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REPUBLIQUE TUNISIENNE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR
Hôpital Militaire Principal Institut Supérieur des Sciences

d’Instruction de Tunis Biologiques Appliquées de Tunis
Rapport de Projet de Fin d’Etudes

En vue de l’obtention de la
LICENCE APPLIQUEE EN BIOTECHNOLOGIE
Parcours Contrôle et Exploitation des Microorganismes

Année universitaire 2017/2018
Epidémiologie des bactériémies au service de néonatologie

à l’Hôpital Militaire Principale d’Instruction de Tunis
Présenté par : Dakhlaoui Rihab

Idi Safa
Soutenu devant :
Présidente du jury : Dr. Halaouli Sonia
Examinateur : Dr. Ben Slama Karim
Encadrants : Pr.Ag. Asli Mohamed Salim et Dr. Fourati Karim
ISSBAT 2017 – 2018 Bibliographie
REPUBLIQUE TUNISIENNE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR
Hôpital Militaire Principale Institut Supérieur des Sciences

d’Instruction de Tunis Biologiques Appliquées de Tunis
Rapport de projet de Fin d’Etudes

En vue de l’obtention de la
LICENCE APPLIQUEE EN BIOTECHNOLOGIE
Parcours Contrôle et Exploitation des Microorganismes
Année universitaire 2017/2018
Epidémiologie des bactériémies au service de néonatologie

à l’Hôpital Militaire Principale d’Instruction de Tunis
Présenté par : Dakhlaoui Rihab

Idi Safa
Soutenu devant :
Présidente du jury : Dr. Halaouli Sonia
Examinateur : Dr. Ben Slama Karim
Encadrants : Pr. Ag. Asli Mohamed Salim et Dr. Fourati Karim
2
Dédicaces
J’offre ce mémoire
A mes très chers parents

Auxquels je dois ce que je suis
Je vous remercie pour tous les efforts que vous avez consentis à mon égard, afin de m’assurer
une vie heureuse et m’initier aux responsabilités.
Que vous trouviez dans ce travail, le fruit de vos sacrifices et la preuve de mon amour infini.
Que Dieu vous bénisse et vous accorde joie, santé et bonheur.
A mes frères Houssem, Mohamed Amine et Rayen
Je vous souhaite tout le bonheur du monde, que la vie puisse vous gâter comme vous le méritez,
et surtout que vous puissiez réaliser vos rêves et vos ambitions.
A toute ma famille,
A ma chère amie Safa
A tous mes autres ami (e) s
Pour leur aide et leur soutien moral dans les moments difficiles.
A tous ceux que j’aime et ceux qui m’aiment.
Dakhlaoui Rihab
3
Dédicaces
J’offre ce mémoire
A mes très chers parents

Qui n’ont cessés, de formuler des prières à mon égard, de me soutenir et de m’épauler pour
que je puise atteindre mes objectifs.
Vous êtes ce que j’ai plus précieux dans la vie.

Pour l’amour que je vous porte et en témoignage de mon éternel dévouement je vous dédie ce
travail avec tous mes souhaits de longue vie et de bonheur
A mon frère Maher et ma sœur Insaf
Pour leur soutien moral et leurs conseils précieux tout au long de mes études.
Je vous souhaite la réussite dans la vie.
A toute ma famille,
A mes chères amies Rihab, Wissal, Rim et Malek
Toujours là quand il le fallait, en souvenirs des bons moments que nous avons passés ensemble,
merci pour l’encouragement et pour votre présence.
A tous mes autres ami (e) s
A tous ceux qui ont collaborés à la réalisation ce travail de prés ou de loin.
Idi Safa
4
Remerciements
Au Professeur agrégé et chef de service de Microbiologie à l’Hôpital Militaire Principale

d’Instruction de Tunis (H.M.P.I.T) Monsieur BEN MOUSSA Mohamed
Nous vous remercions de nous avoir accueillies et intégrer au sein de votre service. Merci
Au Docteur BEN SLAMA Karim Maître de Conférence et Directeur de l’Institut Supérieur

des Sciences Biologiques Appliquées de Tunis (I.S.S.B.A.T) et examinateur de ce mémoire
Nous vous remercions pour votre confiance, votre patience et tous les efforts que vous avez
fournis lors de vos enseignements de microbiologie si précieux. Veuillez trouver dans notre
travail l’expression de notre profonde reconnaissance. Vous nous faites également un grand
honneur en acceptant de juger notre travail. Merci
Au Pharmacien-Lieutenant Professeur Agrégé et Assistant Hospitalo-Universitaire à la

Faculté de Pharmacie de Monastir Monsieur ASLI Mohamed Salim
Nous vous remercions pour la gentillesse et la spontanéité avec laquelle vous avez bien voulu
diriger notre travail. Vous nous faites un grand honneur.
Veuillez trouver ici, l’expression sincère de notre respect et le témoignage de notre profonde
considération. Merci
Au Docteur Karim Fourati
Nous vous remercions pour votre soutien et pour l’effort que vous avez consacré pour nous
orienter et nous aider. On espère que ce présent travail témoigne de notre profond respect.
Au Docteur Halaouli Sonia Maitre-Assistant à l’ISSBAT

Nous vous remercions de nous avoir fait l’honneur d’accepter d’être notre tuteur. Sans votre
clairvoyance et vos corrections minutieuses, ce travail n’aurait pu être préparé et rédigé dans
des conditions favorables. Votre amabilité, votre sérieux, votre compétence, et surtout vos
qualités humaines nous ont beaucoup marquées. Veuillez trouver, chère Madame, dans ce
travail, l’assurance de notre grande estime et de notre profond respect. Merci
Au personnel du « Service de Microbiologie »

Nous vous remercions pour votre soutien moral et pour vos précieux conseils tout au long de
notre projet. Merci
A tous nos enseignants à l’ISSBAT
Qui ont assumés notre formation durant ces trois années d’études
5
Liste des abréviations
ANAES: Agence nationale d’accréditation et d’évaluation en santé

AMX: Amoxicilline
AMK : Amikacine
AMC: Amoxicilline + acide clavulanique
AST : Tests de sensibilité aux antibiotiques
BGN : Bacille à gram négatif
BGP : Bacille à gram positif
BMR : Bactérie multi-résistante
BLSE : Bêta-lactamases à spectre étendu
β-NAD : β-Nicotinamide adénine dinucléotide
C : Chloramphénicol
CA-SFM : Comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie
CAZ : Ceftazidime
CEF: Céfépime
CFM : Céfixime
CGP : Cocci à Gram positif
CHU : Centre hospitalier universitaire
CL: Colistine
CMI : Concentration minimale inhibitrice
Cmin : Concentration minimale
Cmax : Concentration maximale
CO2 : Dioxyde de carbone
CRO : Ceftriaxone
CTX : Céfotaxime
E : Erythromycine
ETP : Ertapénème
E-Test : Bandelettes imprégné d’un gradient d’antibiotique
FA : Acide fusidique
Fan : Neonat aerobic flacon
FISH : Fluorescent In Situ Hybridation
FOS : Fosfomycine
FOX : Céfoxitine
6
GN : Gram négatif
GEN : Gentamycine
GP : Gram positif
H₂O : Molécule d’eau
H₂S : Hydrogène sulfure
IMP : Imipénéme
K : Kanamycine
L : Lincomycine
LNZ :Linézolide
MEM : Méropenème
MH : Mueller-Hinton
MH-F : Mueller Hinton Fastidious Agar
N : Nombre des souches
NAD : Nicotinamide adénine dinucléotide
O : Oxacilline
O₂ :Dioxygène
OMS : Organisation Mondiale de la santé
OPNG : Ortho-nitrophényl-𝛽-galactoside
P : Pénicilline G
PCR : Polymerase Chain Reaction
PIP : Pipéracilline
PR : Pristinamycine
QD :Quinupristin-dalfoprystine
SCN: Staphylocoque à Coagulase Négative
SGB : Streptocoque du groupe B
TCC : Ticarcilline + acide clavulanique
TE :Tétracycline
TEC : Téicoplanine
TIC : Ticarcilline
TM: Tobramycine
TZP : Pipéracilline + Tazobactam
VAN : Vancomycine
7
Unité
µl : microlitre
Ml : millilitre
% : pour cent
° C : degré Celsius
Mm : millimètre
Mg/l : milligramme par litre
3D : tridimensionnel
8
Liste des tableaux
Tableau 1: Principales caractéristiques des BGN non fermentaires responsables de bactériémies

en néonatologie ............................................................................................................................... 7
Tableau 2 : Quantité de sang prélevé selon le poids des patients ................................................... 9
Tableau 3: Milieux de culture et températures d’incubation......................................................... 22
Tableau 4: Technique du test catalase ........................................................................................... 23
Tableau 5: Technique du test oxydase .......................................................................................... 23
Tableau 6 : Technique du test coagulase ....................................................................................... 24
9
Liste des figures
Figure 1: Figure montrant les résultats d’hémocultures. ............................................................... 10

Figure 2: Historique de l’émergence de la résistance aux β-lactamines ....................................... 14
Figure 3: L'automate Bact/Alert 3D® ............................................................................................ 18
Figure 4: Photo montrant la mise en place des flacons d’hémoculture dans le Bact-Alerte 3D ... 18
Figure 5: Système VITEK®2 Compact ........................................................................................ 20
Figure 6: Photo d’une carte d'identification VITEK®2 ................................................................ 20
Figure 7 : Test catalase .................................................................................................................. 23
Figure 8: Test oxydase .................................................................................................................. 23
Figure 9: Test coagulase ................................................................................................................ 24
Figure 10 : Répartition des hémocultures en 2017 ........................................................................ 27
Figure 11: Répartition des nouveau-nés selon le sexe en 2017..................................................... 27
Figure 12: Répartition des germes isolés selon la coloration de Gram ......................................... 28
Figure 13: Nature des germes isolés ............................................................................................. 28
Figure 14: Répartition des hémocultures en fonction des mois .................................................... 29
Figure 15: Répartition des espèces selon le mois .......................................................................... 30
Figure 16 : Profil de résistance des souches d’Alcaligenes xylosoxidans isolées ......................... 31
Figure 17: Profil de résistance des souches de Klebsiella pneumoniae isolées ............................ 32
Figure 18: Profil de résistance des souches des staphylocoques à coagulase négative isolées..... 33
10
Sommaire
Introduction ................................................................................................................... 1
Partie théorique
I. Définitions ......................................................................................................... 2
1. Epidémie nosocomiale .............................................................................................. 2
2. Bactériémie et septicémie........................................................................................... 2
II. Bactériémies néonatales .................................................................................... 2
1. Introduction ............................................................................................................... 2
2. Les bactériémies d'origine materno-fœtale ............................................................... 3
3. Les bactériémies d'origines nosocomiale ................................................................... 4
4. Etiologie ..................................................................................................................... 4
4.1. Etiologie des bactériémies néonatales précoces................................................... 4
4.2. Etiologie des bactériémies néonatales tardives .................................................... 5
5. Caractéristiques bactériologiques des germes les plus incriminés ............................. 5
5.1. Escherichia coli K1 .............................................................................................. 5
5.2. Les streptocoques du groupe B ou SGB .............................................................. 5
5.3. Les staphylocoques .............................................................................................. 6
5.4. Les entérobactéries ............................................................................................... 6
5.5. Les BGN non fermentaires .................................................................................. 7
III. Diagnostic des bactériémies : L’hémoculture ................................................... 7
1. Introduction ............................................................................................................... 7
2. Déroulement d'une hémoculture ................................................................................. 8
2.1. Prélèvement ......................................................................................................... 8
2.2. Mise en culture des prélèvements sanguins par enrichissement bactérien .......... 9
2.3. Lecture des résultats de la culture ...................................................................... 10
2.3.1. Détection visuelle .................................................................................... 10
2.3.2. Détection automatisée ............................................................................. 10
2.4. Identification ...................................................................................................... 11
2.4.1. Méthodes classiques................................................................................ 11
11
2.4.2. Nouvelles méthodes d'identification ...................................................... 12

2.5. Interprétation des résultats ................................................................................. 12
2.6. Prélèvements périphériques ............................................................................... 13
IV. Emergence de la résistance aux β-lactamines ................................................. 13
1. Origines de la résistance aux antibiotiques ............................................................. 13
2. Le cas particulier des β-lactamines ......................................................................... 14
2.1. Définition des β-lactamines ................................................................................. 14
2.2. Résistance à la methicilline ................................................................................. 14
2.3. Production des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) ....................................... 15
2.4. Les carbapénèmases ............................................................................................ 16
Partie pratique
I. Population d’étude .................................................................................................. 17
II. Matériel ................................................................................................................... 17
1. Milieux de culture ................................................................................................... 17
2. Bact-Alert 3D (Biomérieux) .................................................................................... 18
3.VITEK®2 Compact (Biomérieux) ............................................................................. 18
III. Méthodes .............................................................................................................. 20
1. Prélèvements sanguins ............................................................................................ 20
2. Mise en culture dans le Bact-alerte 3D ................................................................... 21
3. Examen microscopique direct ................................................................................. 21
4. Isolement des germes sur milieux gélosés .............................................................. 22
5. Identification des germes isolés .............................................................................. 22
5.1. Caractérisation morphologique ......................................................................... 22
5.2. Caractérisation biochimique..............................................................................23
5.2.1. Tests biochimiques manuels ........................................................................... 23
5.2.2.Tests biochimiques automatisés ....................................................................... 25
6. Test de sensibilité aux antibiotiques ....................................................................... 26
IV. Résultats ............................................................................................................... 28
1. Epidémiologie des bactériémies dans le service de néonatologie de l’HMPIT de janvier
2017 à décembre 2017 ................................................................................................. 28
2. Etude de la résistance aux antibiotiques des principaux germes isolés ................... 31
V. Discussion .............................................................................................................. 35
12

2017 à décembre 2017.................................................................................................. 35
2. Etude de la résistance aux antibiotiques des principaux germes isolés ................... 38
Conclusion .................................................................................................................. 41
Références
Annexes
Annexes
13
ISSBAT 2017 – 2018 Introduction
Introduction
Les bactériémies représentent un problème de santé majeur en néonatologie : en 2015,

l’Organisation Mondiale de la Santé a dénombré 2.8 millions de décès chez les nouveau-nés dont
47.6 % étaient dus à des bactériémies survenues chez des nouveau-nés âgés de 0 à 1 mois
jusqu’à 3 mois après la naissance (Kemeze et al, 2016). L’incidence de ces infections néonatales
est fortement influencée par la fragilité du terrain, notamment le système immunitaire immature
des nouveau-nés, encore plus chez les prématurés, et la multiplication des actes invasifs en
milieu hospitalier (Bertholom, 2016-A).
Les bactériémies rencontrées en néonatologie peuvent être d’origine materno-fœtale ou

nosocomiale, et les germes incriminés sont aussi bien des germes spécifiques que des germes
opportunistes. L’hémoculture constitue la méthode clé pour le diagnostic des bactériémies. Leur
prise en charge repose sur une antibiothérapie précoce et empirique, instituée avant même
l’identification bactériologique précise des germes incriminés, afin de réduire la morbidité et la
mortalité des nouveau-nés. Cependant, la résistance aux antibiotiques est un phénomène
préoccupant, en évolution constante, qui est une menace pour le contrôle de ces infections.
Dans ce contexte, le travail présenté ici, a eu pour objectifs :
- de réaliser une étude épidémiologique rétrospective, à partir des hémocultures de patients

hospitalisés au service de néonatologie à l’Hôpital Militaire Principal d’Instruction de Tunis
(HMPIT) du 1er janvier 2017 au 31 décembre 2017.
- d’établir le profil de résistance, des germes en cause, aux β-lactamines qui sont des
antibiotiques à large spectre d’utilisation généralisée en milieu hospitalier. Le but est d’améliorer
le pronostic des infections néonatales et, de réduire l’émergence et la diffusion de bactéries
multi-résistantes qui viennent compliquer la prise en charge empirique des bactériémies.
1
I. Définitions :
1. Epidémie nosocomiale :
On appelle infection nosocomiale ou infection hospitalière toute maladie contractée à

l'hôpital, et qui est due à des micro-organismes cliniquement et microbiologiquement
reconnaissables et affectant le malade ou l’équipe de soins hospitaliers.
Une épidémie nosocomiale se définit comme une augmentation inhabituelle du nombre

de cas liés à une maladie donnée pendant une unité de temps dans un établissement de soins : les
germes en cause ne sont ni en incubation ni présent à l’admission du patient (Haesebaert et al,
2010).
2. Bactériémie et septicémie:
Une bactériémie se définit par le passage dans le sang, qui est normalement stérile, de
bactéries à partir d’un foyer infectieux primaire. Elle peut apparaître suite à une infection grave
ou suite à des actes ordinaires (brossage des dents) ou médicaux (cathéter, sonde uro-génitale).
Généralement, une bactériémie est asymptomatique (ou transitoire) lorsque les bactéries
présente dans le sang sont peu nombreuses. Elles sont alors rapidement éliminées par le système
immunitaire. Par contre le passage répété dans le sang d’un grand nombre de bactéries, ayant
échappées à la phagocytose, peut provoquer une réponse généralisée grave appelée septicémie.
(Garnier et Mainardi, 2016).
La septicémie est un état physiologique qui se manifeste par l’apparition de foyers

infectieux secondaires et de signes cliniques graves (troubles neurologiques, détresse
respiratoire) associés à une forte fièvre et une inflammation importante en cas de
dysfonctionnement d’organe. Dans les cas les plus graves, elle entraîne un choc septique (Marik
et al, 2017).
II. Bactériémies néonatales :

1. Introduction :
C’est la pathologie hospitalière la plus rencontrée durant la période néonatale de 0 à 28 jours

d’âge. Les nouveau-nés infectés ont pour la plupart un âge de 2,5 ± 4 jours. En effet, pendant les
5 premiers jours de vie, ayant un système immunitaire encore immature, les nouveau-nés sont
facilement infectés par des germes pathogènes opportunistes provenant de leurs mères
2
(bactériémies d’origine materno-fœtale) ou de l’environnement hospitalier (bactériémies

d’origine nosocomiale) (Kemeze et al, 2016).
Les bactériémies d’origine materno-fœtale sont dites bactériémies précoces et les

bactériémies d’origine nosocomiale sont dites bactériémies tardives.
2. Les bactériémies d’origine materno-fœtale :
Ce sont des infections prouvées par la présence d’un agent pathogène dans le sang ou le
liquide céphalo-rachidien, avec un bilan inflammatoire positif dans la période néonatale précoce.
Elles surviennent à un âge inférieur ou égal à 4 jours et surtout dans les 48 premières heures de
vie. En effet, 94% des nouveau-nés sont infectés dans la période néonatale précoce dont 85 %
dans la période néonatale très précoce (Morcel et al, 2013).
Il existe 3 modes de contamination du sang des nouveau-nés :
 La voie hématogène placentaire : les germes en cause passent du placenta vers le sang
des bébés via la veine ombilicale.
 La voie ascendante : en cas de rupture prématuré du sac amniotique, des germes peuvent
passer du tractus génital de la mère vers le liquide amniotique.
 Pendant l’accouchement : la contamination se fait par ingestion, par le nouveau-né, de
sécrétions vaginales lors de la progression de ce dernier dans la filière génitale (Morcel et
al, 2013).
Les principaux facteurs de risque de bactériémie sont la prématurité inexpliquée

inférieure à 35 semaines d’aménorrhée, la réanimation néonatale dans des conditions douteuses
d’asepsie, et la rupture prolongée des membranes supérieure à 12 heures.
Les manifestations cliniques les plus fréquentes sont les troubles thermiques dominées
par l’hyperthermie, les troubles neurologiques, les troubles respiratoires et les troubles du
comportement (Morcel et al, 2013).
3
3. Les bactériémies d’origine nosocomiale :
Les infections nosocomiales représentent un grand problème sanitaire en néonatologie.

Elles apparaissent entre le 5éme et le 28ème jour après la naissance et résultent de la présence de
germes pathogènes dans un établissement de soins.
La survenue d'une infection nosocomiale est essentiellement liée au bon déroulement des
soins (respect de l’asepsie), à l'environnement (sécurité microbiologique et hygiène) et aussi à
des paramètres relatifs au patient comme l'âge ou le type de pathologie pour lequel il a été admis.
Les bactériémies associées à un cathéter vasculaire central ou veineux ombilicale représentent la
moitié de ces infections nosocomiales ; l’autre moitié concerne la prématurité sévère, le petit
poids de naissance et la longue durée d’hospitalisation (Hériteau et al, 2012).
Les principales formes d’infections tardives sont respiratoires (battement des ailes du nez,
des signes de rétraction et tachypnée), hémodynamiques (une tachy/bradycardie, une
hypotension artérielle et une pâleur), et thermiques (une fièvre de 39°C). (Morcel et al, 2013).
4. Etiologie :
4.1. Etiologie des bactériémies néonatales précoces :
En France, les bactériémies néonatales précoces sont en majorité dues aux bactéries de
portage vaginal maternel avec une prédominance des Streptocoques de groupe B (SGB), plus
particulièrement Streptococcus agalactiae (40 à 50 %), et d’Escherichia coli (30 à 40 %)
(Muller-Pedoby et al, 2011).
En Afrique, ces bactériémies sont essentiellement dues aux BGN et aux cocci à Gram
positif (CGP). Des études récentes réalisées au Cameroun (Kemeze et al, 2016) ont montré que
les germes incriminés dans les bactériémies néonatales précoces sont le plus souvent des bacilles
à Gram négatif (BGN) (52.6%), avec la prépondérance d’E. coli (36.8 % des BGN) et de
Klebsiella pneumoniae (10.5% des BGN), et des cocci à Gram positif seulement représentés par
Staphylococcus aureus (47.4 %). Au Maroc, Chemsi et Benomar (2015), ont également
démontré la prédominance des BGN (50.4 %), avec E. coli en tête de liste (33%), et ce grâce à
une étude rétrospective sur 13 ans (janvier 1999-décembre 2011). Dans cette étude, les SGB ont
également été incriminés dans 25.2% des infections confirmées. De rares cas de bactériémies à
bacilles à Gram positif (BGP) ont été rapportés. En Tunisie, 1 cas de bactériémie dû à Listeria
monocytogenes a été diagnostiqué en 2010 (Elbeldi et al, 2010).
4
4.2. Etiologie des bactériémies néonatales tardives :
En France, 70% des cas de bactériémies nosocomiales sont dues aux Staphylococcus à
coagulase négative, avec une prévalence de l’espèce S. epidermidis, suivie des entérobactéries et
de Staphylococcus aureus (Biran et al, 2012 ; Rasigade et al, 2013).
Une étude réalisée en Tunisie par Jaballah et al (2006), au sein du service de réanimation
néonatale de l’hôpital d’enfants de Tunis, a montré que les germes prédominants dans les cas de
bactériémies tardives étaient Klebsiella pneumoniae (26.7 %) suivie de Staphylococcus aureus
(20 %). Plus récemment au Maroc, une étude a démontrée la prévalence des BGN et en
particulier de Klebsiella pneumoniae sécrétrices de β-lactamases (Chemsi et al, 2013).
5. Caractéristiques bactériologiques des germes les plus incriminés :

5.1. Escherichia coli k1 :
C’est un bacille à Gram négatif, en forme de bâtonnet court de la famille des

Enterobacteriaceae. Elle représente le germe commensal aérobie le plus important du tube
digestif.
On distingue 3 types d’E. coli en fonction du type d’antigène qu’elle porte : antigènes
somatiques O, antigènes flagellaires H et antigènes capsulaires K. Le microbiote intestinal
humain constitue un réservoir important d’E. coli K1 qui est responsable de 77% des cas
d’infections néonatales à E. coli (Delannoy et al, 2017).
Les antigènes capsulaires K sont morphologiquement et physico-chimiquement similaires

aux antigènes capsulaires de Streptococcus pneumonice, Neisseria meningitidis, Haemophilus
influenzae et Klebsiella pneumoniae, qui sont des germes mis en cause dans les infections des
voies urinaires, les bactériémies, les septicémies, et les méningites néonatales. C’est pourquoi
une identification fiable par caractérisation des sérogroupes O1 et O2 liés à l’antigène K1 est
nécessaire pour le diagnostic et l’attribution des infections à E. coli chez les nouveau-nés
(Delannoy et al, 2017).
5.2. Les streptocoques du groupe B ou SGB:
Ces germes sont des cocci à Gram positifs disposés en paires ou en chaines, anaérobies
facultatifs, et qui génèrent une étroite zone de 𝛽-hémolyse sur une gélose au sang. Ce sont des
5
germes qui font partie du microbiote vaginal normal. Streptococcus agalactiae est le plus
souvent associée aux infections néonatales précoces.
Les bactériémies néonatales précoces à SGB sont dues à une contamination pendant la
grossesse ou l’accouchement à cause de leur forte présence au niveau rectal et vaginal chez la
femme enceinte. La forte colonisation par les SGB est associée généralement au jeune âge de la
mère, à l’activité sexuelle, aux températures élevées ou à l’humidité et à l’utilisation de tampons
(Money et Allen, 2016).
5.3. Les staphylocoques :
Ce sont des composantes essentielles de la flore humaine normale responsables

d’infections urinaires chez la femme jeune et d’infections nosocomiales associées à l’utilisation
de matériel invasif (sonde, cathéter) (Ferron, 1984).
Les staphylocoques ont une forme en cocci arrangés par deux (diplocoques) ou en amas
(grappe). Ce sont des bactéries à Gram positif.
On distingue :
 Les Staphylocoques à coagulase négative :
Les bactériémies incriminent essentiellement S. hominis, S. épidermidis et S.

saprophyticus (Ferron, 1984).
 Les Staphylocoques à coagulase positive :

Ce groupe est représenté par l’espèce Staphylococcus aureus qui peut être impliquée dans
certaines infections suppuratives (peau, tissu mou et muscle) ou dans des toxi-infections dues à
la synthèse de différentes toxines (Ferron, 1984).
5.4. Les entérobactéries :
Ce sont des bactéries qui prolifèrent en abondance dans l’environnement appartenant à la

flore normale du tube digestif humain ou animal. Ce sont des BGN asporulés, de 2 à 3 𝜇m de
longueur sur 0.6 𝜇m de largeur.
Certains genres sont immobiles (Klebsiella, Shigella, Yersinia pestis), d’autres sont
mobiles grâce à leur ciliature péritriche (Serratia marscence). Les espèces pathogènes possèdent
des pili qui permettent une meilleure adhésion à la cellule hôte (Ferron, 1984).
6
5.5. Les BGN non fermentaires :
Ce sont des bactéries aérobies strictes. Les principaux genres mis en cause dans les
bactériémies sont Pseudomonas aeruginosa, Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter
baumani et Stenotrophomonas maltophilia (tableau 1).
Les patients hospitalisés peuvent jouer le rôle de véritables réservoirs de ces bactéries
(Ferron, 1984).
Tableau 1 : Principales caractéristiques des BGN non fermentaires responsables de

bactériémies en néonatologie (d’après Grosjean et al, 2011).
Famille Genre Espèce Caractères biochimiques
Pseudomonacae Pseudomonas P. aeroginosa Oxydase (+), H2S(-),

Gélatinase (+), OPNG(-)
Moraxellaceae Acinétobacter A. baumani Oxydase(-), Catalase(+)
OPNG(-), Gélatinase (+)
H2S (-)
Alcaligenaceae Achromobacter A. xylosoxidans Oxydase(+), Catalase(+)
(Alcaligenes) Mannitol(-), Lactose(-)
Xanthomonadaceae Stenotrophomonas S. maltophilia Oxydase(-), Catalase(+)
OPNG(+), Gélatine(+)
H2S: Hydrogène sulfure, OPNG: Ortho-nitrophényl-𝛽-galactoside
III. Diagnostic des bactériémies : l’hémoculture.

1. Introduction :
De nombreuses approches moléculaires ont été utilisées pour identifier les bactéries dans
les flacons d’hémoculture positifs : l’amplification par PCR de la fraction de gène codant pour
l’ARNr 16s des bactéries, l’hybridation in situ par la technique « FISH » (Fluorescent In Situ
Hybridation), la révélation par micropuces («microarray »). Ces méthodes sensibles peuvent
permettre le diagnostic précis d’une bactériémie et génèrent des résultats rapides et spécifiques.
Cependant, en routine, ces techniques sont très contraignantes (consommables coûteux et étapes
de réalisation minutieuses et multiples) (Buchan et al, 2015).
7
La spectrométrie de masse MALDI-TOF est une technique physico-chimique qui permet

également une identification rapide des microorganismes (1heure de temps), conduisant à une
diminution de l’usage empirique d’antibiotiques à large spectre. Elle favorise ainsi la réduction
du risque de développement de résistances (Ferroni et al, 2012 ; Clark et al, 2013). Cependant, la
spectrométrie de masse MALDI-TOF nécessite un investissement initial en appareillage très
coûteux.
Malgré les avancées techniques, l’hémoculture reste donc la méthode de routine aux
laboratoires de microbiologie.
L'hémoculture est systématiquement entreprise devant toute fièvre d'origine
indéterminée, surtout si elle s'accompagne de signes évocateurs d'une infection, et ce avant tout
traitement antibiotique. Elle reste donc l’élément clé du diagnostic, du pronostic et du traitement
(Dutta et al, 2009 ; Dinç et al, 2016).
Cet examen de référence a pour but de rechercher les bactéries dans le sang, puis les
identifier pour enfin orienter l’antibiothérapie. Il repose sur un prélèvement de sang mis en
culture dans des conditions particulières pour mettre en évidence la présence de germes aérobies
ou anaérobies (Garnier et Denis, 2011).
2. Déroulement d’une hémoculture :

2.1. Prélèvement :
Le prélèvement est réalisé par ponctions veineuses multiples sur même site ou sur des
sites différents. Il doit être réalisé le plus tôt possible dans l’évolution de la maladie et avant
l’antibiothérapie (voir annexe1). Il se fait généralement pendant l’accès fébrile, de préférence
après les frissons, ce phénomène étant le signe d’une décharge bactérienne probable dans la
circulation sanguine. Trois hémocultures doivent être réalisées par 24 heures, sans qu’un
intervalle de temps particulier soit recommandé entre deux prélèvements. Chez les nouveau-nés,
une seule hémoculture est suffisante pour détecter une infection néonatale (Bertholom, 2016-A).
La concentration bactérienne au cours d’une bactériémie est généralement faible. C’est

pour cela qu’une quantité suffisante de sang doit être prélevée pour détecter une bactériémie et
pour isoler les germes responsables (tableau 2) (Bertholom, 2016-B).
8
Tableau 2 : Quantité de sang prélevé selon le poids des patients
< 1 kg 0,5-2 ml
1,1-2 kg 1,5-4,5ml.
Nouveau-nés et enfants 2,1-12,7 kg 3-6ml.
12,8-36,3 kg 5ml
Adulte 10 ml
2.2. Mise en culture des prélèvements sanguins par enrichissement bactérien:
Les prélèvements servent à ensemencer 2 flacons différents (aérobie et anaérobie) pour

les adultes ou un seul (FAN pédiatrique) chez les nouveau-nés et les enfants. Le milieu de
culture est un milieu supplémenté en facteurs de croissance pour permettre la culture de presque
tous les types de germes (exemples des vitamines B6 pour les streptocoques, et des facteurs X et
V pour l’Haemophilus influenzae), en anticoagulants pour éviter la formation d’amas de fibrine
(exemples du polyanéthol sulfonate et du sodium SPS) et en inhibiteurs d’antibiotiques pour
neutraliser l’action de ces derniers sur les germes à détecter (exemple de la résine et du charbon)
(Bertholom, 2016-A).
Pour les flacons anaérobies, le milieu doit être suffisamment réducteur. C’est un bouillon
Wilkins Chalgrin qui contient le chlorhydrate de cystéine permettant de réduire l’oxygène, du
CO2 et du N2 pour favoriser la culture des bactéries anaérobies strictes. Les flacons aérobies
présentent une atmosphère aérobie enrichie en oxygène pour favoriser la croissance et la
multiplication des bactéries aérobies strictes (Bertholom, 2016-A).
Les flacons FAN, appelés aussi flacons pédiatriques aérobies, sont destinés à la culture et
à la mise en évidence des bactéries à croissance lente ou difficile. Ils contiennent un milieu
nutritif à base de Trypticase soja et de facteurs de croissance comme la L-cystéine ou le
pyridoxal qui facilitent la détection de certaines espèces de streptocoques (Streptococcus
adjacens, Streptococcus defectivus) (Koeck et al, 2001).
Tous les flacons d’hémoculture doivent être acheminés au laboratoire de microbiologie

dans les 2 heures, et sont incubés dans un automate de culture durant 1 à 6 jours à 35-37˚C afin
de favoriser la croissance bactérienne.
9
2.3. Lecture des résultats de la culture :

2.3.1. Détection visuelle :
Une inspection à l’œil nu des flacons d’hémoculture après une incubation à 37˚C pendant
sept jours permet une lecture visuelle. Elle se fait deux fois par jour au cours des premières 48
heures puis une fois par jour pour les cinq jours suivants.
Les signes qui permettent de confirmer une croissance microbienne sont (Bertholom,
2016-A):
 Trouble, voile ou dépôt.

 Hémolyse du sang (spécifique des SGB, Listeria, Clostridium, Bacillus)
 Coagulum (spécifique de Staphylococcus aureus).
 Production de gaz (spécifique des BGN aérobies et anaérobies).
2.3.2. Détection automatisée :
L’automatisation a amélioré les performances de l’hémoculture. En effet divers

automates, (BACTEC® 9050, Bio Argos, Bact Alert, Organon Technica) permettent aujourd’hui
de détecter les hémocultures positives par la mise en évidence de produits métaboliques générés
par la croissance bactérienne.
Au cours de leur croissance, les bactéries produisent du CO2 qui entraine une
acidification du milieu, entrainant un changement de couleur (figure 1) qui sera détecté à l’aide
d’un senseur de pH fixé au fond de chaque flacon. La détection se fait soit par réflectométrie,
soit par fluorescence.
Hémoculture positive Hémoculture négative
Figure 1: Figure montrant les résultats d’hémocultures.
10
Devant toute suspicion de positivité et quelques soit le système utilisé (système

automatique ou manuel), un examen microscopique et une mise en culture sur gélose doivent
être réalisés dans le but d’identifier les bactéries (Bertholom, 2016-A).
2.4. Identification :
2.4.1. Méthodes classiques :
L’identification des germes présents dans les hémocultures positives se fait par une étude
phénotypique grâce à :
 Une caractérisation morphologique : basée sur l’observation à l’œil nu des caractères

culturaux des bactéries isolées (aspect des colonies, présence de pigmentation ou d’odeur
particulière,…) cultivées sur différentes géloses sélectives ou pas. Elle se base aussi sur
la coloration de Gram de frottis des germes isolés (voir annexe 2) suivie d’une
observation microscopique. Les résultats de la coloration de Gram peuvent orienter
l’antibiothérapie, ainsi que certaines étapes ultérieures et complémentaires de
l’identification.
 Une caractérisation biochimique: basée sur des tests miniaturisés regroupés sur des
« cartes » et réalisés par des automates (exemple VITEK). Le choix des cartes est orienté
par la coloration de Gram. L’automate permet également la lecture et l’interprétation des
résultats grâce à un système de lecture optique. L’identification se fait au bout de
quelques heures (3-18 heures).
 Une caractérisation physiologique : basée sur la réalisation d’un antibiogramme qui

complète l’identification ; elle est également réalisée grâce à un automate. Elle est parfois
réalisée manuellement.
2.4.2. Nouvelles méthodes d’identification :

L’amplification par PCR du gène codant pour l’ARNr 16s des bactéries, son séquençage
puis son analyse par comparaison avec ceux déposés dans les banques de données (NCBI,
Infobiogen…) est une technique également utilisée qui permet de réduire le délai de
l’identification des germes isolés à 2 heures (Buchan et al, 2015).
Depuis quelques années la spectrométrie de masse MALDI-TOF est une technique qui
s’est imposée dans les laboratoires de microbiologie clinique. Elle nécessite de disposer d’une
colonie isolée à partir de laquelle sera obtenu un spectre de masse, qui sera comparé à une
11
bibliothèque de spectres pour identifier le germe isolé en seulement 1 heure. Cependant, la

spectrométrie de masse MALDI-TOF reste tributaire d’une mise à jour régulière de la
bibliothèque de spectres (Clark et al, 2013).
2.5. Interprétation :
L’interprétation des résultats tient compte du nombre de flacons positifs, de

l’identification des germes isolés sur le nombre total d’hémocultures réalisées et du contexte
clinique.
 Hémoculture positive :
L’interprétation des hémocultures positives réside souvent dans la distinction entre les
vraies bactériémies et la traduction d’une contamination exogène du prélèvement. Dans la
plupart des laboratoires, 30 à 50% des hémocultures sont des faux positifs dus à des
contaminations d’où l’importance d’une asepsie rigoureuse lors du prélèvement (Bertholom,
2016-A).
La positivité de l’hémoculture ne fait aucun doute si le même germe est retrouvé à partir
de plusieurs prélèvements et si les signes sont évocateurs, ou lorsqu’un pathogène spécifique
(exemple Listeria,Brucelaa spp…) est isolé même à partir d’une hémoculture positive unique.
Par contre, l’isolement d’un germe commensal qui appartient naturellement à la flore cutanée et
/ou environnementale est en faveur d’une souillure (Bertholom, 2016-A).
 Hémoculture négative :
Cette éventualité signe le plus souvent l’absence réelle de germes dans la circulation
sanguine. Pourtant l’hémoculture peut parfois être faussement négative à cause d’un échec de
culture qui peut être la conséquence d’un traitement antibiotique, d’une quantité de sang inoculée
insuffisante, d’une croissance bactérienne trop lente ou d’un milieu de culture non adapté aux
germes en cause (Bertholom, 2016-A).
2.6. Prélèvements périphériques:

Suite à une hémoculture positive, des prélèvements périphériques sont effectués dans le
but de rechercher le foyer infectieux primaire et de déterminer la porte d’entrée de l’agent
microbien pour confirmer le diagnostic d’une bactériémie néonatale précoce (Bonacorsi et al,
2018).
Les prélèvements périphériques sont de trois types : les prélèvements superficiels (oreille,
bouche, nez...), le prélèvement gastrique et le prélèvement placentaire (voir annexe 3).
12
D’après l’agence nationale d’accréditation et d’évaluation en santé (ANAES), toute

hémoculture doit être associée avec à une culture de liquide gastrique sur une gélose au sang et
un autre prélèvement périphérique au choix (ANAES, 2011).
IV. Emergence de la résistance aux β -lactamines :

1. Origines de la résistance aux antibiotiques :
Les antibiotiques sont des substances chimiques capables d’inhiber la croissance des
microorganismes en agissant sur leur métabolisme dans le but de limiter la reproduction des
bactéries (substances bactériostatiques), ou même de les détruire (substances bactéricides).
La résistance aux antibiotiques peut être :
- naturelle ou intrinsèque : elle concerne toutes les souches de la même espèce

bactérienne.
- acquise : elle est la plus préoccupante et se caractérise par l’apparition subite d’une
résistance à un ou plusieurs antibiotiques chez certaines bactéries qui étaient auparavant
sensibles. Lorsque des antibiotiques sont mal ou trop utilisés chez l'homme et/ou l'animal, les
bactéries peuvent s'armer contre ces antibiotiques, en produisant certaines substances chimiques
(enzymes) capables de contrer l’effet de ces derniers. Ils perdent ainsi leur efficacité et ne
peuvent plus être employés pour combattre les infections. Lors de la multiplication bactérienne,
l’ADN peut faire l’objet de mutations qui entrainent des variations génétiques qui, sous l’effet
d’une pression sélective importante, peuvent se transmettre d’une génération à l’autre, donnant
rapidement une descendance pleinement ou majoritairement résistante. Les gènes de résistance
peuvent également se propager et se transmettre à d’autres espèces (Elhani, 2011).
2. Le cas particulier des β -lactamines :

2.1. Définition des β -lactamines :
Les β-lactamines sont des acides organiques relativement forts, formés par un noyau de
base, le β-lactame, responsable de leur activité antimicrobienne. Elles comprennent les
pénicillines, les céphalosporines, les carbapénèmes, les monobactames et les inhibiteurs des β-
lactamases.
Les β-lactamines agissent en bloquant la synthèse des peptidoglycanes indispensables à la

synthèse de la paroi bactérienne surtout chez les bacilles à gram (-) et les cocci à Gram (+).
Etant des antibiotiques à large spectre, elles sont largement utilisées pour lutter contre toutes
13
sortes d’infections bactériennes. Cependant, les β-lactamines sont particulièrement efficaces

contre les espèces Staphylococcus aureus et E. coli ainsi que les bactéries du genre Salmonella
(Buxeraud et al, 2016).
La fin du 20èmesiècle a été marquée par l’émergence d’une résistance aux β-lactamines
conduisant à des échecs thérapeutiques fréquents (figure 2). Cela pose un problème de santé
publique, en particulier dans les hôpitaux où le manque d’hygiène expose les malades à
différents germes opportunistes (tels que S. aureus, P. aeruginosa, E.coli, K. pneumoniae, A.
baumani, E. cloacae et S. marcesens) responsables d’infections nosocomiales aggravant souvent
l’état des patients.
Figure 2 : Historique de l’émergence de la résistance aux β-lactamines (d’après Buxeraud

et al, 2016).
2.2. Résistance à la méthicilline :

Découverte en 1959, c’est une β-lactamine de la classe des pénicillines souvent utilisée
pour l’antibiothérapie des germes à Gram (+), en particulier S. aureus. Commercialisée en 1961,
le milieu hospitalier anglais a été le théâtre dès 1962 de l’émergence d’une nouvelle souche de
S.aureus résistante à la méthicilline (SARM). Puis les SARM se sont répandus dans les hôpitaux
du monde entier et en particulier dans les services de soins intensifs (Buehlmann et Chuard,
2007 ; Behzadnia et al, 2013). Par ailleurs, les SARM sont des souches multi-résistantes aux
antibiotiques, ce qui rend la thérapie de plus en plus pénible en cas d’infection nosocomiale
(Morikawa et al, 2012).
Des études, menées par Sisirak et al (2010), ont démontrées que l'acquisition de la
résistance à la méthicilline est plus fréquente chez les patients traités par pénicillines que chez
ceux exposés aux fluoroquinolones, aux macrolides ou à la pristinamycilline.
Chez les SARM, la résistance à la méthicilline est contrôlée par le gène mecA. Localisé
sur un élément génétique mobile (Staphylococcal Cassette Chromosome mec ou SCCmec), il a
14
probablement été transféré horizontalement à S. Aureus par une espèce de staphylocoque

coagulase négative. Ce gène code pour la transpeptidase PBP2a impliquée dans la synthèse de la
paroi bactérienne. Contrairement aux autres transpeptidases, cette enzyme présente une faible
affinité pour les pénicillines, ce qui rend possible la poursuite de la synthèse de la paroi
bactérienne même en présence de β-lactamines (Buehlmann et Chuard, 2007). Plusieurs autres
bactéries possèdent une résistance à la méthicilline. Cela est dû à un changement de l’affinité
pour les glycopeptides et une modification au niveau du peptidoglycane.
2.3. Production de β -lactamases à spectre étendu (BLSE) :
Les BLSE ont été découvertes en 1980, en France puis en Allemagne (Vora et
Auckenthaler, 2009). La première bactérie productrice de BLSE (K. pneumoniae BLSE) décrite
en Afrique a été isolée en 1984 en Tunisie, à l’hôpital Charles Nicolle. D’autres entérobactéries
productrices de BLSE ont ensuite été isolées (E. coli, Salmonella spp, Providencia stuartii), mais
K. pneumoniae BLSE reste prédominante avec une prévalence pouvant atteindre plus de 87 %
dans les unités de soins intensifs pédiatriques tunisiens (Elhani et al, 2012). Les bactéries
productrices de BLSE sont souvent multi-résistantes et la recrudescence des infections à
bactéries productrices de BLSE en milieu hospitalier entraine très souvent l’échec de
l'antibiothérapie.
Les BLSE forment une grande famille d’enzymes bactériennes hétéroclites capables
d'hydrolyser la plupart des β-lactamines. Elles sont l’arme de résistance des BGN vis-à-vis des β-
lactamines. Ces enzymes sont très actives sur les pénicillines, les céphalosporines de 3 ème
génération (ceftazidime et céfotaxime) et les monobactames (aztreonam), et ne ménagent que les
céphamycines et les carbapénèmes. Elles sont souvent le résultat d’une mutation génétique de
gènes codant pour des β-lactamases naturelles (Vora et Auckenthaler, 2009).
La détection des BLSE peut se faire :
- par une approche phénotypique basée sur des tests de synergies par exemple entre le
clavulanate et la céphalosporine de troisième génération (voir annexe 4), l’utilisation d’un milieu
chromogénique, la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI par l'E-Test),
et le test des disques combinés (Philippon, 2013).
- par une approche génotypique basée sur l’amplification des gènes codant pour les BLSE
(Philippon, 2013).
15
2.4. Les carbapénèmases :

A ce jour, les carbapénèmes représentent le traitement de dernier recours des BGN
producteurs de BLSE, lorsqu’ils ne sont pas producteurs de carbapénémases. Ces dernières sont
des β-lactamases (groupées en classes A, B, C, et D) capables d’hydrolyser les carbapénèmes
(imipénème, méropénème, ertapénème et doripénème). Ce sont des enzymes qui ont été
détectées dans presque toutes les espèces de K. pneumoniae, et qui sont produites par la majorité
des germes nosocomiaux. La production de carbapénémases étant majoritairement associée à une
multi-résistance aux antibiotiques et en particulier à la production de BLSE, leur recrudescence
risque de conduire à une impasse thérapeutique. L’antibiothérapie utilisée en traitement contre
les espèces productrices de β-lactamases se limite aujourd’hui à certains aminosides, la
tigécycine, la collicine, la fosfomycine, ou certaines quinolones (Nordmann et Career, 2010).
La détection des carbapénèmases se fait par une analyse du profil de résistance obtenu
par un antibiogramme. L’étape suivante est le test microbiologique d’activité carbapénémase ou
test de « Hodge » qui reste difficile à réaliser et à interpréter. L’amplification par PCR des gènes
codant pour les carbapénémases restent la méthode la plus spécifique pour l’identification des
carbapénémases (Nordmann et Career, 2010).
16
ISSBAT 2017 – 2018 Matériels et méthodes
I. Population d’étude :
C’est une étude rétrospective réalisée du 01 janvier 2017 au 31 décembre 2017, portant
sur 300 cas de bactériémies diagnostiquées chez des patients hospitalisés dans le service de
néonatologie de l’Hôpital Militaire Principal d’Instruction de Tunis (HMPIT).
Les données ont été recueillies à partir des systèmes informatiques (logiciel SYSLAB) de
l’archive du laboratoire de microbiologie de l’HMPIT. Ces données comportaient le nom et le
sexe du malade, la date de prélèvement, les germes responsables des bactériémies et les données
de l’antibiogramme.
Pour note : un apprentissage de l’ensemble des techniques relatives au déroulement complet

d’une hémoculture a été réalisé sur des prélèvements effectués entre février et mars 2018.
II. Matériel:
1. Milieux de culture :
*Flacons Fan : Ce sont des flacons pédiatriques remplis avec un milieu reformulé qui favorise la
croissance des bactéries et des levures. Ils contiennent des billes polymériques absorbantes
permettant une neutralisation optimale des antibiotiques potentiellement retrouvés dans la
circulation sanguine des patients.
*La gélose au sang : c’est un milieu de base non sélectif pour l’isolement des bactéries. Il est
additionné de sang stérile défibriné donnant des réactions d’hémolyses typiques. La lecture de
l’hémolyse est un critère d’orientation, essentiellement pour les streptocoques.
*La gélose au sang cuit (chocolat) : c’est un milieu non sélectif qui permet la culture de
bactéries très exigeantes. Il est très riche en hématine et en NAD+ qui sont favorables à la
croissance des Haemophilus et des Neisseria.
*La gélose Drigalski : c’est un milieu sélectif pour l’isolement des bactéries à Gram négatif (les
entérobactéries). Il permet la différenciation des bactéries suivant leur aptitude à fermenter le
lactose.
*La gélose Muller-Hinton (MH) : c’est un milieu de base non sélectif pour la culture des
bactéries non exigeantes autres que celles à croissance lente. Elle permet la réalisation de
l’antibiogramme standard.
17
*La gélose Muller-Hinton au sang de cheval défibriné et additionnée de β-NAD (MH-F) :

c’est un milieu qui favorise la croissance des bactéries fastidieuses que l’on trouve dans les
pathologies humaines (pneumocoques, Haemophilus, Moraxella, Listeria, autres types de
streptocoques…).
La composition précise et le mode de préparation (si elle se fait au laboratoire) de chacun

des milieux utilisés sont décrits dans l’annexe 5.
2. Bact-Alert 3D (Biomérieux) :
Toutes les hémocultures parvenues ont été incubées dans l’automate Bact-alerte 3D
combinaison (Biomérieux). C’est un système automatisé qui assure en continu et simultanément
la surveillance, l’agitation et l’incubation de tous les flacons d’hémocultures introduits (figure 3
et 4).
Tiroirs de mise Module

en place des de
flacons (60 contrôle.
cellules/tiroirs)
Lecteur
de code à
barres.
Figure 3: L'automate Bact/Alert 3D®
Figure 4 : Photo montrant la mise en place des flacons d’hémoculture dans le Bact/Alert
3D®.
18
3. VITEK®2 Compact (Biomérieux):
L’automate VITEK de bioMérieux (figure 5) est un système sécurisé et automatisé

composé d’instruments, d’un logiciel et de cartes. Il est utilisé pour l’identification des bactéries
et la détermination de leur sensibilité aux antibiotiques.
Des cartes d'identification VITEK®2 (figure 6) ont été utilisées. Chaque carte comporte
plus de 40 tests biochimiques. L’interprétation des tests est basée sur la technologie de
colorimétrie avancée, assuré par 3 longueurs d’ondes différentes.
Il détermine aussi la concentration minimal inhibitrice (CMI) pour la plupart des

combinaisons germe /antibiotique ainsi qu’une catégorie clinique : sensible, intermédiaire,
résistant.
Dans le cadre de ce travail, les cartes d’identification GN (Gram négatif) et GP (Gram

positif) ainsi que les cartes d’antibiogrammes AST 357 ont été utilisées.
Les cartes GN et GP : Elles servent respectivement à l’identification des germes à Gram négatif
et à Gram positif. Elles font appel à des tests biochimiques conventionnels (mesure de la capacité
d’utilisation de substrats comme sources de carbone, ou mise en évidence d’activités
enzymatiques).
Les résultats définitifs sont obtenus en 10 heures pour les Gram négatifs et 8 heures pour les
Gram positifs.
L’identification est réalisée selon les données et les connaissances sur le germe et les réactions
en cours d’analyse. Cependant, une quantité suffisante de données concernant des souches
connues ont été recueillies pour estimer les réactions typiques d’espèces pour un ensemble de
tests biochimiques discriminants.
Les cartes AST 357 : sont utilisées pour déterminer la sensibilité aux antibiotiques des BGN
fréquemment rencontrés. Pour les cocci à gram positif, l’antibiogramme a été préparé
manuellement.
Chaque carte AST contient 64 micro-puits. Un puit de contrôle contenant uniquement un

milieu de culture est présent sur toutes les cartes et les autres puits contiennent des
concentrations préétablies d’un antibiotique donné et un milieu de culture.
Au terme du cycle d’incubation, les valeurs de CMI sont déterminées pour chaque antibiotique
présent sur la carte.
19
Ecran de
contrôle.
Espace réservé
au remplissage
des cartes.
Espace réservé Instrument

à l’élimination automatisé pour
des cartes après l’identification et
la phase de l’antibiogramme.
remplissage.
Figure 5: Système VITEK®2 Compact
Micro-puits
Tube de
transfert.
Figure 6 : Photo d’une carte d'identification VITEK®2
III. Méthodes :
1. Prélèvements sanguins :
Les prélèvements ont été faits par ponction de la veine jugulaire, crânienne ou ombilicale
chez le nouveau-né et le nourrisson après désinfection de la peau. Ils ont été effectués dans des
conditions d’asepsie extrême afin d'éviter tout risque de contamination. En effet, toute
contamination par n'importe quel type de germes peut gêner l'interprétation du résultat.
Pour le diagnostic des bactériémies, il existe deux types du prélèvement :
 Unique : 4 à 6 flacons en un seul prélèvement.

 Multiples : 2 à 3 ponctions de 2 flacons par tranche pendant 24 heures.
Ces prélèvements de sang total ont servis à inoculer des flacons d’hémoculture : les flacons
pédiatrique Fan qui ont ensuite été acheminés rapidement au laboratoire.
20
2. Mise en culture dans le Bact-alerte 3D :
Toutes les hémocultures parvenues au laboratoire de microbiologie de l’HMPIT ont été

incubées dans l’automate Bact-Alerte 3D combination (BioMérieux) à 37˚C pendant six jours et
les lectures ont été effectuées toutes les 10 minutes. L’appareil avertit chaque résultat positif
grâce à une alarme sonore et visuelle.
3. Examen microscopique direct :
Les microorganismes éventuellement détectés par l’automate doivent être mis en

évidence par un examen microscopique direct réalisé à partir d’un échantillon de bouillon
prélevé dans le flacon d’hémoculture. Cet échantillon a été prélevé à partir chaque flacon
d’hémoculture positive, par l’insertion d’une aiguille de subculture à travers la capsule du flacon.
L’échantillon prélevé sert à réaliser un examen microscopique des germes soit à l’état frais soit
après coloration de gram.
Le premier examen à l’état frais se fait à partir d’une goutte déposée sur une lame porte-
objet, et permet de définir le nombre et l’éventuelle mobilité des germes.
Le second se fait après coloration de Gram (annexe 2) d’un frottis et permet de

déterminer la morphologie cellulaire des germes (cocci ou bacille à gram négatif ou positif).
Ces deux examens ont également permis de déterminer si l’hémoculture était mono-
microbienne ou poly-microbienne.
4. Isolement des germes sur milieux gélosés :
Les examens microscopiques directs ne constituent qu’une étape d’orientation, ils sont
complétés par l’isolement des germes présents dans les flacons d’hémoculture pour permettre
l’identification complète des bactéries. L’isolement se fait par repiquage sur des milieux solides
Le choix des milieux gélosés à utiliser (Gélose au sang, au sang cuit ou Drigalski) a été orienté
par la coloration de Gram.
Un échantillon a été prélevé à partir de chaque flacon d’hémoculture positive, par

l’insertion d’une aiguille de subculture à travers la capsule du flacon. L’échantillon prélevé a été
ensemencé par la méthode en 4 quadrants sur l’une des 3 géloses citées. Les milieuxensemencés
ont ensuite été incubés pendant 48h dans deux étuves différentes (tableau 3). Les conditions
d’asepsie ont été rigoureusement respectées.
21
Tableau 3 : Milieux de culture et températures incubation.
Milieux de culture Types d’étuves

Gélose au sang Une étuve à 37°C enrichie en CO2.
Gélose au sang cuit (chocolat).
Gélose Drigalski Une étuve à 37°C.
L'interprétation se fait comme suit:

 Culture négative : absence des bactéries dans la subculture.
 Culture positive poly-microbienne : plusieurs types de colonies dans le milieu.
 Culture positive mono-microbienne: un seul type de colonie.
5. Identification des germes isolés :

5.1. Caractérisation morphologique :
Basée sur :
- l’observation à l’œil nu des caractères culturaux des bactéries (aspect des colonies sur
les différents milieux de culture), la présence de pigmentation ou d’odeur particulière produite
par certaines bactéries.
- l’observation microscopique des cellules bactériennes après coloration de Gram (type de
Gram, forme et type de regroupement des bactéries).
5 .2. Caractérisation biochimique :
Basée sur la réalisation de différents tests :

- manuels tels que les tests catalase, oxydase et coagulase
- tests réalisés dans l’automate Vitek.
5.2.1. Tests biochimiques manuels :

Test catalase :
Ce test est à la base de l’identification des bactéries Gram (-).
La catalase est une enzyme qui facilite la dégradation du peroxyde d’hydrogène H2O2,
molécule toxique produite au cours du métabolisme aérobie et dégagée par un nombre important
de bactéries. La réaction est la suivante :
H₂O₂ H₂O + ½ O₂
La technique est décrite dans le tableau 4.
22
Tableau 4 : Technique du test catalase

Réactif Technique Résultat
Eau 1. Verser quelques gouttes d’eau Premier cas :
oxygénée oxygénée sur une lame. Absence de dégagement gazeux
2. Prélever à l’aide d’une anse ou La souche est dite catalase (-).
d’une pipette pasteur quelques Deuxième cas :
colonies de la souche à tester Il y a une effervescence
3. Dissocier les colonies dans la goutte La souche est dite catalase (+).
Figure 7: Test catalase
Test oxydase :
Ce test est à la base de l’identification des bactéries Gram (-).
Egalement appelée cytochrome c oxydase, la phénylène diamine oxydase est une enzyme
de la chaine respiratoire bactérienne qui peut oxyder le N-diméthyl-paraphénylène diamine ou le
N-tétraméthyle-paraphényléne diamine contenus dans le réactif d’oxydase. La réation est la
suivante :
DH₂ + ½ O₂ D + H₂O

Tableau 5 : Technique du test oxydase
Réactif Technique Résultat

* Oxalate de N-tétraméthyle 1. Prendre une lame Premier cas :
-paraphényléne diamine t. propre. Apparition d’une coloration rose/violette
* Oxalate de N-diméthyle - 2. Mettre le disque au niveau du disque
paraphényléne diamine n imprégné du réactif et La souche étudiée est oxydase (+).
Xn. l’imbiber avec quelques Deuxième cas
gouttes de l’eau distillée. Le disque reste incolore, la souche
3. Placer quelques étudiée est oxydase(-).
colonies au niveau du
disque
Figure 8 : Test oxydase
23
Test coagulase :
La coagulase est une enzyme qui possède un pouvoir pathogène chez les bactéries, elle
nous oriente vers un genre de staphylocoque, puisque staphylococcus aureus est la seule espèce
qui peut coaguler le plasma du lapin. La réaction est la suivante :
Fibrinogène + H₂O Fibrine qui se polymérise + peptide
Tableau 6 : Technique du test coagulase
Réactif Technique Résultats

Plasma de lapin 1. Mettre dans un tube à hémolyse Premier cas :
oxalaté quelques gouttes du plasma du Coagulation du plasma
lapin. orientation vers le genre
staphylococcus aureus.
2. Ajouter quelques colonies de la Deuxième cas :
souche à étudier. Le plasma reste à l’état liquide.
Orientation vers le genre.
3. Placer le tube à l’étuve à 37°C staphylococcus.
pendant 24h
+
-
Figure 9: Test coagulase
5.2.2. Tests biochimiques automatisés :
Une carte GN ou GP a été utilisée pour identifier chaque microorganisme isolé à partir
d’une hémoculture positive. Le choix de la carte a été conditionné par les résultats de la
coloration de Gram (GN pour les bactéries Gram (-) et GP pour les bactéries Gram (+)).
Chaque carte a été placée dans un tube transparent contenant un inoculum constitué d’une
suspension bactérienne.
Chaque suspension bactérienne a été préparée en mélangeant une quantité d’eau

physiologique (Nacl 0.9 %) avec une quantité de bactéries, prélevées à partir d’une colonie
isolée sur gélose. La turbidité de la suspension obtenue doit être comprise entre 0.5 et 0.65 Mac
Farland. La turbidité a été contrôlée par un densitomètre. Elle a été ajustée soit par ajout de
bactéries, soit par ajout de solution salée.
24
Les tubes, numérotés et arrangés selon l’ordre des patients, ont été placés dans une
cassette où les micro-puits des cartes se remplissent grâce aux tubes de transferts. Une fois le
remplissage terminé, les tubes de transferts ont été séparés de chaque carte. Celles-ci ont enfin
été scellées et incubées à 35.5+/- 1.0°C dans l’automate Vitek.
La détection de chaque réaction a été réalisée par l’automate. Les résultats des caractères
biochimiques ont été notés «-» pour une réaction négative, « + » pour une réaction positive, « ? »
pour toutes réactions ininterprétables. Enfin, l’automate a produit un profil métabolique qui a été
comparé aux profils de taxons connus et répertoriés dans sa base de données. Un calcul de
probabilité d’identification correcte a été effectué grâce au logiciel de l’automate.
6. Test de sensibilité aux antibiotiques :
Toutes les souches isolées ont fait l’objet d’un antibiogramme afin de détecter les
résistances éventuelles aux antibiotiques et d’instaurer une antibiothérapie des plus adaptées à
chaque cas.
Les antibiogrammes ont soit été réalisés en utilisant la carte AST357 du Vitek selon le
même procédé décrit pour les cartes GN et GP, soit manuellement par la méthode de diffusion en
milieu gélosé MH ou MH-F. Les antibiogrammes manuels ont été préparés selon les normes et
les recommandations du Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie
(CA-SFM, 2018) :
Une suspension bactérienne a été préparée, pour chaque bactérie à tester, en mélangeant
une quantité d’eau physiologique (Nacl 0.9 %) avec une quantité de bactéries, prélevées à partir
d’une colonie isolée sur gélose. La turbidité de la suspension obtenue doit être comprise entre 0.5
Mac Farland (CA-SFM 2018). La turbidité a été contrôlée par un densitomètre. Elle a été ajustée
soit par ajout de bactéries, soit par ajout de solution salée.
L’inoculum préparé, a été employé dans les 15 minutes qui suivent sa préparation.
L’inoculation a été effectuée selon les étapes suivantes :
1- Plonger un écouvillon en coton stérile dans la suspension bactérienne.

2- Rejeter l’excès de liquide, pour éviter une sur-inoculation des boites.
3- Ecouvillonner sur la totalité de la surface de la gélose dans 3 directions différentes.
4- Déposer les disques à la surface du milieu de culture à l’aide d’une paire de pinces
stérilisées à la flamme et refroidies, ou avec un distributeur de disques ; puis, on appuie
légèrement sur les disques pour s’assurer qu’il y a un contact avec le milieu. Le contact
25
avec la surface doit être étroit. Une fois déposés, les disques ne peuvent être déplacés car
la diffusion des antibiotiques rapide a déjà commencé.
5- Incuber les boites de Pétri à 35-37°C pendant 16 à 24 heures en présence de 4 à 6% CO2
en aérobiose.
Après incubation, le diamètre de chaque zone d’inhibition observée à été mesurée grâce
à un système de lecture automatisé. Chaque diamètre correspond à une concentration minimale
inhibitrice ou CMI.
L’interprétation des résultats a été faite par comparaison des valeurs obtenues avec des
valeurs de référence : la concentration critique minimale ou CCmin, qui correspond à un
diamètre de 24 mm, et la concentration critique maximale ou CCmax, qui correspond à un
diamètre de 23 mm.
Lorsque le diamètre de la zone d’inhibition est inférieur à 23 mm (CMI>CCmax), la

bactérie est dite résistante. Lorsque le diamètre de la zone d’inhibition est supérieur à 24 mm
(CMI<CCmin), la bactérie est dite sensible. Lorsque le diamètre de la zone d’inhibition est
compris entre 23 mm et 24 mm (CCmin<CMI<CCmax), la bactérie est dite de sensibilité ou de
résistance intermédiaire (voir annexe 6).
26
ISSBAT 2017 – 2018 Résultats
IV. Résultats :
2017 à décembre 2017 :
Durant la période d'étude, 745 hémocultures en provenance du service de néonatologie

ont été analysées au laboratoire de microbiologie de l'HMPIT.
Les résultats des hémocultures durant la période du 1er janvier 2017 au 31 décembre
2017 sont présentés dans la figure 10.
Figure 10 : Répartition des hémocultures en 2017
Parmi ces hémocultures, 430 étaient négatives (soit 57.7%), 21 étaient contaminées (soit
2.8%) et 294 hémocultures étaient positives (soit 39.5%) dont 9,53% étaient à interpréter selon le
contexte clinique des patients concernés. Au total, 294 souches bactériennes ont été isolées et
analysées.
La répartition des nouveau-nés infectés selon le sexe est présentée dans la figure 11.
Figure 11 : Répartition des nouveau-nés selon le sexe en 2017
27
Durant la période d'étude, 63% des nouveau-nés infectés étaient de sexe masculin
(N=184) et 37 % de sexe féminin (N=110), ce qui correspond à un sexe ratio de 1,67.
La coloration de gram réalisée à partir des hémocultures détectées positives a permis de

montrer la forme, le type de regroupement et le type de paroi des germes. La répartition des
germes en fonction de leur morphologie est représentée dans la figure 12.
Figure 12 : Répartition des germes isolés selon la coloration de Gram
Les BGN représentent les germes les plus fréquemment isolés au cours de notre étude,
avec un taux de 52%.
Les différentes espèces isolées dans notre étude sont présentées dans la figure 13.
Figure 13 : Nature des germes isolés

28
Les bacilles à Gram négatifs isolés à partir des hémocultures positives étaient en majorité :
15.60% de Klebsiella spp dont 41.30% de K. pneumoniae, et 22.80% d’Alcaligenese spp dont
95.5% d’Alcaligenes xylosoxidans. Les cocci à Gram positif étaient majoritairement des
staphylocoques à coagulase négative (39.45%) dont S. haemolyticus, S. epidermidis et S.
hominis.
Parmi les bactéries minoritaires :
- 3 germes très souvent responsables de bactériémies précoces (d’origine materno-fœtale)

ont été détectées : E. coli (1.36%), Staphylococcus aureus (1.70%), et Streptococcus agalactiae.
- 3 groupes de germes essentiellement responsables d'infections nosocomiales ont été

identifiés : les staphylocoques spp (41.2%), les entérobactéries (21.8%) avec une majorité de
Klebsiella (15.60%) et de BGN non fermentaires (30.3%).
La figure 14 montre la répartition du type d’hémocultures (positive, négative ou

contaminée) en fonction des mois.
Figure 14 : Répartition des hémocultures en fonction des mois
Le pourcentage des hémocultures positives était pratiquement stable tout au long de la

période étudiée. Cependant au cours de la période estivale (mai–août) il y a eu une recrudescence
importante des hémocultures contaminées avec un pic de 38 % au mois de Juin, alors qu’elles
étaient totalement absentes pendant le reste de l’année.
29
La répartition des espèces selon le mois est présentée dans la figure ci-dessous :
Figure 15 : Répartition des espèces selon le mois.
Le taux d’isolement des staphylocoques à coagulase négative a augmenté à partir du mois

de février (N=11) pour atteindre N= 21 en octobre, avec une légère baisse en Juillet (N=7).
Les Alcaligenese spp, en particulier Alcaligenes xylosidans, prévalaient avec un taux

important (Nmoyenne = 13) pendant la période estivale (mai-juillet).
Pour les autres germes le taux d’isolement variait d’un mois à un autre mais avec des taux
restant faibles.
2. Etude de la résistance aux antibiotiques des principaux germes isolés:
Le système automatisé Vitek a permis de tester la sensibilité des BGN, les plus
fréquemment isolés à partir d’hémocultures positives, à savoir Alcaligenes xylosidans et
Klebsiella pneumoniae, à différentes β-lactamines et autres familles d’antibiotiques.
30
Par contre, les staphylocoques à coagulase négatif qui étaient non seulement les germes
les plus incriminés dans les bactériémies, mais aussi les plus nombreux des CGP isolés ont
également été testés pour leur sensibilité aux antibiotiques, mais manuellement.
Les taux de résistance et de sensibilité d’Alcaligenes xylosoxidans aux différents

antibiotiques testés sont présentés dans le graphique de la figure 16.
Figure 16 : Profil de résistance des souches d’Alcaligenes xylosoxidans isolées.
β-lactamines :Pénicillines : Pipéracilline (PIP), Pipéracilline + Tazobactam (TZP), Ticarcilline (TIC),

Ticarcilline + Acideclavulanique (TCC). Cephèmes : Céfotaxime (CTX), Ceftazidime (CAZ), Cefepime (CEF).
Carbapénèmes :Imipénéme (IMP), Méropenème (MEM).
Aminosides : Amikacine (AMK), Gentamycine (GNT), Tobramycine (TM).
Fosfomycine : Fosfomycine (FOS).
Certaines souches d’Alcaligenes xylosoxidans présentaient une multi-résistance aux

aminosides testés et à la fosfomycine.
D’autres, présentaient un taux de résistance intermédiaire à certaines céphalosporines

(céfotaxime et céfépime) supérieur à 50% alors qu’elles étaient toutes sensibles à la ceftazidime.
Par ailleurs, toutes les souches étaient sensibles aux pénicillines seules ou en association
avec un inhibiteur de β-lactamase, et aux carbapénèmes testés.
31
Les taux de résistance et de sensibilité de Klebsiella pneumoniae aux différentes β-

lactamines testées sont présentés dans la figure 17.
Figure 17 : Profil de résistance des souches de Klebsiella pneumoniae isolées.
β-lactamines :Pénicillines: Amoxicilline (AMX), Pipéracilline (PIP), Pipéracilline + tazobactam

(TZP), Ticarcilline (TIC), Amoxicilline + acide clavulanique (AMC), Ticarcilline + acide clavulanique
(TCC). Cephèmes : Céfoxitine (FOX), Céfixime (CFM), Céfépime (CEF), Ceftriaxone (CRO)
Ceftazidime (CAZ), Céfotaxime (CTX). Carbapénèmes et Monobactams : Ertapénème (ETP),
Imipénème (IPM), Aztréonam (ATM).
Aminosides : Gentamicine (GNT), Tobramycine (TM), Amikacine (AMK).
Polymixine : Colistine (CL).
La majorité des souches de Klebsiella pneumoniae présentaient une multi-résistance à la

majorité des β-lactamines testées (toutes les pénicillines seules et l’association ticarcilline/acide
clavulanique, et à certaines céphalosporines de 3ème génération : céfotaxime, cefixime,
ceftriaxone) et à certains aminosides (tobramycine et gentamicine).
Une grande partie étaient sensibles à l’ertapénème et à la colistine.
Les taux de résistance et de sensibilité des staphylocoques à coagulase négative aux

différents antibiotiques testés sont présentés dans la figure 18.
32
Figure 18 : Profil de résistance des souches de staphylocoques à coagulase négative isolées.
β-lactamines :Pénicillines : PénicillineG (P),Oxacilline (O),Amoxicilline(AMX).Cephèmes : Céfoxitine

(FOX).
Aminosides :Kanamycine (K), Gentamycine (GNT), Tobramycine (TM), Amikacine (AMK).
Tétracyclines :Tetracycline (TE).
Phénicolés : Chloramphénicol (C).
Macrolides et apparentés (MLS):Erytromycine (E), Lincomycine (L), Pristinamycine (PR), Quinupristin-
dalfoprystine (QD).
Acide fusidique : Acide fusidique (FA).
Oxazolidinones : Linézolide (LNZ).
Glycopeptides : Vancomycine (VAN), Teicoplanine (TEC).
Dans notre étude, la majorité des souches de staphylocoques à coagulase négative (plus
de 80 %) étaient des bactéries résistantes pour l’ensemble des pénicillines. Le taux de résistance
à la céfoxitine (ou méticilline) était assez conséquent avec une valeur de 70 % de souches
résistantes.
Des taux importants de résistances à d’autres familles d’antibiotiques (aminosides,

érythromycine et fosfomycine) supérieur ou égal à 80 % ont également été notés.
33
Les antibiotiques les plus efficaces contre les SCN parmi ceux testés étaient de la famille
des MLD (pristinamycine et quinupristin-dalfoprystine) et des aminosides (vancomycine et
téicoplanine) avec un pourcentage de sensibilité supérieur ou égal à 75%.
34
ISSBAT 2017 – 2018 Discussion
V. Discussion :
2017 à décembre 2017.
Les bactériémies chez les nouveau-nés représentent une véritable urgence diagnostique et
thérapeutique. La population étudiée présente plusieurs facteurs de risque: prématurité, faible
poids de naissance, système immunitaire immature, ventilation mécanique, présence de cathéters
veineux ombilicaux et autres procédures invasives.
En présence d’une évolution imprévisible des phénotypes de résistance aux antibiotiques

des pathogènes responsables des infections néonatales ou tardives, il est essentiel de re-situer les
problèmes de santé, de fournir des connaissances et des informations nécessaires à la mise en
œuvre d’action sanitaire efficace au meilleur coût pour les individus et la collectivité des
nouveau-nés, et d’assurer une adaptation de l’antibiothérapie. En effet, le délai de rendu des
résultats est souvent un facteur pronostic des bactériémies.
En ce qui concerne la répartition des bactériémies en fonction du sexe, la catégorie

masculine a été la plus vulnérable aux bactériémies néonatales (63%) avec un sexe ratio de 1.67.
Nos résultats concordent avec ceux obtenus lors d’une étude réalisée récemment à Abidjan qui
montrent des taux respectifs d’infection de 65.4% et 34.6% pour les sexes masculin et féminin
(Folquet et al, 2016). Un sexe ratio équivalent de 1.63 a également été noté au Cameroun en
2016 (Kemeze et al, 2016).
Dans notre étude, le taux de positivité d’hémocultures examinées était de 39.5%. Ce

chiffre est supérieur à celui (15,5 %) mis en avant par une étude réalisée au Mali en 2004 (Maïga
et al, 2004), mais bien inférieur au taux moyen de positivité (52%) observé en moyenne dans les
pays en voie de développement (Andrianarivelo et al, 2010).
Le profil bactériologique des isolats d’hémoculture, dans le service de néonatologie e

l’HMPIT a montré une prédominance des BGN (52%) par rapport aux cocci à Gram positif
(48%). Au Cameroun, une étude récente chez les nourrissons a montré des résultats similaires
avec 56% de BGN et 44% de CPG (Kemeze et al, 2016). Les bactériémies à BGN occupent une
place de plus en plus importante en pathologie humaine. Elles sont parmi les infections les plus
redoutables, surtout en milieu hospitalier où elles aggravent le pronostic des bactériémies avec
un fort taux de mortalité.
35
Dans notre étude, Alcaligenes xylosoxidans était l’espèce de BGN la plus fréquemment
isolée (22,80%) suivie de Klebsiella pneumoniae (15.6%). Listeria monocytogéne était absente
dans nos résultats, par contre elle a été en cause dans 59% des cas dans une étude Française
(Goulet et Laurent, 2008).
Alcaligenes xylosoxidans (nommée également Achromobacter xylosoxidans) fait partie

du groupe des BGN non fermentaires. Opportuniste, elle est responsable de nombreuses
infections (infections urinaires, ostéomyélites, conjonctivites, endocardites) chez les patients
immunodéprimés dont des bactériémies tardives souvent associées au port d’un cathéter (Kim et
al, 2008). Une étude marocaine a montré qu’Alcaligenes xylosoxidans représentait 22% des
isolats (Abba et al, 2012). Cependant, ce taux était largement inférieur au chiffre obtenu
(61.14%) lors d’une étude faite à Monastir (Kooli et al, 2014). Par ailleurs, la recrudescence de
cette bactérie pendant les mois de mai, juin et juillet suggère l’observation d’une épidémie
nosocomiale à Alcaligenes xylosoxidans au sein du service néonatologie.
Klebsiella pneumoniae est une bactérie naturellement présente dans le tube digestif et les
poumons de l’homme. Mais, elle ne provoque pas d’infections tant qu’elle est bien contrôlée.
Toutefois, elle peut devenir agressive lorsque l’organisme est immunodéprimé, provoquant ainsi
plusieurs types d’infections : angines, infections pulmonaires, infections urinaires et
bactériémies. Une étude à Abidjan en 2016 a démontré que Klebsiella pneumoniae était
responsable de 16.9% des bactériémies détectées en néonatologie (Folquet et al, 2016). D’après
la bibliographie, ce germe est aussi bien mis en cause dans les bactériémies materno-fœtales que
nosocomiales.
Malheureusement les données concernant l’âge et la date d’admission des nouveau-nés au
service de néonatologie de l’HMPIT n’étaient pas disponibles, ne nous permettant pas de
déterminer si les souches de Klebsiella isolées étaient responsables de bactériémies précoces ou
tardives. Cependant, les études tunisiennes (Jaballah et al, 2006) tranchent plutôt en faveur de
bactériémies d’origine nosocomiale.
Nos résultats ont montrées également que les isolats de type cocci à gram positif (41.49%
de l’ensemble des isolats) étaient dominés essentiellement par des staphylocoques spp (40.81%)
avec 39.45 % de staphylocoques à coagulase négative et 1.36 % de Staphylococcus aureus. Le
taux de SCN observés est comparable à celui mis en avant par une statistique faite à l’hôpital de
Douala au Cameroun avec une incrimination des SCN dans 44% des cas de bactériémies tardives
(Kemeze et al, 2016). En France ce taux a même dépassé les 70 % des cas de bactériémies
36
nosocomiales mettant en cause S. epidermidis (Biran et al, 2012 ; Rasigade et al, 2013). Par
contre, la comparaison à la bibliographie tunisienne (Jaballah et al, 2006) montre une nette
différence des fréquences de S. aureus (1.36 % dans notre étude contre 20 %) malgré la multi-
résistance avérée de ce germe.
Par ailleurs, le nombre de cas de bactériémies à SCN dans le service de néonatologie de
l’HMPIT est inquiétant et les périodes d’élévation du nombre de SCN relevés suggèrent
l’observation de 2 épisodes épidémiques préoccupants: de février à juin et d’août à octobre.
D’autres germes à faible incidence, mais néanmoins non anodins ont été isolés ; il s’agit
d’E. Coli (1.36%) (Groupe des entérobactéries) et de Streptococcus agalactiae (0.68%) (Groupe
des SGB). En France, Streptococcus agalactiae est en tête de liste de l’étiologie des
bactériémies néonatales précoces (40 à 50%) suivie d’E.coli (30 à 40 %) (Muller-Pedoby et al,
2011). Au Cameroun et au Maroc, l’incidence de Streptocoque agalactiae est plus faible avec
des taux d’isolement respectifs de 19.35% et 16.63% des cas de bactériémies néonatales
(Kemeze et al, 2016 ; Chemsi et Benomar, 2015).
S. agalatiae est une bactérie commensale du tractus digestif à partir duquel se fait la colonisation
des voies génitales de la femme enceinte. Le portage vaginal varie de 5 à 40% au cours de la
grossesse, et la transmission materno-foetale se fait principalement par ingestion de liquide
amniotique contaminé après rupture des membranes ou au moment du passage dans la filière
uro-génitale (Muller-Pedoby et al, 2011).
Quand à E. coli, c’est un germe commensal du tractus digestif généralement inoffensif

sauf quelques souches qui ont acquis des facteurs de virulence comme E. coli sérotype K1. Elle
est mise en cause dans certaines bactériémies néonatales précoces (Muller-Pedoby et al,
2011 ; Kemeze et al, 2016 ; Chemsi et Benomar, 2015). Dans une étude tunisienne récente E.
coli est citée dans le profil bactériologique des infections nosocomiales dont des bactériémies
chez l’adulte (Trifi et al, 2017).
L’incidence en Tunisie de ces deux dernières bactéries dans les services de néonatologie
n’est pas documentée ; il semblerait donc que ce soit des germes en émergence responsable de
bactériémies materno-fœtales. Il est donc nécessaire qu’un service de surveillance inter-
hospitalier de ces bactéries, et de toutes celles isolées, soit mis en place.
Enfin, le pic d’hémocultures contaminées (38%) observé au mois de juin est en

concordance avec celui observé (20%) pendant la même période lors d’une étude réalisée au
CHU Habib Bourguiba à Sfax en 2005 (Kallel et al, 2005). D’après Bertholom (2016-A), c’est
plus particulièrement l’étape cruciale du prélèvement qui est souvent mise en cause dans la
37
contamination des hémocultures, cette étape étant principalement tributaire de la rigueur de cet
acte médical qui doit se faire dans le respect le plus strict des conditions d’asepsie (port de gants,
d’une coiffe et d’une blouse, antisepsie rigoureuse de la peau du patient, etc...).
Par ailleurs, les figures 13 et 14 de la partie « résultats » montrent une coïncidence entre la
prévalence d’Alcaligenes xylosoxidans (22.8 %) et l’apparition des hémocultures contaminées.
N’ayant aucune donnée concernant l’identité des germes contaminants, aucun lien n’a pu être
fait entre ces deux constats. Cependant, les conditions climatiques de cette période estivale sont
propices à la multiplication d’A. xylosidans, qui est une bactérie hydrique contaminant aussi bien
l’eau que les sols (Granowitz et Keenholtz, 1998). Cet épisode suggère donc une possible
transmission manu-portée d’Alcaligenes xylosoxidans qui auraient aggravé le diagnostic des
bactériémies nosocomiales associées à ce germe.
En conclusion, sans pouvoir donner de chiffres précis, nous considérons que la majorité
des bactériémies détectées seraient d’origine nosocomiale mettant en cause principalement les
SCN, Alcaligenes xylosoxydans et Klebsiella pneumoniae.
2. Etude de la résistance aux antibiotiques des principaux germes isolés:
Concernant les β-lactamines, A. xylosoxidans a été décrit comme présentant une grande
sensibilité à la ticarcilline et à la pipéracilline (pénicillines), à la ceftazidime (céphalosporine de
3ème génération) et aux carbapénèmes. En revanche, il est résistant à l’aztréonam (monobactam)
et à toutes les autres céphalosporines. Concernant, les autres familles d’antibiotiques, A.
xylosoxidans a été décrit dans la littérature comme naturellement résistant aux aminosides et à
d’autres antibiotiques appartenant à la famille des rifamycines et des quinolones (Claassen et al,
2011 ; Amoureux et al, 2013).
Dans cette étude, l'individualisation du principal phénotype a montré une grande

sensibilité de cette bactérie à certaines pénicillines telle que la ticarcilline et la pipéracilline dont
la fréquence était de 100% avec une faible synergie à l’acide clavulanique. Les isolats obtenus
étaient aussi sensibles à la ceftazidime ou encore à l'imipenème avec des taux respectifs de 100%
et de 94,30%.
Notre travail, même s’il est plus récent, est en accord avec les phénotypes décris dans la
bibliographie.
Dans notre étude, l’analyse des phénotypes de résistance de Klebsiella pneumoniae a

mis en évidence la production de pénicillinases vu les taux élevées de résistance à l’amoxicilline
38
(100%), la ticarcilline (100%) et à la céfoxitine (66.7%). 26,08% des souches étaient

productrices de BLSE (résistance à la céfotaxime 100%, au ceftriaxone 100%, à la ceftazidime
75%, à la céfépime 50%, à l’amoxicilline 100%, à la pipéracilline 100%, et aux associations
amoxicilline + acide clavulanique 100%, et piperacilline + tazobactam 75%). 8,70% étaient
productrices de carbapénémases (Imipénème 50%).
Les souches isolées à partir des hémocultures positives présentaient donc des multi-résistances
aux carbapénèmes, aux céphalosporines et aux pénicillines.
L’émergence des entérobactéries productrices de BLSE dans le monde est un phénomène

préoccupant (Lolom 2015). Nous assistons à une augmentation continue à l’échelle mondiale
du chiffre de BLSE qui peut être due essentiellement à la longue durée d’hospitalisation en unité
de soins intensifs et à l’utilisation massive des céphalosporines de troisième génération. Ces
enzymes sont capables d’hydrolyser la majorité des β-lactamines souvent utilisées de manière
empirique en première instance pour le traitement de nombreuses infections bactériennes. Par
ailleurs, Klebsiella pneumoniae est bien connue pour être un hôte privilégié de certains
plasmides à l’origine de multi-résistances aux aminosides, aux céphalosporines et aux
carbapénèmes. D’ailleurs, elle est citée dans une liste publiée par l’OMS en 2017 signalant les
bactéries pour lesquelles il est urgent de rechercher et développer de nouveaux antibiotiques.
Les carbapénèmes étaient jusqu’à récemment considérés comme un recours en

antibiothérapie lorsque les bactéries sont productrices de BLSE. Depuis une vingtaine d’année,
on assiste aussi à une augmentation de la résistance aux carbapénémases (OMS 2014). Dans
notre étude 50% des souches de Klebsiella pneumoniae étaient résistantes à l’imipénème. La
résistance aux céphalosporines de troisième génération et aux carbapénèmes est aujourd’hui
souvent croisée à une résistance aux aminosides, ce qui complique d’avantage la prise en charge
thérapeutique.
Par ailleurs, l’innovation en antibiothérapie est de plus en plus limité : en vingt ans plus de 30
molécules ont été retirées du marché, parce que devenues inefficaces, alors que seulement 10
nouvelles molécules ou association de molécules les ont remplacées (OMS 2014).
Les staphylocoques à coagulase négatif sont connus par leur capacité à développer des
résistances aux ß-lactamines. En effet, ils peuvent acquérir des résistances analogues à celles
décrites chez S. aureus : résistance à la penicilline G qui repose sur l’inactivation enzymatique
de l’antibiotique et, résistance à la méticilline due à une modification de la cible de
l’antibiotique. Dans notre étude, les taux de résistance à la penicilline G et à la méticilline étaient
respectivement de 97.2% et de 70%. La fréquence de sensibilité à la méticilline était de 25%.
39
D’après l’observatoire national de l’épidémiologie de la résistance bactérienne aux antibiotiques

(ONERBA), cette fréquence était proche de celle trouvée en 2002 (28%).
La fréquence élevée de résistance à la méticilline est inquiétante. De plus, la résistance croisée à
d’autres classes d’antibiotiques (fluoroquinolones et aminosides) est fréquente ce qui complique
la prise en charge thérapeutique des infections sévères à ces espèces (Quincampoix et Mainardi,
2001). Cependant, l’utilisation de ces antibiotiques peut réussir la thérapie : linézolide,
lincomycine, tétracycline, quinupristin-dalfoprystine, pristinamycine, téicoplanine et
vancomycine.
40
ISSBAT 2017 – 2018 Conclusion
VI. Conclusions et perspectives :
Notre étude rétrospective a colligée 294 cas de bactériémies durant la période du 1

janvier 2017 au 31 décembre 2017.
Les staphylocoques à coagulase négative (SCN) représentaient la première cause de

bactériémie en néonatologie 39.50% à l’HMPIT suivie d’Alcaligenes xylosoxidans, de 22.80% et
K. pneumoniae de 6.46 %. Ces germes peuvent être considérés comme des infectants
nosocomiaux portés soit sur des cathéters ou d’autres dispositifs invasifs, soit manu-portés
pouvant avoir pour origine une eau souillée.
Un important taux de résistance aux β-lactamines des agents pathogènes a été démontré.
Concernant le profil de résistance d’Alcaligenes xylosoxidans, les données rapportées montrent
aussi une fréquence élevée de la résistance aux β-lactamines K. pneumoniae présentait un taux de
résistance faible aux céphalosporines de troisième génération (8.70%) et un phénotype β-
lactamase à spectre élargi (BLSE) observé chez 26.08% des souches. Parmi les souches de SCN
70 % étaient résistantes à la méthicilline.
Les bactériémies représentent donc une pathologie infectieuse préoccupante dans le

service de néonatologie vu leur fréquence et leur gravité menaçant le pronostic vital.
Une meilleure connaissance de l’épidémiologie des bactéries multi-résistantes aux

antibiotiques et/ou émergentes est indispensable. Et, la création d’un réseau de surveillance inter-
hospitalier de ces germes s’impose, l’urgence étant de développer de nouvelles stratégies
efficaces afin de limiter la dissémination de ces derniers.
La lutte contre ces bactéries doit permettre de réduire leur incidence, et repose
essentiellement :
- sur l’utilisation rationnelle des antibiotiques afin de maitriser et prévenir la diffusion des
bactéries multi-résistantes. Le choix des antibiotiques à utiliser est inexorablement lié au
diagnostic rapide et spécifique des germes en cause.
- sur la rigueur des règles d’hygiène à l’hôpital (port de gants à usage unique, d’une
blouse, d’une charlotte, lavage des mains, isolement des malades infectés, manipulations
aseptiques des cathéters veineux ombilicaux et des prélèvements). Le contrôle des eaux potables
en milieu hospitalier est aussi envisageable.
41
ISSBAT 2017 – 2018 Conclusion
Une éducation sanitaire basée sur l’hygiène individuelle et collective de doit donc être
conduite.
42

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REPUBLIQUE TUNISIENNE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Hôpital Militaire Principal Institut Supérieur des Sciences

Rapport de Projet de Fin d’Etudes

Parcours Contrôle et Exploitation des Microorganismes

Epidémiologie des bactériémies au service de néonatologie

Présenté par : Dakhlaoui Rihab

Hôpital Militaire Principale Institut Supérieur des Sciences

Rapport de projet de Fin d’Etudes

Epidémiologie des bactériémies au service de néonatologie

Présenté par : Dakhlaoui Rihab

A mes très chers parents

A tous ceux que j’aime et ceux qui m’aiment.

A mes très chers parents

Vous êtes ce que j’ai plus précieux dans la vie.

Au Professeur agrégé et chef de service de Microbiologie à l’Hôpital Militaire Principale

Au Docteur BEN SLAMA Karim Maître de Conférence et Directeur de l’Institut Supérieur

Au Pharmacien-Lieutenant Professeur Agrégé et Assistant Hospitalo-Universitaire à la

Au Docteur Halaouli Sonia Maitre-Assistant à l’ISSBAT

Au personnel du « Service de Microbiologie »

Liste des abréviations

ANAES: Agence nationale d’accréditation et d’évaluation en santé

Liste des tableaux

Tableau 1: Principales caractéristiques des BGN non fermentaires responsables de bactériémies

Liste des figures

Figure 1: Figure montrant les résultats d’hémocultures. ............................................................... 10

2.4.2. Nouvelles méthodes d'identification ...................................................... 12

1. Epidémiologie des bactériémies dans le service de néonatologie de l’HMPIT de janvier

Les bactériémies représentent un problème de santé majeur en néonatologie : en 2015,

Les bactériémies rencontrées en néonatologie peuvent être d’origine materno-fœtale ou

Dans ce contexte, le travail présenté ici, a eu pour objectifs :

- de réaliser une étude épidémiologique rétrospective, à partir des hémocultures de patients

On appelle infection nosocomiale ou infection hospitalière toute maladie contractée à

Une épidémie nosocomiale se définit comme une augmentation inhabituelle du nombre

La septicémie est un état physiologique qui se manifeste par l’apparition de foyers

II. Bactériémies néonatales :

C’est la pathologie hospitalière la plus rencontrée durant la période néonatale de 0 à 28 jours

(bactériémies d’origine materno-fœtale) ou de l’environnement hospitalier (bactériémies

Les bactériémies d’origine materno-fœtale sont dites bactériémies précoces et les

2. Les bactériémies d’origine materno-fœtale :

Il existe 3 modes de contamination du sang des nouveau-nés :

Les principaux facteurs de risque de bactériémie sont la prématurité inexpliquée

3. Les bactériémies d’origine nosocomiale :

Les infections nosocomiales représentent un grand problème sanitaire en néonatologie.

4.2. Etiologie des bactériémies néonatales tardives :

5. Caractéristiques bactériologiques des germes les plus incriminés :

C’est un bacille à Gram négatif, en forme de bâtonnet court de la famille des

Les antigènes capsulaires K sont morphologiquement et physico-chimiquement similaires

5.2. Les streptocoques du groupe B ou SGB:

5.3. Les staphylocoques :

Ce sont des composantes essentielles de la flore humaine normale responsables

 Les Staphylocoques à coagulase négative :

Les bactériémies incriminent essentiellement S. hominis, S. épidermidis et S.

 Les Staphylocoques à coagulase positive :

5.4. Les entérobactéries :

Ce sont des bactéries qui prolifèrent en abondance dans l’environnement appartenant à la

5.5. Les BGN non fermentaires :

Tableau 1 : Principales caractéristiques des BGN non fermentaires responsables de

Famille Genre Espèce Caractères biochimiques

Pseudomonacae Pseudomonas P. aeroginosa Oxydase (+), H2S(-),

III. Diagnostic des bactériémies : l’hémoculture.

La spectrométrie de masse MALDI-TOF est une technique physico-chimique qui permet

2. Déroulement d’une hémoculture :