,00 -
M9 0,1 0 0,01 75,00 1,80 ± 0,21 7,60 ± 2,19 +
M10 0,5 0 0,01 83,33 1,46 ± 0,32 8,80 ± 2,68 +
M11 1 0 0,01 75,00 1,3 ± 0,26 9,20 ± 1,79 +
M12 2 0 0,01 79,16 1,82 ± 0,19 7,60 ± 2,61 +
M13 0,1 0 0,1 20,83 4,40 ± 1,23 3,20 ± 1,10 ++
M14 0,5 0 0,1 91,66 1,96 ± 0,34 2,80 ± 1,10 ++
M15 1 0 0,1 70,83 1,12 ± 0,23 3,80 ± 1,10 -
M16 2 0 0,1 79,16 1,56 ± 0,30 3,20 ± 1,10 ++
M17 0 0,1 0,01 79,16 1,00 ± 0,19 1,80 ± 0,45 -
M18 0 0,5 0,01 70,83 0,95 ± 0,57 3,20 ± 1,79 -
M19 0 1 0,01 79,16 1,20 ± 0,13 4,40 ± 3,29 -
M20 0 2 0,01 83,33 1,00 ± 0,18 4,80 ± 2,95 -
M21 0 0,1 0,1 87,50 0,70 ± 0,16 3,60 ± 1,67 -
M22 0 0,5 0,1 87,50 1,00 ± 0,41 4,80 ± 1,35 -
M23 0 1 0,1 83,33 1,40 ± 0,13 3,60 ± 1,67 -
M24 0 2 0,1 83,33 1,30 ± 0,21 2,40 ± 0,89 -
59
A B C
D E F F
Figure 08. L’effet des cytokinines seules (A, B et C) et des combinaisons Auxines *
Cytokinines (D, E et F) sur le développement des microboutures obtenues à differents stades.
5.1.2. Aptitude à la régénération par organogenèse
L’organogenèse est la base fondamentale de la multiplication

végétative in vitro, laquelle s’appuie toujours sur la néoformation de méristème
(Margara, 1989). C'est une voie de régénération qui peut être empruntée par les
sélectionneurs en vue d'améliorer la qualité et la quantité des huiles essentielles de
nos lavandes.
L’organogenèse est souvent obtenue en trois phases distinctes : la

callogenèse, la caulogenèse et la rhizogenèse.
L’objectif visé par ce travail, est de régénérer des plantes entières de

Lavandula dentata par organogenèse et/ou embryogenèse somatique. Comme nos
résultats n’ont pas permis d'obtenir des embryons somatiques, nous nous sommes
limités donc, dans cette partie, à présenter uniquement les résultats afférents à la
callogenèse et la caulogenèse. Trois principaux paramètres, connus pour leurs effets
sur ce processus morphogénétique, ont été testés. Il s’agit des régulateurs de
croissance : auxines (ANA et 2,4-D) et cytokinines (ZT, KN et BA) et de trois types
d’explants (hypocotyles, jeunes feuilles et entre-nœuds) prélevés de vitroplants âgés
de 4 semaines de culture.
5.1.2.1. Phase d’induction de la callogenèse
La callogenèse est le phénomène de formation d'amas de cellules par

l'assise génératrice des boutures placées dans les conditions de milieu
favorable (Huglin, 1986). C'est un tissu cicatriciel parenchymateux, tendre et
succulent qui apparaît principalement à la partie inférieure des boutures, mais
également des zones de section des fragments de feuilles et des hypocotyles.
Le suivi de la callogenèse porte à la fois sur la détermination du taux

d’explants callogènes et sur une description qualitative de cals formées (texture,
couleur et taille).
La première observation que nous avons pu faire est que la callogenèse est
induite sur un bon nombre d’explants et dans plusieurs milieux de culture surtout
ceux pourvus d’une combinaison hormonale (auxine * cytokinine). Les premières
proliférations des cals se déclenchent souvent 6 à 10 jours après la mise en culture
de la plupart des explants. Ils commencent d’abord par connaître un léger
gonflement au niveau des zones de blessures puis s’étant par la suite
progressivement aux tissus non lésés de l’explant (figure 09 : A, B, C et D). Parfois
la croissance des cals débute sur les parties se trouvant en contact avec le milieu de
culture puis se généralise sur l’ensemble de l’explant.
Au cours de la callogenèse, certains explants et cals connaissent un

phénomène physiologique majeur qu’est le brunissement (Figure 09 : E et F). Ce
phénomène, résultant de l’oxydation des composés phénoliques des tissus, entrave
sérieusement le développement des cals.
Lors de cette étude nous avons relevé que la nature des explants et la
composition hormonale des milieux de culture, compte parmi les facteurs
déterminants du processus de la callogenèse (tableau 11).
En effet, concernant l’effet de la nature des explants, nous avons noté que
les hypocotyles suivis des entre-nœuds réagissent le mieux à la callogenèse et
donnent des cals plus développés (taille) que ceux produits par les feuilles. Quant au
pourcentage de la callogenèse, les explants ont exprimés quelle que soit leur nature
sur un milieu donné, des taux maximum (100 %).
Nous avons pu constater que malgré l’apparition tardive des cals issus des
d’hypocotyles, ils connaissent une croissance plus rapide et donc plus importante
que ceux produits par les entre-nœuds et les feuilles.
La variation de l’aptitude à la callogenèse en fonction des explants est

connue depuis longtemps (Augé et al., 1989 , Margara., 1989). Les bonnes aptitudes
à la callogenèse manifestées par les hypocotyles et les entre-nœuds sont rapportées
par Chaouche et Abdulhussain (2008) sur Atriplex halimus, et même par Etsé
(2010) sur Zanthoxylum zanthoxyloides Lam.
A B
C D
E F
Figure 9. Induction de la callogenèse sur les explants d’hypocotyles (A et B) et de feuilles (C

et D). L’aspect du phénomène du brunissement des explants et des cals formés (E et F).
Quant à l’effet de la composition hormonale des milieux de culture, on a

observé que les milieux pourvus de cytokinines seules, quelle que soit la nature de
l’explant employé, n’induisent aucune callogenèse. Ce sont les milieux combinant
(auxines * cytokinines) qui favorisent le développement de cals. Les meilleurs taux
de callogenèse (100 %) sont obtenus avec les combinaisons (ANA * KN ou ZT),
surtout les milieux MK7 avec les hypocotyles, MK19 et MZ12 avec les entre-nœuds
et MZ 15 avec les feuilles (tableau 11).
L’inefficacité de l’usage des cytokinines seules pour induire la callogenèse

est rapportée par de nombreux auteurs comme : Dronne et al. (1999) sur le
lavandin ; Saadi et Hamdani (2007) sur Scorpiurus; Gharnit et Ennabili (2009) sur
le caroubier; El yacoubi et al. (2010) sur les agrumes. Cela n’est pas toujours le cas
puisque certains auteurs signalent avoir réussi la callogenèse et l’embryogenèse
somatique à partir de style et stigmate d’oranger en milieu pourvu de BA seule
(01mg/L) (Meziane, 2008).
D’après les résultats du tableau 11, l’induction de la callogenèse se trouve

fortement stimulé lorsque les cytokinines sont combinées aux auxines. Les milieux à
fortes concentrations en auxines stimulent plus la prolifération des cals quelle que
soit la nature et la concentration des cytokinines employées. Les meilleurs taux de
callogenèse (entre 95,83 et 100 %) sont obtenus en présence d’ANA à 0,5 mg/L
(MZ5, MB6 et MK7), suivi du 2,4-D (MZ10, MZ15, MB8 et MK10).
Notons par ailleurs, que la texture des cals varie en fonction de la nature des
cytokinines employées. Les cals produits en présence de ZT et de BA, se
caractérisent en général par une texture friable alors que ceux obtenus avec la KN,
sont de nature compacte.
L’effet de la qualité et de la quantité des régulateurs de croissance sur le

processus de la callogenèse, est connu depuis longtemps (Augé et al., 1989 ,
Margara., 1989). Souvent l’induction de cals nécessite la présence d’auxine.
L’adjonction des cytokinines renforce le pouvoir mitogène des auxines et améliore
les aptitudes callogènes des explants. Cela est rapporté par de nombreux
auteurs comme Dronne (2006) sur le lavandin, Calvo et Segura (1989) sur
Lavandula latifolia, Saidi et al. (2009) sur Aristolochia longa, Haouala et al. (2010)
sur le Gerbera, etc. Cependant, le rapport entre ces deux régulateurs de croissance
change en fonction de plusieurs paramètres comme l’espèce végétale étudiée, la
nature des explants employés, la composition des milieux de base, etc. Sur ce
registre, El Yacoubi et al. (2010) signale que le rapport cytokinines / auxines doit
être faible, dans le cas du Bigaradier et du Poncirier (01mg/L BA et 02 mg/L 2,4-D)
et plus élevé dans le cas du Citrange (5 mg/L BA et 1mg/L 2,4-D).
Tableau 11. L’effet de la combinaison de plusieurs doses d’auxines (ANA, 2,4-D)

et de cytokinines (ZT, BA, KN) sur la callogenèse des hypocotyles, des entre-nœuds
et des feuilles de Lavandula dentata après 4 semaines de culture. Importance des
cals: (-): absence ; (+): présence avec Ø ≤ 0,5 cm, (++): 0,5-1 cm, (+++): 1-1,5 cm.
ZT BA KN ANA 2,4-D Callogenèse Caractéristiques

Milieu
(mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (%) Texture couleur taille
M0 0 / / 0 0 0 / / /
MZ5 0,5 / / 0,5 / 95,83 Fiable Vert-jaunâtre +++
MZ6 1 / / 0,5 / 83,33 Fiable Vert-jaunâtre +++
MZ7 2 / / 0,5 / 94,23 Fiable Vert-jaunâtre +++
MZ10 2 / / / 0,5 69,00 Fiable Vert-brune +++
MB5 / 0,5 / 0,5 / 95,83 Friable Jaunâtre ++
MB6 / 1 / 0,5 / 97,92 Friable Jaunâtre +
MB7 / 2 / 0,5 / 97,92 Friable Jaunâtre +
Hypocotyles
MB8 / 0,5 / / 0,5 93,75 Compact Brune +

MB11 / 0,1 / 0,1 / 93,48 Friable Jaunâtre +
MB12 / 0,5 / 0,1 / 81,25 Friable Jaunâtre +
MK5 / / 0,5 0,5 / 91,49 Compact Jaunâtre +
MK6 / / 1 0,5 / 81,25 Compact Jaune ++
MK7 / / 2 0,5 / 100,00 Compact Jaune +++
MK8 / / 0,5 / 0,5 94,83 Compact Brune +
MK9 / / 1 / 0,5 75,00 Compact Jaune brune +
MK10 / / 2 / 0,5 96,43 Compact Jaune ++
MK12 / / 0,5 0,1 / 70,83 Compact Brune +
MK13 / / 1 0,1 / 72,92 Compact Brune +
MZ12 0,5 / / 0,1 / 100,00 Friable Vert +++
MZ15 0,5 / / / 0,1 76,67 Friable Vert ++
MB15 / 0,5 / / 0,1 90,32 Friable Vert-brune ++
MB17 / 0,01 / 0,01 / 71,00 Friable Vert-brune +
Entrenœuds
MB19 / 0,5 / 0,01 / 27,00 Friable Vert-brune ++

MB20 / 1 / 0,01 / 22,00 Friable Vert-brune +
MK12 / / 0,5 0,1 / 97,22 Compact Vert-Brune ++
MK15 / / 0,5 / 0,1 81,25 Compact Vert-Brune +
MK17 / / 0,01 0,01 / 91,67 Friable Vert jaune +
MK18 / / 0,1 0,01 / 88,89 Friable Vert-jaune +
MK19 / / 0,5 0,01 / 100,00 Friable Vert-jaune +
MK20 / / 1 0,01 / 94,44 Friable Jaune +
MZ12 0,5 / / 0,1 / 86,11 Friable Vert ++
Mz15 0,5 / / / 0,1 100,00 Friable Vert ++
Feuilles
MB12 / 0,5 / 0,1 / 94,44 Friable Vert ++

MB15 / 0,5 / / 0,1 93,33 Friable Vert-Brune ++
MB 19 / 0,5 / 0,01 / 44,00 Friable Vert ++
MK12 / / 0,5 / 0,1 76,67 Compact Brune +
MK19 / / 0,5 0,01 / 72,22 Compact Vert-jaune +
MK20 / / 1 0,01 / 52,78 Compact Vert +
5.1.2.2. Induction et développement de la caulogenèse
Le terme caulogenèse, désigne la néoformation des bourgeons soit

directement sur les explants soit indirectement sur les cals produits au cours de la
phase d’induction. Nous allons rapporter dans ce travail uniquement les résultats
relatifs à la caulogenèse et à la rhizogenèse, deux phases constituant l’organogenèse.
Pour y arriver, nous étions amenés à tester deux principaux paramètres connus pour
leur influence sur ces deux processus morphogénétiques qui sont : la nature des
explants, la composition hormonale du milieu.
Dans le tableau 12, nous avons rapporté uniquement les résultats des
milieux dont la composition hormonale avait permis une induction de bourgeons sur
au moins un type dʼexplant. Au vu des résultats présentés dans ce tableau, il apparaît
que l’obtention de bourgeons adventifs (caulogenèse) est possible chez l’espèce
Lavandula dentata et qu’elle est tributaire à la fois de la composition hormonale de
milieu et de la nature des explants employés.
Les bourgeons néoformés prennent naissance aussi bien sur la surface de

l’explant, sans passer par une phase de callogenèse (caulogenèse directe), que sur les
cals. Pour le premier cas, généralement, après 7 à 10 jours de culture, des zones
verdâtres apparaissent à la surface des explants. On assiste, par la suite, à un
gonflement superficiel de l’épiderme, qui entrainera son déchirement et finira par
créer une petite entrave à travers laquelle sortira les premiers primordia foliaires des
bourgeons néoformés (Figure 10 : A). Quant à la néoformation indirecte, nous
assistons au développement de bourgeons néoformés sur des cals issus d’explant.
Les explants ayant montré des aptitudes caulogènes développent d’abord des cals
puis survient l’apparition de nodules méristèmatiques chlorophylliens qui évoluent
en bourgeons adventifs (Figure 10 : B, C, D et E). L’apparition des premiers
primordia foliaires se fait après 18 jours de l’ensemencement.
a. L’effet de la composition hormonale
La composition hormonale des milieux de culture compte parmi les facteurs

déterminants du processus de la caulogenèse.
Les résultats du tableau 12 montrent que seuls les milieux où sont combinés
les auxines et les cytokinines permettent des réponses favorables à la caulogenèse.
Par contre, aucune réponse n’a été décelée sur les milieux à auxines ou à cytokinines
seules. Les meilleurs taux de caulogenèse (25 %) ont été enregistrés sur le milieu
d’induction MZ12 avec les explants d’entre-nœuds.
Parmi les observations que nous avons pu faire est que parfois les milieux
d’induction servent à la fois à l’induction de cals et de bourgeons mais aussi au
développement de ces bourgeons en pousses végétatives. Les milieux ayant permis
cela contenaient souvent des rapports (auxines / cytokinines) en faveur des
cytokinines. C’est le cas des cals obtenus sur milieu MZ6 où les taux de caulogenèse
sont passés de 20 à 62,50 % (après transfert sur milieu de développement MZ2) et
de 20 à 41,66 % (après transfert sur milieu de développement MZ1). Seulement, il
faut signaler que ces transferts ne conduisent pas tous nécessairement à des
améliorations notables des taux de caulogenèse comme c’est le cas de ceux effectués
sur les milieux à KN.
Le milieu d’induction se révélant à la fois inducteur et permettant le

développement de bourgeons n’est pas nouveau. De nombreux auteurs l’ont signalé
auparavant sur d’autre espèces comme trèfles (Phillips, Collins, 1979) ; le luzerne
(Walker et al., 1979) ; Scorpiurus muricatus ssp (Saadi et Hamdani, 2007).
Les meilleurs résultats de la caulogenèse sont obtenus souvent lorsque le

transfert des cals se fait en milieux à cytokinines seules. Ces derniers permettent de
poursuivre le développement des bourgeons néoformés (figures 10). La ZT et la BA
manifestent un bon pouvoir inducteur vis à vis de la néoformation des bourgeons
(tableau 12).
Des résultats similaires aux nôtres, signalent tout l’intérêt que peut avoir
l’implication des cytokinines dans l’induction de la caulogenèse. C’est le cas de Li
et al. (1986) sur Medicago inpulina ; de L. Vestri et al. (1990) sur Passiflora
coerulea et de Venketeswaran (1990) sur Psophocarpus tetragonolobus. qui
confirment tous l’efficacité des cytokinines à l’égard de la néoformation de
bourgeons.
Dans notre étude, c’est surtout la ZT qui semble posséder les meilleures
performances vis à vis de la caulogenèse comparativement aux autres cytokinines.
Ces résultats corroborent avec les travaux de Sihachakr et al. (1994) ayant porté sur
l’induction et le développement des bourgeons à partir de protoplastes de pomme de
terre douce et par Kpare (1992) sur Acacia raddiana.
b. L’effet de la nature d’explants
Les résultats du tableau 12 montrent que la caulogenèse s’est exprimée avec

les hypocotyles, les entre-nœuds et les feuilles. Ce sont les hypocotyles qui
répondent le mieux à la caulogenèse et donnent les meilleurs résultats (62,50 % sur
le milieu MZ2).
La caulogenèse sʼest exprimée aussi avec les entre-nœuds, mais son

intensité parait moins prononcée quʼavec les hypocotyles. Les rendements
enregistrés oscillent entre 2,86 et 34,67 %, Cependant, avec les feuilles, ce taux a
atteint les 28,76 %
Les potentialités caulogènes différent d’un type d’explant à un autre. Cela

relève des compétences que recèle chaque type d’explant à l’égard de la
morphogenèse. Certains sont réactifs d’autres par contre se montrent récalcitrants
comme l’expliquent Zrÿd (1988) ; Margara, (1989).
Tableau 12. Evolution des taux de caulogenèse selon la composition hormonale des
milieux d’induction (avant transfert ) et de développement (après transfert) et la
nature des explants chez L. dentata. H : hypocotyles ; EN : entrenoeuds et F :
feuilles.
Néoformation de bougeons après transfert sur

Néoformation de bourgeons sur milieu d’induction
milieu de développement
Caulogenèse Nature Milieu de Caulogenèse Nature
Milieu d’induction
(%) d’explant développement (%) d’explant
MZ1
41,66 H
MZ6 (1 mg/L ZT, (0,5 mg/L ZT)
20,00 ± 3,00 H
0,5mg/L ANA) MZ2
62,50 H
(1mg/L ZT)
MZ1
9,01 H
MZ7 (2 mg/L ZT, (0,5 mg/L ZT)
7,5 ± 2,50 H
0,5mg/L ANA) MZ2
8,11 H
(1mg/L ZT)
MZ1
34,67 EN
MZ12 (0,5mg/L ZT, (0,5 mg/L ZT)
25,00 ± 3,00 EN
0,1mg/L ANA) MZ2
(1mg/L ZT)
33,33 EN
MZ1
17,52 F
MZ 12(0,5 mg/L ZT, (0,5 mg/L ZT)
13,86 ± 2,33 F
0,1mg/L ANA) MZ2
17,25 F
(1mg/L ZT)
MB1
2,27 H
MB8 ( 0,5 mg/L BA, (0,5 mg/L BA)
2,22 ± 1,50 H
0,5 mg/L 2,4-D) MB2
2,27 H
(1mg/L BA)
MB1
(0,5 mg/L BA)
11,77 EN
MB 12(0,5 mg/L BA,
10,53 ± 1,90 EN
0,1 mg/L ANA) MB2
10,53 EN
(1mg/L BA)
MB1
26,66 F
MB12 (0,5 mg/L BA, (0,5 mg/L BA)
20,59 ± 3,00 F
0,1 mg/L ANA) MB2
28,76 F
(1mg/L BA)
MB1
2,86 EN
MB19 (0,5 mg/L BA, (0,5 mg/L BA)
2,78 ± 1,00 EN
0,01 mg/L ANA) Mb2
(1mg/L BA)
2,86 EN
MB1
(0,5 mg/L BA)
11,43 EN
MB20 (1 mg/L BA,
2,78 ± 2,00 EN
0,01 mg/L ANA) MB2
2,86 EN
(1mg/L BA)
MK1
18,85 F
MK12 (0,5 mg/L KN, (0,5 mg/L KN)
16,67 ± 2,50 F
0,1 mg/L ANA) MK2
16,80 F
(1mg/L KN)
A B
C D E
F G
Figure 10. Néoformation directe (A) et indirecte (B, C et D) de bourgeons, de pousses

végétatives (E) et de racines (F et G).
5.1.2.3. Induction et développement de la rhizogenèse

Le terme rhizogenése désigne le processus morphologique qui conduit à la
différenciation des racines soit directement sur l’explant soit indirectement sur les cals
produits au cours de la phase d’induction.
Sur les milieux testés pour induire la caulogenèse, on a relevé que certains induisent
plutôt la rhizogenèse. C’est sur les milieux combinant les auxines et les cytokinines que les
racines sont induites à partir de cals. Le tableau 13 présente les milieux ayant induit la
rhizogenèse en fonction de la nature des explants, après 6 semaines de culture.
Généralement, la rhizogenèse commence par s’exprimer à partir de la deuxième

semaine qui suit l’ensemencement des explants. Au début de leur croissance, les racines
démarrent à partir de nodules méristèmatiques sur le cal. Au fil des jours, elles s’allongent
pour différencier des racines entières. Souvent, ces racines prennent des aspects variables et
de coloration blanchâtre à jaunâtre (figure 10 : F, G).
D’après les résultats du tableau 13, ce sont les milieux à ANA combinés aux
cytokinines ZT ou KN (avec un rapport avoisinant 1) qui semblent favoriser la rhizogenèse.
Les meilleures réponses (97,83 %) ont été obtenues avec l’emploi de 0,5 mg/L d’ANA et 0,5
mg/L de ZT (milieu MZ5). Lorsque le rapport ANA / cytokinines est en faveur de ces
derniers, les réponses à la rhizogenèse diminuent comme c’est le cas des milieux MZ7 (02,04
%) et MK18 (31,25 %).
Nous avons relevé aussi que certains milieux étaient favorables à la fois et pour la
caulogenèse et pour la rhizogenèse. En effet, un milieu comme le MZ6 a permis une
caulogenèse de 20 % et une rhizogenèse de 27,5 % (tableaux 12 et 13).
On note par ailleurs que l’emploi du 2,4-D comme source d’auxine n’a pas eu
d’effet sur la rhizogenèse.
Quant à l’effet de la nature des explants sur la rhizogenèse, nous avons constaté que
les hypocotyles réagissent le mieux à ce processus (97,83 %), suivis des entre-nœuds (39,39
%).
L’usage des mélanges (auxines * cytokinines) peut induire une rhizogenèse sur
l’ensemble des explants testés surtout lorsque la balance hormonale est en faveur des auxines.
Ce constat classique, décrit par de nombreux auteurs (Zrÿd, 1989 ; Margara, 1989 ; Augé,
1989), s’est aussi reproduit dans nos expériences sur lavandula dentata. Nous avons relevé
aussi que les transferts de cals, effectués sur des milieux à ANA seules, conduisent toujours à
la formation de racines. Selon Calvo et Segura (1988), l’addition de l’auxine seule aux
milieux d’induction parait plus favorable à l’induction de racines chez L. stoechas et L.
latifolia.
Tableau 13. Aptitude à la rhizogenèse de Lavandula dentata sur les milieux d’induction en
fonction de la nature des explants et la composition du milieu de culture après 6 semaines de
culture.
Composition du milieu
Milieu Nature d’explant Rhizogenèse (%)
(mg/L)
MZ5 0,5 mg/L ZT + 0,5 mg/L ANA H 97,83
MZ6 01 mg/L ZT + 0,5 mg/L ANA H 27,50
MZ7 02 mg/L ZT + 0,5 mg/L ANA H 02,04
MK5 0,5 mg/L KN + 0,5 mg/L ANA H 46,38
MK17 0,01 mg/L KN + 0,01 mg/L ANA EN 39,39
MK17 0,01 mg/L KN + 0,01 mg/L ANA H 36,11
MK18 0,1 mg/L KN + 0,01 mg/L ANA EN 31,25
5.1.3. Aptitudes à l’enracinement des pousses régénérées et leurs
acclimatations
5.1.3.1. Enracinement des pousses
Le succès de la micropropagation, qu’elle soit réalisée via le

microbouturage ou l’organogenèse, nécessite l'induction efficace des racines sur les
pousses régénérées pour pouvoir obtenir des plantes entières.
Pour procéder à l’enracinement des pousses régénérées par microbouturage

ou par néoformation de bourgeons, nous les avons transférées sur des milieux à
composition hormonale variée. Des milieux sans hormones et des milieux pourvus
d’ANA à trois concentrations différentes (0,05, 0, 1 et 1 mg /L). Les résultats de ce
transfert obtenus après six semaines d’exposition sur milieux d’enracinements sont
présentés dans le tableau 14.
Les observations que nous avons pu faire après une semaine de transfert sur
les milieux d’enracinement (quelle que soit leur composition hormonale), est que
des primordias racinaires commencent par apparaître à la base de chaque pousse
(Figure 11). Le taux d’enracinement, la densité et l’élongation des racines varient en
fonction de la composition hormonale des milieux et de la durée d’exposition des
pousses sur ces mêmes milieux (Tableau 14).
En effet, les résultats obtenus, après six semaines d’exposition, montrent

que les meilleurs taux d’enracinement sont obtenus à la fois avec les milieux à
1mg /L d’ANA (94,73 % avec les pousses provenant du microbouturge et (92,33%
avec celles issues de la caulogenèse) et les milieux sans hormone (94 % avec les
pousses provenant du microbouturge et de la caulogenèse). Ces derniers, ont certes
donné des taux élevés d’enracinement mais la densité des racines induites (nombre
de racine par pousse) reste limitée comparativement à celles développées en
présence d’ANA. La densité racinaire était presque 7 à 15 fois plus importante sur
les milieux à ANA que les milieux sans hormone. Quant à l’élongation des racines,
les variations entre les différents milieux n’étaient pas aussi importantes.
Au sujet de l’efficacité des milieux sans hormones sur l’enracinement des
pousses des lavandes, le résultat ne semble pas être nouveau puisque d’autres
auteurs comme Calvo et Segura (1989), Jordan et al. (1998), Sanchez-Gras et Calvo
(1996) et Zuzarte et al. (2010) l’ont signalé auparavant en précisant que les lavandes
sont généralement faciles à s’enraciner. L’enracinement de Lavandula dentata était
spontané et d’après eux aucun ajout d’auxine ne s’avère nécessaire.
Contrairement à ces résultats d’autres travaux rapportent que les traitements

à l’auxine doit être appliqué aux microboutures pour induire l’enracinement. L'ajout
de l’ANA était nécessaire pour atteindre une fréquence élevée d'induction des
racines dans L. stoechas (Nobre, 1996), L. vera (Andrade et al., 1999), L. viridis
(Dias et al., 2002) et L. dentata (Echeverrigarayet al., 2005). L’AIB ainsi que
l’ANA comptent parmi les auxines les plus fréquemment utilisées pour l’induction
de l’enracinement chez d’autres espèces végétales telles que le Quercus, le Castanea
et le Juglans (Schwarz, 1989).
Cela n’a pas était le cas lors de cette étude puisque les milieux sans
hormones ont permis parfois des taux d’enracinement meilleurs sinon proches à
ceux obtenus en présence d’ANA. A ce sujet, il a été constaté que, si les auxines
avaient parfois des conséquences négatives sur l’enracinement, c’était à cause de
leur faible mobilité survenant juste après l’effet inductif qu’elles exercent sur les
pousses et sont plutôt favorable à la callogenèse. Ce constat est rapporté par de
nombreux auteurs comme Auge et al. (1989) et Margara (1989).
Tableau 14 : Aptitude à l’enracinement des pousses régénérées en fonction de la
nature des explants et la composition du milieu après 6 semaines de culture.
Composition
hormonale des Taux Caractéristiques
Origine des pousses milieux d’enracinement
végétatives BA ANA Elongation Nombre de racines
(%)
(mg/L) (mg/L) (cm) par plantule
0 0 93,90 4,00 ± 0,33 0,53 ± 0,19
0 0,05 70,00 3,00 ± 0,21 1,60 ± 0,10
Microbouturage 0 0,1 75,22 3,00 ± 0,80 2,35 ± 0,66
0 1 94,73 4.00 ± 0,83 7,35 ± 0,66
1 0,1 41,11 6,27 ± 1,49 0,93 ± 0,30
0 0 94,00 5,50 ± 0,80 1,00 ± 0,30
0 0,05 74,22 4,50 ± 0,32 2,04 ± 0,53

Caulogenèse
0 0,1 82,00 4,32 ± 0,40 6,00 ± 1,33
0 1 92,33 6,00 ± 0,90 7,00 ± 2,00

A B
C D
Figure 11. Aptitude à l’enracinement des pousses néoformées

5.1.3.2. Acclimatation
Quelle que soit la méthode d’enracinement choisie, les plantes obtenues doivent être
acclimatées (accoutumées) aux conditions extérieures. Cette étape est souvet délicate car il
s’agit pour la plante de passer des conditions d’humidité saturante du tube de culture à celles
de l’extérieures.
Lors de cette étude, nous avons transféré les vitroplants, quelles que soient leurs
voies de régénération, sur des plaques alvéolées en plastique contenant un substrat composé
exclusivement de tourbe stérilisée (pendant 2 heures à 120° C). Les plantules une fois sorties
des tubes à essais, elles sont directement transplantées sur ces alvéoles tout en les couvrant
d’un film plastique afin d’amortir le stress de sevrage (sortie des plantules du tube vers
l’extérieur). Après deux jours du transfert, le film plastique est enlevé et les plantules
séjourneront dans la chambre de culture pendant deux semaines dans des conditions de
température de 23 ± 2 °C et une photopériode de 16/8. Pendant ce temps, les plantules sont
arrosées régulièrement par une solution de MS diluée.
Après 2 semaines, les plantules sont transplantées dans des pots, contenant de la
tourbe stérile, et placées dans une serre en plastique. L’arrosage est toujours assuré avec la
solution MS/2.
Les résultats d’acclimatation ont montré que les plantules de Lavandula dentata,
issues des différents milieux s’adaptent difficilement (tableau 15). Ce sont les plantules
issues de microbouturage qui réussissent le mieux leur adaptation (figure 12). Environ 51 %
des plantules transférées flétrissent au bout de la première semaine de transfert et finissent par
mourir. Les 49 % restantes s’acclimatent et terminent leur croissance et développement.
Ce sont surtout les plantules issues de caulogenèse qui paraissent plus fragiles
comparativement aux plantules issues du microbouturage. En effet, le taux de réussite est de
27.77 % contre 58,78 pour les plantules microbourées.
Les vitroplants développés sur les milieux ont réussi à avoir un développement
important de la partie aérienne et la partie racinaire. Aucun signe de malformation n’a été
observé sur les vitroplants acclimatés (Figure 12).
D’après Auge (1989), les facteurs de réussite de l’acclimatation sont basés surtout
sur le contrôle des conditions extérieures. Le mélange 2/3 tourbe et 1/3 sable (ou perlite) est
fréquemment employé comme substrat d’acclimatation. En plus, l’humidité relative est l’un
des facteurs le plus important. Passant d’un microclimat strictement contrôlé au climat d’une
serre, le plant doit être placé le plus rapidement possible dans une atmosphère à humidité
relativement élevée et bien contrôlée.
Les taux de survie que nous avons obtenu corroborent avec ceux annoncés par Jordan
et al,. (1998) et qui sont de l’ordre de 55 %. Ils sont cependant inférieurs à ceux rapportés par
Echeverrigaray et al. (2005), qui signalent avoir atteint des taux de 87 % avec l’espèce
Lavandula dentata. La qualité du système racinaire est crucial pour une bonne acclimatation
de sorte que ces résultats pourraient être expliqués par des différences dans la stratégie
d'enracinement. Jordan et al., (1998) ont utilisé un milieu exempt d'auxine alors que
Echeverrigaray et al., (2005) ont utilisé l’ANA pour augmenter significativement le nombre
de racines.
Tableau 15: Présentation des taux de survie des plantules après 6 semaines
d’acclimatation.
Nombre de plantules Nombre de Taux de Taux de survie

transférées plantules survies mortalité après 6 semaines
Microbouturage 45 26 42,22 57,78
Caulogenèse 18 5 72,22 27,78
Taux de
49,21
survécu globale
.
B C
D E
Figure 12: Aspect des plantules régénérées in-vitro à différents stades de développement au
cours de la phase d’acclimatation.
5. 2. Analyse de la conformité génétique des pousses régénérées

par Marqueurs RAPD
L’objectif visé par cette étude est de procéder à l’analyse de la conformité

génétique des plants régénérés par organogenèse par rapport à la plante-mère (plante
ayant servi comme source d’explant) en utilisant des marqueurs moléculaires RAPD.
5.2.1. Evaluation de la qualité et de la quantité d’ADN
Lors de cette étude deux protocoles d’extraction d’ADN ont été testés. Le
premier, décrit par Doyle et Doyle (1987) modifié, est classique et le second, emploi
un Kit commercial dénommé « Extract-N-AmpTM Plant PCR Kit » .
L’extraction et la purification des acides nucléiques sont les premières

étapes dans la plupart des études de biologie moléculaire. L’objectif des méthodes
d’extraction dans le cas présent est d’obtenir des acides nucléiques purifiés, afin de
pouvoir mener une analyse RAPD en utilisant la réaction de polymérisation en
chaîne (PCR).
La qualité et la pureté des acides nucléiques comptent parmi les facteurs

les plus critiques pour l’analyse PCR. L’intégrité des ADN extraites a été estimée à
partir des profils électrophorétiques obtenus sur gel d’agarose et aussi par analyse
spectrophotométrique.
5.2 .1.1. Evaluation par Spectrophotométrie
Les résultats des tableaux 16 et 17 montrent que la quantité d’ADN extraite

varie selon la méthode d’extraction employée. Avec la méthode classique (Phénol
/Chlorophorme), les concentrations en ADN étaient moyennes à faible (628 à 996
ng/µL) alors qu’avec le kit commercial, elles ont atteint des valeurs oscillant entre
de 1032 ng/µL et 1700 ng/µL.
Les valeurs des rapports de DO260nm/DO280nm de nos extraits d’ADN, quelle

que soit la méthode d’extraction employée, sont aussi inférieures (égale ou proche
de 1) aux intervalles indiquant la pureté de l’ADN. Selon Barbosa (1998), l'ADN
pur donne un rapport DO260nm/DO280nm de 1,8 à 2,0. Lorsque ce rapport est inférieur
à 1,6, il indique une contamination des extraits par des protéines et / ou d'autres
contaminants et lorsqu’il est supérieur à 2,0 indique que les extraits soient
contaminés par le chloroforme ou le phénol.
5.2.1.2. Evaluation par électrophorèse sur gel d'agarose
La comparaison des profils d’électrophorèse (figure 13 A et B) montre que

l’ADN extrait par kit commercial (Kit Extract-N-Amp TM plant PCR) génère des
bandes de qualité meilleure que celles générées par l’ADN extrait par le protocole
décrit par Doyle et Doyle (1987) modifié. Les extraits d’ADN obtenus par le
protocole classique avaient un aspect visqueux, de couleur brunâtre. L’aspect
brunâtre est certainement dû à des impuretés.
Les impuretés constatées dans nos extraits d’ADN peuvent être expliquées
par la présence de contaminants tels que les polyphénols et les polysaccharides et
une possibilité de contamination par les protéines (Sambrook et Russel, 2001). Les
composés phénoliques s'oxydent lors de l'extraction et interagissent de manière
irréversible avec les protéines et les acides nucléiques pour former une matrice
gélatineuse. Cette matrice pourrait empêcher l'extraction et une amplification
correcte de l’ADN (Sousa et al., 2012). Ils induisent aussi des oxydations et des
dégradations de l'ADN (Dabo et al., 1993).
Divers autres métabolites végétales et des contaminants co-purifiés

introduits par la procédure de purification, tels que le sel ou le phénol, peuvent
conduire à des résultats incohérents. Ils peuvent causer l’inhibition des réactions
enzymatiques, la modification de la mobilité électrophorétique et la dégradation de
l'acide nucléique au cours du stockage (Fang et al., 1992).
Au cours de l'extraction de l'ADN, les polysaccharides peuvent coprécipiter

avec l'ADN après addition d'alcool, qui forment des solutions hautement visqueuses
(Do et Adams, 1991). La contamination par les polysaccharides peut inhiber
l'activité de la Taq polymérase (Fang et al., 1992). Les composés aromatiques
peuvent aussi interférer avec des réactions d'amplification d'ADN (Khan et al.,
2004).
Bien que plusieurs protocoles d'extraction d'ADN, qui sont utilisés avec
succès pour des espèces végétales contenant les polysaccharides et les polyphénols,
ont été développés, aucun d'entre eux sont universellement applicables à toutes les
plantes (Varma et al., 2007).
Dans la plupart des cas, les tissus frais sont utilisés pour l'extraction des
acides nucléiques, car la dégradation et d'autres processus biochimiques
commencent immédiatement une fois le tissu retiré de son environnement (Abu
Almakarem, 2012).
Tableau 16 : Evaluation de la qualité et la quantité des ADN extraits des feuilles de

pousses régénérées par caulogenèse de L. dentata suivant le protocole classique
décrit par Doyle et Doyle (1987) modifié.
Quantité
DO230 DO260 DO280 DO260/DO280 DO260/DO230
(ng/µL)
P01 0,331 0,249 0,254 0,98 0,75 996,00
P02 0,211 0,164 0,152 1,08 0,78 656,00
P03 0,200 0,157 0,147 1,07 0,79 628,00
P04 0,200 0,158 0,147 1,07 0,79 632,00
PM 0,251 0,195 0,190 1,03 0,78 780,00
Tableau 17 : Evaluation de la qualité et la quantité des ADN extraits des feuilles de

pousses régénérées par caulogenèse de L. dentata suivant le protocole du Kit
« Extract-N-AmpTM Plant PCR Kit ».
Quantité
DO230 DO260 DO280 DO260/DO280 DO260/DO230
(ng/µL)
P01 0,697 0,302 0,320 0,94 0,43 1208,00
P02 0,644 0,259 0,236 1,10 0,40 1036,00
P03 0,750 0,343 0,366 0,94 0,46 1372,00
P04 0,668 0,258 0,247 1,04 0,39 1032,00
PM 0,902 0,425 0,450 0,94 0,47 1700,00
P01 P02 P03 P04 PM P01 P02 P03 P04 PM

A B
Figure 13 : Evaluation de la qualité des ADN sur gel d’agarose extraits de feuilles de pousses
régénérées par caulogenèse de L. dentata (A) : Migration des ADN extraits suivant le
protocole décrit par Doyle et Doyle (1987) modifié, (B) Migration des ADN extraits suivant
le protocole du Kit « Extract-N-AmpTM Plant PCR Kit ».
5.2.2 Analyse des profils électrophorétiques
Cette partie du travail a été réalisée dans le but d’évaluer la variation

génétique probable qui peut exister d’abord entre la plante-mère et les plants
régénérés via l’organogenèse (par néoformation de bourgeons) puis entre les plants
régénérés in-vitro eux même.
5.2.2.1 Par rapport aux amorces

Au total, 8 amorces décamères arbitraires RAPD ont été testées pour
vérifier la stabilité génétique entre la plante-mère (PM) et les 4 plants dénommées
(P01, P02, P03 et P04) régénérés par organogenèse sur des milieux de culture à
composition hormonale variée.
Sur les 8 amorces employées, seules 5 ont pu générer des profils

génomiques clairs et exploitables (figures 14 et 15). Les résultats présentés dans le
tableau 18 montrent que le nombre de bandes amplifiées varie selon l’amorce
employée. Le nombre maximal de bandes amplifiés (10) a été obtenu avec l’amorce
OPA-04, suivie de l’OPA-03 avec 8 bandes ; de l’OPA-01 et OPA-10 avec 4
bandes, chacune et enfin de l’OPW-12 avec seulement 2 bandes. La taille de tous les
fragments amplifiés (bandes) se situe entre 100 et 1600 pb.
Toujours selon les résultats du tableau 18, nous constatons que les amorces
OPA-01, OPA-03, OPA-04 et OPA-10 ont toutes générées des bandes polymorphes.
Sur les 28 bandes générées au total, 16 sont polymorphes. Seule l’amorce APW-12 a
donné des bandes totalement monomorphes (aucun polymorphisme) dont les tailles
sont comprises entre 160 et 290 pb.
Le polymorphisme généré par les amorces OPA-01, OPA-03, OPA04 et

OPA-10 peut être le résultat des modifications soit dans la séquence du site de
liaison des amorces ou des changements qui modifient la taille empêchant ainsi la
réussite de l’amplification d’un ADN cible (ex. insertion, délétion, inversion)
(Modgil et al., 2005).
Tableau 18 : Analyse des profils RAPD en termes de nombre de bandes amplifiées,

pourcentage de polymorphisme pour les différentes amorces utilisées avec
l’ensemble des plants régénérés in-vitro. P01, P02, P03, P04 : Les différentes plants
régénérés ; PM : Plante-mère.; NBT : Nombre total des bandes ; NBP : Nombre de
bandes polymorphes ; NBM : Nombre de bandes monomorphes ; TB : Intervalle de
taille des bandes (pb) ; P (%) : pourcentage de polymorphisme (%) ; M (%) :
Pourcentage de monomorphisme (%).
NBT NBP
Amorces
P01 P02 P03 P04 PM P01 P02 P03 P04 PM
OPA-01 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1
OPA-03 5 7 5 5 5 1 3 1 1 1
OPA-04 7 4 4 6 6 5 2 2 4 4
OPA-10 2 4 4 2 2 0 2 2 0 0
Opw-12 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0
NBT 19 20 18 18 18 7 8 6 6 6
Séquences NBT TB NBP P (%) NBM M (%)
OPA-01 5’CAGGCCCTTC3’ 4 130-1000 2 50,00 2 50,00
OPA-03 5’AGTCAGCCAC3’ 8 240-660 4 50,00 4 50,00
OPA-04 5’AATCGGGCTG3’ 10 100-1600 8 80,00 2 20,00
OPA-10 5’GTGATCGCAG3’ 4 130-1000 2 50,00 2 50,00
Opw-12 5’TGGGCAGAAG3’ 2 160-290 0 0,00 2 100,00
5.2.2.2 Par rapport aux plants régénérés
A la lecture des résultats du tableau 19 et les figures 14 et 15, l’analyse du

polymorphisme par les marqueurs RAPD montre qu’il existe une variabilité (un
polymorphisme) entre les différents plants analysés. Le taux de polymorphisme le
plus élevé a été enregistré avec le P02 (40 %), suivi du P01 (36.84 %,). la Plante-
mère, le P03 et le P04 ont enregistré un taux de polymorphisme de l’ordre de
33.33%.
C’est avec le variant P02 que nous avons enregistré le maximum de bandes
(20) (total des bandes générées par l’ensemble des amorces) dont 8 sont
polymorphes (tableau 19). Il est suivi du P01 avec un total de 19 bandes dont 7
polymorphes et des variants P03, P04 et la plante mère (PM) qui génèrent 18 bandes
dont 6 sont polymorphes pour chacun d’eux.
Nous avons noté aussi que les tailles des différentes bandes générées
varient entre 100 pb et 1600 pb pour l’ensemble des plants testés. Cependant, il y a
lieu de rappeler que certaines bandes étaient spécifiques à certains variants. C’est le
cas par exemple du variant P01 qui a généré deux bandes spécifiques de 1550 pb et
1600 pb (obtenu avec OPA-04), du P02 (300 pb, 390 pb et 510 pb, avec l’OPA-03)
et de la plante-mère (100 pb avec l’OPA-04).
Tableau 19 : Résumé des profils RAPD des 5 échantillons (les plants régénérés et la
plante-mère) générés par l’ensemble des amorces employées. P01, P02, P03 et P04 :
les différents plants régénérés ; PM : Plante-mère.
Description P01 P02 P03 P04 PM

Nombre total de bandes 19 20 18 18 18
Nombre de bandes monomorphes 12 12 12 12 12
Nombre de bandes polymorphes 7 8 6 6 6
Pourcentage de polymorphisme 36,84 40,00 33,33 33,33 33,33
Nombre des amorces utilisées 5 5 5 5 5
Polymorphisme moyen par amorce 1,4 1,6 1,2 1,2 1,2
Nombre moyen de bandes par amorce 3,8 4 3,6 3,6 3,6
Intervalle de taille des bandes obtenues 120-1600 120-1000 120-1000 120-1000 100-1000
1500pb
1000pb
1000pb
900pb
800pb
700pb 500pb
600pb
500pb 400pb
400pb 300pb
300pb 200pb
200pb 100pb
100pb
M P01 P02 P03 P04 PM M P01 P02 P03 P04 PM
A B
Figure 14 : Diagrammes électrophorétiques RAPD des 5 échantillons (les plants régénérés et

la plante-mère) générés par les deux amorces (A) : OPA-10 et (B) : OPW-12. P01, P02, P03,
P04 : les différents plants régénérés in vitro ; PM : plante-mère ; M : marqueur de taille (DNA
Ladder 100pb) ; pb : paire de bases.
Figure 15: Diagrammes électrophorétiques RAPD des 5 échantillons (les plants régénérés et
la plante-mère) générés par les trois amorces (A) : OPA-01 ; (B) : OPA-03 et (C) : OPA-04.
P01, P02, P03, P04 : les différents plants régénérés in vitro ; PM : plante-mère ; M : marqueur
de taille (DNA Ladder 100pb) ; pb : paire de bases.
5.2.3 Analyse des clusters
L'empreinte génétique est largement utilisée pour détecter la variation

somaclonale et d'évaluer l'identité génétique et la stabilité dans les vitrocultures. Sur
la base des données RAPD, un dendrogramme, réalisé pour les 5 échantillons (4
plants régénérés in vitro et la plante-mère) à l’aide du logiciel PAST (méthode
CLUSTER ANALYSIS), a permis de visualiser la position relative de chaque variant
dans notre collection (Figure 16). Une matrice de similarité entre la plante–mère et
les 4 plants régénérés in-vitro (variants) a été calculée en utilisant le coefficient de
similarité de JACCARD pour obtenir un coefficient de corrélation de similitude
entre chaque paire des échantillons utilisés (Tableau 20).
La classification hiérarchique des marqueurs moléculaires RAPD a permis

de distinguer deux grands groupes avec un indice de similarité supérieure à 60 %
(figure 16). Chaque Cluster regroupe des plants génétiquement proches. Le premier
Cluster (C01) se divise en deux sous-groupes avec une similarité d’environ 65 %. Le
premier sous-groupe est formé de la plante mère (PM) et le P04 avec une
ressemblance de 89 %. Alors que le deuxième sous-groupe est représenté seulement
par le P01. Le deuxième Cluster (C02) comprend les plants P02 et P03 avec
similarité de 72 %.
Bien que le dendrogramme a donné une relation entre les différents clones,
la matrice de similarité et de distance génétique a fourni une meilleure résolution de
cette relation entre les plants régénérés in-vitro et la lignée parentale qu’est la plante-
mère (tableau 20).
D’après la lecture du tableau 20, la similitude la plus proche est celle

observée entre la plante mère et le P04 (89.47 %). C’est le P02 qui semble être le
plus éloigné par rapport à la plante mère puisqu’il présente un taux de similarité de
l’ordre 52 % (donc un taux de variabilité de 48 %).
La variabilité qui existe entre la plante mère et le P04 d’une part et la plante
mère et les autres plants (P01, P03 et P02) peut être liée à la composition hormonale
des milieux de culture dont ils sont issus (régénérés). En effet, si nous analysons la
composition hormonale du milieu ayant donné le P04 (plante la plus proche à la
PM), nous constatons qu’il comprend de l’ANA à 0,1 mg/L et 0,5 mg/L de ZT,
alors que le P02 qui présente une grande variabilité avec la plante mère est obtenu en
milieu contenant 0,5 mg/l d’ANA et 1 mg/l de ZT c’est à dire en milieu qui contient
5 fois plus d’ANA et deux fois plus de ZT. Il est fort probable donc à ce que les
fortes concentrations en ANA et de la ZT sont derrière cette forte variabilité
génotypique.
Figure 16 : Dendrogramme de similarité et de distance génétique entre les quatre

somaclones et la plante mère (PM) régénéré par CLUSTER ANALYSIS basé sur l’indice de
similarité de JACCARD (Logiciel PAST) en fonction des profils éléctrophorétiques obtenus
par les marqueurs RAPD. P01: 0.5 mg/L BA + 0.5 mg/L ANA (MB8) ; P02 : 01 mg/L Zn +
0.5 mg/L ANA (MZ6) ; P03 : 0.5 mg/L Kn + 0.1 mg/L ANA (MK12) ; P04 : 0,5 mg/L Zn +
0.1 mg/L ANA (MZ1).
Tableau 20 : Matrice de similarité et de distance génétique entre les échantillons
analysés (les plants régénérés in-vitro et la plante-mère) (Indice de JACCARD,
Logiciel PAST).
P01 P02 P03 P04 PM

P01 1 0,56 0,6087 0,68182 0,6087
P02 0,56 1 0,72727 0,52 0,52
P03 0,6087 0,72727 1 0,71429 0,71429
P04 0,68182 0,52 0,71429 1 0,89474
PM 0,6087 0,52 0,71429 0,89474 1
Les cellules végétales cultivées in vitro sont connues pour être sensibles à
des variations génomiques ou somaclonales. Des facteurs tels que le génotype, la
durée de la culture, des conditions de culture, le type et la concentration de
l'hormone utilisée dans le milieu, peuvent affecter cette variation somaclonale (Bairu
et al., 2006 ; Kaeppler et al., 2000 ; Evans et al., 1984). Autres facteurs, y compris
les modifications génétiques et épigénétiques pourraient aussi être impliqués dans
ces variations (Kaeppler et al., 2000).
En général, les cultures issues de microbouturage, d’apex ou de méristèmes

sont moins exposées à ces variations (Rout et al., 1998) que ceux issues de
caulogenèse ou de l’embryogenèse somatique ( al- Zahim et al., 1999 ; Yang et al.,
1999).
Selon Mohanty et al. (2008), l’analyse RAPD a révélé des bandes

monomorphes montrant l'absence de polymorphisme dans les cinquante régénérants
analysés, confirmant ainsi l'uniformité génétique entre les somaclones issus de
bourgeonnes axillaire de Zingiber officinale. L’étude de Jikku et al. (2012) montre
l’efficacité des marqueurs RAPD dans la détection des variations qui peuvent
survenir à la suite d’induction de cals à partir d’explants foliaires de Jotropha
curcas.
La variation peut être une conséquence de la contrainte intrinsèque dans la
déprogrammation cellulaire induite par les régulateurs de croissance des plantes. Les
fortes concentrations en auxines et en cytokinines sont les facteurs les plus
impliqués dans le processus de variabilité génotypique particulièrement chez les
plantes régénérées in vitro (Martin et Pachathundkandi, 2006 ; Zryd, 1988, Margara,
1989). Sur ce même registre, George et Sherrington (1984), signalent que les fortes
concentrations de régulateurs de croissance à moyen et long terme de la culture sont
les principales causes de la variation dans les plantes cultivées in vitro. Même à des
niveaux optimaux, la multiplication à long terme peut souvent conduire à des
variations somaclonales dans les plantes micropropagés.
Les fortes concentrations en auxines ou en cytokinines créent des

conditions de stress (stress auxinique) lors de la micropropagation. A ce moment le
génome est anormalement reprogrammée et son expression peut être remise à zéro
ou peut ne pas suivre la même séquence ordonnée qui se produit dans des conditions
normales (Jain, 2001). Les plantes régénérées sous un tel environnement stressant
peut participer à la réinitialisation de l'ADN ou de restructuration qui peut donner
lieu à une variabilité au niveau génomique (Zhao et al., 2005).
Selon Mohanty et al. (2008), l’analyse RAPD a révélé des bandes

monomorphes montrant l'absence de polymorphisme dans les cinquante régénérants
analysés, confirmant ainsi l'uniformité génétique entre les somaclones issus de
bourgeonnes axillaire de Zingiber officinale. L’étude de Jikku et al. (2012) montre
l’efficacité des marqueurs RAPD dans la détection des variations qui peuvent
survenir à la suite d’induction de cals à partir d’explants foliaires de Jotropha
curcas.
La variation peut être une conséquence de la contrainte intrinsèque dans la

déprogrammation cellulaire induite par les régulateurs de croissance des plantes. Les
fortes concentrations en auxines et en cytokinines sont les facteurs les plus
impliqués dans le processus de variabilité génotypique particulièrement chez les
plantes régénérées in vitro (Martin et Pachathundkandi, 2006 ; Zryd, 1988, Margara,
1989). Sur ce même registre, George et Sherrington (1984), signalent que les fortes
concentrations de régulateurs de croissance à moyen et long terme de la culture sont
les principales causes de la variation dans les plantes cultivées in vitro. Même à des
niveaux optimaux, la multiplication à long terme peut souvent conduire à des
variations somaclonales dans les plantes micropropagés.
Les fortes concentrations en auxines ou en cytokinines créent des

conditions de stress (stress auxinique) lors de la micropropagation. A ce moment le
génome est anormalement reprogrammée et son expression peut être remise à zéro
ou peut ne pas suivre la même séquence ordonnée qui se produit dans des conditions
normales (Jain, 2001). Les plantes régénérées sous un tel environnement stressant
peut participer à la réinitialisation de l'ADN ou de restructuration qui peut donner
lieu à une variabilité au niveau génomique (Zhao et al., 2005).
Conclusion
Conclusiuon
Conclusion
La promotion et la valorisation de la filière des plantes aromatiques et

médicinales (PAM) peuvent jouer un rôle déterminant dans le développement socio-
économique d’un pays. Il existe plus de 300 espèces végétales à usage thérapeutique
et aromatique, parmi les 3150 espèces que compte l’Algérie. Malgré leur
importance, ces ressources n’ont jamais fait l’objet d’une attention particulière de la
part des professionnels ou des scientifiques en vue de les préserver et de les
valoriser.
L’objectif de la présente contribution entre dans ce contexte et visait à

régénérer in vitro une plante sauvage qui fait partie de la grande panoplie des PAM
que possède le pays. La plante en question est Lavandula dentata, une espèce
spontanée à grande valeur ajoutée.
La présente étude ambitionnait donc de régénérer in vitro de plantes

entières de lavande dentée (Lavandula dentata) selon deux modes de multiplication :
le microbouturage (multiplication conforme) et l’organogenèse et/ou
l’embryogenèse somatique (multiplication non conforme). L’étude visait aussi à
contrôler la conformité génétique des plants régénérés via l’organogenèse et/ou
l’embryogenèse en employant des marqueurs moléculaires RAPD. Nous résumons,
dans ce qui suit (en deux parties distinctes) les résultats relatifs à la
micropropagation et aussi au contrôle de la conformité.
1- Les résultats de la micropropagation
1.1 - Sur la multiplication via le microboutrage, les résultats étaient très

intéressants. Le facteur qui s’est montré déterminant sur le taux de débourrement et
d’élongation des pousses régénérées est la composition hormonale des milieux de
culture. En effet, c’est avec l’apport de la BA seule, aux doses de 0.1 à 0.5 mg/L,
que les meilleurs taux de débourrement des bourgeons chez Lavandula dentata
(variant entre 83.33 et 91.66 %) ont été obtenus. De même pour l’élongation des
pousses, c’est toujours la BA appliquée à 1 mg/L qui donne les meilleurs résultats
(5,12 cm) au bout de 4 semaines de culture. Aussi, le nombre moyen des pousses
93
Conclusiuon
régénérées par bouture augmente avec la concentration en BA. L’emploi de 2 mg/L

de BA a permis d’atteindre des moyennes de 8,20 pousses par bouture.
Même l’utilisation de certaines combinaisons entre BA et ANA ont permis

d’obtenir des résultats très intéressants. A titre d’exemple, les taux de débourrement
ont pu atteindre les 91.66 % sur des milieux contenant 0,5 mg/L BA et 0,1mg/L
ANA. Quant au nombre de pousses régénérées par bouture, c’est la combinaison
1mg/L BA, 0.01mg/L ANA qui apparaît favorable en donnant un nombre moyen de
9,20 pousses par bouture. Par contre, la concentration de 0.1 mg/L BA et 0.1 mg/L
ANA favorise plus l’élongation des pousses (4.4 cm après 4 semaines de culture).
Sur les milieux témoins (milieu MS dépourvu d’hormones), les résultats du

débourrement sont très intéressants puisqu’ils ont permis d’obtenir des taux
avoisinant les 90 %. Même observation pour l’élongation. Le seul inconvénient
(comparativement aux résultats précédents) que nous avons pu relever concerne le
nombre de pousses régénérées par bouture qui reste très faible (1 pousse par
bouture).
1.2 - Pour la multiplication via l’organogenèse, nous nous sommes limités

dans cette conclusion a présenté seulement les résultats relatifs à la caulogenèse et à
l’enracinement des pousses régénérées.
C’est par la voie de la caulogenèse que nous avons réussi à obtenir la

néoformation de bourgeons adventifs qui se sont développés par la suite en pousses
végétatives. La composition hormonale s’est montrée de nouveau très influente sur
la caulogenèse. Les meilleurs taux (de caulogenèse) sont obtenus sur le milieu
d’induction MZ12 (0.5 mg/L ZT, 0.1mg/L ANA) (25%) avec les explants d’entre-
noeuds. Les cals induits sur certains milieux contenant une combinaison (ZT *
ANA) voient leur taux de caulogenèse augmenter après leur transfert sur des milieux
« dits de développement » contenant 1 mg/L de zéatine (62,50 %) et 0.5 mg/l de
zéatine (41,66 %). La BA et la KN manifestent aussi un pouvoir inducteur vis à vis
de la néoformation des bourgeons mais qui reste en deçà des résultats obtenus avec
la ZT.
94
Conclusiuon
Lors de ce travail, nous avons relevé aussi que la part d’influence de la

nature des explants sur la caulogenèse n’est pas négligeable. Les explants les
hypocotyles ont montré les meilleures aptitudes caulogènes comparativement aux
entre-nœuds et aux feuilles.
1.3 - Le succès de la micropropagation, qu’elle soit réalisée via le

microbouturage ou l’organogenèse, nécessite l'induction efficace des racines sur les
pousses régénérées pour pouvoir obtenir des plantes entières.
Les résultats récoltés, après six semaines du transfert des pousses régénérées via le
microbouturage ou la caulogenèse sur des milieux « dits d’enracinement » (milieux sans
hormones ou contenant diverses doses d’ANA), montrent que les meilleurs taux
d’enracinement sont obtenus sur les milieux pourvus d’ANA à 1mg /L (94,73 % avec les
pousses provenant du microbouturge et 92,33 % avec celles issues de la caulogenèse) et les
milieux sans hormone (94 % avec les pousses provenant du microbouturge et de la
caulogenèse). Ces derniers, ont certes donné des taux élevés d’enracinement mais la densité
des racines induites (nombre de racines par pousse) reste limitée comparativement à celles
développées en présence d’ANA. La densité racinaire était presque 7 à 15 fois plus importante
sur les milieux à ANA que les milieux sans hormone.
L’essai d’acclimatation a montré que les plantules de Lavandula dentata, issues des différents
milieux s’acclimatent difficilement, 51% flétrissent à partir de la première semaine. Les
plantules de lavande, issues de microbouturage, n’ont pas de problèmes d’adaptation ex vitro.
En effet, le taux de réussite des plantes transplantées est de 58.78 %. Au contraire, les plantes
néoformées par organogénèse semblent être plus fragile que celles issues de microbouturage.
2. Concernant le contrôle de la conformité génétique des vitroplants régénérés par

caulogenèse par rapport à la plante mère, par l’utilisation de la technique des marqueurs
RAPD (pour la première fois dans notre laboratoire), nous a permis d’obtenir des résultats très
intéressants. En effet, grâce à cette technique dans laquelle 8 amorces décamères ont été
utilisées, nous avons pu mettre en évidence l’existence d’une variation somaclonale
(polymorphisme) au sein des vitroplants étudiés.
Sur les 8 amorces employées, seules 5 ont pu générer des profils

génomiques clairs et exploitables. Nous avons relevé que les amorces OPA-01,
95
Conclusiuon
OPA-03, OPA-04 et OPA-10 ont toutes générées des bandes polymorphes. Sur les
28 bandes générées au total, 16 sont polymorphes. Seule l’amorce APW-12 a donné
des bandes totalement monomorphes (aucun polymorphisme) dont les tailles sont
comprises entre 160 et 290 pb.
Le taux de polymorphisme le plus élevé a été enregistré avec le P02 (40 %),
suivi du P01 (36.84 %,). La plante-mère, le P03 et le P04 ont enregistré un taux de
polymorphisme de l’ordre de 33.33 %.
C’est avec le variant P02 que nous avons enregistré le maximum de bandes
(20) (total des bandes générées par l’ensemble des amorces) dont 8 sont
polymorphes. Il est suivi du P01 avec un total de 19 bandes dont 7 polymorphes et
des variants P03, P04 et la plante mère (PM) qui génèrent 18 bandes dont 6 sont
polymorphes pour chacun d’eux.
L’analyse de la matrice de similarité entre la plante–mère et les 4 plants

régénérés in-vitro (variants) nous a permis de distinguer deux grands groupes avec
un indice de similarité supérieure à 60 %. Le premier groupe (Cluster) se divise en
deux sous-groupes avec une similarité d’environ 65 %. Le premier sous-groupe est
formé de la plante mère (PM) et le P04 avec une ressemblance de 89 %. Alors que le
deuxième sous-groupe est représenté seulement par le P01. Le deuxième groupe
comprend les plants P02 et P03 avec similarité de 72 %.
L’analyse de la matrice de similarité nous a permis de confirmer que la

similitude la plus proche est celle observée entre la plante mère et le P04 (89.47 %).
C’est le P02 qui semble être le plus éloigné par rapport à la plante mère puisqu’il
présente un taux de similarité de l’ordre 52 % (donc un taux de variabilité de 48 %).
La variabilité qui existe entre la plante mère et le P04 d’une part et la plante
mère et les autres plants (P01, P03 et P02) peut être liée certainement à la
composition hormonale des milieux de culture dont ils sont issus (régénérés).
En guise de conclusion nous pouvons dire qu’il serait très intéressant de

reproduire dans l’avenir cette étude pour confirmer certains résultats très probants et
tester également d’autres paramètres connus pour leur influence sur la
96
Conclusiuon
micropropagation comme : la nature des explants (autres types d’explants), la nature

des sucres, les milieux de base (autres que le milieu MS), les acides aminés, etc. en
vue d’optimiser les rendements en plants régénérés. Il serait aussi, fort intéressant
d’orienter les recherches sur la voie de l’embryogenèse somatique qui peut ouvrir de
nouvelles perspectives dans le domaine de la micropropagation des lavandes qui
semble présenter une certaine récalcitrance.
La présente étude a été une occasion pour nous de tester pour la première
fois dans notre laboratoire, une technique utilisant les marqueurs moléculaires afin
de vérifier la conformité génétiques de nos vitroplants. A ce sujet, il serait aussi
intéressant d’essayer d’une part d’optimiser les techniques d’extraction de l’ADN
chez l’espèce lavande afin d’avoir des produits de qualité et en quantité suffisante et
d’autre part de tester des marqueurs moléculaires autre que le RAPD tels que les
SSR, les ISSR, etc.
La maitrise et la réussite de toutes ces voies de régénération et de

techniques moléculaire peuvent constituer une première approche devant conduire à
l’élaborer d’un programme d’amélioration et de sélection génétique de l’espèce
lavande dans notre pays.
97
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Annexes
Annexes
Annexe I : les principaux techniques de marquage moléculaire : coûts et domaines d’application
génétiques (Sylvain et al., 2000)
Annexes
Annexe II : Solutions et milieux de culture in vitro
1. Milieu de Murashige et Skoog (1960)
Constituants Solutions Volume à Concentration

mères (mg.L-1) ajouter(ml.L-1) finale (mg.L-1)
Macroéléments NH4NO3 33 000 50 1 650
20X KNO3 38 000 1 900
CaCl2-2H2O 8 800 440
MgSO4-7H2O 7 400 370
KH2PO4 3 400 170
Microéléments MnSO4-H2O 2 230 05 22.3
200X ZnSO4-7 H2O 860 8.6
H3BO3 620 6.2
KI 83 0.83
Na2MoO4-2H2O 25 0.25
CuSO4-5 H2O 2.5 0.025
CoCl2-6 H2O 2.5 0.025
Fer Na2EDTA 3 730 01 37.3
1000X FeSO4-7 H2O 2 780 27.8
Vitamines Glycine 2000 01 0.1

1000X Ac. Nicotinique 500 0.5
Pyridoxine-HCl 500 0.5
Thiamine-HCl 100 2
Sucres Myo-inositol 100

Sucrose 30000
Agar 7000
2. La solution de Fer EDTA :

FeSO4-7 H2O et Na2EDTA sont dissout séparément dans 1/10e et 1/9e du volume désiré finale
d’eau distillée à 60°c respectivement. Sur une table d’agitation chauffante, verser progressivement
la solution de FeSO4-7H2O dans celle de Na2EDTA, puis laisser le mélange sous agitation
pendant une heure, me mélande passe progressivement d’une couleur jaune claire à jaune fonçé,
elle sera stockée à l’abri de la lumiére à 4°c.
Annexes
3. Les régulateurs de croissance
Régulateurs Solvants
ANA 1N NaOH
2,4-D EtOH ou 1N NaOH
BA 1N NaOH
ZN 1N NaOH
KN 1N NaOH
GA3 EtOH
Annexes
Annexe III : Réactifs et solutions de biologie moléculaire

1. Les réactifs d’extraction d’ADN de la méthode non commerciale
Solution réactifs Préparation Volume

prélevé
Tampon Tris 1,4 M NaCl 8.19g (NaCl) dans 28ml compléter à

HCl 100ml(H2O) 100 ml avec
H 2 O
stérile.
100 mM Tris 1,211g de Tris dans 80 ml de 10ml

HCl pH=08 H 2 O. ( pH à 8, HCl )
20mM EDTA 0.584g dans 100 ml (PH8 4ml
pH=08 avec NaOH)
SDS 10% SDS 10g dans 100ml de H2O 33µl
Phenol : Phenol , Pour 50 ml : Pour 700µl :

Chloroforme : Chloroforme, alcoo 25 ml Phenol 350µl
alcool l isoamylique 24ml Chloroforme, 336µl
isoamylique 1ml alcool isoamylique 14µl
Chloroforme : Chloroforme, alcool Pour 25ml : Pour 700µl :

alcool isoamylique 24ml Chloroforme, 672µl
isoamylique 1ml alcool isoamylique 28µl
10 mM Tris-HCl, Dilution : 1ml Tris (100mM) 10ml Complété a

Tampon TE pH 8, + 9ml H2O 100ml avec
H2O
1mM d'EDTA pH 8 1ml EDTA(20mM) pH 08 + 2ml

19 ml H2O
Annexes
2. Tampon TAE 50X (Tris acétate EDTA à 50X)
Tris-base. 242g
Acide acétique glacial 57,1ml
EDTA 100ml (0,5M, pH8)
H2O stérile Complité à 1000ml
3. Tampon TAE 0,5X
Prélevé 1ml de Tampon TAE 50X complité à 100ml avec l’eau distillée
4. Gel d'agarose 0,8%
Agarose 0,8g
Tampon TAE 0,5X (pH 8) 100ml
5. Tampon de charge
Na- EDTA ( 500 Mm) 2 ml

bleu de bromophénol (2%) 0.75 ml
glycérol (100%) 5 ml
xylene cyanole (2%) 0.75 ml
H2 O 1.5 ml
Annexes
Annexe IV : Les profils électrophorétiques
1. L’amorce OPA-01
1000pb
900pb
800pb
700pb
600pb
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
M P01 P02 P03 P04 PM
Populations
Bandes Taille Pourcentage
P01 P02 P03 P04 PM
1 130 1 1 1 1 1
2 230 1 1 1 1 1
OPA-01 3 300 1 1 1 0 0 50%

4 1000 0 0 0 1 1
T= 4 3 3 3 3 3
bandes polymorphes 2 1 1 1 1 1 50%
bandes monomorphes 2 2 2 2 2 2 50%

Annexes
1500pb
1000pb
900pb
800pb
700pb
600pb
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
M P01 P02 P03 P04 PM
Populations
P01 P02 P03 P04 PM
1 240 1 1 1 1 1
2 300 0 1 0 0 0
3 330 1 1 1 1 1
4 390 0 1 0 0 0
OPA-03 5 490 1 1 1 1 1 50%
6 510 0 1 0 0 0
7 600 1 1 1 1 1
8 660 1 0 1 1 1
T=8 5 7 5 5 5
Annexes
1500pb
1000pb
900pb
800pb
700pb
600pb
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
M P01 P02 P03 P04 PM
Populations
P01 P02 P03 P04 PM
1 100 0 0 0 0 1
2 130 1 1 1 1 1
3 215 1 1 1 1 1
4 370 0 0 1 1 1
5 465 1 0 0 1 1
OPA-04 6 610 1 0 0 1 0 80%
7 710 0 1 1 1 1
8 1000 1 1 0 0 0
9 1550 1 0 0 0 0
10 1600 1 0 0 0 0
T=10 7 4 4 6 5
Annexes
1000pb
900pb
800pb
700pb
600pb
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
M P01 P02 P03 P04 PM
Populations
P01 P02 P03 P04 PM
1 130 1 1 1 1 1
2 210 1 1 1 1 1
OPA-10 3 825 0 1 1 0 0 50%
4 1000 0 1 1 0 0
T=4 2 4 4 2 2
Annexes
5. L’amorce OPW-12
1000pb
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
M P01 P02 P03 P04 PM
Populations
P01 P02 P03 P04 PM
1 160 1 1 1 1 1
OPW-12 2 290 1 1 1 1 1 0.00
T=2 2 2 2 2 2
bandes polymorphes 0 0 0 0 0 0 0.00
bandes monomorphes 2 2 2 2 2 2 100.00
Abstract
The objective of this paper was to regenerate in vitro a wild plant that is part of
the vast array of PAM in Algeria. The plant in question is Lavandula dentata,
spontaneous species with high added value. Therefore, this study aspired to regenerate
whole plants in vitro toothed lavender multiplication in two modes: micropropagation
and organogenesis and / or somatic embryogenesis. The study also aimed to monitor the
compliance of genetic plants regenerated via organogenesis using RAPD molecular
markers.
On multiplication via microboutrage, the contribution of the only BA, at doses
of 0.1 to 0.5 mg / L (between 83.33 and 91.66%) or in combination with 0.1 mg / L
NAA (91.66%) proved necessary to maximize the proliferation of axillary shoots. BA
provides good morphology in terms of number and length of shoots.
The results of buds on a medium lacking hormones are very interesting
(approaching 90%.) But are limited by the number of developing shoots which remains
low compared to areas equipped with BA.
It is by way of caulogenesis that we have managed to obtain adventitious buds.
The best rates are obtained on the MZ12 induction medium (0.5 mg / L ZT 0.1mg / l
NAA) (25%) with explants of internodes. The induced callus on some media containing
a combination (ZT * ANA) caulogenesis see their rates rise after transfer to the "so-
called development" media containing 1 mg / l zeatin (62.50%) and 0.5 mg / l zeatin
(41.66%).
The transfer of regenerated shoots on rooting media show that the best rates are
obtained on the environments provided with ANA at 1 mg / L (94.73% with shoots from
microbouturge and 92.33% with those from the caulogenesis) and hormone-free media
(94%). Root density was almost 7-15 times higher on ANA environments that media
without hormones.
The acclimatization test showed that seedling Lavandula dentata from
micropropagation, have no ex vitro adaptation problems. Indeed, the plant is
transplanted success rate of 58.78%. In contrast, plants neoformed by organogenesis
appear to be more fragile.
It has been possible to demonstrate the existence of a somaclonal variation in
vitro plants studied. The analysis of the similarity matrix confirmed that the closest
similarity is that observed between the mother plant and P04 (MZ12: 0.5 mg / L ZT +
0.1 mg / L NAA) (89.47%). Is the P02 (MZ6: 01 mg / L Zn + 0.5 mg / L NAA) that
appears to be furthest relative to the parent plant since it has an order of the similarity
rate of 52% (thus a rate variability of 48%).
Keywords: Aromatic and medicinal plants Lavandula dentata, micropropagation,

organogenesis, genetic conformity, somaclonal variation, RAPD-PCR..
L’objectif de la présente contribution visait à régénérer in vitro une plante sauvage qui
fait partie de la grande panoplie des PAM que possède L’Algérie. La plante en question est
Lavandula dentata, une espèce spontanée à grande valeur ajoutée. La présente étude ambitionnait
donc de régénérer in vitro de plantes entières de lavande dentée selon deux modes de
multiplication : le microbouturage et l’organogenèse et/ou l’embryogenèse somatique. L’étude
visait aussi à contrôler la conformité génétique des plants régénérés via l’organogenèse en
employant des marqueurs moléculaires RAPD.
Sur la multiplication via le microboutrage, l’apport de la BA seule, aux doses de 0.1 à 0.5
mg/L (entre 83.33 et 91.66 %) ou combinée à 0.1 mg/L d’ANA (91.66 %) s’est révélée nécessaire
pour maximiser la prolifération des pousses axillaires. La BA assure un bon aspect morphologique
en termes de nombre et longueur des pousses.
Les résultats de débourrement sur un milieu dépourvu d’hormones sont très intéressants
(avoisinant les 90 %.) mais sont limités par le développement en nombre de pousses qui reste
faible comparativement aux milieux pourvus de BA.
C’est par la voie de la caulogenèse que nous avons réussi à obtenir des bourgeons
adventifs. Les meilleurs taux sont obtenus sur le milieu d’induction MZ12 (0.5 mg/l ZT, 0.1mg/l
ANA) (25%) avec les explants d’entre-noeuds. Les cals induits sur certains milieux contenant
une combinaison (ZT * ANA) voient leur taux de caulogenèse augmenter après leur transfert sur
des milieux « dits de développement » contenant 1 mg/l de zéatine (62,50 %) et 0.5 mg/l de
zéatine (41,66 %).
Le transfert des pousses régénérées sur des milieux d’enracinement montrent que les
meilleurs taux sont obtenus sur les milieux pourvus d’ANA à 1mg /L (94,73 % avec les pousses
issues de microbouturge et 92,33 % avec celles issues de la caulogenèse) et les milieux sans
hormone (94 %). La densité racinaire était presque 7 à 15 fois plus importante sur les milieux à
ANA que les milieux sans hormones.
L’essai d’acclimatation a montré que les plantules de Lavandula dentata issues de

microbouturage, n’ont pas de problèmes d’adaptation ex vitro. En effet, le taux de réussite des
plantes transplantées est de 58.78 %. Au contraire, les plantes néoformées par organogénèse
semblent être plus fragiles.
On a pu mettre en évidence l’existence d’une variation somaclonale au sein des

vitroplants étudiés. L’analyse de la matrice de similarité permis de confirmer que la similitude la
plus proche est celle observée entre la Plante mère et le P04 (MZ12 : 0,5 mg/L ZT + 0.1 mg/L
ANA) (89.47 %). C’est le P02 (Mz6 : 01 mg/L Zn + 0.5 mg/L ANA) qui semble être le plus
éloigné par rapport à la plante mère puisqu’il présente un taux de similarité de l’ordre 52 % (donc
un taux de variabilité de 48 %).
Mots clés : Plantes aromatiques et médicinales, Lavandula dentata, Micropropagation,

Microbouturage, organogenèse, conformité génétique, Variation somaclonale, PCR-RAPD.

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République Algérienne Démocratique et Populaire

‫وزارة التعليم العالى و البحث العلمي‬

Faculté des sciences de la nature et de la vie

Contribution à la régénération in-vitro de Lavandula dentata via

Soutenu le : 25/06/2015 devant la commission d’examen composée de :

Qualité Nom et Prénom Grade Etablissement d’origine

Année universitaire : 2014/2015

A mes très chers parents

A mon très cher mari Abdellah

A mes chers frères, A mes gracieuses sœurs

A tous ceux qui me sont chers.

Figure 01. Cladogramme des Angiospermes (APGIII, 2009)…………… 07

Figure 03. Variation morphologique des corolles chez le genre Lavandula

Figure 04. Aire de répartition des espèces de lavandes dans le monde

Figure 05. Aspect d’une plante entière (A), de graines, de feuilles et de

Figure 06. Les différentes étapes de microboutures de Lavandula dentata

Figure 07. Mise en culture des différents explants obtenus des

Figure 08. L’effet des cytokinines seuls (A, B et C) et des combinaisons

Figure 09. Induction de racines (A et B) et de cals (C et D) sur les

Figure 10. Néoformation directe (A) et indirecte (B, C et D) de bourgeons,

Figure 12. Aspect des plantules régénérées in-vitro à différents stades de

Figure 14. Diagrammes électrophorétiques RAPD des 5 échantillons (les

Figure 15. Diagrammes électrophorétiques RAPD des 5 échantillons (les

Figure 16. Dendrogramme de similarité et de distance génétique entre les

Tableau 02. Les principales espèces de Lavandula décrites en Algérie……………….. 16

Tableau 04. Les principaux ravageurs de lavande et lavandin (Fontaine, 2011)……… 19

Tableau 05. Les différentes voies de micropropagation et la nature des explants, 27

Tableau 07. Composition du mélange réactionnel pour PCR/RAPD selon le protocole 51

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Tableau 20. Matrice de similarité et de distance génétique entre les échantillons

La préservation et la valorisation des plantes aromatiques et médicinales (PAM) dont

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Selon la classification phylogénétique ou classement APG (Angiosperm phylogeny

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Figure 01. Cladogramme des Angiospermes (APGIII, 2009)

Les Lamiacées (anciennement appelée Labiées, terme de lèvre « du latin labium » ou

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En phytothérapie et aromathérapie: comme nous l’avons signalé, la famille est une

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1.2.3. Origine et aire de répartition

La zone algéro-marocaine est clairement un centre de diversité avec un grand nombre

Tableau 02. Les principales espèces de Lavandula décrites en Algérie.

Secti espèc Sous- Caractérisation botanique Aire de Références

Lavandula saharica Upson et Jury diffère de Lavandula antineae Espèce

1.2.4. Chimie du genre Lavandula

L’huile essentielle de chaque espèce de Lavande possède son propre profil

Espèces composé principal Réferences

Lavandula Linalol et linalool

Lavandula latifolia Linalol, 1.8-cineol Munôz-Bertomeu et al.,

Lavandula x Linalol, lonalool Desautels et al., 2009

intermedia acétate, camphor et 1.8-

Lavandula Camphor et 1.8-

Lavandula viridis 1.8- cinéole et Nogueira et Romano,