THÈSE DE DOCTORAT DE

L'UNIVERSITÉ DE RENNES 1

ÉCOLE DOCTORALE N° 605

Biologie Santé
Spécialité : « Santé publique »

Par Estelle DRÉANO

Utilisation
Par Estelle
DRÉANOdes farines de plumes en alimentation
animale : impact de la présence des antibiotiques
Thèse présentée et soutenue à Rennes, le 14 Novembre 2022
Unité de recherche : Analyse de Résidus et Contaminants, ANSES – Laboratoire de Fougères

Composition du Jury :

Président : Membre invité :

Bruno LE BIZEC Anne-Marie JACQUES
Professeur – Oniris Laberca – Nantes Expert pharmacologue – ANMV Fougères

Rapporteurs : Directeur de thèse :

Ludovic PELLIGAND Michel LAURENTIE
Professeur – The Royal Veterinary College Directeur de recherche – ANSES Fougères

Jean-Lou DORNE
Expert toxicologue – EFSA Co-directrice de thèse :
Sophie MOMPELAT
Chargée de projet de recherches – ANSES
Examinateur : Fougères
Agnès FOURNIER
Maître de conférences – Université de Lorraine

1
2
 Remerciements
Ce travail de thèse était pour moi une opportunité mais surtout une expérience
extraordinaire et enrichissante. En ce sens, je tiens à remercier toutes les personnes qui ont
participé à ce projet de près ou de loin. De par sa transversalité, la thèse Aviplume m’a permis
de rencontrer de belles personnes spécialisées dans différents domaines d’expertise. J’espère
avoir l’occasion d’être amenée à travailler de nouveau avec elles sur de nouvelles
collaborations.
En premier lieu, je tiens à remercier les membres de mon jury de thèse, Ludovic
Pelligand et Jean-Lou Dorne en qualité de rapporteurs, Bruno Le Bizec et Agnès Fournier en
qualité d’examinateurs, ainsi qu’Anne-Marie Jacques en qualité de membre invité, pour
m’avoir fait l’honneur d’accepter de juger mes travaux de recherche. Je remercie aussi
chaleureusement les membres de mon comité de suivi de thèse, Barbara Le Bot et Angélique
Travel, pour leurs nombreux conseils et leur bienveillance à mon égard.
J’ai eu la chance de mener la totalité de ma thèse au sein de l’Agence Nationale de
Sécurité Sanitaire de l’Alimentation, de l’Environnement et du Travail (ANSES) située à
Fougères. En ce sens, je souhaite tout d’abord remercier Pascal Sanders pour m’avoir acceptée
dans un premier temps en tant que stagiaire de master, puis, en tant que doctorante. Je
remercie également Tahar Ait Ali, plus récemment directeur du laboratoire ANSES de
Fougères, pour son suivi sur mes travaux de recherche et son écoute attentive.
Je remercie tout particulièrement mes encadrants Michel Laurentie, mon directeur de
thèse, et Sophie Mompelat, ma co-directrice de thèse :
➢ Michel, merci infiniment pour tout ce que tu as su me transmettre au niveau des
expérimentations animales mais surtout au niveau statistique et pharmacocinétique.
Merci aussi pour le partage de tes bonnes recettes de cassoulet ou encore de
sanquette, recette plus atypique !
➢ Sophie, tout d’abord merci de m’avoir recrutée en tant que stagiaire sur le projet
Ecoplume et d’avoir eu confiance en moi pour mener à bien cette thèse. Merci
infiniment d’avoir toujours été à mon écoute et de m’avoir fait évoluer. J’ai beaucoup
appris avec toi, que ce soit sur la rédaction d’article, le management de projet, la
valorisation scientifique, la pédagogie ou encore l’encadrement de stagiaires. Tu peux
maintenant te concentrer sur la validation de ton HDR jusqu’à l’arrivée du prochain
doctorant !
Je tiens également à remercier toutes les personnes qui ont travaillé sur ce projet avec
moi :
➢ Dominique, merci de m’avoir accueillie au sein de l’unité ARC tout d’abord en tant que
stagiaire, puis en tant que doctorante. Tu m’as vu évoluer et tu t’es toujours rendu

3
 disponible lorsque j’en avais besoin. Merci encore pour ta gentillesse et tes nombreux
conseils.
➢ Alexis, un immense merci pour ton temps passé à l’animalerie lors des prises de sang
mais également pour ton aide à l’exploitation des données collectées en
pharmacocinétique. Je te souhaite le meilleur pour tes prochains projets et ta carrière.
➢ Charlotte, je tiens à te remercier pour toute l’aide apportée lors des phases animales
pour les différents prélèvements et surtout pour les nombreuses manips que tu as
réalisées en microbiologie. Merci également pour ton soutien, ton écoute et ta joie de
vivre toujours au rendez-vous ☺ J’espère sincèrement que tous tes projets
professionnels et personnels vont se concrétiser !
➢ Jean-François, pour toutes les heures consacrées à l’animalerie avec moi, les
« quelques » week-ends d’astreinte et ton humour, je te remercie sincèrement.
➢ Christophe, Arnaud, merci pour le partage de vos connaissances sur la résistance
antimicrobienne avec moi. Je tiens à vous exprimer toute ma reconnaissance.
➢ Marie-Pierre L., un immense merci pour toute l’aide que tu m’as apportée pour le
broyage des plumes. Sans toi, je croyais ne jamais en finir. Merci également pour nos
innombrables discussions qui me permettaient de me détendre et pour tes nombreux
conseils.
➢ Antoine, merci pour ton aide sur le second article et pour tes conseils sur le
déroulement de la thèse. Tu avais raison, tout s’est éclairci à la dernière année de
thèse, j’ai enfin commencé à voir le travail fourni et ce qu’il a apporté.
➢ Un sincère remerciement à David et Fanny, deux stagiaires qui ont contribués à
l’avancement du projet. Sans votre travail, je n’aurais jamais pu finir dans les temps.
Je vous souhaite le meilleur pour vos projets futurs !
Un sincère merci à toute l’unité ARC qui m’ont accueillie à bras ouvert dans leur
« famille » :
➢ Pierrick, je tiens à te remercier d’avoir accepté de partager ton bureau avec moi. Merci
d’avoir répondu à mes multiples questions sur le plan technique ou sur la HRMS. Merci
aussi pour nos nombreuses discussions, souvent portées sur la nourriture, mais aussi
sur le jardinage ou le bricolage ! Tu as toujours été à mon écoute, et pour cela je t’en
remercie.
➢ Sophie G., tout d’abord je tiens à te remercier pour m’avoir formée sur les bonnes
pratiques de laboratoire. Mais au-delà du travail, j’ai trouvé une véritable amie,
toujours présente et à mon écoute. Un immense merci pour toutes nos discussions
partagées dans ton bureau qui m’ont permis de découvrir nos passions communes tel
que les enquêtes (sans oublier la tante Ernestine !), la danse country et la généalogie.
➢ Mélaine, un immense merci pour ta bonne humeur constante et ton écoute. Tes rires
(ou cris selon les circonstances) à l’autre bout du couloir m’ont bien fait rire ! ☺
➢ Yvette, le rayon de soleil du laboratoire, rien que pour ça je te remercie. Tu sais
transmettre ta bonne humeur et surtout ta force ! Merci également pour toutes les
randonnées que tu nous as organisé aux beaux jours, souvent bien plus longues que
prévues … J’ai adoré passé des heures à discuter de nombreuses heures au laboratoire
ou lors de nos randonnées à 2 ! Merci mille fois !

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 ➢ Pierre, le jeune papa de l’équipe, Marie-Pierre C., discrète mais à l’écoute, Murielle,
pour l’énergie que tu fournis sur ton travail, en particulier sur la nouvelle
réglementation, Cristina, bientôt tu écriras cette page, courage ! Plus qu’une année !
Kahina, pour ton sourire, tes quelques conseils sur la thèse et nos discussions parfois
un peu trop éloignées du travail, Maïwenn, la petite nouvelle dans cette immense
famille, bienvenue et fais toi confiance !
Merci également aux personnes qui ont contribué à la réussite de ma thèse :
Hélène, pour ton efficacité pour les schémas pour les articles scientifiques et dans
l’impression des étiquettes allant à -80°C, Nathalie, pour l’organisation des cafés scientifiques
et pour me trouver une salle pour ma soutenance de thèse, Alexia, pour avoir organiser mon
déplacement aux Pays-Bas et pour ta gentillesse, Annie, pour ton aide à trouver un logement
sur Paris et des trains, Sarah, merci pour toute la partie ressource humaine, tu as toujours été
là pour moi et avec le sourire ! Lucie, pour nos échanges sur la convention Ecoplume, sur les
états de frais, sur les achats pour le broyeur à billes mais aussi pour nos échanges de volants
lors de nos parties de badminton ! Frédéric, pour ton aide à me fournir un ordinateur portable
pour que je puisse télétravailler.
Par ailleurs, je remercie tout particulièrement :
Sylvie J. pour ton écoute et ton aide pour les consommables lors de besoins urgents, Alain
pour ton efficacité à gérer les commandes et faire le nécessaire pour nous tous au quotidien,
Mireille pour venir voir comment j’allais régulièrement et surtout pour la transmission de ta
bonne humeur toujours présente, Estelle pour tous tes nombreux conseils sur la thèse et pour
partager des promenades avec nos jeunes chiens, Anne-Louise pour toutes nos discussions
entre deux couloirs (que du bonheur dans la construction de ta maison ! ☺), Rachelle pour les
réunion H2O organisées chez toi et tes conseils dans l’utilisation des produits ménagers,
Régine pour avoir répondu à mes quelques questions sur la partie règlementaire des plans de
contrôle et de surveillance et pour m’avoir fait découvrir de belles randonnées à Mézières-
sur-Couesnon, Raphaël pour les quelques échanges qu’on a eu, dans 2 ans c’est toi qui écrira
cette page pour ton mémoire de thèse ☺, Emmanuelle pour ton aide sur les recherches
bibliographiques et le respect de l’intégrité scientifique, Valérie G. pour ta gentillesse et pour
m’avoir soutenue lors de mon premier congrès, Yohann pour tous tes dépannages
informatiques et pour les quelques installations de logiciels nécessaires dans la réussite de ma
thèse, Céline pour toute ta gentillesse et tes astuces bricolages, Jérôme H. pour tes quelques
participations aux phases animales lorsqu’on manquait de bras, Paméla pour ta bienveillance
et je te souhaite de continuer dans ton activité à côté du travail, les objets que tu fabrique
sont vraiment magnifiques ! Thibaut pour les arrangements que tu m’as accordé concernant
le Q-exactive, Ludovic pour le télétravail, grâce à toi j’ai insisté et obtenu gain de cause alors
merci, Mickaël pour toute la partie qualité du bon fonctionnement du laboratoire, Gaëtan
pour l’installation des nouveaux bureaux et pour tes nombreux dépannages d’électricité ou
de plomberie.
Merci infiniment à toutes les personnes que je n’ai pas citées mais qui ont participé, de
près ou de loin, à mon bien-être au laboratoire.

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 Un immense merci à tous mes amis qui ont toujours été là pour moi:
Anaëlle, malgré ton stress, tu as toujours été là pour moi. C’est bientôt fini pour toi aussi,
tu vas y arriver haut la main ! Clémence, merci de m’avoir demandé d’être ton témoin de
mariage, je n’aurais pas pu rêver mieux ! Sonia et Arnaud, on viendra prochainement vous voir
dans votre nouveau chez vous, c’est promis !
Et, pour finir, je n’oublie pas ma famille, à commencer par mes parents, sans qui je ne serais
jamais arrivé où j’en suis. Vous m’avez toujours soutenue, je ne pourrais jamais vous remercier
pour tout ce que vous avez fait pour moi, de ma naissance à aujourd’hui. Je vous rendrai la
pareil autant que je pourrais, je vous le promets ! Maxime, un immense merci pour tout
l’amour que tu me donnes et pour ton soutien constant, pour le meilleur et pour le pire ☺. Et
bien sûr, je remercie mes petits compagnons à quatre pattes, Prince, Oscar et Sookie, sans qui
la vie serait beaucoup moins … amusante !

6
 TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES PUBLICATIONS ET DES COMMUNICATIONS 9

LISTE DES ABRÉVIATIONS ET GLOSSAIRE 11

LISTE DES FIGURES 13

LISTE DES TABLEAUX 15

LISTE DES ANNEXES 15

INTRODUCTION GÉNÉRALE 16

PARTIE I : CONTEXTE SCIENTIFIQUE 18

I- ÉTAT DE L’ART 19
1. LES PRODUITS DERIVES DE L’AGRICULTURE 19
1.1. La plume 19
1.1.1. Structure et composition 19
1.1.2. Outil d’évaluation d’une exposition aux facteurs environnementaux 20
1.2. Valorisation des plumes 25
1.2.1. La place de la plume dans l’industrie 25
1.2.2. La farine de plumes 26
2. LES ANTIBIOTIQUES EN MILIEU AVICOLE 30
2.1. La volaille 30
2.1.1. Contextualisation du marché avicole 30
2.1.2. Les maladies avicoles 32
2.2. Les antibiotiques et les conséquences liées à cette utilisation 32
2.2.1. Usages des antibiotiques chez le poulet de chair 32
2.2.2. Conséquence d’une exposition aux antibiotiques 36
2.3. Sécurité sanitaire des aliments : plans de surveillance et de contrôle, règlementations et préventions
38
2.3.1. Chez l’animal 39
2.3.2. Chez l’homme 40
2.3.3. Préventions 40
3. ANALYSE PHARMACOCINETIQUE ET METHODOLOGIE ANALYTIQUE 41
3.1. Analyse et paramètres pharmacocinétiques 41
3.1.1. Analyse compartimentale 42
3.1.2. Analyse non compartimentale 42
3.2. Techniques analytiques 44
3.2.1. Techniques de séparation 44
3.2.2. Techniques de détection/quantification 46
3.3. Préparation des échantillons de plumes 50
3.3.1. Broyage 50
3.3.2. Extraction et purification 51
3.4. Le cycle de vie d’une méthode analytique 57
3.4.1. Vocabulaire et démarche de validation 58
3.4.2. L’approche globale : le profil d’exactitude 59

7
4. CONCLUSION GENERALE 62
II- OBJECTIFS DE LA THÈSE ET STRATÉGIE DE RECHERCHES 63

PARTIE II : RÉSULTATS 66

I- OUTILS ANALYTIQUES 67
1. ARTICLE 1 : METHODE ANALYTIQUE MULTIRESIDUS 67
2. EXTENSION ET VALIDATION DE LA METHODE 84
II- PRÉSENCE DES ANTIBIOTIQUES SUR LES PLUMES ET IMPACT SUR LES BACTÉRIES 86
1. ARTICLE 2 : PRESENCE ET DEPLETION DE LA SULFADIAZINE, DU TRIMETHOPRIME ET DE L’OXYTETRACYCLINE DANS LES PLUMES DE
POULET DE CHAIR TRAITES ET IMPACT DES BACTERIES 86
2. ARTICLE 3 : ÉTUDE EXPLORATOIRE – DISTRIBUTION DES ANTIBIOTIQUES LE LONG DE LA PLUME 105
III- PRÉSENCE DES ANTIBIOTIQUES DANS LA FARINE DE PLUMES 116
1. IMPACT DU PROCESSUS DE FABRICATION DE FARINE DE PLUMES SUR LES ANTIBIOTIQUES 116
1.1. Contexte 116
1.2. Méthodologie 116
1.3. Résultats et discussions 118
1.4. Conclusion 120
2. ANALYSE DE FARINES DE PLUMES INDUSTRIELLES 120
2.1. Contexte 120
2.2. Méthodologie 120
2.3. Résultats et discussions 121
2.4. Conclusion 123

PARTIE III : DISCUSSIONS GÉNÉRALES, PERSPECTIVES ET CONCLUSION 124

I- DISCUSSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES 125

II- CONCLUSION 129

BIBLIOGRAPHIE 130

ANNEXES 138

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 LISTE DES PUBLICATIONS ET DES COMMUNICATIONS

Publications dans des revues scientifiques à comité de lecture :

- Dréano E, Miquel D, Taillandier J-F, Laurentie M, Hurtaud-Pessel D, Mompelat S.

Antimicrobial residues along the broiler feathers: a non-invasive sample matrix for
monitoring and surveillance of veterinary treatments used in poultry. Food and Control.
Soumis en Août 2022.

- Dréano E, Valentin C, Taillandier J-F, Travel A, Soumet C, Bridier A, Hurtaud-Pessel D,

Laurentie M, Viel A, Mompelat S. Presence and depletion of sulfadiazine, trimethoprim
and oxytetracycline into feathers of treated broiler chickens and impact on antibiotic
resistant bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2022.

- Dréano E, Laurentie M, Hurtaud-Pessel D, Mompelat S. Multi-class analysis of 30

antimicrobial residues in poultry feathers by liquid chromatography tandem mass
spectrometry. Food Additive & Contaminants Part A. 2021. 38(10): p. 1701-1716.

Communications en congrès internationaux :

- Dréano E, Laurentie M, Taillandier J-F, Travel A, Hurtaud-Pessel D, Mompelat S.

Persistence of sulfadiazine and trimethoprim in broiler chicken feathers. Oral
communication to World Poultry Congress – Paris. 8-11 Août 2022.

- Dréano E, Miquel D, Laurentie M, Taillandier J-F, Hurtaud-Pessel D, Mompelat S.

Antimicrobial residues along the broiler feathers: a non-invasive sample matrix for
monitoring and surveillance of veterinary treatments used in poultry. Oral
communication to EuroResidue IX – Pays-Bas. 23-25 Mai 2022.

- Mompelat S, Dréano E. Advances in tracking antibiotic residues in feathers – Ecoplume

project. Paper presented at the 25th Workshop for the “control of antimicrobial
residues in food from animal origin”. Fougères, France. 2020.

9
Communications en congrès nationaux :

- Dréano E, Laurentie M, Pessel D, Mompelat S. Stabilité des agents antimicrobiens dans

les plumes lors de la production de farine de plumes. Poster présenté à Analytics.
Nantes. 5-8 Septembre 2022.

- Dréano E, Laurentie M, Hurtaud-Pessel D, Mompelat S. Determination of antimicrobial

residues contamination in broiler feathers for animal exposure assessment. Poster
commenté en 180 secondes aux journées scientifiques de l’école doctorale Biologie
Santé. Brest. Décembre 2021.

- Dréano E, Laurentie M, Hurtaud-Pessel D, Rolland J-G, Taillandier J-F, Mompelat, S.

Assessment of antimicrobial residues in broiler feathers using a multiclass LC-MS/MS
method. Poster présenté aux journées scientifiques et doctorales de l’ANSES.
Septembre 2021.

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 LISTE DES ABRÉVIATIONS ET GLOSSAIRE
ABRÉVIATIONS
Sigles Signification
ACN Acétonitrile
AF Acide Formique
ALEA Animal Level of Exposure to Antimicrobials
ANMV Agence Nationale du Médicament Vétérinaire
ANSES Agence Nationale de SÉcurité Sanitaire de l’environnement et du travail
AUC Area Under the Curve
AUMC Area Under the Moment Curve
Directorate General for Health and Consumer Protection of the European
DG SANCO
Commission
EMA European Medicines Agency
ESB Encéphalopathie Spongiforme Bovine
ESI Electropray Source Ionisation
FAOSTAT Food Agriculture Organization Corporate Statistical Database
H2O Eau
HCl Acide chlorhydrique
HL Half-Life
HLB Hydrophilic-Lipophilic Balanced
HPLC High Performance Liquid Chromatography
ITAVI Institut Technique de l’Aviculture et des petits animaux
LC Liquid Chromatography
LC-MS/MS Liquid chromatography with tandem mass spectrometry
LLE Liquid-Liquid Extraction
LMR Limites Maximales de Résidus
LOD Limit Of Detection
LOQ Limit Of Quantification
MeOH Méthanol
MgSO4 Sulfate de magnésium
MRM Multiple Reactions Monitoring
MRT Mean Residence Time
MS Mass Spectrometry
MS/MS Tandem Mass Spectrometry
NCA Non Compartmental Analysis
NaCl Chlorure de sodium
Na2EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt
Na2SO4 Sulfate de sodium
OMS Organisation Mondiale de la Santé humaine
OTC Oxytétracycline
PAT Protéines Animales Transformées
PE Profil d’Exactitude
PSPC Plans nationaux de Surveillance et de Contrôle
QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged and Safe
SCX Strong Cation eXchange
SDZ Sulfadiazine
SIFCO Syndicat des Industries Françaises de COproduits animaux
SLE Solid-Liquid Extraction
SPE Solid-Phase Extraction
SRM Selected Reaction Monitoring
TEC Tonne Équivalent Carcasse
TFA Acide TrifluoroAcétique

11
 TMP Triméthoprime
Tr Temps de rétention
UV UltraViolet
WOAH World Organisation for Animal Health
GLOSSAIRE
Termes Définitions
« l’absorption correspond à la phase de résorption associée aux éventuels
Absorption phénomènes de dégradation du principe actif au premier contact d’un
organe (effets de premier passage) »[1].
Phénomène de surface par lequel des molécules (gaz ou liquides) se fixent
Adsorption
sur des surfaces solides.
« Substance d’origine naturelle ou synthétique, utilisée contre les infections
Antibiotiques
causées par les bactéries »[2].
« substance ayant une action directe sur les micro-organismes et utilisée
pour le traitement ou la prévention d’infections ou de maladies infectieuses,
Antimicrobiens
dont les antibiotiques, les antiviraux, les antifongiques et les
antiprotozoaires »[3].
Matière biologique ayant la capacité d’éliminer des substances d’une
Biosorbant
solution[4].
« étape par laquelle un médicament quitte le compartiment central
Distribution
systémique pour diffuser dans les tissus et compartiments secondaires »[1].
correspond à la disparition d’un médicament soit par la voie rénale
Élimination
(excrétion*), soit par la voie biliaire (métabolisation)[1].
correspond à l’élimination rénale d’un médicament sous forme inchangée
Excrétion
(c’est-à-dire, non métabolisée) dans les urines[1].
« teneur maximale en résidus, résultant de l’utilisation d’un médicament
Limite maximale de résidus vétérinaire (…), que la Communauté peut accepter comme légalement
(LMR) autorisée ou qui est reconnue comme acceptable dans ou sur des denrées
alimentaires »[5].
« on entend par médicament vétérinaire toute substance ou association de
substances qui remplit au moins l’une des conditions suivantes : a) elle est
présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventives à
l’égard des maladies animales ; b) elle a pour but d’être utilisée chez l’animal
Médicaments vétérinaires ou de lui être administrée en vue de restaurer, de corriger ou de modifier des
fonctions physiologiques en exerçant une action pharmacologique,
immunologique ou métabolique ; c) elle a pour but d’être utilisée sur des
animaux en vue d’établir un diagnostic médical ; d) elle a pour but d’être
utilisée pour l’euthanasie d’animaux »[3].
Pharmacocinétique « décrit le devenir du médicament dans l’organisme »[1].
« substances pharmacologiquement actives, exprimées en mg/kg ou µg/kg
sur la base du poids frais, qu’il s’agisse de substances actives, d’excipients ou
Résidus
de produits de dégradation, ainsi que leurs métabolites restant dans les
aliments produits à partir d’animaux »[5].
« période minimale entre la dernière administration d’un médicament
vétérinaire à un animal et l’obtention de denrées alimentaires provenant de
Temps d’attente cet animal qui, dans des conditions normales d’utilisation, est nécessaire
pour garantir que ces denrées alimentaires ne contiennent pas de résidus en
quantités nocives pour la santé publique »[3].
Maladie infectieuse qui peut être transmise de l’animal à l’homme et vice-
Zoonose
versa.

12
 LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Nomenclature et schéma d'une plume ................................................................................................. 20
Figure 2 : Gravure de Jacques Callot. La noblesse, le guerrier au chapeau orné d'une grande plume. (Source :
musée du Louvre).................................................................................................................................................. 25
Figure 3 : Part relative des destinations des farines de plumes en 2018 (source : SIFCO) ................................... 28
Figure 4 : Schéma général d’un process industriel de fabrication de farine de plumes (source : SIFCO et règlement
n°99/534/CE) ......................................................................................................................................................... 29
Figure 5 : (A) Évolution de la production mondiale de volaille de chair entre 1961 et 2020, (B) répartition relative
de la production européenne de la production de volaille de chair en 2020, (C) évolution de la production
française de volaille de chair entre 1961 et 2020. (données source : FAOSTAT). ................................................. 31
Figure 6 : Production de volailles en France entre 2000 et 2020 présentée par tonne équivalent carcasse (tec)
(Source : FranceAgriMer) ...................................................................................................................................... 31
Figure 7 : Modes d'action des antibiotiques sur une bactérie (source : Chardon, H. et al.) ................................. 33
Figure 8 : Évolution des indicateurs ALEA par famille d'antibiotiques entre 2011, 2016 et 2020 pour les volailles
(source : Rapport annuel de l’ANMV, 2021) ......................................................................................................... 36
Figure 9 : La résistance aux antimicrobiens dans la chaîne alimentaire humaine (source : OMS) ....................... 37
Figure 10 : Principaux mécanismes bactériens de résistance aux antibiotiques (source : Chardon, H. et al.) ..... 38
Figure 11 : Estimation du nombre de traitements antibiotiques par animal (ALEA : Animal Level of Exposure to
Antimicrobials - estimation obtenu en divisant le poids vif traité par la masse animale totale pour une espèce
donnée) (source : ANSES - ANMV) ........................................................................................................................ 41
Figure 12 : Représentation pharmacocinétique d'un modèle à deux compartiments avec : D = dose administrée,
VD = volume de distribution du compartiment, Ct = concentration en médicament dans le compartiment à
l’instant t, kentrée et ksortie = constantes de vitesse d’échange entre les deux compartiments, k élimination = constante
de vitesse d’élimination, Et = quantitée excrétée à l’instant t .............................................................................. 42
Figure 13 : Calcul des aires par la méthode des trapèzes (source : Gabrielsson et al.) ........................................ 43
Figure 14 : Principe général d’un système analytique de chromatographie liquide ............................................. 45
Figure 15 : Principe général d’un système analytique de spectrométrie de masse .............................................. 47
Figure 16 : Principe d'une source Electrospray (source : https://stringfixer.com/fr/Electrospray_ionization#wiki-
2) ........................................................................................................................................................................... 48
Figure 17 : Principe d'un triple quadripôle (source :
https://www.wikiwand.com/en/Triple_quadrupole_mass_spectrometer) ......................................................... 49
Figure 18 : Principe du broyeur à billes MM 400 de chez Retsch ......................................................................... 50
Figure 19 : Principe de l'extraction en phase solide (SPE) (source : waters) ......................................................... 51
Figure 20 : Cycle de vie d'une méthode d'analyse (source : guide de validation ANSES) ..................................... 57
Figure 21 : Illustration de la méthodologie de caractérisation d'une méthode analytique selon une approche
"critère par critère" (source : guide de validation ANSES) .................................................................................... 59
Figure 22 : Illustration de la méthodologie de caractérisation d'une méthode analytique selon une approche
"globale" (source : guide de validation ANSES)..................................................................................................... 59
Figure 23 : Représentation schématique des termes de validation (justesse, fidélité et exactitude) .................. 60
Figure 24 : Illustration d'un profil d'exactitude d’une méthode analytique validée ............................................. 61
Figure 25 : Synthèse de la problématique du projet de recherche : des sources aux voies de contamination pour
l’animal, l’homme et l’environnement ................................................................................................................. 63
Figure 26 : Méthode d'extraction validée ............................................................................................................. 67
Figure 27 : Méthode analytique développée et validée pour l’analyse des différents échantillons .................... 68
Figure 28 : Profils d'exactitudes de la sulfadiazine dans (A) les plumes, (B) le plasma et (C) les fientes .............. 85
Figure 29 : Zones de prélèvements des plumes sur des poulets de chair traités à la sulfadiazine, au triméthoprime
et à l'oxytétracycline ............................................................................................................................................. 86
Figure 30 : Synthèse des études cinétiques et microbiologiques réalisées chez le poulet de chair ..................... 87
Figure 31 : Structure et segmentation d'une plume ........................................................................................... 105
Figure 32 : Processus industriel adapté au laboratoire ....................................................................................... 117

13
Figure 33 : Boxplot de l’impact global du processus industriel de fabrication des plumes en farine de plumes
adapté à l'échelle du laboratoire (n=10) pour la sulfadiazine (A), le triméthoprime (B) et l’oxytétracycline (C). La
médiane des données est représentée par la ligne horizontale dans le box. Les lignes horizontales qui bordent le
box représentent 25% (Q1) et 75% (Q3) des valeurs. Les lignes verticales de part et d'autre du diagramme
représentent 25 % des valeurs inférieures et supérieures des données. ........................................................... 118
Figure 34 : Boxplot de l’impact par étape du processus industriel de fabrication des plumes en farine de plumes
(n=8) pour la sulfadiazine (A), le triméthoprime (B) et l’oxytétracycline (C). Le pourcentage (%) est l’expression
de la perte en antibiotiques par rapport à l’échantillon initial. .......................................................................... 119
Figure 35 : Synthèse de la méthode d’analyse des échantillons de farines de plumes industrielles .................. 120
Figure 36 : Fréquence de détection des résidus d'antibiotiques pour les analytes positifs détectés (>LOD) dans les
échantillons de farine de plumes industrielles (n=101). Le nombre d'échantillon dans lequel l'antibiotique a été
détecté est indiqué au-dessus de chaque barre. Plusieurs antibiotiques peuvent être présents dans un même
échantillon. ......................................................................................................................................................... 121
Figure 37 : Occurrence des résidus d’antibiotiques en fonction du nombre d'analyte dans un même échantillon
industriel de farine de plumes. ........................................................................................................................... 122
Figure 38 : Distribution des analytes quantifiables (>LOQ) dans les échantillons industriels de farine de plumes
............................................................................................................................................................................ 122

14
 LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Études pharmacocinétiques d’antimicrobiens* dans les plumes ....................................................... 22
Tableau 2 : Utilisation des PAT pour l'alimentation animale selon leur provenance (source : Règlement UE
n°2021/1372) ........................................................................................................................................................ 27
Tableau 3 : Présentation générale des familles d'antibiotiques utilisées chez le poulet de chair et leurs structures
principales (source : RefAvi et rapport annuel de 2020 de l’ANMV) .................................................................... 34
Tableau 4 : Types de chromatographie selon la nature de la colonne (granulométrie et diamètre) ................... 46
Tableau 5 : Applications et utilisations des sels et adsorbants de la méthode QuEChERS (source : Interchim) .. 52
Tableau 6 : Performances des méthodes d'analyse validées pour le dosage de résidus d’antibiotiques dans les
plumes ................................................................................................................................................................... 54
Tableau 7 : Définition du vocabulaire de la validation (source : guide de validation ANSES) ............................... 58
Tableau 8 : Performance de la méthode analytique pour la sulfadiazine, le triméthoprime et l’oxytétracycline
dans les plumes, plasma et fientes ....................................................................................................................... 84

LISTE DES ANNEXES

Annexe 1 : Liste des 30 antimicrobiens d'intérêts - formules et structures chimiques développées ................. 138
Annexe 2 : Définitions et équations permettant la construction d'un profil d'exactitude ……………………………….139
Annexe 3 : Supplementary data de l'article 1 ………………………………………………………………………………………………….142
Annexe 4 : Supplementary data de l'article 2 ………………………………………………………………………………………………….149
Annexe 5 : Résultats de dépistage et quantification des échantillons industriels de farine de plumes …………….154

15
 INTRODUCTION GÉNÉRALE
Les mots indiqués d’un astérisque (*) sont définis dans un glossaire situé en début de mémoire

Dans un contexte où l’écologie et la santé environnementale sont mises en avant, la

valorisation des produits dérivés de l’agriculture non comestibles, tels que les plumes, est
encouragée. Ces produits dérivés des animaux d’élevage sont en majeure partie revalorisés et
utilisés pour diverses applications. En 2018, plus de 800 000 tonnes de plumes ont été
valorisées[6]. Les plumes, riches en protéines et en azote[7], sont valorisées et transformées en
farine de plumes. Ces farines peuvent être, par la suite, soit incorporées dans les engrais, soit
dans l’alimentation animale aquacole, porcine ou des animaux domestiques[8].
Cependant, la plume présente la caractéristique d’adsorber les substances organiques ou
inorganiques, dont les antibiotiques*[9-16]. Les antibiotiques potentiellement présents dans les
plumes peuvent aussi se retrouver dans les farines de plumes[17]. À ce jour, il n’y a aucune
règlementation concernant la présence d’antibiotiques dans les plumes et dans les farines de
plumes.
La deuxième viande consommée dans le monde est la volaille, dont le poulet de chair et
la poule pondeuse, qui représente deux tiers de cette consommation[18]. Cette viande,
considérée maigre et peu calorique, est appréciée pour son apport en vitamine B, en fer et
pour ses protéines animales. Néanmoins, les élevages avicoles peuvent être exposés aux
maladies bactériennes impliquant l’utilisation d’antibiotiques pour éviter la propagation des
maladies ou la mort des animaux. Ces antibiotiques peuvent être par la suite présents dans
les denrées d’origine animale.
L’exposition des animaux et de l’homme aux antibiotiques a conduit à la sélection de
bactéries devenues résistantes. Afin de limiter l’exposition de l’homme aux antibiotiques via
les denrées, des règlementations et des plans de surveillance et de contrôle ont été mis en
place. Dans cette continuité, pour lutter contre la résistance bactérienne due à l’utilisation
d’antibiotiques dans les élevages agricoles, un plan pluriannuel, Ecoantibio (2012-2022)[19,20],
a été instauré par le Ministère de l’Agriculture et de l’Alimentation français. C’est dans le cadre
du plan EcoAntibio 2 (2017-2022) que la thèse Aviplume a été réalisée, en lien avec le projet
Ecoplume[21].
L’objectif de ces travaux de recherches était d’évaluer l’impact de la présence
d’antibiotiques dans les farines de plumes utilisées dans l’alimentation animale. Pour
répondre à cet objectif, nous nous sommes intéressés au devenir des antibiotiques dans les
plumes et dans les farines, impliquant la mise en œuvre d’outils analytiques performants.

16
Ce mémoire présente les travaux réalisés à travers trois parties :
➢ La première partie est divisée en deux :

o Dans un premier temps, des éléments bibliographiques permettent de

décrire le contexte de l’étude. La valorisation des plumes et des farines de
plumes est détaillée puis l’utilisation des antibiotiques dans les élevages
avicoles est exposée. Enfin, les outils pharmacocinétiques et analytiques
pouvant être mis en œuvre pour répondre à notre objectif sont présentés.
o Dans un second temps, la question de recherche du sujet de thèse ainsi
que les différentes stratégies mises en œuvre pour y répondre sont posées.

➢ La deuxième partie expose les résultats obtenus au cours des différents travaux
réalisés tout au long de ce sujet de recherche à travers trois publications, dont une
acceptée et deux soumises.

➢ La troisième partie formule des éléments de réponse à la problématique

compte tenu des travaux effectués et introduit des perspectives de recherches futures.

17
PARTIE I : CONTEXTE
SCIENTIFIQUE

18
 I- ÉTAT DE L’ART

1. Les produits dérivés de l’agriculture

En France, la valorisation des produits dérivés de l’agriculture représente près de 3,2

millions de tonnes[6]. Les plumes peuvent être traitées et utilisées en tant que matière
première dans différents domaines industriels pour leur composition et leurs caractéristiques.

1.1. La plume

1.1.1. Structure et composition

L’origine des plumes remonte à 250 millions d’années, à l’ère du Trias[22]. Leur rôle
principal, tout comme les poils, est de protéger l’animal de l’eau et des températures.
Les plumes couvrent environ 75 % du corps des oiseaux et représentent 3 à 6 % de leur
poids corporel[7]. Leur couleur varie d’une espèce à une autre, généralement dû à la présence
de mélanine[7], pigment naturel déterminant également la couleur de la peau et des poils. Une
plume est composée de 91 % de protéines, de 8 % d’eau et de 1 % de lipides[23]. La protéine
majoritairement présente dans les plumes est la kératine, principalement composée de
cystine et de tyrosine[7]. La kératine, produite par les kératinocytes, situés dans l’épiderme de
l’être vivant, est définie comme une protéine insoluble également identifiée dans les cheveux,
les poils, le bec ou encore les griffes. Chez les oiseaux, la kératine permet de protéger les
plumes de leur environnement extérieur en participant à leur imperméabilité.
La composition des plumes est proche de celle des cheveux chez l’Homme[24]. Cependant,
contrairement aux cheveux, la plume ne connaît pas une croissance linéaire et l’animal peut
avoir des périodes de mue à différents moments de son existence[7, 25]. La croissance des
plumes débute vers le cinquième jour d’incubation de l’embryon[7], sous la forme de cellules
épidermiques[26]. Chez le poulet, la mue débute vers la troisième semaine de vie de l’animal
par la perte du duvet[25]. La plume est constituée de trois parties distinctes qui lui permettent
de former une structure ramifiée. Elle est composée de barbes qui se trouvent être la partie
duveteuse de la plume. Les barbes, formées en premier[7], sont reliées par un rachis afin de
former cet agencement ramifié. Le calamus, correspondant à la partie inférieure du rachis
implantée dans l’épiderme de l’animal et vascularisée, est formé en dernier[7] (Figure 1).

19
 Figure 1 : Nomenclature et schéma d'une
plume

1.1.2. Outil d’évaluation d’une exposition aux facteurs environnementaux

Les cheveux et les poils, par exemple, sont des matrices connues pour être utilisées au
contrôle antidopage grâce à leur capacité de stocker des substances chimiques ou biologiques
auxquelles l’être vivant a été exposé[27, 28].
Les plumes, ayant une composition physiologique proche des cheveux et des poils, ont fait
l’objet de quelques études menées dans le cadre de projets internationaux (par exemple, le
projet Birdhealth ou le projet Masca) afin d’évaluer l’exposition humaine et animale à la
pollution environnementale (par exemple, les métaux lourds, les pesticides, les médicaments
humains)[29-43]. Suite à l’absorption* de polluants dans l’organisme de volatile, des traces de
métaux lourds ont été détectés dans des plumes provenant de volatiles (par exemple, les
manchots, les vautours, etc.)[29, 30, 32-36]. Ces molécules inorganiques retrouvées dans la plume
suggèrent, soit une contamination des plumes par l’eau ou l’air environnant (contamination
externe) ou, soit une contamination par voie interne, c’est-à-dire par transfert de la substance
dans la circulation sanguine jusqu’aux plumes après ingestion[29, 30, 32-36]. La matrice plume
semble être un bon marqueur de la pollution environnementale par les substances
inorganiques (par exemple, les métaux lourds) mais également pour les molécules organiques
tel que les pesticides[31, 38-41]. La plume paraît donc être adaptée à la surveillance de
l’exposition des animaux à des substances organiques ou inorganiques.
Quelques études pharmacocinétiques ont été réalisées de 1994 à aujourd’hui afin de
déterminer la présence éventuelle dans les plumes de médicaments vétérinaires suite à un
traitement chez la volaille[11-13, 15, 16, 42, 44-48]. En vue de mieux comprendre le devenir et le
transfert des principes actifs administrés chez la volaille dans les plumes, les concentrations

20
et durées de présence ont été évalués à différentes échéances[9-12, 14, 16, 46, 47, 49, 50]. Parmi les
médicaments vétérinaires étudiés, nous retrouvons les antibiotiques*. Notamment, le devenir
de l’enrofloxacine et de son métabolite, la ciprofloxacine, dans les plumes de poulet de chair
a été étudié pendant 9 jours après la fin du traitement[9]. Les résultats ont révélé des teneurs
deux à trois fois plus élevées en enrofloxacine et en ciprofloxacine dans les plumes par rapport
aux reins, foies et muscles entre le quatrième et le neuvième jour[9]. De la même manière, le
devenir de plusieurs antibiotiques dans les plumes a été étudié en analysant et quantifiant le
composé parent et/ou son métabolite (Tableau 1). Les antibiotiques administrés restent
présents dans la plume plusieurs jours après la fin du traitement thérapeutique (Tableau 1).
La variabilité de la cinétique des antibiotiques dans la plume dépend du principe actif
administré, de la dose ou encore de la voie d’administration de la molécule (Tableau 1)[10-12,
50].

Par ailleurs, deux études se sont intéressées au devenir des antibiotiques le long de la
plume[10, 12]. Pour ce faire, la plume a été segmentée en plusieurs parties à un temps donné
après traitement de l’animal. Les résultats ont permis de déceler des teneurs en antibiotiques
plus élevées dans l’apex de la plume[10], et en particulier dans les barbes[12].

21
 Tableau 1 : Études pharmacocinétiques d’antimicrobiens* dans les plumes
Familles
Antimicrobiens analysés Schémas posologiques*
antimicrobiennes
10 mg/kg de poids vif
Enrofloxacine d’enrofloxacine une fois par
+ jour pendant 3 jours
Ciprofloxacine consécutifs par injections
intramusculaires
24 mg/kg de poids vif une fois
Fluméquine par jour pendant 5 jours
consécutifs par voie orale
Quinolones Comparaison de trois
traitements différents :
A : 50 µg/mL une fois par jour
pendant 5 jours consécutifs via
l’eau de boisson
Enrofloxacine B : 50 µg/mL une fois par jour
pendant 5 jours consécutifs par
pulvérisation
C : 5 µg/mL une fois par jour
pendant 28 jours consécutifs
via l’eau de boisson
Comparaison de trois
traitements différents :
A : 1200 mg/L une fois par jour
pendant 5 jours consécutifs (du
7ème au 11ème jour de l’animal)
via l’eau de boisson
B : 300 mg/L une fois par jour
Tétracyclines Oxytétracycline
pendant 3 jours consécutifs (du
20ème au 22ème jour de l’animal)
via l’eau de boisson
C : 156 mg/L une fois par jour
pendant 24 jours consécutifs
(du 7ème au 30ème jour de
l’animal) via l’eau de boisson
Échéances Résultats dans la plume Résultats dans d’autres matrices Références
À 216 heures, 4, 0,3 et 6,9 µg/kg de
À 216 heures après la dernière
H6, H9, H24, H48, H72, résidus d’enrofloxacine et de
administration d’enrofloxacine, 36,5 San Martin et al.,
H96, H120, H144, H168, ciprofloxacine ont été quantifiés
µg/kg de résidus d’enrofloxacine et 2007
H192 et H216 respectivement dans le foie, les
de ciprofloxacine ont été quantifiés
muscles + peau et les reins
Au 6ème jour après la dernière
Au 6ème jour après la dernière
administration de fluméquine, 4,5 et
administration de fluméquine, 429
J1, J2, J3, J4, J5 et J6 4,2 µg/kg de résidus de fluméquine ont Cornejo et al., 2010
µg/kg de résidus de fluméquine ont
été quantifiés respectivement dans le
été quantifiés
muscle et le foie
À J24, selon le traitement administré,
différentes concentrations de résidus
Pour le traitement A et B : d’enrofloxacine ont été
J3, J10, J17 et J24 quantifiées dans les plumes : NA** Jansen et al., 2016
Pour le traitement C : J24 A : 2500 µg/kg
B : 5000 µg/kg
C : 6500 µg/kg
Selon le traitement administré,
différentes concentrations
Selon le traitement administré,
d’oxytétracycline ont été quantifiées :
différentes concentrations de résidus
d’oxytétracycline ont été quantifiées
Dans les muscles :
dans les plumes : Berendsen et al.,
J31 A : 0,01 mg/kg ; B : 0,02 mg/kg ; C :
A : 6,8 mg/kg 2013
0,21 mg/kg
B : 6,8 mg/kg
C : 21 mg/kg
Dans le foie :
A : 0,04 mg/kg ; B : 0,04 mg/kg ; C :
0,35 mg/kg
22
 Familles
Antimicrobiens analysés Schémas posologiques*
antimicrobiennes
Comparaison de trois
traitements différents :
A : 20 % de doxycycline à 15
mg/kg de poids vif une fois par
jour pendant 5 jours
consécutifs par gavage par voie
orale
Doxycycline
B : 5 mg/kg de poids vif une fois
par jour pendant 5 jours
consécutifs par pulvérisation
C : 1 mg/kg de poids vif dans
l’eau de boisson une fois par
jour pendant 27 jours
consécutifs
50 mg par kg de poids vif à 10
% d’oxytétracycline une fois par
Oxytétracycline
jour pendant 7 jours par gavage
par voie orale
30 mg/kg de poids vif à 10 % de
Florfénicol
florfénicol une fois par jour
Phénicolés + µg/kg de florfénicol et de résidus de
pendant 5 jours consécutifs par
Florfénicol amine
gavage par voie orale
32 mg/kg de poids vif une fois
par jour pendant 7 jours
Macrolides Tylosine
consécutifs par gavage par voie
orale
30 mg/kg de poids vif à 10 % de
sulfachloropyridazine une fois
Sulfachloropyridazine par jour pendant 5 jours
consécutifs par gavage par voie
Sulfamides orale
100 mg/kg de poids vif une fois
Sulfaméthazine par jour pendant 21 jours
consécutifs via la nourriture
Échéances
Pour le traitement A et B :
J1, J4, J8, J15, J18 et J22
Pour le traitement C : J22
J3, J5, J7, J13, J19 et J22
J5, J10, J15, J20, J25, J30,
J35 et J40
J4, J7, J9, J11, J13 et J15
J7, J14, J21, J3, J36 et J38
J1, J3, J5, J7 et J14
23
Résultats dans la plume Résultats dans d’autres matrices Références
À J22, selon le traitement administré,
À J22, selon le traitement administré, différentes concentrations de
différentes concentrations de résidus doxycycline ont été quantifiées :
de doxycycline ont été
quantifiées dans les plumes : Dans les muscles : Gajda et al., 2019
A : 86,3 µg/kg A : <LOQ ; B : <LOQ ; C : 181 µg/kg
B : 604 µg/kg
C : 901 µg/kg Dans le foie :
A : <LOQ ; B : <LOQ ; C : 268 µg/kg
Au 22ème jour après la dernière
Au 22ème jour, les résidus
administration d’oxytétracycline, 27
d’oxytétracycline ne sont plus détectés Cornejo et al., 2017
µg/kg de résidus d’oxytétracycline
(<LOQ) dans les muscles et le foie
ont été quantifiés dans les plumes
Au 40ème jour après la dernière
administration de florfénicol, 116,2
NA Cornejo et al., 2016
florfénicol amine ont été quantifiés
dans les plumes
Au 15ème jour après la dernière
Au 15ème jour, les résidus de tylosine
administration de tylosine, 356,6
ne sont plus détectés (<LOD) dans les Cornejo et al., 2017
µg/kg de résidus de tylosine ont été
muscles et le foie
quantifiés dans les plumes
Au 14ème jour après la dernière
Au 14ème jour, les résidus de
administration de résidus de
sulfachloropyridazine étaient inférieurs
sulfachloropyridazine, 438 µg/kg de Pokrant et al., 2018
à la LOD dans le muscle et de 16,2
sulfachloropyridazine ont été
µg/kg dans le foie
quantifiés dans les plumes
Au 14ème jour après la dernière
administration de sulfaméthazine, 5
NA Suo et al., 2019
mg/kg de résidus de sulfaméthazine
ont été quantifiés dans les plumes
 Familles
Antimicrobiens analysés Schémas posologiques* Échéances Résultats dans la plume Résultats dans d’autres matrices Références
antimicrobiennes
50 mg/kg de poids vif à 25 % de Au 16ème jour après la dernière
Au 16ème jour, les résidus de
lincomycine une fois par jour J1, J2, J4, J6, J8, J10, J13 administration de lincomycine, 3138
Lincosamides Lincomycine lincomycine ne sont plus détectés Pokrant et al., 2019
pendant 7 jours consécutifs par et J16 µg/kg de résidus de lincomycine ont
(<LOD) dans les muscles et le foie
gavage par voir orale été quantifiés dans les plumes
*Schéma posologique : posologie, durée, voie d’administration ** NA : non adapté (pas d’étude spécifique dans d’autres matrices)

24
 La plume possède donc des propriétés adsorbantes* mais elle a également la capacité à
être biosorbant* comme, par exemple, avec le Bleu Brillant (colorant), pouvant être piégé au
sein de la plume[51].
Les caractéristiques de la plume font d’elle un outil adapté à l’évaluation de l’exposition
des animaux aux pollutions environnementales et au contrôle et la surveillance de traitements
vétérinaires dans les élevages avicoles. La plume est toutefois utilisée principalement dans
différents domaines industriels.

1.2. Valorisation des plumes

1.2.1. La place de la plume dans l’industrie

La plume s’est imposée dans l’industrie du textile dès le IIIème

millénaire av. J-C., en Égypte, où elle était utilisée de manière
ornementale pour les éventails. En France, la plume apparue vers
le XIIIème siècle pour décorer les chapeaux des seigneurs et des
guerriers (Figure 2). Elle fut par la suite utilisée dans la fabrication
de couettes, d’oreillers, de duvets, etc. Les plumes
majoritairement utilisées pour ces textiles proviennent des
canards ou des oies.
À l’exception du textile, la plume pourrait devenir un nouvel
outil indispensable pour d’autres industries telles que l’industrie
pharmaceutique, cosmétique, ou encore du plastique de par sa
richesse en protéines, en carbone, en oxygène et en azote[52]. Ses
Figure 2 : Gravure de Jacques
Callot. La noblesse, le guerrier au capacités isolantes pourraient permettre à la plume d’être
chapeau orné d'une grande utilisée dans le domaine du bâtiment en tant qu’isolant
plume. (Source : musée du
Louvre)
électrique ou comme matériau de construction grâce à ses
propriétés thermiques[53].
La plume trouve également sa place dans le domaine agroalimentaire. En effet, le mélange
des fibres de plumes à la pâte de bois permet de fabriquer des emballages en industrie
agroalimentaire et ainsi limiter l’utilisation du bois[54]. Riche en azote et protéines, la plume
peut également être valorisée en farine de plumes et être incorporée comme matière
première en alimentation animale (aquacole, porcine et animaux domestiques) ou dans les
engrais[8, 55-57]. En 2018, près de 120 milles tonnes de plumes ont été collectées dans les
élevages avicoles français avant d’être valorisées et transformées en farine de plumes[6]. Pour
une tonne de plume, 300 kg de farines de plumes sont produits.

25
 1.2.2. La farine de plumes

➢ Règlementations :

Les produits dérivés des animaux d’élevage, tels que les plumes, sont désignés comme
étant des « sous-produits » en référence à la traduction du terme « animal by-product » du
règlement CE n°1774/2002[58]. Les sous-produits sont définis comme des «cadavres entiers ou
parties d’animaux ou produits d’origine animale (…) non destinés à la consommation humaine,
y compris les ovules, les embryons et le sperme »[58]. Le Syndicat des Industries Françaises de
Coproduits animaux (SIFCO) utilise le terme « coproduits animaux » pour désigner les produits
dérivés destinés à être valorisés. Les coproduits sont répartis en trois catégories selon leur
provenance[58] :
o Catégorie 1 :
Les matières de catégorie 1 correspondent aux produits devant être éliminés ou ne
pouvant faire l’objet que d’une valorisation énergétique. Ces coproduits sont issus d’animaux
atteints ou suspects de maladies, ou encore contaminés par des substances illégales (après
inspection sanitaire) ou des contaminants dangereux. Les cadavres d’animaux familiers ou de
zoo appartiennent à cette catégorie. Les coproduits de cette catégorie peuvent être valorisés
comme combustibles via les graisses ou éliminés par incinération.
o Catégorie 2 :
Les matières de catégorie 2 correspondent au lisier et à tous les produits d’origine animale
collectés lors du traitement des eaux résiduaires des abattoirs. Les coproduits issus d’animaux
morts en dehors d’un abattoir ou ne contenant pas de résidus* médicamenteux (après
inspection sanitaire) et ne relevant pas de la catégorie 1 font également partie de cette
catégorie. Ces coproduits peuvent être valorisés pour la fertilisation agricole pour les parties
solides mais également en biocarburant via les graisses collectées.
o Catégorie 3 :
Les matières de catégorie 3 sont issues d’animaux sains abattus en abattoirs et déclarés
propres à la consommation humaine, c’est à dire exempts de signe de maladie transmissible
aux êtres humains ou aux animaux. Ces coproduits animaux concernent la peau, les sabots,
les cornes, les plumes, le sang, les os, etc. Ils peuvent être valorisés pour la fertilisation
agricole, le textile, les biocarburants. Cependant, ils sont principalement transformés et
valorisés en farines animales pour être, par la suite, utilisés dans l’alimentation animale
aquacole, des animaux de rente et des animaux domestiques[8]. En France, parmi les matières
premières transformées de catégorie 3, 26 % correspondent à des coproduits provenant
d’élevage avicole, dont majoritairement des plumes[6].

26
 En 1985, la maladie neurodégénérative l’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) (ou
« crise de la vache folle »), fit son apparition sur le territoire anglais. Les farines animales,
contaminées par des restes d’animaux malades et utilisées dans l’alimentation des animaux
de rente, ont été incriminées. Suite à cette crise sanitaire, les réglementations concernant les
farines animales ont considérablement évoluées depuis ces trente dernières années.
Durant les années 1990, l’utilisation des farines animales transformées devient prohibée
dans l’alimentation des bovins[59]. Cette interdiction a été, par la suite, étendue à l’ensemble
des ruminants conformément à la décision de la commission européenne n°94/381/CE [60].
Quatorze ans après le début de cette crise sanitaire, la décision européenne n°99/534/CE
impose un traitement thermique à 133°C à 3 bars pendant 20 minutes pour les produits
dérivés toute catégorie (1, 2 et 3) provenant d’animaux[61]. Malgré la mise en place de
règlementation, au début des années 2000, les cas d’ESB continuent d’être observé. L’État
français décide alors d’interdire toute utilisation des farines animales destinées à
l’alimentation animale à l’exception des animaux domestiques[62]. En 2013, les farines
animales sont réintroduites dans l’alimentation aquacole[63].
Les produits de la valorisation des coproduits de catégorie 3 conduisant à l’obtention de
farines animales, sont aujourd’hui désignés par le terme « Protéines Animales Transformées
(PAT) »[64]. Les PAT issues de volailles peuvent être constituées d’un mélange de farines (farine
d’os, farine de sang, farine de plumes, …). Elles sont aujourd’hui principalement incorporées
en alimentation animale aquacole, porcine ou des animaux domestiques[8, 63, 65]. Le règlement
n°2021/1372 stipule que le non-cannibalisme inter-espèce doit être maintenu[8]. En 2021,
l’utilisation des PAT provenant des élevages porcins devient autorisée pour l’alimentation des
volailles. Et à l’inverse, les PAT dérivées des élevages avicoles deviennent autorisées pour
l’alimentation des porcs (Tableau 2)[8].

Tableau 2 : Utilisation des PAT pour l'alimentation animale selon leur provenance (source : Règlement UE n°2021/1372)

L’évolution de la règlementation a permis une réintroduction progressive des PAT dans la

chaîne alimentaire animale via leur alimentation et par conséquent indirectement dans la
chaîne alimentaire humaine. Les PAT sont aujourd’hui soumises à des contraintes de
traçabilité via l’utilisation de documents commerciaux ou de certificats sanitaires par les

27
expéditeurs, les transporteurs ou encore les utilisateurs des coproduits[64]. Ces documents
permettent d’assurer que les PAT produites sont issues de coproduits d’animaux sains. Par
ailleurs, afin d’assurer la sécurité sanitaire, les PAT sont réglementées concernant la présence
de contaminants chimiques (détergents, métaux lourds) ou la présence de corps étrangers.
Néanmoins, aucune règlementation n’existe à ce jour concernant la présence de résidus de
médicaments vétérinaires dans les coproduits animaux, tels que les plumes, farines de plumes
et PAT, malgré leur potentielle présence en alimentation animale. Dans la suite de ce
mémoire, nous nous focaliserons sur la farine de plumes uniquement.

➢ Processus de fabrication :

En 2018, près de 38 milles tonnes de farine de plumes ont été fabriquées, principalement
destinées à l’alimentation animale (Figure 3)[6]. Les produits finaux, engrais ou aliments pour
animaux, sont composés en général de 10 à 20 % de farine de plumes[6].

Figure 3 : Part relative des destinations des farines de plumes en 2018 (source : SIFCO)

La fabrication de farine de plumes par les industries de transformation des coproduits est
schématiquement opérée de la façon suivante (Figure 4) :
1) Les plumes sont en premier lieu collectées dans les élevages puis entraînées avec de
l’eau vers des camions de collecte.
2) Les corps étrangers (débris de matériel) éventuels sont ensuite extraits des lots de
plumes avant concassage, calibrage et émottage des plumes.

28
 3) Conformément à la décision européenne n°99/534/CE[61], concernant les mesures
applicables au traitement de certains déchets animaux dans le cadre de la protection
contre les encéphalopathies spongiformes transmissibles, les plumes subissent un
traitement thermique sous pression puis un séchage.
4) La farine de plumes est enfin obtenue suite au broyage des plumes.

Figure 4 : Schéma général d’un process industriel de fabrication de

farine de plumes (source : SIFCO et règlement n°99/534/CE)

➢ Présence de substances organiques :

La présence de substances organiques a été observée dans des échantillons de farines de
plumes commercialisées en Asie et aux États-Unis[17]. Des antidépresseurs, des fongicides, de
la caféine, des hormones et des médicaments vétérinaires, en particulier des antibiotiques,
ont été détectés[17]. Tous les échantillons de farines de plumes industrielles (n=12) analysées
ont révélé la présence de deux à dix antimicrobiens[17]. Cette unique étude sur les farines de
plumes implique d’évaluer l’impact des procédés de fabrication de farine de plumes sur les
antibiotiques ou autres contaminants. A notre connaissance, il n’existe pas d’étude de l’impact
du processus de fabrication de farine de plumes sur la stabilité des antibiotiques
potentiellement présents.
Les plumes et la farine de plumes, riche en matière azotée et en protéines, ont la capacité
de stocker les substances organiques et inorganiques auxquelles la volaille est exposée. La
présence d’antibiotiques dans les plumes et la farine n’étant pas réglementée, leur devenir et
leur stabilité nécessite d’être étudiés pour comprendre et évaluer les risques potentiels de
transmissions d’antibiotiques à l’animal via l’alimentation, et indirectement à l’homme.

29
2. Les antibiotiques en milieu avicole

Des maladies peuvent survenir dans les élevages des volailles (poulets, poules pondeuses,
dindes, canards, …). Lorsqu’il s’agit de maladies bactériennes, les animaux peuvent être traités
par des médicaments vétérinaires, et en particulier, des antibiotiques.

2.1. La volaille

2.1.1. Contextualisation du marché avicole

La Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database (FAOSTAT) a collecté

de nombreuses données en aviculture entre 1961 et 2020. Avec plus de 200 millions de tonnes
produites, les États-Unis sont le premier pays producteur de volaille (Figure 5-A). La demande
en volaille augmentant continuellement, la production américaine a été multipliée par huit
entre 1961 et 2020. Le marché de la production de volaille en Europe en 2019 représente 8 %
de la production mondiale[66]. Actuellement, le premier producteur Européen, se trouve être
la Pologne avec 2,1 millions de tonnes de volailles produites. Plus de deux tiers de la
production européenne, soit 71,4 %, est représentée par la Pologne, l’Espagne, la France,
l’Italie, l’Allemagne et les Pays-Bas (Figure 5-B).
La production de volaille française a beaucoup évolué entre 1961 et aujourd’hui.
Cinquième producteur mondial, la France connaît ensuite une forte augmentation de sa
production entre 1990 et 2000 (Figure 5-C), avec la Bretagne et la Vendée ayant un rôle
moteur dans ce développement[67]. Cependant, face à la concurrence mondiale et
européenne[68], en 2020, la France diminue par deux sa production et arrive alors en 28 e
position sur le rang mondial et 3e sur le rang européen avec près de 1,1 million de tonnes de
volaille produites.

30
Figure 5 : (A) Évolution de la production mondiale de volaille de chair entre 1961 et 2020, (B) répartition relative de la
production européenne de la production de volaille de chair en 2020, (C) évolution de la production française de volaille de
chair entre 1961 et 2020. (données source : FAOSTAT).

Le poulet et la dinde représentent à eux seuls 75 % de la production de volaille française

(Figure 6).

Figure 6 : Production de volailles en France entre 2000 et 2020 présentée par tonne équivalent
carcasse (tec) (Source : FranceAgriMer)

31
 Malgré la diminution de la production de volaille en France en 2020, la tendance actuelle
est de produire de façon intensive pour répondre à la croissance démographique. Il existe de
nombreux labels français reposant sur différents critères tels que la nourriture,
l’hébergement, le mode d’élevage ou encore l’âge à l’abattage.
Le label standard (ou conventionnel) représente actuellement 83 % des élevages avicoles
français[69]. La sélection génétique a permis de sélectionner des poulets de chair pouvant
atteindre 2 kg à l’âge de 6 semaines contre 1,5 kg à l’âge de 12 semaines pour le label rouge.
En Europe, les poulets de chair sont élevés sur sol, à l’extérieur ou dans des bâtiments en
présence de litière, tandis que les poules pondeuses sont élevées en cage[70]. La densité des
élevages de poulets est réglementée et ne peut pas dépasser 42 kg/m 2 de poids vif.
Néanmoins, l’élevage en groupe favorise l’apparition de maladies (virus, bactéries, parasites).

2.1.2. Les maladies avicoles

Dans la suite de ce mémoire, nous nous focaliserons sur les maladies bactériennes.
De nombreuses infections bactériennes peuvent affecter les différents élevages de poulet
de chair. Parmi ces infections, on considère les colibacilloses (ou infection à Escherichia coli)
et le coryza infectieux (infection à Avibacterium paragallinarum) comme étant des infections
bactériennes fréquentes des voies respiratoires pouvant entraîner la mort de l’animal[71]. La
clostridiose aviaire (infection à Clostridium botulinum), une zoonose*, est aussi une maladie
bactérienne fréquente en élevage affectant les villosités intestinales des volailles. Pour limiter
l’apparition et la propagation de ces maladies bactériennes, au cours de l’année 2020, plus de
400 000 tonnes d’animaux ont été traités avec des antibiotiques dans les élevages de
poulets[72].

2.2. Les antibiotiques et les conséquences liées à cette utilisation

2.2.1. Usages des antibiotiques chez la volaille

➢ Usages :
Le Comité mondial WOAH (Organisation mondiale de la santé animale) et l’OMS
(Organisation mondiale de la santé humaine) ont adopté une liste d’agents antimicrobiens
nécessaires en médecine vétérinaire[73] et humaine[74]. Certaines familles d’antibiotiques sont
communes à ces deux médecines. Les familles des quinolones et des pénicillines, traitant des
infections humaines graves, sont utilisées dans les élevages avicoles. Ces deux familles sont
considérées critiques, c’est-à-dire qu’il n’existe pas d’autre traitement alternatif dans le cas
d’une infection humaine grave[74]. Les antibiotiques relevant des familles des phénicolés,

32
lincosamides, sulfamides et tétracyclines, également utilisés dans les élevages avicoles, sont
catégorisés « hautement importants » et sont utilisés pour traiter des infections humaines[74].
L’Union Européenne a interdit l’usage préventif d’antibiotiques en médecine vétérinaire pour
tous les animaux et a mis en place la possibilité de réserver certains antimicrobiens
exclusivement à l’homme[3], dont les céphalosporines.
La classification des antibiotiques est généralement basée sur leur structure chimique ou
encore leur mode d’action (Figure 7)[75].

Figure 7 : Modes d'action des antibiotiques sur une bactérie (source : Chardon, H. et al.)

En médecine vétérinaire, les antibiotiques peuvent avoir deux types d’usagesa[76] :

o Le traitement curatif :
L’usage curatif ou thérapeutique des traitements vétérinaires vise à contrôler une
infection bactérienne déjà existante[76].
o Le traitement préventif :
Le traitement préventif peut être métaphylactique ou prophylactique. L’usage
métaphylactique correspond au traitement d’un groupe entier d’animaux lors de premiers
signes cliniques de quelques animaux[76]. L’usage prophylactique correspond au traitement
d’un élevage en présence de facteurs de risque important propice au développement
d’infection[76].
Les traitements dans les élevages peuvent être réalisés par voie entérale (voie orale) ou
par voie parentérale (voie intraoculaire ou musculaire). Le traitement par voie orale peut être

a
Depuis 2006, il est interdit d’utiliser les antibiotiques en tant que facteur de croissance dans l’Union Européenne. Depuis Avril 2022,
l’importation et la mise sur le marché en France de viandes et de produits transformés (à base de viandes) issus d’animaux ayant reçu des
antibiotiques facteurs de croissance est interdite.
33
administré via l’eau de boisson ou via l’alimentation. Pour ce dernier cas, des pré-mélanges
médicamenteux peuvent être utilisés : des médicaments vétérinaires sont directement
incorporés dans la fabrication de l’aliment pour l’animal[77-79]. De grands élevages d’animaux
peuvent également être traités via la nébulisation ou la pulvérisation d’un traitement
antibiotique dans le bâtiment. Le traitement passe alors dans les voies respiratoires des
animaux. Chez le poulet ou la poule pondeuse, l’administration des médicaments vétérinaires
se fait cependant principalement via l’eau de boisson.

➢ Antibiotiques utilisés chez le poulet :

Les principales familles d’antibiotiques autorisés et potentiellement utilisés en élevage
chez le poulet sont présentées dans le Tableau 3[80, 81]. Les substances indiquées dans le
règlement n°37/210/CE et ayant une LMR fixée chez la volaille peuvent être potentiellement
utilisés en élevage avicole dans le cas de maladies.
Tableau 3 : Présentation générale des familles d'antibiotiques utilisées chez le poulet de chair et leurs structures principales
(source : RefAvi et rapport annuel de 2020 de l’ANMV)

Familles d’antibiotiques Descriptions générales Squelettes carbonés

Diaminopyrimidines Composés de synthèse dérivés du cycle pyrimidine.
Ils sont généralement associés aux sulfamides en
raison d’effet synergique, en particulier le
triméthoprime.

Les diaminopyrimidines sont généralement utilisés

pour les infections digestives et pulmonaires ainsi
que les septicémies.

Exemple : Triméthoprime
Lincosamides Isolés et découverts en 1952 à partir d’espèces de
Streptomyces, ils sont constitués d’un cycle
pyrrolidine lié par une liaison amide à une molécule
de sucre. Ils sont principalement actifs contre les
bactéries Gram (+) et protozoaires.

Les lincosamides sont utilisés dans le cadre

d’infection cutanées ou dentaires.

Exemple : Lincomycine
Macrolides Composés à propriétés bactériostatiques constitués
de macrocycles de lactone souvent associés à des
sucres.

Les macrolides sont généralement utilisés pour les

infections respiratoires.

Exemples : Érythromycine, Tylvalosine

Phénicolés Composés de synthèse essentiellement
bactériostatiques constitués d’une fonction
phénylpropanoïde.

Les phénicolés sont utilisés dans le cadre de

traitements d’infections dermiques ou d’infections
respiratoires.

Exemples : Florfénicol amine, Thiamphénicol

34
 Familles d’antibiotiques Descriptions générales Squelettes carbonés
Pénicillines Composés bêta-lactamines principalement actifs
contre des bactéries à Gram (+).

Les pénicillines sont généralement utilisées dans le

traitements d’infections respiratoires et gastro-
intestinales.

Exemples : Amoxicilline, ampicilline, cloxacilline,

dicloxacilline, oxacilline, pénicilline G, pénicilline V
Quinolones Composés généralement constitués d’un groupement
pipérazine.

Les quinolones sont utilisées dans le cadre

d’infections respiratoires ou de septicémies.

Exemples : Ciprofloxacine, danofloxacine,

enrofloxacine, acide oxolinique, sarafloxacine
Sulfamides Découverts en 1935, ce sont des composés de
synthèse efficaces contre les bactéries de Gram (+) et
(–).

Les sulfamides sont généralement utilisés en

association avec le triméthoprime
(diaminopyrimidine) dans le traitement de la
colibacillose.

Exemples : Sulfadiazine, sulfadiméthoxine,

sulfaméthazine, sulfaméthoxazole,
sulfaméthoxypyridazine, sulfaquinoxaline
Tétracyclines Composés constitués de quatre cycles accolés et
utilisés pour cibler les bactéries parasites
intracellulaires.

Les tétracyclines sont utilisées dans le cadre d’un

traitement de septicémie ou encore d’infections
respiratoires et digestives.

Exemples : Oxytétracycline, épi-oxytétracycline,

tétracycline, épi-tétracycline, chlortétracycline, épi-
chlortétracycline

L’Agence Nationale du Médicament Vétérinaire (ANMV) évalue le niveau d’exposition des

animaux aux antibiotiques (ALEA) en considérant la totalité des antibiotiques vendus sur
l’année comme étant administrés aux animaux élevés sur le territoire national durant cette
même année. Les volailles ont été principalement exposées aux antibiotiques appartenant aux
familles des polypeptides, des tétracyclines et des pénicillines au cours de l’année 2020 (Figure
8)[80]. Les polypeptides, pénicillines et les tétracyclines sont généralement utilisés en première
intention car ce sont des antibiotiques à large spectre, c’est-à-dire qu’ils sont efficaces contre
un grand nombre de bactéries. Avant 2011, les céphalosporines représentaient environ 5 %
des ventes[82]. Cependant, depuis 2011, elles ne sont plus autorisées chez les volailles afin de
préserver l’usage de ces antibiotiques exclusivement à l’homme, constituant l’unique
traitement de certaines maladies infectieuses (infections graves des voies respiratoires basses
et hautes, infections urinaires, etc.) chez l’être humain[83].

35
Figure 8 : Évolution des indicateurs ALEA par famille d'antibiotiques entre 2011, 2016 et 2020 pour les volailles (source :
Rapport annuel de l’ANMV, 2021)

2.2.2. Conséquence d’une exposition aux antibiotiques

La résistance des bactéries aux antibiotiques existe en médecine vétérinaire et en

médecine humaine. Les bactéries résistantes aux antibiotiques peuvent être potentiellement
transmises à l’homme via les denrées issues d’animaux d’élevage destinées à la
consommation humaine (Figure 9)[74], et, à l’inverse, l’homme, sous traitement antibiotique,
peut transmettre des bactéries résistantes aux animaux.

36
 Figure 9 : La résistance aux antimicrobiens dans la chaîne alimentaire humaine (source :
OMS)

Suite à l’émergence de bactéries résistantes, le terme « antibiorésistance » a été employé

et a été défini comme la capacité d’une bactérie à résister à l’action d’un antibiotique dans le
cas d’une infection bactérienne. Il existe deux formes de résistance[75] :
o La résistance innée :
La résistance innée est une résistance à un antibiotique de manière naturelle,
potentiellement dû à un défaut d’accès de l’antibiotique dans la bactérie.
o La résistance acquise :
Un traitement antibiotique mal adapté (sous-dosage, surdosage ou non adapté à la
bactérie visée) peut entraîner le développement de bactéries résistantes. Ces bactéries
peuvent devenir résistantes via trois mécanismes principaux (Figure 10)[75] :
▪ La mutation chromosomique permettant de contourner l’effet
de l’antibiotique, c’est-à-dire que la bactérie se protège en empêchant
l’antibiotique de se lier, soit à la paroi bactérienne, soit à la cible interne.
▪ L’antibiotique administré peut être modifié et/ou dégradé par
des enzymes bactériennes, rendant l’antibiotique alors inactif.
▪ L’expulsion par efflux rejette l’antibiotique administré dans le
milieu extérieur. L’antibiotique n’accède donc plus en quantité suffisante à
la cible présente dans la bactérie.

37
 Une même espèce bactérienne peut présenter plusieurs mécanismes de résistance à une
même famille d’antibiotiques. Une bactérie peut aussi être résistante à plusieurs familles
d’antibiotiques, devenant ainsi multirésistante.

Figure 10 : Principaux mécanismes bactériens de résistance aux antibiotiques (source : Chardon, H. et al.)

Nous nous focaliserons sur la bactérie la plus commune : Escherichia coli. Cette bactérie se
développe dans l’intestin de l’animal et peut être retrouvée dans les fientes. Sur l’année 2020,
près de 38 % des bactéries Escherichia coli chez la volaille présentent des résistances à au
moins 3 familles d’antibiotiques[84]. Entre 2014 et 2020, les pourcentages de résistance à
l’ampicilline, aux fluoroquinolones, au sulfaméthoxazole (sulfamide), au triméthoprime et aux
tétracyclines a diminué de façon significative chez les Escherichia coli isolées chez le poulet[84].
Dans les principaux pays mondiaux et européens producteurs de volaille, plus de 40 % des
bactéries Escherichia coli sont devenues résistantes aux familles des tétracyclines, des
sulfamides et des pénicillines[85].
Aujourd’hui, 4,95 millions des mortalités humaines mondiales sont associées à la
résistance antimicrobienne[86]. Pour préserver la santé humaine et animale, il est primordial
de déterminer les facteurs potentiels qui pourraient amener à une sélection de bactéries
résistantes chez l’animal et être indirectement transmises à l’homme.

2.3. Sécurité sanitaire des aliments : plans de surveillance et de contrôle,

règlementations et préventions

La sécurité sanitaire des aliments a pour objectif de veiller à l’hygiène et à l’innocuité des
aliments à travers des règlementations et des contrôles des filières agroalimentaires.

38
 La stratégie méthodologique de choix permettant d’élaborer des normes en matière de
sécurité sanitaire alimentaire est l’analyse de risque[87]. Elle comporte trois volets :
l’évaluation des risques, la gestion des risques et la communication sur les risques.
L’évaluation est séparée de la gestion et de la communication afin de permettre une
évaluation la plus objective possible sur la base de données scientifiques. L’évaluation des
risques repose sur quatre étapes : (i) l’identification du danger qui permet d’appréhender la
toxicité sous son aspect aiguë ou chronique, (ii) la caractérisation du danger qui permet
d’identifier les doses qui induisent les effets toxiques et/ou les doses qui ne présentent pas
d’effet toxique, (iii) l’évaluation de l’exposition qui permet d’évaluer l’exposition de l’Homme
et (iv) la caractérisation du risque, phase dans laquelle le niveau d’exposition chez l’Homme
est comparée à la Valeur Toxicologique de Référence retenue[87]. L’évaluation est réalisée au
niveau mondial par le JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) qui
transmet son avis au Codex Alimentarius, au niveau européen par l’EFSA (Autorité européenne
de sécurité des aliments) qui fournit son avis à la DG SANCO (Direction générale de la santé et
des consommateurs). Au niveau français, c’est l’ANSES qui a la charge de réaliser ses
évaluations qu’elle transmet sous forme d’avis principalement à la DGAL (Direction générale
de l'Alimentation), mais également à d’autres directions ou ministères. Le gestionnaire va
mettre en place des politiques pour gérer les risques et ce en quatre composantes :
l’appréciation des risques, l’évaluation des différentes options de gestion des risques,
l’exécution de la décision de gestion et le suivi de contrôle[87].
Les plans de contrôle (PC) sont imposés par la communauté européenne tandis que les
plans de surveillance (PS) sont réalisés à l’échelle nationale. Les contaminants recherchés
peuvent être chimiques, biologiques ou physiques Des LMR ont été établies pour les résidus
chimiques par décision de la Commission Européenne basée sur un avis scientifique rendu par
l’Agence européenne du médicament (EMA) pour les denrées[88].

2.3.1. Chez l’animal

La fabrication d’aliment pour animaux est aujourd’hui règlementée[79, 89]. Cependant, des
contaminations croisées peuvent avoir lieu entre les aliments exempts de médicaments et les
aliments médicamenteux car ils sont parfois fabriqués sur les mêmes lignes de production[77,
78]. Des plans de surveillance réalisés en 2017 et 2018 ont mis en évidence la présence

d’antibiotique dans l’alimentation animale[90-92]. L’animal peut donc être exposé à de faibles
concentrations d’antibiotiques via l’alimentation générant de la résistance. Des bactéries
résistantes peuvent ainsi se développer et être transmises indirectement à l’homme via la
consommation de denrées animales.
L’aliment pour animaux peut également constituer une source d’exposition aux
antibiotiques en raison de la présence potentielle de résidus d’antibiotiques dans les matières
premières entrant dans sa composition. L’aliment des poissons et des porcs d’élevage peut
être composé de 10 à 20 % de farine de plumes. Quelques études confirment que les plumes
et les farines de plumes ont la capacité de stocker les antibiotiques auxquels l’animal a été

39
exposé introduisant ainsi la question du risque d’accroissement du développement de
l’antibiorésistance.

2.3.2. Chez l’homme

Pour réduire l’exposition humaine aux antibiotiques via les aliments issus de l’élevage, des
moyens et des règlementations concernant l’utilisation des antibiotiques en élevage agricole
en Europe ont été mis en place. Pour cela, des limites maximales de résidus* (LMR) ont été
fixées[93]. Par la suite des temps d’attente avant abattage* des animaux d’élevage ont été
définis selon le traitement thérapeutique administré.
Dans le cadre de la surveillance et du contrôle, des PSPC sont réalisés chaque année pour
évaluer l’exposition du consommateur via la consommation de denrées d’origine animale ou
végétale[94]. L’application de ces PSPC permet, entre autres, de contrôler une utilisation
correcte des médicaments vétérinaires dans les élevages, l’objectif étant de protéger les
consommateurs à l’exposition de résidus. Les PSPC de 2019 en filière avicole décèlent aucune
non-conformités[95].
2.3.3. Préventions

Concernant la prévention, un plan pluriannuel (2012-2022), Ecoantibio, visant à lutter

contre l’antibiorésistance a été mis en place par le Ministère de l’Agriculture et de
l’Alimentation. Les objectifs principaux du plan Ecoantibio 1 (2012-2017)[20] étaient, dans un
premier temps, de réduire d’au moins 25 % l’usage des antibiotiques utilisés en traitement
vétérinaire, et, dans un second temps de réduire considérablement l’utilisation des
fluoroquinolones et des céphalosporines de 3ème et 4ème génération en médecine vétérinaire.
Afin de répondre à ces objectifs, différents axes ont été développés tels que :

• Le suivi de la consommation des antibiotiques destinés aux traitements vétérinaires

• La sensibilisation des personnes qui utilisent ces traitements
• La vérification du respect des règles et des pratiques de prescription
Concernant le plan Ecoantibio 2 (2017-2022)[96], les objectifs étaient d’évaluer les impacts
du premier plan et d’en poursuivre les actions tout en maintenant la tendance à la baisse de
l’exposition des animaux aux antibiotiques. La thèse a été réalisée dans le cadre du plan
Ecoantibio 2.
Depuis 2011, l’exposition globale des animaux aux antibiotiques a diminué de 45,4 %[97].
Dans le filière avicole, l’usage des antibiotiques a été réduit d’environ 50% en 10 ans (Figure
11)[98].

40
 Figure 11 : Estimation du nombre de traitements antibiotiques par animal (ALEA : Animal Level of Exposure to
Antimicrobials - estimation obtenu en divisant le poids vif traité par la masse animale totale pour une espèce
donnée) (source : ANSES - ANMV)

Pour les travaux de recherche présentés dans ce mémoire, nous nous sommes focalisés sur
30 antibiotiques autorisés et couramment utilisés dans les élevages avicoles français. La
structure et les familles de ces antibiotiques sont présentées en Annexe 1.

3. Analyse pharmacocinétique et méthodologie analytique

La présence de résidus d’antibiotiques dans les plumes et dans les farines, utilisées dans
la fabrication d’aliment pour animaux, nécessite d’être étudiée. Pour cela, nous avons besoin
d’outils adaptés et performants pour comprendre le devenir des antibiotiques dans les plumes
et dans la farine de plumes. A notre connaissance, aucune modélisation compartimentale n’a
été réalisée pour décrire le devenir des antibiotiques et prévoir la distribution* dans la plume
lors de traitements.

3.1. Analyse et paramètres pharmacocinétiques

La pharmacocinétique permet de décrire l’évolution des concentrations d’un principe actif

dans l’organisme, permettant de comprendre le devenir de ce principe actif dans les matrices
analysées. Il existe deux approches qui peuvent être compartimentale ou non-
compartimentale.

41
 3.1.1. Analyse compartimentale

L’objectif d’une analyse compartimentale est de représenter la réalité biologique à travers

un modèle pharmacocinétique comportant un ou plusieurs compartiments. Le modèle peut
comporter un seul compartiment (modèle simple) ou plusieurs[99]. Par exemple, une dose de
médicament introduite par voie intraveineuse peut se distribuer entre deux compartiments :
le compartiment « 1 » et le compartiment « 2 » (Figure 12). Un équilibre s’établit alors entre
les deux compartiments correspondant à la vitesse de transfert (kentrée et ksortie) et avec la
concentration présente dans chaque compartiment (Figure 12).

Figure 12 : Représentation pharmacocinétique d'un modèle à deux compartiments avec : D = dose administrée, VD = volume
de distribution du compartiment, Ct = concentration en médicament dans le compartiment à l’instant t, kentrée et ksortie =
constantes de vitesse d’échange entre les deux compartiments, kélimination = constante de vitesse d’élimination, Et = quantitée
excrétée à l’instant t
L’analyse compartimentale permet de prédire le devenir d’un médicament dans
l’organisme. Cependant, son utilisation nécessite que le modèle sélectionné représente au
mieux les données expérimentales, déterminant donc la qualité des résultats obtenus.

3.1.2. Analyse non compartimentale

Par définition, l’analyse non compartimentale (NCA) n’utilise pas la théorie des
compartiments. Son objectif est de décrire le devenir du médicament dans l’organisme. Elle
est définie par certains paramètres :

42
 ➢ Aire sous la courbe :
L’exposition globale de l’animal au médicament vétérinaire administré est représenté par
l’aire sous la courbe (AUC) et l’aire sous la courbe du premier moment (AUMC) entre le début
du traitement (t=0) et le moment de la dernière concentration mesurable (Clast). Ces
paramètres sont calculés en utilisant la méthode des trapèzes correspondant à la somme des
aires entre deux prélèvements t et t+1 (Figure 13)[100] :

Figure 13 : Calcul des aires par la méthode des trapèzes (source : Gabrielsson et al.)

L’AUC est calculée grâce à l’Équation 1 :

𝑛
𝐶𝑖 + 𝐶𝑖+1
𝐴𝑈𝐶 = ∑ × 𝛥𝑡 (1)
2
𝑖=1

L’AUC extrapolée de la dernière concentration quantifiable (Clast) à l’infini peut être

calculée grâce à l’Équation 2 :
𝐶𝑙𝑎𝑠𝑡
𝐴𝑈𝐶𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑝 = (2)
𝜆𝑧
Le λz correspond à la pente de la phase terminale obtenue par régression linéaire et doit
être calculé avec 3 points minimum.

➢ Temps moyen de résidence :

Le temps passé, en moyenne, par un médicament dans l’organisme est représenté par le
temps moyen de résidence (MRT). Ce paramètre tient compte de l’absorption*, de la
distribution* et de l’élimination* du médicament (uniquement dans le cas d’une
administration non intraveineuse). Il se calcule grâce à l’Équation 3 :

43
 𝐴𝑈𝑀𝐶𝑙𝑎𝑠𝑡
𝑀𝑅𝑇 = (3)
𝐴𝑈𝐶𝑙𝑎𝑠𝑡

➢ Temps de demi-vie :
Le temps de demi-vie (HL) correspond au temps nécessaire pour que la concentration de
la substance soit divisée par 2[101]. Il se calcule grâce à l’Équation 4 :
ln(2)
𝐻𝐿 = (4)
𝜆𝑧

L’avantage de la NCA est l’absence de nécessité de formuler une hypothèse sur le modèle
pharmacocinétique car l’AUC est évaluée à partir des points expérimentaux obtenus, même
si les données sont peu nombreuses (sparse data). Cependant, cette méthode ne permet pas
de décrire les processus de transfert qu’il pourrait y avoir entre deux compartiments (par
exemple, le transfert entre sang et plumes).

3.2. Techniques analytiques

Pour déterminer des paramètres pharmacocinétiques et décrire des données obtenues, il

est indispensable d’avoir des outils analytiques performants et fiables capable de quantifier
de faibles concentrations (de l’ordre du µg/kg) de résidus.
La majorité des études portant sur l’analyse des résidus antibiotiques dans les plumes
présente des méthodes développées et validées pour un seul antibiotique [9-15, 47, 49, 50, 102] ou
une même famille d’antibiotiques[16, 103]. La difficulté est de développer une méthode unique
pour l’analyse d’antibiotiques appartenant à différentes familles et n’ayant pas les mêmes
propriétés physico-chimiques. La technologie évoluant, des méthodes analytiques
multirésidus dans les plumes ont pu être développées[104, 105]. Pour développer une méthode
multirésidus d’antibiotiques dans les plumes et dans la farine, il est nécessaire d’utiliser une
technique de séparation et de détection appropriée à l’ensemble des molécules analysées
ainsi qu’une méthode unique (si possible) de préparation des échantillons.

3.2.1. Techniques de séparation

Il existe différentes méthodes pour séparer des substances chimiques organiques entre
elles. Les techniques chromatographiques restent les plus utilisées pour l’analyse de
molécules organiques dans diverses matrices. La chromatographie gazeuse (GC) et la
chromatographie liquide (LC) sont les deux chromatographies les plus utilisées pour l’analyse
de molécules organiques. Dans le cas de l’analyse des antibiotiques, qui sont des molécules

44
non volatiles et thermolabiles, la LC est la technique de séparation la plus adaptée (Tableau
6)[9-14, 16, 47, 49, 50, 102-106]. Le principe général de la LC est présenté sur la Figure 14.

Figure 14 : Principe général d’un système analytique de chromatographie liquide

Les principaux paramètres à optimiser pour le développement d’une méthode d’analyse

par LC (HPLC, UPLC ou nano) sont :

➢ La colonne analytique :
Les antibiotiques sont des molécules amphiphiles. C’est-à-dire qu’ils sont constitués de
groupements polaires et apolaires. Les groupements polaires restent cependant majoritaires.
Afin de séparer un mélange, un mécanisme de compétition s’installe entre la rétention des
analytes dans la phase stationnaire et l’élution des analytes dans la phase mobile. Dans le cas
d’un mélange d’antibiotiques, une colonne ayant une phase stationnaire apolaire de type
octadécyl (C18) est la plus adaptée pour permettre aux analytes d’être légèrement retenus
via leurs groupements apolaires par la colonne avant d’être entraîné par la phase mobile
polaire (Tableau 6)[9-16, 47, 49, 50, 102-105]. Ce type de chromatographie est la chromatographie en
phase inverse.

45
 La granulométrie de la phase stationnaire est également un paramètre important dans le
choix de la colonne. Une faible granulométrie améliore le temps d’analyse et l’allure des pics
mais il faut que le système d’appareillage soit adapté aux pressions plus élevées. Il existe trois
principales chromatographies liquide définis par la granulométrie et le diamètre de la
colonne (Tableau 4) :
Tableau 4 : Types de chromatographie selon la nature de la colonne (granulométrie et diamètre)

Types de chromatographie Granulométrie des particules Diamètre de colonne

Chromatographie liquide haute performance (HPLC) 3 - 5 µm 3,9 - 4,6 mm
Chromatographie liquide ultra haute performance (UPLC) < 4 µm 3,9 - 4,6 mm
Nano chromatographie liquide (nano LC) 1 - 5 µm 75 µm
L’analyse des antibiotiques dans les plumes a principalement été réalisée par HPLC ou
UPLC (Tableau 6).
➢ Le mode d’élution :
L’élution peut être effectuée en mode isocratique, c’est-à-dire que la composition de la
phase mobile ne varie pas au cours du temps d’analyse, ou bien en mode gradient. Ce dernier
mode implique que la composition de la phase mobile varie au cours du temps, soit de façon
continue (gradient linéaire) ou soit par paliers (gradient non linéaire). Le mode gradient
(linéaire ou non) a pour intérêt de séparer des substances chimiques proches structuralement
tout en permettant une meilleure résolution des pics. Dans le cas de l’analyse des
antibiotiques dans les plumes, c’est ce mode qui est le plus utilisé (Tableau 6).
➢ La phase mobile (nature et composition) :
La composition de la phase mobile va influencer l’élution des substances d’intérêt dans le
système chromatographique. L’analyse des antibiotiques dans les plumes est généralement
effectuée en utilisant un gradient binaire, c’est-à-dire un mélange de deux solvants, soit dans
un milieu acidifié ou tamponné (Tableau 6). Le milieu tamponné permet de maintenir la
stabilité du pH et donc de maintenir l’état d’ionicité des analytes (cations, anions, neutres,
zwiterions) liés à leur caractère acido-basique. L’acidification permet généralement de faciliter
la protonation (ajout d’un ion H+) des analytes lors de leur passage dans la source améliorant
ainsi le rendement d’ionisation. Dans le cas d’une chromatographie en phase inverse, la phase
mobile est constituée de solvants polaires (par exemple, le méthanol ou l’acétonitrile) pour
entraîner les antibiotiques qui sont des molécules polaires. L’avantage d’utiliser un gradient
binaire est de pouvoir faire varier la polarité du solvant injecté dans la LC et ainsi d’optimiser
la séparation des analytes.

3.2.2. Techniques de détection/quantification

La LC peut être couplée à différents systèmes de mesure tels que la fluorimétrie,

l’ultraviolet (UV) ou encore la spectrométrie de masse (MS). Le couplage usuel est la LC-MS
(Tableau 6). Néanmoins, en présence de molécules composées d’un groupement
chromophore (par exemple, la tylosine), il est envisageable d’utiliser un spectrophotomètre

46
ultraviolet visible (UV). Si la molécule présente un groupe fluorescent, il est possible de la
détecter avec un fluorimètre (par exemple, les fluoroquinolones). Cependant, certaines
substances antibiotiques ne possèdent pas de groupe chromophore, ni fluorescent (par
exemple, la lincomycine). La LC-MS offre une grande sélectivité et permet d’atteindre de
faibles concentrations dans les plumes (Tableau 6).
Le principe de la MS est présenté sur la Figure 15 :

Figure 15 : Principe général d’un système analytique de spectrométrie de masse

Constituée de trois parties distinctes, la MS permet d’identifier les molécules d’intérêt,

préalablement ionisées, en fonction de leur rapport masse moléculaire (m) sur la charge de
l’ion (z) formé (m/z) :
➢ Une source d’ionisation :
Il existe différentes sources d’ionisation permettant de produire des ions en phase
gazeuse. Le choix de la source d’ionisation dépend des molécules à analyser. Les principaux
critères de choix sont :
o La volatilité et la stabilité thermique des molécules
o Les fonctions chimiques présentes
o La taille des molécules (masse moléculaire)
Les ionisations dites « dures » génèrent des ions moléculaires à nombre impair d’électrons
se fragmentant parfois totalement. C’est le cas par exemple pour l’impact électronique (EI).
Les ionisations dites « douces » génèrent des ions moléculaires à nombre pair d’électrons
qui restent généralement stables. C’est le cas pour la source MALDI et la source d’ionisation
Electrospray (ESI). Cependant, la source MALDI ne s’utilise pas en couplage avec une méthode
séparative, contrairement à la source ESI qui peut être couplée à la LC.

47
 La source ESI est basée sur la formation à pression atmosphérique d’ions mono et
multichargés, positivement ou négativement selon le mode d’ionisation utilisé. A pression
atmosphérique et sous un potentiel électrique élevé, l’extrait d’échantillon est nébulisé après
son passage dans la LC ; de fines gouttelettes chargées positivement ou négativement sont
formées. Le solvant provenant de la phase mobile est évaporé grâce à un courant de gaz
chauffé : il y a fission des gouttelettes jusqu’à formation d’ions individuels désolvatés. Les ions
sont ensuite dirigés vers le système dispersif (Figure 16).
Les 30 substances antibiotiques choisies dans notre étude, ayant des m/z allant de 248 à
1042, sont des molécules non volatiles. De plus, leurs fonctions amine primaire (-NH2), acide
carboxyliques (-COOH) ou alcool (-OH), leurs confèrent une importante thermolabilité,
nécessitant l’usage d’une source d’ionisation « douce ». La source ESI est donc adaptée à
l’analyse des antibiotiques dans toutes les matrices, y compris la plume (Tableau 6).

Figure 16 : Principe d'une source Electrospray (source :

https://stringfixer.com/fr/Electrospray_ionization#wiki-2)

➢ Un système dispersif :
Les ions formés dans la source sont ensuite accélérés vers le système dispersif qui permet
de trier les ions selon leur rapport m/z. Le système dispersif généralement utilisé en ESI, en
particulier pour l’analyse d’antibiotiques, est constitué de trois quadripôles, (triple
quadripôles) (Tableau 6). Le premier quadripôle permet de sélectionner les ions dits
« parents » selon le rapport m/z. Le deuxième quadripôle joue le rôle de cellule de collision
afin de fragmenter ces ions parents en ions dits « fils », et, enfin, le troisième et dernier
quadripôle sélectionne les ions fils selon leur rapport m/z (Figure 17). Cette description
correspond à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). L’intérêt est de confirmer
l’identité de l’analyte dans l’échantillon analysé.

48
 Figure 17 : Principe d'un triple quadripôle (source :
https://www.wikiwand.com/en/Triple_quadrupole_mass_spectrometer)

➢ Le détecteur :
Le détecteur correspond au mode de détection à utiliser dans le cadre d’analyse LC-
MS/MS. Le mode SRM (Selected Reaction Monitoring) correspond aux scans pour une fenêtre
de masse en comparaison au mode MRM (Multiple Reaction Monitoring) qui, lui, correspond
aux scans de plusieurs fenêtres de masse en même temps (plusieurs transitions). Ces deux
modes sont généralement combinés ensemble dans le domaine de la protéomique pour
l’analyse d’échantillons biologiques[107]. Le mode MRM est principalement utilisé pour
l’analyse d’antibiotiques dans les plumes (Tableau 6). Ce mode a l’avantage d’être spécifique
de la molécule ciblée en éliminant la plupart des analytes non ciblées. Il « isole » le composé
à analyser. Il permet ainsi de réduire le signal sur bruit (S/N) et d’améliorer la détection et la
quantification.
Considérant l’ensemble des informations extraites de la littérature scientifique concernant
l’analyse des substances antibiotiques dans les plumes (Tableau 6) et les performances des
méthodes décrites, la technique de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de
masse en tandem (LC-MS/MS) s’avère être la technique analytique de choix. Cependant, la
plume est une matrice complexe composée notamment de kératine et de protéines. Cela
implique le recours à des techniques d’extraction des substances antibiotiques dans les
plumes et de purification des échantillons.

49
 3.3. Préparation des échantillons de plumes

3.3.1. Broyage

Les premières études sur le dosage des antibiotiques dans les plumes prédécoupaient les
plumes avant de les broyer au mortier[12, 47]. Au fil des années, de nouvelles technologies ont
été développées permettant de faciliter le broyage de matrice complexe, notamment des
plumes. Par exemple, le broyeur à billes[108] permet de broyer, mélanger et homogénéiser les
matrices solides introduites dans des enceintes (bols de broyage) en une fine poudre de
l’ordre de 5 µm (Figure 18). Les enceintes de broyage, contenant l’échantillon solide ainsi que
des billes de broyage, sont mises en mouvement sur le plan horizontal par les vibrations en
forme d’arc de cercle des enceintes que produit l’instrument. Le broyage de l’échantillon a
lieu sous l’impact des billes sur l’échantillon contre les parois des enceintes de broyage.

Figure 18 : Principe du broyeur à billes MM 400 de chez Retsch

50
 3.3.2. Extraction et purification

Après le broyage, la préparation des échantillons comporte deux étapes essentielles :

➢ L’extraction :
L’extraction consiste au traitement de l’échantillon permettant d’isoler les substances
d’intérêts de la matrice étudiée. Le choix de la technique d’extraction dépend de la nature de
la matrice (liquide ou solide) et des molécules à extraire. Les extractions les plus utilisées pour
l’analyse des antibiotiques est l’extraction liquide/liquide (LLE), dans le cas d’une matrice
liquide (par exemple le lait), et l’extraction solide/liquide (SLE), dans le cas d’une matrice
solide (par exemple le muscle de porc, les plumes, …) ou encore l’extraction sur phase solide
(SPE). La SPE permet d’extraire et de concentrer les analytes d’intérêt. Son principe repose sur
l’affinité des substances d’intérêt avec la phase stationnaire présente dans les différentes
cartouches SPE. II existe des cartouches adaptées soit pour les espèces ioniques de type SCX®
(« Strong Cation eXchange ») ou à interaction hydrophile et lipophile de type HLB®
(« Hydrophilic-Lipophilic Balanced »). La phase stationnaire de la cartouche SPE est
conditionnée avec des solvants avant le dépôt des extraits contenant les analytes d’intérêt.
Les analytes d’intérêts, retenus par la phase stationnaire de la cartouche, sont élués après
élimination des possibles interférents (étape de lavage) avant une étape d’évaporation ou de
reconstitution (Figure 19).

Figure 19 : Principe de l'extraction en phase solide (SPE) (source : waters)

L’analyse des antibiotiques dans les plumes repose sur une SLE (Tableau 6). L’efficacité de
l’extraction des substances d’intérêt en SLE est due au choix des solvants. Pour rappel, les
antibiotiques sont des molécules polaires. Cela implique l’utilisation de solvants polaires (par

51
exemple le méthanol, l’acétonitrile, …) pour extraire les antibiotiques des plumes (Tableau 6).
L’eau, solvant polaire également, pourrait être utilisée dans l’extraction des antibiotiques dans
les plumes et dans la farine de plumes, cependant, une phase d’évaporation est réalisée après
l’extraction pour concentrer les analytes. L’eau s’évaporant à 100°C, les antibiotiques
thermolabiles pourraient être dégradés durant la phase d’évaporation. L’ajout de solution
acide ou de solution tampon est possible dans les extraits pour réguler le pH et favoriser
l’ionisation des analytes d’intérêts (Tableau 6).
➢ La purification :
La purification d’échantillon extrait permet d’éliminer les éventuels interférents (par
exemple les protéines) présent dans la matrice étudiée pouvant affecter l’analyse de la
molécule cible en LC-MS/MS. Il existe différentes techniques de purification :
o SPE :
Les cartouches SPE peuvent également être utilisées dans le cadre d’une purification des
échantillons. La phase stationnaire des colonnes SPE interagissent avec certains interférents,
contrairement aux analytes qui passent directement à travers la cartouche sans être retenus.
Ce mode d’utilisation se fait donc en une étape (versus 3 ou 4 en SPE classique).
o QuEChERS :
La méthode QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged and Safe) est basée sur le
principe d’une LLE ou SLE avec un solvant organique en présence de sels et de tampon. Cette
technique rapide, facile, peu chère, efficace, robuste et fiable a été développée en 2003 afin
d’extraire les pesticides dans les végétaux et les sols[109]. Aujourd’hui, elle peut être appliquée
dans la recherche de résidus de médicaments vétérinaires dans les denrées animales[110, 111].
Il existe différentes variétés de sels et d’adsorbants* avec des propriétés physico-chimiques
différentes, pouvant être ajustés (quantité ou nature du sel) en fonction des substances et
matrices analysées (Tableau 5)[112].
Tableau 5 : Applications et utilisations des sels et adsorbants de la méthode QuEChERS (source : Interchim)

Sels/Adsorbants Fonctions
Élimine les traces d’eau pour une meilleure dispersion des
Sulfate de magnésium anhydre
substances de l’échantillon et facilite le traitement de la phase
(MgSO4)
organique
Chlorure de sodium Favorise la séparation des phases et le transfert préférentiel des
(NaCl) analytes vers la phase organique
Élimine les substances acides, les pigments polaires, les sucres et
Silice greffée amine primaire secondaire (PSA)
acides gras de la matrice
Silice greffée
Purifie la matrice des lipides et stérols
C18
Carbone graphite Élimine les pigments ainsi que les molécules à structures planaires et
(PGC) les caroténoïdes

52
 o Salting out :
Ce nouveau procédé, mis en avant en 2017[113], consiste à saturer la phase aqueuse en sel,
facilitant le transfert des substances d’intérêt vers la phase organique.
Les méthodes d’analyses de résidus antibiotiques dans les plumes employées comportent
parfois des techniques de purifications (clean-up) utilisant la technique SPE (Tableau 6).
Toutefois, les techniques de QuEChERS et de salting-out n’ont pas encore été mises en
application pour l’analyse de résidus d’antibiotiques dans les plumes.
Le Tableau 6 présente l’ensemble des caractéristiques et des performances des méthodes
d’analyse des résidus d’antibiotiques dans les plumes. Les méthodes analytiques
multirésidus[104, 105] ont présenté des performances moins fidèles (reproductibilité et
répétabilité) pour les antibiotiques étudiés par rapport aux méthodes analytiques
développées pour un seul composé ou une même famille d’antibiotiques.

53
 Tableau 6 : Performances des méthodes d'analyse validées pour le dosage de résidus d’antibiotiques dans les plumes

Extractions/Purifications Séparations/Détections Limites analytiques

Antimicrobiens
Techniques Conditions Techniques Conditions Justesse Répétabilité LOD LOQ Références
analysés
(µg/kg) (µg/kg)
12 g de plumes broyées Colonne Symmetry C18
Double extraction : LC-MS/MS A* : MeOH + 0,1 % TFA
Enrofloxacine San Martin et
SLE 30 mL d’acétone en mode B* : H20 + 0,1 % TFA 102-108 % 1-7 % NM** 1
Ciprofloxacine al., 2007
puis MRM Mode gradient
20 mL d’acétone ESI +
12 g de plumes broyées Colonne Symmetry C18
Double extraction : LC-MS/MS A : MeOH + 0,1 % TFA
Cornejo et al.,
Fluméquine SLE 30 mL d’acétone en mode B : H20 + 0,1 % TFA 91-92 % 13-14 % 1,5 2
2010
puis MRM Mode gradient
20 mL d’acétone ESI +
Colonne Symmetry C18
0,25 g ou 0,50 g de
A : ACN + 10mM
plumes broyées
LC-MS/MS d’acétate d’ammonium Berendsen et
2 mL d’acétone
Oxytétracycline SLE + SPE en mode B : H2O + 1mM NM NM NM NM al.,
2 mL de tampon McIlvain-
SRM d’acétate d’ammonium 2013
EDTA
Mode gradient
SPE : Oasis HLB
ESI +
Colonne Synergie fusion
2 g de plumes broyées
RP
Double extraction :
A : MeOH/H2O (90/10)
20 mL H2O LC-MS/MS
Florfénicol + 0,1 % d’acide acétique Cornejo et al.,
SLE 20 mL d’acétone en mode 99-102 % 1-16 % 20 24,5
Florfénicol amine B : H2O + 0,1 % d’acide 2016
puis MRM
acétique
15 mL de
Mode gradient
dichlorométhane
ESI +

12 g de plumes broyées
Double extraction : Colonne C18
Haag et al.,
Enrofloxacine SLE 30 mL d’acétone LC-Fluo A : ACN + triéthylamine 93-100 % NM 62 80
2016
puis B : H2O + triéthylamine
20 mL d’acétone

SLE + 0,1 g de plumes broyées LC-MS/MS Colonne Symmetry C18

Jansen et al.,
Enrofloxacine hydrolyse 2 mL de MeOH + 0,125 % en mode A : ACN/H2O (90/10) + 93-102 % 4-9 % 10 50
2016
acide + SPE de TFA SRM 5mM AF

54
 Extractions/Purifications Séparations/Détections Limites analytiques
Antimicrobiens
Techniques Conditions Techniques Conditions Justesse Répétabilité LOD LOQ Références
analysés
(µg/kg) (µg/kg)
Bain-marie : 1h à 45°C B : H2O + 5mM AF
2 mL de tampon McIlvain Mode gradient
puis ESI +
14 mL de tampon
McIlvain
SPE : Strata-X
5 g de plumes broyées Colonne C18
10 mL de tampon A : ACN + 1M
phosphate dibutylamine Cornejo et al.,
Tylosine SLE + SPE LC-UV 61-105 % 2-8 % 50 64,1
15 mL MeOH B : H2O 2017
15 mL H2O C : 0,02M dibutylamine
SPE : SCX Mode isocratique
10 g de plumes broyées Colonne C18 Sunfire
20 mL d’acétone LC-MS/MS A : MeOH + 0,1 % AF
Oxytétracycline Cornejo et al.,
SLE + SPE 20 mL de tampon en mode B : H2O + 0,1 % AF 96-105 % 16-19 % 20 22,6
4-Épi-oxytétracycline 2017
McIlvain MRM Mode gradient
SPE : Oasis HLB ESI +

85-106 % pour les 9-20 % pour les

Colonne C18
tétracyclines, 93- tétracyclines, 3-
A : MeOH + 2mM
1 g de plumes broyées 131 % pour les 29 % pour les
formation d’ammonium
2 mL MeOH + 0,125 % de quinolones, 73- quinolones, 4-82
LC-MS/MS + 0,16 % AF
TFA 134 % pour les % pour les Jansen et al.,
Multirésidus SLE + SPE en mode B : H2O + 2mM formate 2-20 NM
16 mL de tampon macrolides, 99- macrolides, 4-34 2017
SRM d’ammonium + 0,16 %
McIlvain 110 % pour les % pour les
AF
SPE : Strata-X lincosamides, 93- lincosamides, 4-
Mode gradient
116 % pour les 25 % pour les
ESI +
sulfamides sulfamides

Colonne C8
2 g de plumes broyées LC-MS/MS A : MeOH + 0,1 % AF
Pokrant et al.,
Sulfachloropyridazine SLE + SPE 40 mL d’éthyl acetate en mode B : H2O + 0,1 % AF 98-101 % 23 % 10 14,6
2018
SPE : Bakerbond MRM Mode gradient
ESI +
LC-MS/MS Colonne C18 Sunfire
Chlortétracycline 5 g de plumes broyées Pokrant et al.,
SLE + SPE en mode A : MeOH + 0,1 % AF 92-107 % 8-17 % 20 20
Oxytétracycline 20 mL d’acétone 2018
MRM B : H2O + 0,1 % AF

55
 Extractions/Purifications Séparations/Détections Limites analytiques
Antimicrobiens
Techniques Conditions Techniques Conditions Justesse Répétabilité LOD LOQ Références
analysés
(µg/kg) (µg/kg)
20 mL de tampon Mode gradient
McIlvain ESI +
puis
10 mL de tampon
McIlvain
SPE : Oasis HLB
Colonne C18 Sunfire
A : ACN + 0,1 % acide
1 g de plumes broyées LC-MS/MS acétique
Maddaleno et
Lincomycine SLE + SPE 40 mL MeOH en mode B : H2O + 0,1 % acétate 98-101 % 0,6-7 % 19 62,7
al., 2019
SPE : Chromabond MRM d’ammonium
Mode gradient
ESI +
Colonne C18
0,2 g de plumes broyées LC-MS/MS A : ACN
Gajda et al.,
Doxycycline SLE 4 mL H2O + 5 % en mode B : H2O + 0,1 % AF NM 8% NM 5
2019
trichloroacétique MRM Mode gradient
ESI +
0,2 g de plumes broyées Colonne C18
1 mL d’acide oxalique à LC-MS/MS A : ACN
Gajda et al.,
Multirésidus SLE + SPE 0,02M en mode B : H2O + 0,025 % HFBA 93-107 % 4-12 % NM NM
2019
8 mL d’ACN MRM Mode gradient
SPE : Oasis HLB ESI +
Sulfamethazine Colonne C18
0,1 g à 0,5 g de plumes
LC-MS/MS A : MeOH + 0,1 % AF
broyées Decheng et al.,
SLE + SPE en mode B : H2O + 0,1 % AF 93-103 % NM 0,3 1
5 mL d’HCL 2019
MRM Mode gradient
SPE : HLB
ESI +
* Composition de la phase mobile ; ** Non mentionné

Afin d’apporter des données fiables, il est nécessaire d’avoir des méthodes analytiques validées performantes.

56
 3.4. Le cycle de vie d’une méthode analytique

Les travaux de cette thèse ont été menés dans un laboratoire de référence national et
européen sur les résidus de médicaments vétérinaires dans les aliments d’origine animale.
Actuellement, il n’existe pas de cadre règlementaire pour l’analyse d’antibiotiques dans les
coproduits animaux. Nous avons donc fait le choix de nous placer dans le cadre règlementaire
de la décision de la commission 2002/657/CE[114], notre objectif étant d’avoir des outils
performants dans l’analyse de résidus antibiotiques dans les plumes et dans la farine de
plumes. Cette décision réglementaire portant sur les performances d’analyse et
l’interprétation des résultats, est mise en place en laboratoire dans le cadre d’analyse de
routine.
Tout développement de méthode analytique ciblée implique le choix des analytes
d’intérêt en amont avant de procéder au développement et à l’optimisation de la méthode
d’analyse satisfaisant les différents critères des paramètres à évaluer, conformément à la
décision de la commission 2002/657/CE[114] (Figure 20).

Figure 20 : Cycle de vie d'une méthode d'analyse (source : guide de validation ANSES)

L’évaluation des performances et la validation d’une méthode analytique sont décrites

dans différentes normes, notamment la norme ISO 17025[115] : « La validation est la
confirmation par examen et l’apport de preuves objectives du fait que les exigences
particulières en vue d’une utilisation prévue déterminée sont remplies ». Par ailleurs, la
décision de la commission 2002/657/CE[114], récemment remplacée par la décision
2021/808[116], présente les modalités d’application de la directive 96/23/CE[117] concernant les
performances des méthodes d’analyse pour le contrôle de résidus dans les denrées d’origine
animale ainsi que l’interprétation des résultats.

57
 3.4.1. Vocabulaire et démarche de validation

Le terme « validation » et ceux des caractéristiques associées sont définis dans le Tableau
7[118].
Tableau 7 : Définition du vocabulaire de la validation (source : guide de validation ANSES)

Caractéristiques Définitions
« Confirmation par examen et la fourniture de preuves objectives que les exigences
Validation
particulières pour l’usage spécifique prévu sont remplies »[115].
Caractérisation Détermination des critères de performance d’une méthode
Relation proportionnelle entre les concentrations théoriques et les concentrations
Linéarité
calculées
Fonction de réponse Relation entre la réponse et les concentrations théoriques
Étroitesse de l’accord entre la valeur moyenne obtenue à partir d’une large série de
Justesse
résultats d’essais et une valeur de référence acceptée
Étroitesse de l’accord entre une série de mesures provenant de multiples prises d’un
Fidélité
même échantillon homogène dans des conditions précises
Variabilité prenant en compte les effets jours, opérateur, équipements au sein d’un même
Fidélité intermédiaire
laboratoire
Répétabilité Variabilité dans un même jour, pour un même opérateur et un appareillage identique
Variabilité totale incluant la variabilité liée aux laboratoires utilisant la méthode
Reproductibilité
analytique
Étroitesse de l’accord entre le résultat d’essais et la valeur de référence acceptée (justesse
Exactitude
+ fidélité)
Limite de détection
Plus petite quantité pouvant être détectée mais non quantifiée comme valeur exacte
(LOD)
Limite de quantification Plus petite quantité quantifiable avec une exactitude définie c’est-à-dire une justesse et
(LOQ) une fidélité connue
Capacité à établir de manière univoque l’existence de la substance à analyser en présence
Sélectivité
d’autres substances potentiellement présentes
Spécificité Capacité à établir que le signal mesuré provient seulement de la substance à analyser

Suite à l’application du protocole de validation de la méthode d’analyse, les paramètres

de performances obtenus (biais, écart-type, etc.) pour les caractéristiques étudiées (justesse,
fidélité, etc.) sont confrontées aux critères définis d’après la décision 2002/657/CE [114].
La caractérisation d’une méthode d’analyse peut se faire par approche dite « critère par
critères » (Figure 21), c’est-à-dire qu’elle consiste à traiter séparément chaque critère. Cette
approche est généralement utilisée dans le cadre de la référence, par exemple, lors de la
validation d’une méthode d’analyse de résidus de médicaments vétérinaires dans les denrées
conformément aux exigences de la décision 2002/657/CE.

58
Figure 21 : Illustration de la méthodologie de caractérisation d'une méthode analytique selon une approche "critère par
critère" (source : guide de validation ANSES)

3.4.2. L’approche globale : le profil d’exactitude

La caractérisation d’une méthode d’analyse peut aussi se faire par une approche dite
« globale » (Figure 22). Cette approche est basée sur un seul paramètre de performance, à
savoir l’exactitude, regroupant la justesse et la fidélité d’une méthode (Annexe 2).

Validation

Figure 22 : Illustration de la méthodologie de caractérisation d'une méthode analytique selon une approche "globale"
(source : guide de validation ANSES)

L’approche globale permet de conclure sur la validité d’une méthode analytique selon un
seul critère, l’intervalle d’acceptabilité, lié aux exigences professionnelles. Par définition,
l’exactitude (erreur totale) est une combinaison de la justesse (erreur systématique) et de la
fidélité (erreurs aléatoires) (Figure 23), rendant cette approche intéressante par rapport à
l’approche classique. Ces deux paramètres, que sont la justesse et la fidélité, sont
systématiquement évalués lors de la validation d’une méthode analytique.

59
Figure 23 : Représentation schématique des termes de validation (justesse, fidélité et exactitude)

Le profil d’exactitude (PE)[119-122], est un outil statistique graphique (Figure 24) prenant en
compte l’erreur totale, soit la justesse et la fidélité d’une méthode analytique. Il se construit
en se basant sur la construction d’un intervalle de tolérance (β) en utilisant les estimations du
biais (justesse) et de la variance (fidélité intermédiaire et répétabilité) pour chaque niveau de
concentration étudié. La méthode analytique est alors considérée valide si, et seulement si,
l’intervalle de tolérance est situé dans les limites d’acceptabilité (±λ) préalablement fixées.
Selon les domaines d’application, les limites d’acceptabilité peuvent être de 20 % ou encore
de 30 %.
Pour construire l’intervalle de tolérance, il est nécessaire de fixer la proportion (1- β) qui
correspond au pourcentage de mesures situées en dehors de l’intervalle de tolérance. Par
exemple, avec un β de 80 %, un résultat sur cinq (20 %) risque d’être en dehors de l’intervalle
de tolérance.
Le PE permet également de fournir une information supplémentaire relative aux LOQ. Ces
LOQ correspondent à l’intersection entre les limites d’acceptabilité et l’intervalle de tolérance.
À défaut d’intersection, les LOQ d’une méthode se rapportent aux concentrations extrêmes
du domaine de validation qui a été étudié.
Différents PE peuvent être générés pour différentes fonction de réponse. Un indice
d’exactitude est calculé en se basant sur la justesse, la fidélité et la gamme de
concentration[123]. L’indice d’exactitude représente l’ensemble de la variabilité de la méthode
analytique. Plus il est proche de 1, plus la gamme couverte est totale avec une limite
acceptable et garantie. Le PE choisi sera celui avec l’indice d’exactitude le plus proche de 1 et
la fonction de réponse la plus simple[120].

60
Figure 24 : Illustration d'un profil d'exactitude d’une méthode analytique validée

Cette approche globale est aujourd’hui utilisée dans différents domaines y compris pour
l’analyse de médicaments vétérinaires dans les denrées[124, 125] mais n’a cependant jamais été
employée pour la recherche d’antibiotiques dans les plumes et dans la farine de plumes.
La LC-MS/MS semble être l’outil le plus adapté pour évaluer le devenir des antibiotiques
dans les plumes et dans la farine de plumes. Après optimisation chromatographique et de la
préparation des échantillons, la méthode analytique peut être validée selon deux approches :
critères par critères ou globale. Une approche globale permet d’évaluer l’exactitude de la
méthode à travers la justesse et la fidélité et d’avoir un graphique unique représentant la
fiabilité de la méthode analytique.

61
4. Conclusion générale

Les coproduits animaux, tel que les plumes, sont aujourd’hui recyclés et valorisés dans
différents domaines, y compris le domaine agroalimentaire. Les plumes, riches en protéines
et en azote, sont transformées en farine de plumes. Ces farines peuvent être par la suite
incorporées dans les engrais ou utilisées dans la composition d’alimentation pour animaux
(poissons, porcs, et animaux domestiques). La présence de maladies bactériennes dans les
élevages avicoles implique l’utilisation d’antibiotiques pour éviter la propagation de la maladie
ou la mort des animaux infectés. La plume à la capacité d’adsorber les substances
inorganiques et organiques auxquelles l’animal a pu être exposé. Dans le cas des antibiotiques,
ils peuvent être présents dans la plume pendant une durée plus longue que dans les tissus.
L’impact de la valorisation des plumes en farine de plumes sur la teneur des antibiotiques
dans ces dernières n’a jamais été étudié. La présence éventuelle d’antibiotiques dans les
farines de plumes implique donc potentiellement une exposition involontaire des animaux
aux antibiotiques via l’alimentation animale, et indirectement une exposition de l’homme.
Une exposition récurrente aux antibiotiques, chez l’animal ou chez l’homme, pourrait
entraîner des mécanismes de résistance chez certaines bactéries et ainsi participer au
développement de bactéries résistantes.
La présence des antibiotiques dans les farines de plumes et le devenir lors des procédés
de fabrication nécessite d’être étudiés pour évaluer le risque d’exposition des animaux aux
antibiotiques à travers l’alimentation animale. Dans cet objectif, nous avons souhaité
comprendre les mécanismes de transfert des antibiotiques dans la plume. Pour cela, il était
essentiel d’avoir des outils pharmacologiques et analytiques performants, permettant de
fournir des résultats fiables. L’analyse non compartimentale semble être adaptée pour une
étude comportant peu de données chez le poulet (sparse data). L’analyse de ces données
devra être réalisée à partir de données de mesures issues d’une méthode analytique
multirésidus fiable et performante, comportant une étape essentielle de préparation
d’échantillon (extraction/purification). La LC-MS/MS semble être la technique de choix pour
quantifier des antibiotiques dans les plumes. Il serait également intéressant d’évaluer l’impact
du traitement sur la résistance bactérienne ainsi que la transmission de bactéries des fientes
aux plumes au vu de l’absence de données sur ce sujet.

62
 II- OBJECTIFS DE LA THÈSE ET STRATÉGIE DE RECHERCHES

Il est important de définir les facteurs pouvant contribuer à la circulation de résidus

antibiotiques chez l’animal, et indirectement chez l’homme via les denrées, avec comme
risque, le développement potentiel de bactéries résistantes aux antibiotiques. La valorisation
des plumes en farine de plumes pourrait être un facteur de transmission de résidus
d’antibiotiques via l’alimentation animale. La question de recherche qui découle
indirectement de l’état de l’art est :
Faut-il mettre en place des règlementations concernant la présence de résidus
d’antibiotiques dans les coproduits animaux, en particulier dans les plumes, et dans les
produits transformés tels que les farines de plumes ?
La synthèse de la problématique du projet de recherche est représentée sur la Figure 25.

Figure 25 : Synthèse de la problématique du projet de recherche : des sources aux voies de contamination pour l’animal,
l’homme et l’environnement

63
 Pour comprendre le devenir des antibiotiques dans les plumes et les farines, les objectifs
de cette thèse sont les suivants :

A- Outils analytiques

Afin de pouvoir étudier le devenir des résidus antibiotiques chez le poulet de chair, en
particulier dans les plumes et dans la farine de plumes, des outils analytiques performants ont
été développés et validés. Une approche globale, utilisant le profil d’exactitude, a été adoptée
pour la validation des méthodes analytiques.
En premier lieu, une méthode de dosage LC-MS/MS a été validée pour 30 substances
antibiotiques autorisés en élevage avicole français (Annexe 1), l’objectif étant d’avoir un outil
analytique performant permettant d’analyser des plumes et des farines industrielles. La
méthode analytique reposant sur une extraction SLE suivie de la technique de salting out a
fait l’objet d’un article accepté en 2021 dans Food Additives and Contaminants : Part A.
Afin de comprendre le devenir des antibiotiques chez le poulet, en particulier dans les
plumes et les farines, nous nous sommes focalisés sur trois antibiotiques à large spectre (la
sulfadiazine, le triméthoprime et l’oxytétracycline) utilisés dans les élevages avicoles et en
médecine humaine. Ces antibiotiques sont catégorisés « hautement important » en médecine
humaine. La méthode analytique multirésidus a alors été adaptée et validée pour les matrices
plasma et fientes et les gammes ont été étendues pour la matrice plume.

B- Présence des antibiotiques sur les plumes et impact sur les bactéries

Une étude cinétique de la sulfadiazine, du triméthoprime et de l’oxytétracycline a été

menée dans les plumes, plasma et fientes chez le poulet de chair. L’objectif était de
comprendre les mécanismes de transfert des antibiotiques dans les plumes (contamination
interne ou externe). Pour décrire le profil cinétique de ces trois antibiotiques, une analyse non
compartimentale a été réalisée car les données obtenues étaient peu nombreuses (sparse
date) du fait de contraintes liées au bien-être animal. En parallèle, une étude de la
transmission de bactéries résistantes de la fiente à la plume a été réalisée afin d’évaluer
l’impact potentiel du traitement des volailles par les antibiotiques sur la flore intestinale de
l’animal via les fientes et les plumes. Deux modes d’élevage ont été étudiés : la cage et le sol,
l’objectif étant de comparer le mode d’hébergement en cage (utilisé chez les poules
pondeuses), et le mode d’hébergement sur sol (utilisé chez le poulet de chair). Les résultats
obtenus lors de ces études cinétiques et microbiologiques ont été soumis au Journal of
Agricultural and Food Chemistry.
Une étude exploratoire a également été menée sur des plumes provenant d’animaux
hébergés en cage : la distribution de la sulfadiazine, du triméthoprime et de l’oxytétracycline

64
a été observée le long de la plume à travers une étude de segmentation sur des plumes
provenant uniquement des ailes. L’objectif était de comprendre la migration des antibiotiques
dans la plume au cours du temps. Ces résultats ont été présentés au congrès EuroResidue IX
et ont fait l’objet d’un article soumis dans Food Control.

C- Présence des antibiotiques dans la farine de plumes

L’impact de la transformation des plumes en farine sur les antibiotiques a été évalué. Pour
ce faire, de la farine de plumes a été fabriquée en adaptant un protocole industriel à l’échelle
du laboratoire sur des plumes contaminées en sulfadiazine, triméthoprime et oxytétracycline.
Par ailleurs, des échantillons de farine de plumes industriel français ont été analysés par LC-
MS/MS avec la méthode analytique multirésidus validée pour 30 antibiotiques.

65
PARTIE II : RÉSULTATS

66
 L’ensemble des résultats ont été générés dans le cadre du plan Ecoantibio 2 (2017-2022)
ayant pour actions (1) d’élaborer, mettre à jour et diffuser des guides de bonnes pratiques et
(2) surveiller l’évolution de l’antibiorésistance (axe et actions 11 et 14 du plan Ecoantibio).

I- Outils analytiques

1. Article 1 : Méthode analytique multirésidus

L’objectif de ce premier travail de recherche était de développer et valider une méthode

analytique performante multirésidus par LC-MS/MS afin de détecter et de quantifier des
résidus d’antibiotiques dans des échantillons de plumes et de farine. Cette méthode repose
sur une extraction solide/liquide suivie d’une étape de saturation en sel de la phase aqueuse
(salting out) (Figure 26). Après optimisation, la méthode d’analyse multirésidus par LC-MS/MS
a été validée selon les recommandations de la décision de la commission n°2002/657/CE [114]
tout en suivant une approche globale via l’utilisation du profil d’exactitude[120-122].

Figure 26 : Méthode d'extraction validée

Une synthèse de la méthode est présentée sur la Figure 27.

67
Figure 27 : Méthode analytique développée et validée pour l’analyse des différents échantillons

La méthode d’analyse multirésidus a fait l’objet d’une publication en 2021 dans Food
Additive & Contaminants Part A :
Dréano E, Laurentie M, Hurtaud-Pessel D, Mompelat S. Multi-class analysis of 30
antimicrobial residues in poultry feathers by liquid chromatography tandem mass
spectrometry. Food Additive & Contaminants Part A. 2021. 38(10): p. 1701-1716.
Les supplementary data de cet article se trouvent en Annexe 3.

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2. Extension et validation de la méthode

Pour étudier la distribution de la sulfadiazine, du triméthoprime et de l’oxytétracycline

chez le poulet de chair, la méthode analytique, initialement validée pour 30 antibiotiques dans
la plume, a été validée pour ces trois antibiotiques dans les matrices plasma et fiente et la
gamme de validation a été étendue dans la matrice plume (Tableau 8).
Tableau 8 : Performance de la méthode analytique pour la sulfadiazine, le triméthoprime et l’oxytétracycline dans les
plumes, plasma et fientes

Fidélité intermédiaire LOQ et gamme

Matrices Antibiotiques Justesse (%)
(%) validée (µg/kg)
Sulfadiazine -1,18 – 2,13 0,43 – 1,19 5 – 4000
Plumes Triméthoprime -7,93 – 10,18 0,61 – 3,73 5 – 1000
Oxytétracycline -3,55 – 8,90 5,02 – 20,05 5 – 4000
Sulfadiazine 0,22 – 0,73 0 – 2,09 5 – 4000
Plasma Triméthoprime -2,08 – 7,52 0,75 – 3,83 10 – 1000
Oxytétracycline -1,44 – 6,64 3,73 – 8,58 10 – 4000
Sulfadiazine -2,56 – 6,71 1,33 – 7,40 5 – 4000
Fientes Triméthoprime 1,69 – 16,57 2,97 – 7,47 5 – 1000
Oxytétracycline -0,53 – 11,54 3,45 – 8,21 20 – 4000
Tolérances -20 % à + 10% <24

La validation a été réalisée selon une approche globale via l’application du profil
d’exactitude[120-122] (Figure 28).

84
Figure 28 : Profils d'exactitudes de la sulfadiazine dans (A) les plumes, (B) le plasma et (C) les fientes

Cette méthode analytique a été par la suite appliquée dans le cadre d’une étude de
recherche pharmacocinétique réalisée sur des poulets de chair hébergés en cage et sur sol.

85
 II- PRÉSENCE DES ANTIBIOTIQUES SUR LES PLUMES ET IMPACT
SUR LES BACTÉRIES

1. Article 2 : Présence et déplétion de la sulfadiazine, du triméthoprime et de

l’oxytétracycline dans les plumes de poulet de chair traités et impact des bactéries

Les objectifs de ces travaux sont :

➢ Étudier le devenir de la sulfadiazine associée au triméthoprime et de l’oxytétracycline
chez le poulet de chair. Pour ce faire, des échantillons de plumes, fientes et plasma
ont été analysés par LC-MS/MS et une analyse non compartimentale a été effectuée
pour décrire le devenir de ces trois antibiotiques chez le poulet de chair. Les plumes
ont été prélevées sur différentes zones de l’animal pour observer la répartition des
antibiotiques dans les plumes de poulet de chair (Figure 29).

Figure 29 : Zones de prélèvements des

plumes sur des poulets de chair traités à la
sulfadiazine, au triméthoprime et à
l'oxytétracycline

➢ Évaluer l’impact potentiel du traitement antibiotique sur l’évolution de la résistance

aux antibiotiques des souches bactériennes indicatrices dans les fientes.

➢ Évaluer la transmission de souches bactériennes résistantes aux antibiotiques des

fientes aux plumes pour deux modes d’élevages différents : cage et sol.

86
 Une synthèse de l’étude est présentée sur la Figure 30.

Figure 30 : Synthèse des études cinétiques et microbiologiques réalisées chez le poulet de chair

L’étude a fait l’objet d’un article soumis en Août 2022 au Journal of Agricultural and Food
Chemistry :
Dréano E, Valentin C, Taillandier J-F, Travel A, Soumet C, Bridier A, Hurtaud-Pessel D,
Laurentie M, Viel A, Mompelat S. Presence and depletion of sulfadiazine, trimethoprim and
oxytetracycline into feathers of treated broiler chickens and impact on antibiotic resistant
bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2022.
Les supplementary data de cet article se trouvent en Annexe 4.

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2. Article 3 : Étude exploratoire – Distribution des antibiotiques le long de la plume

Une étude exploratoire a été menée sur des poulets de chair en cage. L’objectif de cette
étude était de comprendre le mécanisme de transfert de la sulfadiazine, du triméthoprime et
de l’oxytétracycline dans les plumes et d’observer la distribution de ces antibiotiques le long
de la plume au cours du temps.
Pour cela, des plumes provenant des ailes de poulet de chair traités ont été segmentées
en 9 segments avant analyse par LC-MS/MS. En premier lieu, le calamus a été séparé du reste
de la plume, puis, la plume a été segmentée en quatre segments de même longueurs. Pour
chacun de ces segments, les barbes ont été séparés du rachis (Figure 31).

Figure 31 : Structure et segmentation d'une plume

Cette étude a été présentée au Congrès EuroResidue IX (Pays-Bas, 23-25 Mai 2022) à
travers une communication orale et a fait l’objet d’un article soumis en Août 2022 au journal
Food Control :
Dréano E, Miquel D, Taillandier J-F, Laurentie M, Hurtaud-Pessel D, Mompelat S.
Antimicrobial residues along the broiler feathers: a non-invasive sample matrix for monitoring
and surveillance of veterinary treatments used in poultry. Food and Control. Soumis Août
2022.

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 III- PRÉSENCE DES ANTIBIOTIQUES DANS LA FARINE DE PLUMES

1. Impact du processus de fabrication de farine de plumes sur les antibiotiques

1.1. Contexte

Avant d’être transformées en farine, les plumes sont soumises à un traitement thermique
sous pression avant d’être séchées puis broyées. Il n’existe aucune donnée renseignant sur
l’impact des procédés de fabrication des farines de plumes sur les antibiotiques. Une meilleure
connaissance de l’effet du processus de fabrication des farines sur les antibiotiques
permettrait de contribuer à l’évaluation de l’exposition des animaux d’élevage aquacoles et
porcins. Dans cet objectif, des plumes issues de deux groupes d’animaux traités
indépendamment par la sulfadiazine et le triméthoprime d’une part et l’oxytétracycline, ont
été analysées avant et après production de farine afin d’évaluer l’impact de fabrication sur la
stabilité des résidus antibiotiques. Les travaux réalisés ont fait l’objet d’une présentation sur
poster au congrès national Analytics du 5 au 8 Septembre 2022.

1.2. Méthodologie

En vue d’évaluer l’impact du traitement thermique de la plume sur les antibiotiques, deux
animaux, âgés de cinq semaines, ont été traités, indépendamment à l’oxytétracycline (ACTI-
TETRA B™, Laboratoires Biove) et à la sulfadiazine associée au triméthoprime (ADJUSOL TMP
SULFA LOQUIDE™, Virbac). Le traitement a été administré par voie orale (gavage) selon la
posologie recommandée, c’est-à-dire 20 mg/kg de poids vif en oxytétracycline et 25/5 mg/kg
de poids vif en sulfadiazine/triméthoprime, administrés une fois par jour pendant 5 jours
consécutifs.
Dans le cas de notre étude, nous nous sommes placés dans un cas extrême, c’est-à-dire
que :
o Les plumes peuvent être contaminées par les fientes car les animaux étaient
hébergés sur le sol, sans litière ou terre qui permettrait d’absorber les fientes
o Le traitement a été administré à 5 semaines de vie de l’animal, alors que les
volailles sont généralement traitées dans les quinze jours après leur naissance
o Le traitement thérapeutique a été administré selon la posologie maximale
recommandée
o La voie d’administration du principe actif était contrôlée (gavage)

116
 Le temps d’attente règlementaire avant abattage a été respecté, soit de 12 jours après
la fin du traitement pour la sulfadiazine et le triméthoprime et de 7 jours après la fin du
traitement pour l’oxytétracycline.
Pour évaluer l’impact du processus industriel sur les antibiotiques, deux études ont été
réalisées sur les plumes contaminées :
➢ Etude du processus global de fabrication :
L’impact du processus global de fabrication de farine de plumes sur la stabilité de la
sulfadiazine, du triméthoprime et de l’oxytétracycline a été déterminé. Pour cela, 10 réplicas
de plumes issues des animaux traités ont été analysées par LC-MS-MS avant et après
fabrication en farine de plumes pour évaluer la perte globale d’antibiotiques. Le processus
industriel, comportant 4 étapes, a été adapté à l’échelle du laboratoire (Figure 32).

Figure 32 : Processus industriel adapté au laboratoire

➢ Etude de chaque étape du processus :

Les étapes de lavage, de traitement thermique et de séchage (i.e. étapes 1 à 3 illustrées
dans la Figure 32) ont été évaluées chacune indépendamment les unes des autres. L’objectif
était de déterminer l’influence de chaque étape sur la stabilité de la sulfadiazine, du
triméthoprime et de l’oxytétracycline. Pour cela, 8 réplicas de plumes ont été analysés par LC-
MS/MS avant et après chaque étape.
Un test de Student ou une analyse de la variance (ANOVA) suivi d’un test de comparaisons
multiples de moyennes (Tukey) ont été réalisés sur les deux études (globale et par étape) afin
de comparer les résultats (logiciel GraphPad, version 9.4). Un seuil significatif de 0,05 a été
retenu.

117
 1.3. Résultats et discussions

➢ Processus global :
Les résultats obtenus ont mis en évidence un impact significatif du processus de
fabrication de farine de plumes sur la stabilité de la sulfadiazine, du triméthoprime et de
l’oxytétracycline (Figure 33). Une perte de 57 % a été observée pour la sulfadiazine (Figure 33-
A) tandis qu’une perte de 22 % a été mesurée pour le triméthoprime (Figure 33-B). Le
triméthoprime semble plus stable que la sulfadiazine suite à l’application du processus.
Concernant l’oxytétracycline, une perte totale a été observée (<LOD : 5 µg/kg) (Figure 33-C).

Figure 33 : Boxplot de l’impact global du processus industriel de fabrication des plumes en farine de plumes adapté à l'échelle
du laboratoire (n=10) pour la sulfadiazine (A), le triméthoprime (B) et l’oxytétracycline (C). La médiane des données est
représentée par la ligne horizontale dans le box. Les lignes horizontales qui bordent le box représentent 25% (Q1) et 75%
(Q3) des valeurs. Les lignes verticales de part et d'autre du diagramme représentent 25 % des valeurs inférieures et
supérieures des données.

➢ Processus par étape :

Un impact significatif (p-value<0,05) de chaque étape du processus de la fabrication de
farine sur la stabilité de la sulfadiazine, du triméthoprime et de l’oxytétracycline a été constaté
(Figure 34). Suite à l’étape de lavage, une perte moyenne de 56 % est observée pour la
sulfadiazine (Figure 34-A). Cependant, aucune différence significative des concentrations en
sulfadiazine est observée entre les étapes de lavage, d’autoclave et de passage à

118
l’étuve (Figure 34-A). Concernant le triméthoprime, (Figure 34-B) une perte de 33 % a été
mesurée après l’étape de lavage. Contrairement à la sulfadiazine, la concentration en
triméthoprime est significativement différente entre les étapes de lavage et d’autoclave
(Figure 34-B). L’étape de l’autoclave a eu un impact significatif sur le triméthoprime avec une
perte en concentration de 78 % par rapport aux échantillons de plumes initiaux (Figure 34-B).
Une perte de 22 % en triméthoprime avait été constaté lors de l’étude du processus global
(Figure 33-B). La différence des résultats peut s’expliquer par l’échantillonnage réalisé ou un
manque d’homogénéité des échantillons analysés. Néanmoins, aucune différence significative
des concentrations est observée entre l’étape de l’autoclave et de l’étuve (Figure 34-B). Une
perte moyenne de 89 % a été observé pour l’oxytétracycline dès l’étape du lavage (Figure 34-

Figure 34 : Boxplot de l’impact par étape du processus industriel de fabrication des plumes en farine de plumes (n=8) pour la
sulfadiazine (A), le triméthoprime (B) et l’oxytétracycline (C). Le pourcentage (%) est l’expression de la perte en antibiotiques
par rapport à l’échantillon initial.

C).
Concernant l’impact du lavage sur la perte en sulfadiazine, triméthoprime et
oxytétracycline, les résultats observés pourraient s’expliquer par l’eau qui dissoudrait la fiente
en contact de la plume entraînant certainement les antibiotiques potentiellement présents.

119
 1.4. Conclusion

Le processus de fabrication a un impact sur la stabilité de la sulfadiazine, du triméthoprime

et de l’oxytétracycline. Après application du processus industriel à l’échelle du laboratoire,
l’oxytétracycline n’est plus détectée (<LOD : 5µg/kg) dans les échantillons. Une perte
moyenne de 57 % et de 22 % a été observée pour la sulfadiazine et le triméthoprime
respectivement. L’étape de lavage, correspondant à l’échaudage de l’animal, diminue de plus
de la moitié les concentrations en sulfadiazine et en oxytétracycline. Le processus de
fabrication de farine de plumes minimise ainsi les risques concernant la présence de résidus
d’antibiotiques dans les farines. Néanmoins, les résultats démontrent que les pertes
observées sont substances dépendantes. Tous les antibiotiques ne sont pas dégradés à l’issue
du processus de fabrication. Ils pourraient donc être transférés aux animaux via l’alimentation
animale.

2. Analyse de farines de plumes industrielles

2.1. Contexte

Une centaine d’échantillon (n=101) de farine de plumes provenant d’industries françaises

ont été analysées par LC-MS/MS avec la méthode multirésidus présentée dans l’article 1.
L’objectif était de déterminer la présence éventuelle de 30 substances antibiotiques ainsi que
leurs niveaux de concentration dans les farines utilisées dans l’alimentation animale.

2.2. Méthodologie

Les échantillons, collectés dans différentes régions françaises dans le cadre d’un
partenariat avec le Syndicat des Industries Françaises de COproduits animaux (SIFCO), ont été
analysés par LC-MS/MS.
Une synthèse de l’étude est présentée sur la Figure 35.

Figure 35 : Synthèse de la méthode d’analyse des échantillons de farines de plumes industrielles

120
 2.3. Résultats et discussions

Les résultats ont révélé 46 % des échantillons présentant des concentrations résiduelles (>
LOD) à au moins un antibiotique. Les familles d’antibiotiques principalement détectées sont
les quinolones, les pénicillines, les phénicolés, les sulfamides et les diaminopyrimidines (Figure
36). Parmi les antibiotiques principalement utilisés dans les élevages de poulets de chair, 70
% n’ont pas été détectés dans les échantillons de farine de plumes industrielles (Figure 36).
L’antibiotiques fréquemment détecté est le triméthoprime avec 33 %, soit un tiers, des
échantillons présentant des concentrations supérieures à la LOD (Figure 36). Dans les élevages
avicoles, le triméthoprime est administré en association avec un sulfamide. Or, les résultats
présentent moins d’échantillons positifs aux sulfamides qu’au triméthoprime (17 % contre 33
%) (Figure 36). L’étude de l’impact du processus de fabrication de farine de plumes sur la
stabilité des antimicrobiens a mis en évidence une stabilité plus élevée du triméthoprime par
rapport à la sulfadiazine, expliquant peut-être les résultats observés dans les échantillons de
farine de plumes industrielles.

Figure 36 : Fréquence de détection des résidus d'antibiotiques pour les analytes positifs
détectés (>LOD) dans les échantillons de farine de plumes industrielles (n=101). Le nombre
d'échantillon dans lequel l'antibiotique a été détecté est indiqué au-dessus de chaque barre.
Plusieurs antibiotiques peuvent être présents dans un même échantillon.

Du point de vue de la composition des échantillons en résidus d’antibiotiques, au

moins 10 % des échantillons ont présentés entre un et quatre antibiotiques détectés dans un
même échantillon (Figure 37).

121
 Figure 37 : Occurrence des résidus d’antibiotiques en fonction du nombre
d'analyte dans un même échantillon industriel de farine de plumes.

Sur les 46 % d’échantillons présentant des concentration résiduelles (>LOD), seuls 18

échantillons ont présenté au moins un analyte quantifiable (i.e. ayant une concentration
supérieure à la LOQ). Les concentrations quantifiées s’échelonnent entre 7,56 et 191,21 µg/kg,
toutes substances confondues. Le triméthoprime est présent dans 78 % des échantillons
quantifiables (Figure 38) avec des concentrations allant de 16,93 à 84,90 µg/kg (cf. Annexe 5
répertoriant les résultats de dépistage et de quantification des échantillons industriels de
farine de plumes).

Figure 38 : Distribution des analytes quantifiables (>LOQ) dans les échantillons industriels de farine de plumes

Dans la littérature scientifique, les résultats d’une étude concernant l’analyse de douze
échantillons de farine de plumes provenant des États-Unis et d’Asie rapporte la présence de
deux à dix antibiotiques par échantillon (sulfamides : 83 % ; macrolides : 75 % ;
fluoroquinolones : 67 % et tétracyclines : 58 %)[17]. Deux familles antibiotiques sont communes
à nos résultats : les fluoroquinolones et les sulfamides[17]. La différence entre les résultats
obtenus dans cette étude[17] et dans la présente étude peut s’expliquer (1) par le nombre
d’échantillons (n = 12 versus n =101), (2) par le processus de fabrication des farines de plumes
qui peut différer d’un pays à l’autre, (3) par les différents usages des traitements

122
thérapeutiques vétérinaires appliqués selon les pays et (4) par les pratiques d’élevage
recourant à l’usage d’additifs à base d’antibiotiques qui sont encore autorisés dans des pays
hors UE.

2.4. Conclusion

Les résidus de médicaments vétérinaires, en particulier les antibiotiques, sont en partie

réintroduits dans l’environnement et la chaîne alimentaire animale et humaine par le biais des
plumes et des farines de plumes. Les échantillons analysés ont mis en évidence neuf
antimicrobiens, de différentes familles, présents dans 46 % des farines de plumes industrielles,
avec des concentrations étendues entre 7 et 191 µg/kg, impliquant la contribution des farines
de plumes au transfert de résidus d’antibiotiques à l’animal et à l’homme, et indirectement à
l’émergence de l’antibiorésistance.

123
 PARTIE III :
DISCUSSIONS
GÉNÉRALES,
PERSPECTIVES ET
CONCLUSION

124
 I- DISCUSSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES

Les plumes sont valorisées et transformées en farine de plumes pour être ensuite
incorporées dans l’alimentation animale (aquacole, porcine et animaux domestiques). Dans le
cadre du plan Ecoantibio 2[96], notre intérêt s’est porté sur les substances antibiotiques
pouvant être présentes dans les plumes et dans la farine. La présence potentielle de résidus
antibiotiques dans les farines pourrait participer à l’émergence de bactéries résistantes.
Pour évaluer la présence de substances antibiotiques dans la farine de plumes, une
méthode d’analyse par LC-MS/MS pour 30 antibiotiques autorisés en élevage avicole français
a été développée et validée. La validation de la méthode repose sur une approche globale et
prend en compte la justesse et la fidélité c’est-à-dire l’exactitude de la méthode. Cette
méthode a été, par la suite, utilisée comme outil pour évaluer la présence et quantifier les
antibiotiques dans les plumes et dans la farine. Toutefois, il serait intéressant d’étendre la
méthode à d’autres substances, notamment les anticoccidiens couramment utilisés en
médecine vétérinaire chez la volaille[126], ainsi que les autres substances interdites en France
et en Europe, mais pouvant par ailleurs être utilisés dans les élevages avicoles dans des pays
tiers.
Ces travaux de thèse ont été focalisés sur le devenir de trois antibiotiques dans les plumes
et dans la farine. Différents critères ont été pris en compte dans la sélection de ces
antibiotiques tel que les ventes réalisées en milieu avicole français, les risques de résistance
bactérienne ou encore la criticité de certaines familles d’antibiotiques en santé humaine et
utilisées chez la volaille. Notre étude a portée sur le devenir de la sulfadiazine, du
triméthoprime et de l’oxytétracycline dans les plumes de poulet de chair. Le peu de données
plasmatiques et dans les plumes (sparse data) a conduit à réaliser une analyse de type non
compartimentale (NCA) qui a permis la description du devenir de ces trois antibiotiques dans
le plasma et dans la plume (à l’exception du triméthoprime dans le plasma par manque de
données). Le temps moyen de résidence (MRT) s’est révélé cinq à douze fois supérieur dans
les plumes que dans le plasma pour l’oxytétracycline et la sulfadiazine respectivement lorsque
les animaux étaient hébergés en cage. Les teneurs en sulfadiazine, triméthoprime et
oxytétracycline dans les plumes prélevées sur les ailes, poitrine, cuisses et dos ne montrent
pas de différence significative selon les zones de prélèvement. Concernant les fientes
collectées au sein d’un même lot et prélevées non individuellement, une NCA n’a pas pu être
réalisée. Les animaux auraient pu être isolés individuellement au cours des études (cage et
sol) mais dans ces conditions, le bien-être animal n’aurait pas été respecté pour des études
aussi longues (2 mois). De nouvelles études pourraient être réalisées pour apporter des
données complémentaires sur le devenir des antibiotiques dans les plumes et dans la farine.
D’autres techniques de modélisation comme la PBPK par exemple, pourraient être employées
pour s’approcher davantage de la réalité biologique.

125
 Perspective 1
Lors de l’analyse des échantillons de farine de plumes industrielles
françaises, 11 % des échantillons présentaient des concentrations supérieures à
la LOQ en enrofloxacine, antibiotique appartenant à la famille des
fluoroquinolones, et utilisé également en médecine humaine. Une nouvelle
étude pharmacocinétique pourrait donc être menée pour étudier le devenir de
fluoroquinolones dans les plumes et dans les farines. Les aminoglycosides et les
polypeptides, en particulier la colistine, sont couramment utilisés en élevage
avicole[80]. Concernant l’impact de l'utilisation de ces antibiotiques chez les
animaux sur la santé publique et la santé animale, ils sont positionnés, tout
comme les fluoroquinolones, à un rang de priorité élevé dans la classification de
l’OMS, ainsi que dans celle de l’EMA/AMEG (Antimicrobial Advice Ad Hoc Expert
Group)[127, 128]. Ces substances pourraient donc être également ciblées dans une
étude pharmacocinétique. Néanmoins, des optimisations spécifiques à l’analyse
de la colistine seraient à prévoir. L’analyse de la colistine représente un challenge
car cette molécule est connue pour sa capacité à se fixer sur les différents
matériaux (verrerie et instruments analytiques) lors de son analyse[129].
Des modèles pharmacocinétiques génériques et/ou spécifiques à ces
antibiotiques et basés sur la physiologie (PBPK) pourraient également être
développés en tant qu’outils de prédiction des niveaux d’antibiotiques dans les
plumes et farine de plumes. La modélisation PBPK permettrait également
d’optimiser et de maîtriser les doses d’antibiotiques utilisées.
Il pourrait être également envisagé d’utiliser des « antibiotiques verts »,
antibiotiques avec un impact écologique minimal sur le microbiome animal, afin
de rompre le lien entre les résistances humaines et animales[130].

Parallèlement, des bactéries Escherichia coli totales et résistantes ont été dénombrées
dans les fientes et les plumes pour des poulets de chair hébergés en cage et sur sol. L’absence
de bactéries Escherichia coli prouve l’absence de contamination des plumes via les fientes
lorsque les animaux sont hébergés en cage (cas des poules pondeuses en élevage). Toutefois,
la présence de sulfadiazine, de triméthoprime et d’oxytétracycline à des concentrations
élevées dans les plumes, provenant d’animaux hébergés en cage et sur sol, signifie que les
plumes ont probablement été contaminées via le sang (contamination interne), peut-être par
le calamus qui est la seule partie de la plume vascularisée. Les quelques études réalisées sur
la présence d’antibiotiques sur les plumes émettaient l’hypothèse de contamination externe
potentielle par les fientes. Effectivement, une contamination externe des plumes par les
fientes est envisageable car les bactéries Escherichia coli dénombrées dans les plumes dans
notre étude sur sol l’ont prouvé. Les bactéries Escherichia coli, potentiellement résistantes

126
suite au traitement thérapeutique, peuvent donc être transmises des fientes aux plumes
lorsque les animaux sont hébergés sur sol (cas des poulets de chair en élevage).
Cependant, les analyses microbiologiques des fientes étaient hétérogènes et n’ont pas mis
en évidence un réel impact des traitements à la sulfadiazine, au triméthoprime et à
l’oxytétracycline sur la résistance des bactéries Escherichia coli. L’hétérogénéité des
échantillons pourrait être dû à la manière dont les fientes ont été collectées. En effet, les
fientes, composées de fèces et d’urine, étaient sélectionnées selon leur aspect visuel (celles
qui semblaient les plus fraîches étaient prélevées) et étaient collectées, soit dans des
collecteurs situés en dessous des cages, soit sur le sol directement. Dans les collecteurs, il y
avait un mélange de fèces et d’urine, l’urine pouvant difficilement s’évaporée. A l’inverse, sur
le sol, l’urine pouvait probablement s’évaporée plus facilement, ne permettant pas de
comparer les résultats obtenus dans les deux modes d’hébergement.
Dans le cas des études en cage et sur sol, les animaux ont été traités vers la 4 e ou 5e
semaine après leur naissance une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Dans les élevages
avicoles, les animaux sont généralement traités dès leurs premiers jours. Nous avons fait le
choix de nous situer dans le cas le plus extrême en terme de risque d’exposition aux
antibiotiques.

Perspective 2
Une étude pourrait être réalisée sur des poussins traités dont on analyserait les
plumes environ 40 jours après le début du traitement. Cette étude permettrait
d’apporter de nouvelles données pour évaluer le risque de présence d’antibiotiques
dans les plumes et dans les farines, dans un contexte d’élevage où les conditions
correspondraient cette fois aux pratiques courantes. Les fientes pourraient être
également collectées pour mesurer l’impact du traitement antibiotique sur la flore
intestinale de l’animal. Pour ce faire, les animaux pourraient être isolés dans des cages
à métabolisme entre 24h et 48h maximum.

Une étude parallèle et exploratoire a été réalisée sur des plumes provenant des ailes de
poulets de chair lorsque ceux-ci étaient en cage. L’objectif de cette étude était d’observer la
distribution de la sulfadiazine, du triméthoprime et de l’oxytétracycline le long de la plume au
cours du temps. Les antibiotiques étaient principalement concentrés dans les barbes. Une
migration de la sulfadiazine et du triméthoprime a été observée le long de la plume avec la
croissance de celle-ci. Néanmoins, pour l’oxytétracycline, aucune migration n’a été constatée.
La plume, contrairement aux cheveux, n’a pas une croissance linéaire et n’a pas la même
croissance selon les zones[25], rendant difficile la datation de prise d’un traitement
thérapeutique.

127
 Ces travaux de recherches ont révélé la présence de la sulfadiazine, du triméthoprime et
de l’oxytétracycline dans les plumes pendant au moins 2 mois chez des poulets de chair âgés
de 4 à 5 semaines au début de l’étude. Les plumes étant valorisées en farine de plumes avant
d’être utilisées dans la fabrication d’aliment pour animaux, le devenir des antibiotiques au
cours des procédés de fabrication de la farine a été étudié. La fabrication des farines en
conditions de laboratoire maîtrisées pour certains paramètres (lavage, traitement thermique
et séchage), a conduit à une dégradation totale de l’oxytétracycline et une dégradation
partielle de la sulfadiazine et du triméthoprime. Il serait intéressant de réaliser des études
complémentaires en spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) afin d’identifier les
produits de dégradations éventuellement formés sous l’effet de la chaleur [131]. Le principe
serait de comparer les empreintes spectrales MS des extraits avant et après application du
processus de fabrication afin de discriminer d’éventuels produits néoformés issus des
substances antibiotiques parentes.
Le protocole d’origine de fabrication des plumes en farine qui a été adapté pour les besoins
de cette étude correspond au protocole utilisé en France et probablement en Europe.
Néanmoins, les farines de plumes incorporées dans l’alimentation animale française peuvent
provenir de différents pays. Il est donc possible que différents protocoles de fabrication de
farine de plumes existent et il serait alors intéressant de les recenser puis de comparer leur
impact sur le devenir des antibiotiques dans les farines.
L’analyse de farine de plumes industrielles françaises a révélé 46 % des échantillons
présentant des concentrations résiduelles en antibiotiques autorisés en France et en Europe
chez la volaille.

Perspective 3
Une étude pourrait porter sur l’analyse de farine de plumes provenant de différents
pays. Des règlementations existent en France et en Europe, cependant certains pays
n’appliquent pas les mêmes règlementations. L’analyse des farines industrielles
pourraient révéler la présence de molécules interdites dans les élevages avicoles
pouvant être utilisées en médecine humaine. L’importation éventuelle de ces farines
en Europe impliquerait, à terme, la mise en place de plans de surveillance et de
contrôle afin d’évaluer l’exposition des animaux aux antibiotiques via l’alimentation
animale.

128
 II- CONCLUSION

Suivant une approche originale et complémentaire, le travail réalisé a porté à la fois sur la
plume et la farine de plumes.
Les travaux de cette thèse ont permis de valider un outil analytique performant et adapté,
pour l’analyse dans les plumes et dans la farine de 30 antibiotiques autorisés chez la volaille
en Europe. La validation de la méthode d’analyse a reposé sur une approche globale via
l’utilisation du profil d’exactitude. Cet outil a pu être, par la suite, appliqué sur des échantillons
de farines de plumes. La méthode d’analyse a été par la suite validée dans les matrices plasma
et fientes et la gamme de dosage a été étendue dans la matrice plume afin d’être appliquée
lors d’une étude in vivo réalisée sur des poulets de chair.
Le devenir de la sulfadiazine, du triméthoprime et de l’oxytétracycline a été observé dans
le plasma, les fientes et les plumes des poulets de chair hébergés en cage et sur sol. Le temps
moyen de résidence dans les plumes provenant d’animaux hébergés en cage était en
moyenne de 197h (i.e. 8 jours), 259h (i.e. 11 jours) et 215h (i.e. 9 jours) pour la sulfadiazine,
le triméthoprime et l’oxytétracycline respectivement. Les concentrations mesurées ont révélé
des teneurs plus élevées dans les plumes provenant de poulets hébergés sur sol qu’en cage.
Des résidus antibiotiques ont été quantifiés dans des plumes prélevées sur des animaux ayant
été traités 2 mois auparavant. Les résultats du dénombrement des bactéries Escherichia coli
ont mis en évidence à la fois une voie de contamination interne des plumes via le sang pour
les animaux hébergés en cage et sur sol, et une voie de contamination externe des plumes via
les fientes pour les animaux hébergés sur sol.
L’impact du processus de fabrication de farine adapté à l’échelle du laboratoire a été
évalué sur le devenir de la sulfadiazine, du triméthoprime et de l’oxytétracycline. Une
dégradation partielle a été constatée pour la sulfadiazine et le triméthoprime et une
dégradation totale pour l’oxytétracycline. L’analyse de farines de plumes industrielles a révélé
la présence d’antibiotiques dans 46 % des échantillons analysés.
L’incorporation de farines de plumes dans la fabrication des aliments pour animaux
pourraient contribuer à la transmission potentielle d’antibiotiques à l’animal et à l’homme,
participant indirectement à l’émergence et à la sélection de bactéries résistantes. Les travaux
de recherche de cette thèse montrent la nécessité de réviser les règlementations des
coproduits animaux et des PAT concernant la présence des antibiotiques en Europe. Un suivi
régulier de cette présence pourrait être réalisé aux moyens de plans de surveillance et de
contrôle.

129
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137
 ANNEXES
Annexe 1 : Liste des 30 antimicrobiens d'intérêts - formules et structures chimiques développées

138
Annexe 2 : Définitions et équations permettant la construction d’un profil d’exactitude

Les critères de validation d’une méthode analytique et nécessaires dans la construction d’un
profil d’exactitude sont :
Termes anglais Termes français Définitions
La justesse exprime l’étroitesse de l’accord entre la
valeur moyenne obtenue à partir d’une large série
Trueness Justesse de résultats d’essais et une valeur de référence
acceptée comme telle. La justesse donne une
indication sur les erreurs systématiques.
La fidélité exprime l’étroitesse de l’accord entre
une série de mesures provenant de multiples prises
Precision (repeatability d’un même échantillon homogène dans des
Fidélité (répétabilité et
and intermediate conditions prescrites. Elle donne des informations
fidélité intermédiaire)
precision) sur l’erreur aléatoire et est évaluée à deux niveaux :
la répétabilité et la fidélité intermédiaire.

L’exactitude exprime l’étroitesse de l’accord entre

le résultat d’essai et la valeur de référence
acceptée comme telle, appelée également “valeur
conventionnellement vraie”. L’exactitude prend en
Accuracy Exactitude compte l’erreur totale, c’est à dire l’erreur
systématique et l’erreur aléatoire liées au résultat.
Par conséquent, l’exactitude est l’expression de la
somme de la justesse et de la fidélité. Elle est
estimée à partir du profil d’exactitude.

La justesse est exprimée en terme de biais absolu (ug/kg), de biais relatif (%) ou de taux de
recouvrement (%) pour chaque niveau de concentration des standards de validation. Si pour un
niveau de concentration, est la moyenne des concentrations introduites et que est
l’estimation de la concentration moyenne obtenue à partir des concentrations calculées alors
nous avon
(1)

(2)

(3)
L'intervalle de confiance à 95% des recouvrements est calculé de la façon suivante :

(4)

Avec inférieure et supérieure sont les limites normales inférieures et supérieures de confiance
pour la moyenne des concentrations calculées de la façon suivante:

(5)

139
Avec :

t est le quantile de la distribution de Student t à np-1 degrés de liberté

α = 0.05

est la déviation standard empirique des concentrations

n est le nombre de répétitions par série

p est le nombre de séries

La fidélité (répétabilité et fidélité intermédiaire) peut être exprimée en écart type (SD) et en
terme de coefficient de variation (CV). Les estimations des composantes de la variance sont
obtenues par l’approche itérative du maximum de vraisemblance restreint (REML).

(6)
L'écart type (SD) de la fidélité intermédiaire est égal à =

L'équation permettant de calculer la limite supérieure de confiance à 95% de la fidélité

intermédiaire est définie par l'équation suivante:

(7)

L'équation permettant de calculer la limite supérieure de confiance à 95% de la répétabilité est

définie par l'équation suivante:

(8)
=

Avec :

MSE est l'erreur quadratique moyenne pour estimer la variance de répétabilité

MSM est le carré moyen du modèle utilisé pour estimer la variance entre les séries

n est le nombre de répétitions par série

p est le nombre de séries

est le quantile de distribution du Chi-carré à 1-α = 0.95 avec ν degrés de liberté

140
 est l'estimation de la variance inter - série

est l'estimation de la variance intra - série

ν est le nombre de degrés de liberté calculés à l'aide de la méthode Satterthwaite

Le profil d’exactitude est obtenu en reliant entre elles d’une part les bornes inférieures et d’autre
part les bornes supérieures de l’intervalle de tolérance, bornes calculées pour chaque niveau de
concentration. La formule utilisée pour le calcul de cet intervalle de tolérance est :
(9)

La méthode est considérée comme valide pour l’intervalle de dosage où le profil d’exactitude
est compris dans les limites d’acceptation fixées a priori. Cette approche garantit que seul un
pourcentage, préalablement fixé, des futures mesures d’échantillons inconnus seront en dehors
de ces limites.

141
Annexe 3 : Supplementary data de l'article 1
Supplementary data 1: MS/MS parameters for the multiresidue method in feathers and
retention time
Precursor ion Product ion DP* CE** Retention
Analytes CXP*** (V)
m/z m/z (V) (V) time (min)
Florfenicol amine 248.2 230.0 51 17 14 1.40
130.1 51 33 10 1.40
Amoxicillin 366.1 349.0 50 13 12 3.00
114.0 50 33 12 3.00
208.0 50 20 12 3.00
Sulfadiazine 251.0 156.0 53 22 12 3.90
108.0 53 30 12 3.90
Lincomycin 407.5 126.0 60 40 15 4.50
359.0 60 26 15 4.50
Trimethoprim 291.2 230.2 36 31 14 5.30
123.1 36 33 6 5.30
Ampicillin 350.3 106.0 50 20 12 5.30
160.0 50 20 12 5.30
Oxytetracycline 461.0 426.0 65 30 15 5.50
443.0 65 17 15 5.50
Epi-oxytetracycline 461.0 426.0 65 30 15 5.50
443.0 65 17 15 5.50
Sulfamethazine 279.1 156.0 50 25 12 5.60
108.0 50 36 12 5.60
Thiamphenicol 356.1 337.9 51 13 20 5.70
307.9 51 21 18 5.70
Ciprofloxacin 332.2 314.0 61 30 15 5.90
231.0 61 47 15 5.90
Epi-tetracycline 445.0 410.0 55 27 15 5.90
427.0 55 25 15 5.90
Tetracycline 445.0 410.0 55 27 15 5.90
427.0 55 25 15 5.90
Sulfamethoxypyridazine 281.0 156.0 60 25 12 6.00
108.0 60 35 12 6.00
Danofloxacin 358.3 340.0 60 33 15 6.10
355.0 60 50 15 6.10
Enrofloxacin 360.1 342.0 72 30 15 6.20
286.0 72 50 15 6.20
Epi-chlortetracycline 479.2 444.0 60 29 15 6.60
461.8 60 23 15 6.60
Sarafloxacin 386.3 368.0 50 30 15 6.70
348.0 50 50 15 6.70
Chlortetracycline 479.2 444.0 60 29 15 7.00
461.8 60 23 15 7.00
Sulfamethoxazole 254.0 156.1 66 23 14 7.20
108.2 66 33 8 7.20
Erythromycin 734.4 158.0 90 50 12 7.40
576.5 90 25 12 7.40
Oxolinic acid 262.2 244.0 53 25 15 7.40
216.0 53 10 15 7.40
Sulfadimethoxine 311.1 156.0 60 25 12 7.60
108.0 60 40 12 7.60
Sulfaquinoxaline 301.0 156.0 50 23 12 7.60
108.0 50 40 12 7.60
Penicillin G 335.1 160.0 50 15 12 7.80
176.0 50 15 12 7.80
Penicillin V 351.2 160.0 50 15 12 8.15
114.0 50 45 12 8.15
Oxacillin 402.1 160.0 50 18 12 8.40
243.0 50 18 12 8.40

142
 Precursor ion Product ion DP* CE** Retention
Analytes CXP*** (V)
m/z m/z (V) (V) time (min)
Cloxacillin 436.1 277.0 50 20 12 8.80
160.0 50 20 12 8.80
Tylvalosin 1042.6 109.3 121 95 12 8.90
174.1 121 57 12 8.90
Dicloxacillin 470.0 160.0 50 20 12 9.25
310.8 50 20 12 9.25
Internal standards
Amoxicllin-D4 370.1 353.1 50 13 12 3.00
Sulfadiazine-13C6 257.0 162.0 53 22 12 3.90
Lincomycin-D3 410.2 129.1 60 40 15 4.50
Trimethoprim-D9 300.5 234.0 36 31 14 5.30
Sulfamethazine-13C6 285.1 162.0 50 25 12 5.60
Tetracycline-D6 451.0 416.0 72 30 15 5.90
Enrofloxacin-D5 365.0 321.0 55 27 15 6.20
Sulfadoxine-D3 314.0 156.0 60 25 12 7.05
Erythromycin-D6 740.4 164.1 90 50 12 7.40
Sulfadimethoxine-D6 317.0 156.0 60 25 12 7.60
Penicillin G-D7 342.1 160.0 50 15 12 7.80
Cloxacillin-13C4 440.1 281.0 50 20 12 8.80

143
Supplementary data 2: Concentration levels (µg.kg-1) of validation standards
Concentration level expressed in relation to target level 1.0
Analytes
0.5 1.0 2.0
Amoxicillin 25 50 100
Ampicillin 25 50 100
Chlortetracycline 50 100 200
Ciprofloxacin 50 100 200
Cloxacillin 150 300 600
Danofloxacin 50 100 200
Dicloxacillin 150 300 600
Enrofloxacin 50 100 200
Epi-chlortetracycline 50 100 200
Epi-oxytetracycline 50 100 200
Epi-tetracycline 50 100 200
Erythromycin 100 200 400
Florfenicol amine 50 100 200
Lincomycin 25 50 100
Oxacillin 150 300 600
Oxolinic acid 25 50 100
Oxytetracycline 50 100 200
Penicillin G 25 50 100
Penicillin V 13 25 50
Sarafloxacin 50 100 200
Sulfadiazine 50 100 200
Sulfadimethoxine 50 100 200
Sulfamethazine 50 100 200
Sulfamethoxazole 50 100 200
Sulfamethoxypyridazine 50 100 200
Sulfaquinoxaline 50 100 200
Tetracycline 50 100 200
Thiamphenicol 25 50 100
Trimethoprim 25 50 100
Tylvalosin 25 50 100

144
Supplementary data 3: Concentration levels (µg.kg-1) of calibration standards
Concentration level expressed in relation to target level 1.0
Analytes
0.25 0.5 1.0 1.5 2.0
Amoxicillin 13 25 50 75 100
Ampicillin 13 25 50 75 100
Chlortetracycline 25 50 100 150 200
Ciprofloxacin 25 50 100 150 200
Cloxacillin 75 150 300 450 600
Danofloxacin 25 50 100 150 200
Dicloxacillin 75 150 300 450 600
Enrofloxacin 25 50 100 150 200
Epi-chlortetracycline 25 50 100 150 200
Epi-oxytetracycline 25 50 100 150 200
Epi-tetracycline 25 50 100 150 200
Erythromycin 50 100 200 300 400
Florfenicol amine 25 50 100 150 200
Lincomycin 13 25 50 75 100
Oxacillin 75 150 300 450 600
Oxolinic acid 13 25 50 75 100
Oxytetracycline 25 50 100 150 200
Penicillin G 13 25 50 75 100
Penicillin V 6 13 25 38 50
Sarafloxacin 25 50 100 150 200
Sulfadiazine 25 50 100 150 200
Sulfadimethoxine 25 50 100 150 200
Sulfamethazine 25 50 100 150 200
Sulfamethoxazole 25 50 100 150 200
Sulfamethoxypyridazine 25 50 100 150 200
Sulfaquinoxaline 25 50 100 150 200
Tetracycline 25 50 100 150 200
Thiamphenicol 13 25 50 75 100
Trimethoprim 13 25 50 75 100
Tylvalosin 13 25 50 75 100

145
Supplementary data 4: Accuracy indexes according to mathematical models
Weighted 1/X Weighted 1/X2 Weighted 1/X Weighted 1/X2 Linear regression Linear regression
Linear Quadratic
Analytes linear linear quadratic quadratic after logarithm after square root
regression regression
regression regression regression regression transformation transformation
Amoxicillin 0,7988 0,7184 0,7074 0,7063 0,7045 0,6934 0,5917 0,6577
Ampicillin 0,7702 0,7710 0,7677 0,7653 0,7703 0,7691 0,7629 0,7672
Chlortetracycline 0,7469 0,7678 0,7464 0,7542 0,7646 0,7607 0,7536 0,7490
Ciprofloxacin 0,5988 0,6375 0,5507 0,5522 0,6401 0,6399 0,5635 0,5809
Cloxacillin 0,7675 0,6740 0,6352 0,6526 0,6288 0,5143 0,62,82 0,6667
Danofloxacin 0,7071 0,7141 0,6999 0,7032 0,7221 0,7273 0,7040 0,7032
Dicloxacillin 0,8731 0,8794 0,8442 0,8444 0,8754 0,8588 0,7922 0,8366
Enrofloxacin 0,7317 0,7309 0,7297 0,7279 0,7338 0,7343 0,7303 0,7301
Epi-chlortetracycline 0,5512 0,8223 0,6296 0,7069 0,8281 0,4598 0,7146 0,6095
Epi-oxytetracycline 0,7866 0,3890 0,8032 0,8075 0,3830 0,4793 0,8131 0,7983
Epi-tetracycline 0,5840 0,8354 0,6912 0,7887 0,8446 0,8506 0,7788 0,6595
Erythromycin 0,6387 0,2381 0,5637 0,5319 0,3477 0,4501 0,4348 0,5712
Florfenicol amine 0,6110 0,6036 0,6228 0,7083 0,4987 0 0,6156 0,5983
Lincomycin 0,8280 0,8152 0,8214 0,8220 0,8321 0,8240 0,7004 0,7885
Oxacillin 0,7848 0,7829 0,7838 0,8104 0,7759 0,7300 0,7899 0,7856
Oxolinic acid 0,7708 0,7298 0,7803 0,7913 0,7526 0,7404 0,7741 0,7732
Oxytetracycline 0,7640 0,7355 0,8217 0,8456 0,7700 0,5596 0,8445 0,8169
Penicillin G 0,9114 0,9056 0,9122 0,9152 0,9114 0,9165 0,8931 0,9054
Penicillin V 0,8314 0,7662 0,8479 0,8534 0,7738 0,7924 0,8394 0,8392
Sarafloxacin 0,7733 0,7452 0,7761 0,7765 0,6824 0,7424 0,7689 0,7750
Sulfadiazine 0,8288 0,8375 0,8016 0,7897 0,8256 0,7883 0,6408 0,7709
Sulfadimethoxine 0,8455 0,8388 0,8459 0,8458 0,8409 0,8438 0,8322 0,8421
Sulfamethazine 0,7919 0,7414 0,7958 0,7950 0,7793 0,8052 0,7351 0,7828
Sulfamethoxazole 0,6765 0,6872 0,6727 0,6670 0,6775 0,6604 0,6641 0,6724
Sulfamethoxypyridazine 0,8075 0,7998 0,8108 0,8173 0,8008 0,8020 0,8101 0,8090
Sulfaquinoxaline 0,7026 0,6170 0,7407 0,7570 0,6588 0,6935 0,7459 0,7354
Tetracycline 0,6592 0,4429 0,6530 0,6186 0,4923 0,5178 0,6174 0,6415
Thiamphenicol 0,7198 0,5163 0,7305 0,7179 0,5550 0,5862 0,7000 0,7180
Trimethoprim 0,8965 0,8778 0,8926 0,8931 0,8968 0,9125 0,8591 0,8833
Tylvalosin 0,7434 0,5362 0,7601 0,7580 0,6367 0,7449 0,7457 0,7554
For the majority of analytes the mathematical model that has been chosen is linear regression except for ciprofloxacin, epi-chlortetracycline and epi-tetracycline where the
quadratic regression model is the most appropriate.

146
Supplementary data 5: Zoom of chromatograms (LC-MS/MS) of spiked feather extract for the
highest point in range. (a) LC-MS/MS chromatogram of all antimicrobial residues in feather.
(b) Zoom of a) corresponds to the chromatogram of the analytes trimethoprim,
oxytetracycline, epi-oxytetracycline, thiamphenicol, sulfamethoxypyridazine, enrofloxacin,
sarafloxacin, sulfamethoxazole, erythromycin, sulfadimethoxine, penicillin V, tylvalosin,
cloxacillin and dicloxacillin. (c) Zoom of a) corresponds to the chromatogram of the analytes
florfenicol amine, amoxicillin, sulfadiazine, lincomycin, ampicillin, sulfamethazine,
ciprofloxacin, tetracycline, epi-tetracycline, danofloxacin, chlortetracycline, epi-
chlortetracycline, oxolinic acid, sulfaquinoxaline, penicillin G, and oxacillin.

147
Supplementary data 6: Accuracy profile parameters

Parameters
Analytes Acceptance limits (%) Tolerances limits (%)
Amoxicillin 40 30
Ampicillin 40 20
Chlortetracycline 40 20
Ciprofloxacin 30 10
Cloxacillin 10 10
Danofloxacin 30 10
Dicloxacillin 20 10
Enrofloxacin 30 10
Epi-chlortetracycline 40 20
Epi-oxytetracycline 40 20
Epi-tetracycline 40 20
Erythromycin 10 10
Florfenicol amine 20 10
Lincomycin 10 10
Oxacillin 20 10
Oxolinic acid 30 10
Oxytetracycline 40 20
Penicillin G 20 10
Penicillin V 20 10
Sarafloxacin 30 10
Sulfadiazine 10 5
Sulfadimethoxine 20 10
Sulfamethazine 10 5
Sulfamethoxazole 30 20
Sulfamethoxypyridazine 30 20
Sulfaquinoxaline 20 10
Tetracycline 20 10
Thiamphenicol 20 10
Trimethoprim 20 10
Tylvalosin 30 20

148
Annexe 4 : Supplementary data de l'article 2
Supplementary data 1: Plasma concentration of Sulfadiazine (SDZ), Trimethoprim (TMP) and
Oxytetracycline (OTC) after oral gavage of broilers after 5 days of treatment (n=2-3)
Drugs Time points after start treatment Average concentration
(h) (mg.L-1)
SDZ 0.5 43.98 ± 29.94
1 174.22 ± 94.94
2 35.01 ± 0.61
3 574.09 ± 86.61
5 366.60 ± 79.50
7 451.71 ± 119.59
24 2.99 ± 6.30
28 79.74 ± 3.08
30 37.16 ± 17.53
48 3.15 ± 1.92
96 2.72 ± 2.61
104 29.95 ± 1.56
106 26.28 ± 5.77
108 22.66 ± 8.43
120 5.30 ± 1.19
144 0.02 ± 0.01
TMP 0.5 1.86 ± 1.91
1 0.58 ± 0.19
2 0.72 ± 0.08
3 1.29 ± 0.04
5 0.71 ± 0.04
7 0.51 ± 0.07
24 <LOQ
28 1.30 ± 0.03
30 0.46 ± 0.19
48 <LOQ
96 <LOQ
104 0.20 ± 0.01
106 0.21 ± 0.01
108 0.28 ± 0.05
120 <LOQ
144 <LOQ
OTC 0.5 0.67 ± 0.45
1 0.57 ± 0.51
2 1.13 ± 0.29
3 0.50 ± 0.28
5 0.43 ± 0.10
7 0.19 ± 0.10
24 0.04 ± 0.02
28 0.13 ± 0.05
30 0.09 ± 0.03
48 <LOQ
96 <LOQ
104 0.08 ± 0.03
106 0.10 ± 0.07
108 0.04 ± 0.02
120 0.03 ± 0.01
144 <LOQ

149
Supplementary data 2: Feathers concentration (wings, breast, legs and back) of Sulfadiazine
(SDZ), Trimethoprim (TMP) and Oxytetracycline (OTC) after oral gavage in caged broilers after
5 days of treatment (n=6)
Drugs Time points after Average concentration in feathers (mg.kg-1)
start treatment (h) Wings Breast Legs Back
SDZ 24 29.18 ± 28.58 17.08 ± 13.10 20.33 ± 18.41 10.62 ± 11.18
96 34.51 ± 5.98 25.13 ± 7.27 37.70 ± 52.60 25.04 ± 14.16
120 64.69 ± 22.02 49.77 ± 18.32 53.26 ± 56.13 35.59 ± 18.11
144 40.97 ± 7.66 38.86 ± 11.35 24.68 ± 2.80 29.26 ± 15.98
168 35.25 ± 9.92 21.15 ± 7.62 23.04 ± 6.10 20.40 ± 8.22
264 23.54 ± 8.07 16.46 ± 5.00 9.63 ± 2.17 9.67 ± 2.70
336 8.73 ± 1.57 6.62 ± 2.66 3.93 ± 0.57 5.23 ± 2.95
504 3.89 ± 1.37 3.89 ± 1.17 1.60 ± 0.79 1.68 ± 0.48
696 2.01 ± 1.44 0.68 ± 0.44 0.49 ± 0.11 0.83 ± 0.16
1104 0.16 ± 0.06 0.12 ± 0.05 0.08 ± 0.01 0.17 ± 0.18
TMP 24 2.61 ± 0.68 2.23 ± 0.89 2.34 ± 0.92 1.43 ± 0.58
96 9.68 ± 1.99 7.95 ± 2.37 9.67 ± 10.56 8.61 ± 3.91
120 9.05 ± 2.48 8.62 ± 2.25 8.41 ± 5.60 6.32 ± 1.78
144 7.46 ± 0.62 6.73 ± 1.41 6.08 ± 0.28 6.22 ± 1.26
168 6.58 ± 1.35 5.65 ± 0.38 6.11 ± 1.30 5.84 ± 0.40
264 4.91 ± 1.01 3.43 ± 0.46 2.64 ± 0.44 2.89 ± 0.22
336 4.09 ± 0.69 3.24 ± 0.93 1.80 ± 0.40 3.22 ± 0.96
504 1.98 ± 1.10 2.09 ± 0.68 0.81 ± 0.44 1.32 ± 0.61
696 1.06 ± 0.88 0.35 ± 0.35 0.15 ± 0.16 0.69 ± 0.29
1104 0.09 ± 0.09 0.05 ± 0.05 0.02 ± 0.01 0.13 ± 0.21
OTC 24 0.48 ± 0.17 0.83 ± 1.21 0.64 ± 0.76 0.25 ± 0.19
96 1.11 ± 0.36 1.30 ± 0.83 0.54 ± 0.15 0.83 ± 0.38
120 1.47 ± 0.54 1.13 ± 0.20 1.22 ± 1.12 0.82 ± 0.42
144 0.96 ± 0.36 0.77 ± 0.17 0.87 ± 0.72 0.54 ± 0.33
168 1.17 ± 0.38 1.09 ± 0.43 0.57 ± 0.26 0.80 ± 0.53
264 0.58 ± 0.20 0.61 ± 0.20 0.32 ± 0.09 0.29 ± 0.11
336 0.45 ± 0.15 0.40 ± 0.10 0.18 ± 0.08 0.17 ± 0.71
504 0.15 ± 0.04 0.12 ± 0.05 0.12 ± 0.34 0.08 ± 0.04
696 0.05 ± 0.04 0.03 ± 0.01 0.01 ± 0.009 0.02 ± 0.01
1104 0.006 ± 0.005 0.002 ± 0.003 <LOQ 0.002 ± 0.005

150
Supplementary data 3: Feathers concentration (wings, breast, legs and back) of Sulfadiazine
(SDZ), Trimethoprim (TMP) and Oxytetracycline (OTC) after oral gavage in floor broilers after
5 days of treatment (n=6)
Drugs Time points after Average concentration in feathers (mg.kg-1)
start treatment (h) Wings Breast Legs Back
SDZ 24 128.45 ± 67.51 120.24 ± 64.01 21.31 ± 7.27 16.14 ± 9.06
96 157.69 ± 42.16 249.60 ± 52.70 119 .10 ± 58.08 37.99 ± 24.92
120 89.73 ± 39.53 184.07 ± 91.90 90.07 ± 31.42 45.20 ± 23.74
144 112.35 ± 47.32 209.37 ± 80.10 65.71 ± 31.12 29.68 ± 21.70
168 72.60 ± 23.70 132.30 ± 33.56 66.90 ± 29.96 28.20 ± 17.97
264 47.30 ± 17.36 60.15 ± 32.91 24.05 ± 9.37 20.66 ± 7.54
336 33.29 ± 25.06 28.66 ± 17.19 17.76 ± 14.88 36.99 ± 40.20
504 23.52 ± 9.81 32.26 ± 30.63 5.42 ± 5.17 9.57 ± 5.96
696 11.06 ± 12.07 1.52 ± 0.74 0.33 ± 0.14 1.54 ± 0.87
1104 0.34 ± 0.08 0.11 ± 0.03 0.06 ± 0.04 0.09 ± 0.02
TMP 24 24.58 ± 14.17 18.62 ± 6.85 5.06 ± 1.40 3.70 ± 1.53
96 30.55 ± 6.49 37.64 ± 5.60 21.21 ± 7.66 10.13 ± 4.33
120 18.92 ± 8.03 33.93 ± 20.72 19.17 ± 5.25 12.03 ± 3.39
144 26.00 ± 7.18 37.18 ± 8.01 14.26 ± 3.91 9.70 ± 4.40
168 14.27 ± 3.88 18.83 ± 3.75 10.07 ± 5.75 7.79 ± 2.70
264 10.64 ± 1.09 10.53 ± 3.44 6.80 ± 1.38 6.32 ± 0.93
336 7.60 ± 3.39 6.98 ± 3.31 4.43 ± 2.08 5.97 ± 1.35
504 6.06 ± 1.69 7.21 ± 4.98 1.92 ± 0.68 4.24 ± 1.19
696 3.59 ± 3.05 0.87 ± 0.67 0.25 ± 0.11 1.50 ± 0.85
1104 0.08 ± 0.02 0.03 ± 0.01 0.04 ± 0.03 0.05 ± 0.04
OTC 24 2.38 ± 1.02 3.00 ± 2.65 1.03 ± 0.78 0.59 ± 0.36
96 4.59 ± 0.93 9.31 ± 6.49 3.77 ± 1.20 1.55 ± 0.48
120 6.70 ± 4.46 6.94 ± 2.57 2.36 ± 1.25 1.42 ± 0.39
144 9.38 ± 7.27 9.86 ± 6.62 2.79 ± 1.34 1.67 ± 0.59
168 8.97 ± 5.31 8.00 ± 4.74 5.14 ± 1.65 1.64 ± 0.45
264 2.57 ± 1.12 1.98 ± 0.96 1.80 ± 1.25 1.00 ± 0.46
336 1.44 ± 0.58 1.44 ± 0.67 0.68 ± 0.34 0.67 ± 0.26
504 0.48 ± 0.37 0.71 ± 0.31 0.17 ± 0.15 0.36 ± 0.21
696 0.24 ± 0.16 0.08 ± 0.05 0.02 ± 0.01 0.10 ± 0.06
1104 0.03 ± 0.01 0.01 ± 0.005 0.009 0.01 ± 0.004

151
Supplementary data 4: Droppings concentration of Sulfadiazine (SDZ), Trimethoprim (TMP)
and Oxytetracycline (OTC) after oral gavage in caged and floor broilers after 5 days of
treatment (n=1)
Housing Time points after start Concentration in droppings (mg.kg-1)
treatment (h) SDZ TMP OTC Epi-OTC
Cage 24 32.32 7.12 0.08 0.03
96 90.88 16.34 68.90 2.49
120 44.97 9.19 2.74 0.04
144 0.31 0.06 0.68 0.06
168 0.23 0.08 2.12 0.08
264 0.03 0.008 0.66 0.03
336 0.01 <LOQ 0.13 <LOQ
504 0.009 <LOQ 0.02 <LOQ
696 <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ
1104 <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ
Floor 24 165.21 38.65 13.67 0.39
96 129.82 27.02 8.53 0.17
120 182.46 47.13 4.56 0.15
144 1.06 0.43 2.14 0.13
168 0.43 0.07 0.30 0.007
264 0.22 0.04 0.16 0.01
336 0.17 0.05 0.19 0.02
504 0.03 0.01 0.08 0.01
696 0.007 <LOQ 0.05 0.01
1104 <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ

152
Supplementary data 5: Number of total and resistant Escherichia coli bacteria in droppings (cage)
and feathers (floor) of Sulfadiazine (SDZ), Trimethoprim (TMP) and Oxytetracycline (OTC) after oral
gavage in caged and floor broilers after 5 days of treatment (n=1 for droppings and n=2-3 for feathers).
Total Escherichia coli Resistant Escherichia
Matrices Housing Groups Treatments Time (h)
(log10 UFC.g-1) coli (log10 UFC.g-1)
Droppings Cage I SDZ/TMP 0 5.6782 4.5531
96 5.8603 5.8195
144 5.6902 5.6474
504 6.8751 6.5977
II OTC 0 5.6990 4.7634
96 5.4771 5.4843
144 5.9085 5.7993
504 4.7364 2.9380
III Control VS SDZ/TMP 0 5.3355 4.0086
96 5.9345 4.3284
144 6.1409 4.2330
504 6.3324 4.4440
Control VS OTC 0 5.3355 3.5752
96 5.9345 4.8325
144 6.1409 4.9590
504 6.3324 4.5289
Feathers Floor IV SDZ/TMP 0 5.4802 5.2631
0 5.1649 5.2855
0 5.7883 4.5664
24 5.2944 4.6679
24 5.4757 5.2538
24 6.2588 -
96 4.2764 4.3433
96 5.6937 5.5433
96 3.7905 3.3925
504 6.6561 6.6308
504 3.9083 3.6865
504 5.5146 5.0907
V OTC 0 5.9535 5.9269
0 5.8812 5.7156
0 5.6788 5.3430
24 5.0972 4.8097
24 4.6818 4.6526
24 6.6625 6.6860
96 6.7782 6.7970
96 5.6709 5.7123
96 6.0862 6.2001
504 5.8239 5.9720
504 5.6116 5.6521
504 6.9085 6.8573
VI Control VS SDZ/TMP 0 6.6242 5.0332
0 6.0743 5.0365
24 4.9191 4.5864
24 5.3457 3.8934
96 5.7039 5.0290
96 5.5055 4.1298
504 5.6359 5.1849
504 6.5707 5.5426
Control VS OTC 0 6.6242 6.1098
0 6.0743 4.4211
24 4.9191 4.6361
24 5.3457 4.7520
96 5.7039 5.4584
96 5.5055 5.2759
504 5.6359 5.4859
504 6.5707 6.2116

153
Annexe 5 : Résultats de dépistage et quantification des échantillons industriels de farine de
plumes

154
Titre : Utilisation des farines de plumes en alimentation animale : impact de la présence des antibiotiques

Mots clés : Antibiotiques, plumes, farine de plumes, exposition, alimentation animale

Résumé : Les plumes issues de l’élevage avicole sont L’objectif était d’étudier le devenir de trois
valorisées par les industries agroalimentaires des antibiotiques sélectionnés : la sulfadiazine, le
coproduits animaux en farine de plumes. Riches en triméthoprime et l’oxytétracycline. En parallèle de ces
protéines, ces farines sont principalement incorporées études, l’impact du traitement antibiotiques a été
dans l’alimentation animale aquacole, porcine et des étudié sur les bactéries Escherichia Coli. Des travaux
animaux domestiques. Des études ont révélé la complémentaires ont été réalisés sur des farines de
présence d’antibiotiques dans les plumes pendant plumes fabriquées au laboratoire et sur des farines de
plusieurs jours après l’administration d’un traitement plumes provenant de l’industrie.
thérapeutique. Cependant, aucun règlement n’est
Les résultats obtenus montrent la nécessité de réviser
établi concernant la présence d’antibiotiques dans les
les règlementations des coproduits animaux et des
plumes et dans les farines. Les plumes et les farines
protéines animales transformées concernant la
de plumes, pourraient contribuer à l’émergence de
présence d’antibiotiques dans les plumes et dans les
bactéries résistantes aux antibiotiques.
farines de plumes en Europe.
Pour évaluer l’impact de la présence d’antibiotiques
sur les animaux via l’utilisation de farines de plumes en
alimentation animale, les travaux de la thèse se sont
focalisés sur deux études cinétiques réalisées sur des
poulets de chair hébergés (1) en cage et (2) sur sol.

Title: Feather meal use in animal feed: impact of the presence of antibiotics

Keywords: Antibiotics, feathers, feather meal, exposure, animal feed

Abstract: Feathers from poultry farming are processed
by the animal by-product food industry as feather meal.
Rich in protein, these meals are mainly incorporated
into aquaculture, pigs and pets food. Studies have
shown the presence of antibiotics in feathers for
several days after therapeutic treatment. However,
there are no regulations regarding the presence of
antibiotics in feathers and feather meal. Feathers and
feather meal could potentially contribute to the
emergence of antibiotic resistant bacteria.
To assess the impact of the presence of antibiotics on in feathers and feather meal in Europe.
animals via the use of feather meal in animal feed, the
thesis work focused on two kinetics studies carried out
on broilers housed (i) in cages and (ii) on the floor.
The objective was to study the fate of three selected
antibiotics: sulfadiazine, trimethoprim and
oxytetracycline. In parallel to these studies, the impact
of the antibiotic treatment was studied on Escherichia
Coli bacteria. Complementary work was carried out on
feather meal produced in the laboratory and on
feather meal from industry.
The results obtained show the need to revise the
regulations on animal by-product and processed
animal proteins concerning the presence of antibiotics

155