THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE LA COMMUNAUTE UNIVERSITE GRENOBLE
ALPES
Spécialité : Physiologie – Physiopathologies – Pharmacologie
Arrêté ministériel : 25 mai 2016

Présentée par
Morgane COUCHET

Thèse dirigée par Christophe MOINARD

PU, Université Grenoble-Alpes

Co-encadrée par Charlotte BREUILLARD

PhD, Université Grenoble-Alpes

Préparée au sein du Laboratoire de Bioénergétique

Fondamentale et Appliquée, unité INSERM – 1055
dans l'École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant

L’ornithine transcarbamylase :
Rôle et régulation dans
l’homéostasie protéino-énergétique

Thèse soutenue publiquement le 08 octobre 2019

devant le jury composé de :

Mr Thomas DECAENS
PU – PH, Université Grenoble-Alpes (Président)
Mme Francisca JOLY
PU – PH, Université Paris VII (Rapporteur)
Mr Dominique DARDEVET
DR, UMR10119, INRA Auvergne (Rapporteur)
Mme Béatrice MORIO
DR, INSERM U1060 / INRA U1393, Université Lyon 1 (Membre)
Mme Perrine MARQUET-DE ROUGE
MCU, UMR1140, Université Paris-Descartes (Membre)
 Remerciements

Tout d’abord, je souhaiterais adresser mes remerciements à l’ensemble des membres du jury
pour l’intérêt qu’ils portent à ce travail. Je remercie Mme Francisca Joly et Mr Dominique
Dardevet d’avoir accepté d’être rapporteurs. Merci pour votre implication. Je remercie
également Mme Béatrice Morio, Mme Perrine Marquet-de Rougé et Mr Thomas Decaens
d’avoir accepté d’examiner ce travail.

Je souhaiterais remercier Mr Uwe Schlattner pour m’avoir permis d’effectuer ma thèse au sein
du laboratoire LBFA, ainsi que pour avoir accepté de participer à mes CST.

Je tiens à remercier Mr Christophe Moinard pour son encadrement et sa rigueur

professionnelle qui m’ont permis de mener à bien cette thèse. Je vous remercie de la
confiance que vous m’avez accordée en me proposant ce projet qui vous tient à cœur. Je vous
remercie également pour votre disponibilité et vos conseils tout au long de cette thèse.
Certains conseils très avisés m’auront même suivit régulièrement pendant ces 4 années :
« Faites-moi confiance », « Ne vous mettez pas la rate au court-bouillon ».

Je tiens également à remercier Mme Charlotte Breuillard qui m’a co-encadrée pendant cette
thèse. De « marraine » de thèse à co-encadrante, en passant par un congrès plutôt épique à
La Haye en 2017. Je souhaiterais te remercier pour ton engagement dans ce projet ainsi que
pour avoir pris le temps de discuter et de m’avoir fait mûrir dans le monde professionnel.
Merci pour ton aide, ta rigueur (surtout sur les fichiers Excels) et tes conseils.

Je voudrais remercier Mr Guillaume Vial pour avoir soutenu ma candidature pour cette thèse.

Je souhaiterais remercier Mr Moïse Coeffier et Mr Dominique Darmaun pour leurs conseils et

leur investissement dans ce projet.

Je voudrais aussi remercier l’ensemble du service de gastro-entérologie du CHU de Grenoble

et particulièrement Mr Nicolas Mathieu et Mme Sandie Pestour sans qui ce projet d’explants
n’aurait pas pu voir le jour. Je vous remercie pour votre investissement.
Je tiens à remercier l’institut Cochin, Paris, ainsi que l’institut Curie, Paris, pour leur
investissement précieux dans l’établissement de notre lignée murine Cre/Lox. Je remercie
également la PHTA qui gère l’entretien de cette lignée.

Je souhaite remercier de nouveau Mme Béatrice Morio ainsi que Mr Philippe Noirez pour leur
aide et leur implication dans notre projet in vivo ainsi que Mr Walid Rachidi pour ses conseils
et son investissement.

Je voudrais remercier Mme Christelle Corne et Mr John Rendu pour leur implication dans ce
projet de thèse et leur disponibilité.

Je souhaite bien sûr, remercier l’ensemble des personnes qui m’ont accueilli au LBFA.
Je souhaiterais remercier particulièrement Mme Sandrine Lablanche qui m’a permis de
terminer sereinement ma thèse.
Aussi, je voudrais remercier Mme Karine Couturier pour son investissement dans le projet
depuis l’écriture du comité d’éthique jusque dans les manips.
Je souhaite également remercier Mr Hervé Dubouchaud pour ses innombrables dépannages
(à distance ou non) technique et informatique ainsi que sa disponibilité.
Je souhaite remercier Mr Eric Fontaine pour avoir supporté notre projet auprès du CHU et
pour ses conseils scientifiques, ainsi que Mr Jean-Marc Moulis qui a toujours répondu présent
lorsque j’avais besoin de conseils.
Je voudrais remercier Mr Frederic Lamarche pour son aide en culture cellulaire mais pas que...
Je te remercie également pour ta bonne humeur et ton soutien durant ces 4 ans.
Je remercie également Marie-France, ma « maman », ainsi qu’Emily et Inès pour leur
présence.
Je souhaite chaleureusement remercier Cindy et Pauline pour leur travail à l’animalerie. Merci
pour votre aide quotidienne et votre gentillesse.
Un grand merci à Sarah, Gérard puis Salvatore pour votre aide et votre disponibilité.
Je remercie aussi Régis qui m’a dépatouillé plus d’une fois avec ses solutions ingénieuses.
Je remercie également Mme Amel Arouchi, Mr Geoffrey Maillard et Mr Stéphane Attia pour
avoir mis la main à la patte pour acquérir l’ensemble des données expérimentales.
Je voudrais aussi remercier Mr Dany Mandala, stagiaire de master II, pour son travail.
Une thèse étant remplie de rebondissements émotifs, je n’aurais pu la mener à bien sans le
soutien des « anciens » co-doctorants qui sont bien plus aujourd’hui, alors merci :
- Arthur pour ton humour et ton interprétation de «il est venu le temps des cathédrales»
- Charline pour ta décontraction en toute situation
- Céline pour ta gentillesse et ta douceur
- Clovis pour ton aide statistique et pour m’embarquer dans les aventures sportives
- Adeline, pour un tas de choses, mais par-dessus tout pour m’avoir hébergé quand je
me suis enfermée hors de chez moi ! Merci pour ton écoute et nos folies partagées !
- Camille pour ta présence même à l’autre bout du monde. Merci d’être toujours
partante pour milles choses, sportives ou non, et merci pour cette coloc ensemble!
Et merci aux « nouveaux » : Marius, merci pour nos pauses « discussions d’avenir ». Martin,
merci pour le travail que tu as fourni en tant que stagiaire puis en tant que thésard et merci
pour nos remixes de chansons!! Enfin merci à vous deux pour ces souvenirs musicaux dans les
laboratoires.

Je remercie le reste de la troupe qui m’a sortie la tête du travail plus d’une fois et qui a fait
preuve d’une grande écoute, Marie, Pat, Ju, Oliv, Aurélie. Un grand merci, également, aux
copains de Grenoble ou d’ailleurs, qui m’ont soutenus pendant ces 4 années, et surtout cette
dernière année, malgré mon absence régulière lors des retrouvailles.

Aussi, j’aimerais remercier tout particulièrement Tristan. Merci pour ta patience et tes
encouragements dans cette dernière année de thèse. Merci pour toutes tes attentions et
merci d’avoir relu ma thèse en entier…deux fois, alors que tu n’y comprenais pas un traitre
mot. Et enfin, je voudrais te dire que tu as joué ton rôle de « mental » à la perfection.

Evidemment, je ne peux finir ces remerciements sans m’adresser à ma famille, ma ressource

pendant cette thèse. Je remercie particulièrement ma maman, Anne, et mon papa, Gilles, qui
m’ont poussé, pour atteindre cette étape. Merci de m’avoir soutenu, épaulé et d’avoir
toujours répondu présents lorsque j’en avais besoin. Un grand merci à mes sœurs, Sandy et
Tiffany, qui m’ont apporté l’amour et la légèreté dont j’avais besoin pendant cette thèse.

Enfin, je remercie toutes les personnes qui, de près comme de loin, ont contribuées à
l’aboutissement de ce travail.
Table des matières

LISTE DES ABREVIATIONS ........................................................................................................... 1

TABLE DES ILLUSTRATIONS ......................................................................................................... 5

PUBLICATIONS, COMMUNICATIONS, FORMATIONS SUIVIES..................................................... 7

INTRODUCTION GENERALE ...................................................................................................... 10

DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................................. 14

1. L’Ornithine transcarbamylase (OTC) ................................................................................. 15

1.1. Structure de l’OTC ..................................................................................................... 15

1.2. Synthèse de l’OTC ...................................................................................................... 17

1.3. Localisation de l’OTC.................................................................................................. 19

1.4. Réaction catalysée par l’OTC ..................................................................................... 20

1.5. Propriétés biochimiques ............................................................................................ 22

1.6. Régulation de l’OTC ................................................................................................... 25

1.7. Mutations de l’OTC et conséquences ........................................................................ 27

1.7.1. Mutations hépatiques ........................................................................................ 27

1.7.2. Diagnostique et traitements .............................................................................. 28

2. Métabolisme de la citrulline (CIT) ..................................................................................... 30

2.1. Propriétés générales .................................................................................................. 30

2.2. Transport de la CIT ..................................................................................................... 30

2.2.1. Transport intercellulaire ..................................................................................... 30

2.2.2. Transport intracellulaire ..................................................................................... 31

2.3. Synthèse..................................................................................................................... 32

2.3.1. Synthèse de la CIT par l’OTC............................................................................... 32

2.3.2. Synthèse de la CIT par les nitric oxide synthase (NOS) ...................................... 32

2.3.3. Catalyse de la CIT par l’argininosuccinate synthase (ASS) ................................. 33

 2.4. Métabolisme tissulaire .............................................................................................. 33

2.4.1. Métabolisme hépatique de la CIT ...................................................................... 33

2.4.2. Métabolisme intestinal de la CIT ........................................................................ 36

2.4.3. Métabolisme rénal de la CIT............................................................................... 38

2.5. Relation inter-organes ............................................................................................... 39

2.6. Marqueurs de la fonctionnalité rénale et intestinale ............................................... 41

2.6.1. Marqueur de la fonctionnalité rénale ................................................................ 41

2.6.2. Marqueur de la fonctionnalité intestinale ......................................................... 41

2.7. Métabolisme corps entier de la CIT ........................................................................... 43

2.7.1. Tolérance et caractéristiques pharmacocinétiques ........................................... 46

2.7.2. CIT et dysfonction intestinale ............................................................................. 48

2.7.3. La CIT en tant que précurseur du NO ............................................................... 49

2.7.4. Fonction cardiovasculaire .................................................................................. 51

2.7.5. CIT et fonction cérébrale .................................................................................... 53

2.7.6. CIT et fonction musculaire ................................................................................. 55

2.7.7. CIT et métabolisme lipido-énergétique ............................................................. 60

BUT DE L’ETUDE ....................................................................................................................... 63

TRAVAUX EXPERIMENTAUX ..................................................................................................... 65

Etude n°1 .................................................................................................................................. 66

Etude n°2 .................................................................................................................................. 68

Etude n°3 ................................................................................................................................ 108

DISCUSSION GENERALE .......................................................................................................... 158

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................................. 166

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .......................................................................................... 169

ANNEXES ................................................................................................................................. 194

 LISTE DES
ABREVIATIONS

1
4E-BP1 : eukaryotic translation initiation C
factor 4E-binding protein 1
CAMK : Ca2+/calmodulin-dependent
A protein kinase

AA : acide aminé CYS : L-cystéine

AANE : acide aminé non essentiel CIT : L-citrulline

AAV : adeno-associated virus CP : carbamylphosphate

ADMA : asymmetric dimethylarginine CPS : Carbamoyl-phosphate synthase

ADN : acide désoxyribonucléotide CPT : Carnitine palmitoyl transférase

AGNE : acide gras non-estérifié CRP : C-reactive protein

Akt : protein kinase B D–E

ALT : alanine aminotransférase EDL : extensor digitorum longus
Apo : apolipoprotéine
F
APP : amyloid precursor protein
FAD : flavine adénine dinucléotide
ARG : L-argnine
FMN : flavine mononucléotide
ARGase : arginase
G
ARN : acide ribonucléotide
GLN : L-glutamine
ASL : argininosuccinate lyase
GLNase : glutaminase
ASS : argininosuccinate synthase
GLY : L-glycine
AST : aspartate transaminase
GSH : Glutathion
ATC : aspartate transcarbamylase

ATP : adénosine triphosphate

H
Hb : hémoglobine
B
HDL : high density lipoprotein
BAEC : bovine aortic endothelial cell
HIS : L-histidine
BH4 : tétrahydrobioptérine

2
 I O
IFN : interféron OAT : ornithine aminotransférase

IL : interleukine ORC : ornithine carrier

J–K ORN : L-ornithine

Ki : constante d’inhibition OTC : ornithine transcarbamylase

Km : constante de Michaëlis OTCd : ornithine transcarbamylase

deficiency
KO : knock out
P
L
P5C : Δ1-l-Pyrroline-5-Carboxylate
LDL : low density lipoprotein
PALO : delta-N-phosphonacetyl-L-
LEU : L-leucine ornithine

LPS : lipopolysaccharide PAM : presequence translocase-associated

motor
M
PEPCK : Phosphoénolpyruvate
MCP : monocyte chemo-attractant protein carboxykinase

MET : L-méthionine pH : potentiel hydrogène

MPS : muscular protein synthesis Pi : phosphate inorganique

mTORC1 : mammalian target of PI3K : Phosphoinositide 3-kinase

rapamycin complex 1
PPAR : Peroxisome proliferator-activated
N receptor

NADH : Nicotinamide adénine PRO : L-proline

dinucléotide
Q–R
NAGS : N-acétylglutamate synthétase
rLAT : rat large neutral amino acid
NFκB : nuclear factor kappa B transporter

NO : nitric oxide (monoxyde d’azote
radicalaire)

NOS : nitric oxide synthase

3
 S TIM : translocase inner membrane

S6K1 : S6 kinase 1 TNF : tumor necrosis factor

SER : L-serine TOM : translocase outer membrane

SNC : système nerveux central U

SUnSET : surface sensing of translation UCP : Uncoupling protein

T UV : ultra-violet

TAB : tissu adipeux blanc V–Z

TFAM : mitochondrial transcription factor VEGF : vascular endothelial growth factor
A
WT : wild type
THR : L-thréonine
ZDF : zucker diabetic fatty

4
 TABLE DES
ILLUSTRATIONS

5
Liste des figures
Figure 1. Diagramme en ruban de la forme trimérique de l'OTC, d’après Shi et al, 2001. ..... 16

Figure 2. Transport des polypeptides dans la matrice mitochondriale (adapté de

Wasilewski et al., 2017)............................................................................................................ 18

Figure 3. Activité enzymatique de 3 enzymes, OTC, OAT et arginase au cours du

développement, pourcentage par rapport au stade adulte (D'après Herzfeld et al., 1976)… 24

Figure 4. Formule topologique de la citrulline ......................................................................... 30

Figure 5. Cycle de l'Urée........................................................................................................... 35

Figure 6. Métabolisme inter-organes ARG– CIT – ARG (D’après Breuillard et al, 2015) ......... 39

Figure 7. Degré de corrélation entre la concentration plasmatique en CIT et la longueur

résiduelle de l'intestin grêle (D’après Crenn et al., 2000)........................................................ 42

Figure 8. Métabolisme de la CIT au niveau de l'organisme entier (D’après Allerton et al.,

2018)......................................................................................................................................... 45

Figure 9. cinétique de la concentration plasmatique en CIT chez 8 sujets sains, après

absorption orale de (a) 2g, (b) 5g, (c) 10g, (d) 15g. (moinard et al, 2008) .............................. 47

Figure 10. Contenu protéique musclaire (mg/organe) (A) et synthèse protéique

musculaire du tibialis (mg protéine/heure) (B) (D’après Osowska et al., 2006). .................... 55

Figure 11. Voie de signalisation mTORC1 (Adapté de Julien et Roux, 2010) ........................... 58

Liste des tableaux

Tableau 1. Activité enzymatique tissulaire de l’OTC (D’après Jones et al., 1961)................... 22

Tableau 2. Constantes d'inhibitions des substrats de l'OTC dans le foie de rats (D'après
Lusty, 1979) .............................................................................................................................. 26

6
 PUBLICATIONS,
COMMUNICATIONS,
FORMATIONS SUIVIES

7
Publications
Articles scientifiques :

o An in vitro explant model to study intestinal amino acids metabolism

Sandie Pestour*, Morgane Couchet*, Charlotte Breuillard, Christelle Corne, Nicolas
Mathieu, Frédéric Lamarche, Eric Fontaine, Moïse Coëffier and Christophe Moinard.

Soumis pour publication.

o Regulation of citrulline synthesis in human enterocytes: role of hypoxia and

inflammation
Morgane Couchet*, Sandie Pestour*, Charlotte Breuillard, Christelle Corne, John
rendu, Eric Fontaine and Christophe Moinard.

Soumis pour publication.

*1er auteur ex-aequo

o Does endogenous citrulline controls protein-energy metabolism ?

Morgane Couchet, Charlotte Breuillard, Karine Couturier, Chritelle Corne and
Christophe Moinard.

En préparation.

Revue scientifique :

o La citrulline : Un allié de choix dans la prise en charge thérapeutique ?

Morgane Couchet, Charlotte Breuillard and Christophe Moinard.

Agir pour les Maladies Métaboliques, Juin 2019, Vol n°13.

Communication écrite
o Does citrulline from intestinal mucosa can affect the muscular function?
Morgane Couchet, Charlotte Breuillard, Sandie Pestour, Frédéric Lamarche, Christelle
Corne, Eric Fontaine and Christophe Moinard.
Journée annuelle des doctorants, EDCSV, Juin 2017 – GRENOBLE, FRANCE.

8
Communication orale
o Hypoxia increase citrulline production by human enterocytes: an in vitro study
Morgane Couchet, Sandie Pestour, Charlotte Breuillard, Frédéric Lamarche, Christelle
Corne, Eric Fontaine and Christophe Moinard.

39ème congrès ESPEN, Septembre 2017 – Den Haag, PAYS-BAS.

o Obstructive sleep apnea and malnutrition: a preliminary study.

Charlotte Breuillard, Sophie Moulin, Sophie Bouyon, Morgane Couchet, Geoffrey
Maillard, Christophe Moinard and Elise Belaidi.

39ème congrès ESPEN, Septembre 2017 – Den Haag, PAYS-BAS.

Formations suivies
o Label RES (Recherche et Enseignement Supérieur),
Université Grenoble-Alpes, 2016 – 2018.
 Doctorant en contrat d’enseignement (DCE), CNU 86, Faculté de Pharmacie
Enseignement 2h Nutrition – Volémie, Formation Expérimentation animale,
2018.
Enseignement TP/TD, Master I Biotechnologies, Santé, Management
64h/an, 2016 – 2017, 2017 – 2018.

 Evaluation des enseignements, 2017.

 Encadrer efficacement ses TD, 2017.
 Ce que manager veut dire, 2016.
 Introduction au métier d’enseignant – chercheur, 2016.
 Initiation à l’esprit critique et Zététique, 2016.

o Membre organisateur de la Journée Annuelle des doctorants (JAD),

DLST, Grenoble, 14 juin 2018.

o Membre organisateur du 20ème forum BIOTechno Rhônes-Alpes,

Centre des Congrès, Lyon, 12 juin 2017.

o Expérimentation animale : Obtention du Niveau 1 et 2,

Université Grenoble-Alpes, 2016.

o Diet and Health, Mediterranean Diet as one exemple,

Summer school, University of Barcelona, 2016.

9
INTRODUCTION
GENERALE

10
La L-citrulline (citrullus lanatus) (CIT) est un acide aminé non essentiel et non protéinogène.
Outre son rôle d’intermédiaire dans le cycle de l’urée, qui constitue un circuit fermé au niveau
hépatocytaire, la CIT est produite de manière conséquente par les cellules entérocytaires dans
l’intestin grêle (Windmueller et Spaeth, 1981). Cette découverte a suscité l’intérêt des
scientifiques pour cet acide aminé intestinal. L’une des particularités de cet acide aminé est
qu’il n’est pas capté par le foie mais libéré dans la circulation sanguine systémique. Comme la
CIT n’est que très peu présente dans l’alimentation (uniquement dans la pastèque de façon
quantitative et à l’état de trace dans les autres aliments), la quantité de CIT produite par
l’intestin est en rapport direct avec la concentration plasmatique en CIT. Cela fait de la CIT un
très bon marqueur de la fonctionnalité entérocytaire (Crenn et al., 2000).
Enfin, depuis deux décennies, les propriétés métaboliques de la CIT ont été mises en évidence.
Tout d’abord, il a été démontré que la CIT avait, en tant que précurseur de l’arginine et du
monoxyde d’azote radicalaire (NO), des effets sur le système cardiovasculaire (Romero et al.,
2006), mais également, de façon plus surprenante, que la CIT jouait un rôle important dans la
régulation de l’homéostasie azotée (Osowska et al., 2004). En effet, un travail princeps
(Osowska et al., 2004), réalisé dans un modèle murin de syndrome du grêle court, a permis de
mettre en évidence que la CIT est capable de restaurer le bilan azoté de ces animaux, mettant
en avant son rôle de modulateur du métabolisme protéino-énergétique. Depuis, plusieurs
équipes ont étudié les effets de la CIT sur ce métabolisme, principalement dans le muscle.
Osowska et al. (Osowska et al., 2006) ont montré dans un modèle de rats âgés dénutris qu’un
apport de CIT stimule la synthèse protéique musculaire (MPS). Ces effets ont d’ailleurs été
confirmés chez l’Homme (Jourdan et al., 2014). Dans ce même modèle de rat âgé dénutri,
Faure et al. (Faure et al., 2012) ont pu mettre en évidence une augmentation de la masse
musculaire et de l’activité motrice avec un apport de CIT, montrant ainsi la capacité de la CIT
à préserver la fonction musculaire globale. Ces effets sont aussi retrouvés dans un modèle de
rats adultes en restriction calorique (Ventura et al., 2013). Plus récemment, Le Plénier et al.
(Le Plénier et al., 2017) ont montré que la CIT a une action directe sur la MPS à travers la voie
de signalisation mTORC1/PI3K/MAPK, voie principale de régulation de la synthèse protéique.
Cette dernière a un rôle de signal du statut énergétique et oxydoréducteur de la cellule et
intègre plusieurs informations de voies adjacentes (insuline, facteurs de croissance,
mitogènes). Les auteurs ont également pu confirmer ces résultats in vivo. La MPS étant très
couteuse en énergie, il semble légitime de penser que la CIT pourrait avoir des effets sur le

11
métabolisme énergétique. En effet, Faure et al. (Faure et al., 2013) mettent en évidence par
une approche protéomique, qu’une stimulation de la MPS s’accompagne d’un changement du
métabolisme énergétique musculaire. Aussi, Moinard et al. (Moinard et al., 2015) ont montré
qu’une complémentation en CIT stimule l’expression d’un facteur de biogenèse mitochondrial
(TFAM). Très récemment, Goron et al. (Goron et al., 2019) ont mis en évidence dans une
culture de myotubes la capacité de la CIT à ré-orienter les flux d’ATP au profit de la MPS.
Au niveau de la régulation du métabolisme énergétique, Joffin et al. (Joffin et al., 2014a,b) ont
montré dans un modèle de culture d’explants de tissu adipeux (TA) que la CIT est capable
d’améliorer le profil lipidique grâce à une action directe en stimulant la libération des acides
gras non estérifiés (AGNE) et du glycérol. De plus, la CIT semble avoir un rôle bénéfique pour
la fonction cérébrale (Marquet-de Rougé et al., 2011 ; Guingay et al., 2013 ; Moinard et al.,
2017), la stimulation du système immunitaire (Bansal et al., 2004 ; Breuillard et al., 2015), et
l’insulinosensibilité (Capel et al., 2015).
L’implication de la CIT dans le métabolisme protéino-énergétique a largement été mis en
évidence, néanmoins ces résultats sont acquis dans le cas d’apports exogènes de CIT. Par
conséquent, les connaissances sur le rôle de la CIT endogène dans l’organisme et de la
régulation de sa production restent limitées.
Physiologiquement, la CIT circulante est synthétisée dans l’intestin par une enzyme clé,
l’ornithine transcarbamylase (OTC). La régulation de la fonctionnalité de cette dernière est
donc de grande importance pour la biodisponiblité de la CIT et par conqéquent pour le
maintien de l’homéostasie protéino-énergétique.
Aussi, plusieurs modèles in vivo de déficience en OTC ont été développés. Cependant, que ce
soit l’utilisation d’un inhibiteur spécifique de l’OTC, le delta-N-phosphonacetyl-L-ornithine –
PALO – (Hoogenraad et al., 1985), ou encore le développement d’un modèle murin OTC
déficient, la souris spf-J (Tarasenko et al,. 2015), ces modèles affectent le gène de l’OTC dans
l’intestin mais aussi dans le foie, affectant ainsi le cycle de l’urée. Cette aspécificité ne permet
donc pas de conclure quant à l’importance de la production de CIT endogène pour le
métabolisme protéino-énergétique.
Dans ce travail, nous proposons d’explorer le rôle de l’OTC, en tant qu’enzyme synthétisant la
CIT, dans l’homéostasie protéino-énergétique ainsi que sa régulation.
Pour cela, nous avons mis en place deux études ; la première in vitro et la seconde in vivo.

12
Le travail in vitro a consisté, dans un premier temps, à adapter un modèle d’explant duodénal
humain pour l’étude du métabolisme de la CIT car la lignée intestinale Caco2 n’exprime pas
l’OTC (Travail expérimental n°1). Dans un second temps, la régulation de l’OTC a été étudiée
dans le modèle d’explant duodénal humain validé précédemment. Dans ce travail, les effets
de plusieurs conditions retrouvées cliniquement (Inflammation, Hypoxie, ou une combinaison
des deux) sur la régulation de l’OTC ont été etudiés afin d’évaluer l’impact d’une altération du
statut énergétique sur la fonctionnalité de l’OTC et la production de CIT (Travail expérimental
n° 2).
Le travail in vivo a permis d’élaborer un nouveau modèle murin transgénique KO inductible
pour le gène de l’OTC intestinale suivant un système de mutation Cre/Lox, afin d’explorer
l’impact d’un effondrement de la biodisponibilité en CIT sur l’ensemble de l’organisme et
particulièrement sur la fonction musculaire (travail expérimental n°3).

13
 DONNEES
BIBLIOGRAPHIQUES

14
 1. L’Ornithine transcarbamylase (OTC)

L’ornithine transcarbamylase (OTC, aussi appelée ornithine carbamoyltransférase, OCT ; EC

2.1.3.3) est une enzyme présente dans un grand nombre d’organismes incluant les vertébrés,
les micro-organismes et les plantes (Bellocco et al., 1993 ; Laliberte et al., 1990 ; Eisenstein et
al., 1984, Xiong et al., 1989 ; Tsuji et al., 1983). Chez les vertébrés et la plupart des micro-
organismes, l’OTC permet la production de L-citrulline (CIT) à partir de L-ornithine (ORN). Chez
les eucaryotes, l’enzyme fonctionnelle de l’OTC se trouve dans la matrice mitochondriale
(Takiguchi et al., 1989). Chez les mammifères, la CIT est synthétisée dans le foie, où elle
participe au cycle de l’urée (Cf partie 2.4.1). Cependant, ce pool de CIT est non échangeable
avec le reste de l’organisme et il ne participe pas au métabolisme général de la CIT (Jourdan
et al., 2008). Par ailleurs, la CIT est synthétisée de façon quantitative par l’intestin et elle joue
un rôle majeur dans l’homéostasie des acides aminés (AA) (en particulier celui de la L-
glutamine (GLN) et de la L-arginine (ARG) (Breuillard et al., 2015).

1.1. Structure de l’OTC

Au cours de l’évolution, l’OTC est très bien conservée. En effet, sa structure primaire et sa
structure tertiaire sont très bien caractérisées dans le foie et la muqueuse intestinale de
plusieurs espèces, y compris l’Homme. La structure tertiaire de l’enzyme correspond au
repliement spécifique de la molécule, lui conférant sa fonctionnalité biologique. Au niveau
structural, l’OTC est un trimère composé de 3 monomères de 35 à 40 KDa comprenant, chez
l’Homme, 354 AAs.

La structure tertiaire de chaque monomère est composée de 2 domaines structuraux liés entre
eux par une longue chaîne intermédiaire d’hélices α (Figure 1). Chacun des domaines est
composé d’un feuillet β, encadré par des hélices α (α-β-α), parallèle entre elles, et des boucles
mélangeant les topologies α et β (Diaz-Munoz et al., 2010 ; Shi et al., 2001). Le site actif de
l’enzyme se trouve à la charnière entre ces deux domaines et est partagé avec les monomères
adjacents (Shi et al., 2001).

15
Figure 1. Diagramme en ruban de la forme trimérique de l'OTC (D’après Shi et al, 2001).
Les trois monomères sont représentés par les couleurs jaune, bleu et rouge. Les molécules de CP sont
représentées en vert. CP=Carbamoylphosphate, ORN=Ornithine, SMG loop=Boucle SER-MET-GLY.

Le domaine de liaison avec le carbamoylphosphate (CP) se trouve en position N-terminal et

est composé d’un motif constant SER-THR-ARG-THR-ARG (position 90 à 94). Ce dernier se lie
spécifiquement au groupement phosphate du CP. La structure globale de la liaison OTC-CP a
permis le développement de deux inhibiteurs spécifiques de l’enzyme : PALO-OTC et L-
norvaline-OTC (Shi et al., 1998 ; Shi et al., 2000) (cf partie 1.6).
Une partie du domaine de liaison avec l’ornithine se trouve en position C-terminale et contient
un motif constant LEU-HIS-CYS-LEU-PRO (position 301 à 305) (Kuo et al., 1990 ; Kraus et al.,
1985). Le résidu CYS semble être indispensable pour la liaison de cette molécule selon
plusieurs études utilisant la mutagenèse et des modifications chimiques (kuo et al., 1990 ;
McDowall, 1990 ; Marshall et Cohen, 1972). En effet, la conformation de l’enzyme permet au
motif CYS303 - LEU304 d’interagir avec l’azote du groupe carbamoyl du CP et d’attaquer l’azote
du second substrat. Il permettrait donc de stabiliser cette combinaison tétrahédrique.
De plus, le mouvement d’un autre motif possédant un haut degré de flexibilité est
indispensable à la liaison du second substrat et à la libération du produit de la réaction (Shi et
al., 2001). Cette région flexible est composée de plusieurs hélices α. Elle permet de connecter
les deux domaines C-ter et N-ter et contient une boucle composée du motif constant SER-

16
MET-GLY (position 267 à 269) (Diaz-Munoz et al., 2010). Cette région forme une poche de
liaison au second substrat qui induit un changement conformationnel permettant à la boucle
flexible de former le site actif.
L’assemblage quaternaire de l’enzyme forme un homotrimère (Figure 1). Le site actif de
l’enzyme étant formé par l’interface entre chaque monomère (Curis et al., 2005).
Globalement, les interactions entre les sous-unités permettent de maintenir la forme
trimèrique de l’enzyme ainsi que son activité, les feuillets β confèrant la résistance et les
hélices α la flexibilité au peptide (Allewell et al., 1999 ; Dia-Munoz et al., 2010). Aussi, l’OTC
humain contient un nœud interne suggérant une plus grande stabilité par rapport à d’autres
transférases (Sutkowska et al., 2008).

1.2. Synthèse de l’OTC

L’isolation et la caractérisation du gène de l’OTC humain ont été finalisées en 1988 (Hata et
al., 1988). Ce gène se situe sur le bras court du chromosome X (Xp21.1) et mesure environ 73
kb (Lindgren et al., 1984 ; Horwish et al., 1984). Il est composé de 10 exons (séquences non
codantes) et 9 introns (séquences codantes). Alors que la longueur des séquences des exons
sont relativement stables (environ 140 bp), celle des introns varient énormément allant de 80
bp à 21,7 kb. L’OTC possède deux régions fonctionnelles importantes, le site de liaison au CP
codé par l’exon 3 et le site de liaison à l’ORN codé par l’exon 9 (Kraus et al., 1985). Le code
nucléaire des protéines mitochondriales est très spécifique. Ces polypeptides sont synthétisés
dans les polyribosomes libres puis libérés dans le cytoplasme où ils subiront une modification
post-traductionnelle afin d’intégrer la matrice mitochondriale (Schatz et al., 1983 ; Wasilewski
et al., 2017) (Figure 2). Ces polypeptides sont synthétisés sous forme de précurseurs de taille
plus importante que celle de la protéine mature. En effet, ils contiennent une région d’AAs
« leader » en position N-terminal qui n’est pas retrouvée dans la protéine mature
correspondante. L’import mitochondrial de ces précurseurs nécessite une liaison spécifique
avec une molécule de la membrane externe mitochondriale permettant la translocation du
polypeptide.

17
Figure 2. Transport des polypeptides dans la matrice mitochondriale (D’après Wasilewski et al.,
2017)
Les proteines sont synthétisées dans les ribosomes cytosoliques. Le précurseur est acheminé dans
l’espace intermembranaire via la translocase de la membrane externe TOM (translocase outer
membrane) puis transféré dans la matrice mitochondriale via la translocase de la membrane interne
TIM23 (translocase inner membrane) associé au complexe PAM (presequence translocase-associated
motor). La pré-séquence N-terminal est alors clivée grâce à l’action de la MPP (mitochondrial
processing peptidase).

La traversée membranaire est une étape qui requiert de l’énergie et le clivage de la portion
« leader » N-terminal dans la matrice mitochondriale (Schatz et al., 1983). L’OTC est donc
synthétisée dans le cytoplasme sous forme d’un précurseur allant de 40 KDa à 43 KDa suivant
les espèces. Ce premier produit de transition a une demi-vie de 1 à 2 min dans le cytoplasme
(Mori et al., 1982). Lors de son entrée dans la mitochondrie, l’OTC est clivée en trimères qui
constituent la forme active de l’enzyme. L’import est énergie-dépendant et le clivage de la
séquence « leader » est catalysé par une protéase de la matrice mitochondriale (Conboy et
al., 1981). Comme vu précédemment (cf partie 1.1), la forme mature de l’enzyme, chez
l’homme et la souris, est un trimère dont chaque monomère identique est de 36.5KDa
(Pierson et al., 1977), localisé dans la matrice mitochondriale (Gamble et Lehninger., 1973).
Dans la mitochondrie, l’OTC active a une demi-vie très variable en fonction de l’hétérogénéité

18
du tissu. Une étude a estimé la demi-vie de l’OTC mitochondrial entre 6 et 9 jours dans du foie
de rat (Wallace et al., 1986). Ces résultats sont confirmés par une étude de Vargas et al.,
(Vargas et al., 1987).
La structure du gène de l’OTC semble être relativement bien conservée entre les espèces,
l’homologie entre l’Homme, le rat et la souris variant de 75 à 92%. Néanmoins, des différences
notables rendent le gène de l’OTC espèce-spécifique, avec, par exemple, une différence en
région 5’ (Takigushi et al., 1987 ; Hata et al., 1986 ; Veres et al., 1986). Quoiqu’il en soit, un tel
degré de conservation laisse penser que l’OTC joue un rôle majeur dans la régulation du
métabolisme.

1.3. Localisation de l’OTC

Au niveau de l’organisme entier, l’OTC active est retrouvée dans plusieurs organes, néanmoins
son activité est notable uniquement dans le foie et l’intestin (Jones et al., 1961). Dans le
système digestif (digestion des protéines et absorption sous forme d’AAs) une étude
immunocytochimique a mis en évidence la présence de l’OTC dans le foie et l’intestin grêle
ainsi que son absence dans l’estomac et le gros intestin (Hamano et al., 1988). Cette même
étude a validé par microscopie électronique la présence de l’OTC spécifiquement dans la
mitochondrie en spécifiant, par évaluation de la densité mitochondriale, que la présence de
l’enzyme dans l’intestin grêle était deux fois moins importante que dans le foie. Ces résultats
sont supportés par une étude de l’expression génique de l’OTC montrant que la concentration
en ARNm de l’OTC dans la muqueuse intestinale correspond à 50% de celle retrouvée dans le
foie (Ryall et al., 1985). Dans l’intestin, l’activité de l’OTC est différentielle en fonction de la
portion intestinale (duodénum, jéjunum, iléon, colon), et plus importante au niveau de
l’intestin proximal (Raijman et al., 1974).

Au niveau cellulaire, un travail cytochimique et histologique effectué à partir de foie de rats a

permis de mettre en évidence que la densité mitochondriale de l’OTC n’est pas aléatoire et
que l’enzyme est associée avec la membrane interne mitochondriale (Powers-Lee et al., 1987).
Elle représente 3 à 4% de la quantité totale de protéine constituant la mitochondrie (Clarke et
al., 1976).

19
Le bon fonctionnement de l’OTC est primordial afin d’éviter une hyperammoniémie, il n’est
donc pas illogique de retrouver également l’OTC dans d’autres tissus. Plus particulièrement,
cette enzyme est retrouvée dans le cerveau (Lopes-Marques et al., 2012) et semble impliquée
dans la modulation neuronale. En effet, des auteurs ont montré une recrudescence de
l’expression génique de l’OTC dans le cerveau de personnes atteintes de la maladie
d’Alzheimer (Bensemain et al., 2009 ; Hansmannel et al., 2009).

1.4. Réaction catalysée par l’OTC

L’OTC est une enzyme de la famille des transférases, c'est-à-dire qu’elle transfère un
groupement fonctionnel carbamoyl (-CO-NH2) de la molécule CP à un groupement amine du
second substrat. L’aspartate transcarbamylase (ATC) dont le second substrat est la L-
aspartate, et l’OTC dont le second substrat est l’ORN sont les enzymes les plus étudiées de
cette famille (Allewell et al., 1999). L’OTC permet la synthèse de CIT à partir de l’ORN et de CP
mais également son catabolisme. C’est ce que l’on appelle un mécanisme réactionnel de type
ping-pong.

𝐿 − 𝑂𝑟𝑛𝑖𝑡ℎ𝑖𝑛𝑒 + 𝐶𝑎𝑟𝑏𝑎𝑚𝑜𝑦𝑙 𝑝ℎ𝑜𝑠𝑝ℎ𝑎𝑡𝑒 ↔ 𝐿 − 𝐶𝑖𝑡𝑟𝑢𝑙𝑙𝑖𝑛𝑒 + 𝑃ℎ𝑜𝑠𝑝ℎ𝑎𝑡𝑒

Néanmoins, thermodynamiquement, la réaction engendrée est largement à l’avantage de la

production de CIT (Reichard et al., 1960).

La réaction catalysée par l’OTC s’effectue de manière séquentielle. Dans un premier temps,
l’enzyme se lie au substrat n°1 : le CP. C’est uniquement après la formation du complexe
binaire que la nouvelle conformation de l’enzyme permet la fixation du second substrat,
l’ORN, de manière coopérative. La libération des produits suit le même processus, la CIT est
libérée dans un premier temps, puis le phosphate inorganique (Pi) dans un second temps
(Marshall et Cohen et al., 1972; Legrain et Stalon, 1976; Wargnies et al., 1978). Une étude de
la structure cristallographique de l’OTC, complexée ou non à ses substrats, chez Escherichia
Coli (E. Coli) a montré une modification importante de la structure et de l’orientation de
l’enzyme lors de la liaison avec le CP. La structure de la liaison OTC-CP chez l’Homme étant
très similaire à celle proposée par l’étude chez E. coli, suggère que la liaison de l’OTC à son
premier substrat, le CP, induit le plus de changements conformationnels tandis que la fixation

20
de son second substrat, l’ORN, permet uniquement d’induire la boucle SER-MET-GLY en site
actif. Ces résultats sont confirmés par des études montrant des différences dans les spectres
d’absorption UV entre les complexes enzymatiques (Miller et al., 1990 ; Legrain et Stalon,
1976 ; Goldsmith et al., 1993). De Gregorio et al., en 1999, ont montré que la liaison de l’OTC
à son premier substrat (i.e le CP) induit une grande isomérisation de l’enzyme.
Aussi, l’étude de la structure binaire et tertiaire de l’enzyme explique cette réaction
séquentielle. En effet, la fixation de l’ORN induit un enfouissement du site de liaison du CP
pour « fermer » le site actif. Ainsi, le CP doit se fixer en premier, lorsque la boucle SER-MET-
GLY est éloignée du site actif (Shi et al., 2000).

21
 1.5. Propriétés biochimiques

Comme nous l’avons évoqué précédemment, la synthèse de CIT, chez les mammifères, est
une étape clé du cycle de l’urée, ce qui explique que l’OTC est essentiellement hépatique.
Néanmoins, elle est également présente en quantité non négligeable dans l’intestin, même si
son activité reste beaucoup moins importante (Jones et al., 1961) (Tableau 1).

Tableau 1. Activité enzymatique tissulaire de l’OTC (D’après Jones et al., 1961)

Activité enzymatique de l’OTC

Tissus
(µmol.g-1.h-1)
Foie 4110
Muqueuse intestinale (grêle) 100
Rein 5
Glandes salivaires 12
Pancréas 2
Glandes surrénales 3
Thymus 2
Poumons 2
Muscles 0
Cœur 0
Cerveau 0
Rate 0

Chez le rat, l’activité enzymatique de l’OTC se met en place très rapidement après la naissance,
que ce soit dans le foie ou bien dans l’intestin. Son accumulation est très significative dans les
3 premières semaines de vie pour atteindre sa valeur adulte lors du sevrage (Herzfeld et al.,
1976) (Figure 3). Chez l’Homme l’OTC commence à s’exprimer après 50 jours de gestations et
sa valeur adulte est atteinte quelques semaines avant la naissance (Colombo et Richterich,
1968). Cette enzyme pourrait donc être indispensable au besoin développemental accru des
nouveaux nés. Reichard et al. (Reichard et al., 1960), montrent que l’activité de l’enzyme dans
la muqueuse intestinale correspond à 14% de son activité hépatique. La formation de la CIT
est favorisée expérimentalement selon les conditions suivantes : une température de 37-38°C,
un pH entre 7,6 et 8,1 et une concentration en substrat (CP et ORN) d’environ 0,1 M. L’OTC

22
hépatique purifiée montre un Km pour le CP de 0,26 mM et un Km pour l’ORN de 0,4 mM à
pH 7,7 (Lusty et al., 1979). En effet, une variation de pH n’affecte pas la constante d’affinité
du CP pour l’OTC (Marshall et Cohen, 1972), cependant, l’affinité de l’ORN diminue avec
l’augmentation du pH (pH 6 à pH 8) (Snodgrass et al., 1968, Raijman et al., 1974). Par ailleurs
l’OTC est également capable d’utiliser comme substrat secondaire d’autres AAs basiques
comme la L-lysine (LYS) (Marshall et Cohen, 1972). Tout comme l’ORN, le Km de la LYS (environ
270 mM) est pH-dépendant. Le produit de cette réaction est l’homocitrulline. Dans les
conditions optimales de cette réaction (37°C, pH 7,7), le taux de production de
l’homocitrulline est minime puisqu’il correspond à 0,16% de celui de la CIT (Marshall et Cohen,
1972). De plus, comme indiqué ci-avant, l’affinité de la LYS pour l’OTC est très inférieure de
celle de l’ORN, ce qui rend cette réaction négligeable en condition physiologique (Ryan et al.,
1964).

23
Figure 3. Activité enzymatique de 3 enzymes, OTC, OAT et arginase au cours du développement,
pourcentage par rapport au stade adulte (D'après Herzfeld et al., 1976).
A. Dans l'intestin grêle. B. Dans le foie

L’OTC suit une cinétique de Michaelis-Menten. A l’état d’équilibre, la réaction enzymatique

est largement en faveur de la production de CIT (Reichard et al., 1960). Aussi, la variablité du
Km de l’ORN pour l’OTC est à mettre en relation avec le mécanisme séquentiel de la réaction.
En effet, plus les concentrations de CP diminuent plus le Km et la Vmax de l’OTC pour la L-ORN
diminue (Inoue et al., 1990). De plus, Kuo et al. (Kuo et al., 1985), ont analysé la réaction
engendrée par l’OTC selon différents pH et ont pu mettre en évidence que seules les espèces

24
zwitterioniques d’ORN (H2N(CH2)3CH(NH3+)COO-) se liaient de manière productive à l’OTC.
En effet, c’est la formation spécifique de ce complexe qui permet l’attaque nucléophile sur
l’ornithine et conduit à la formation des produits de la réaction. Dans cette conformation, la
déprotonation du groupe δ-NH3+ est évitée et la transcarbamoylation potentialisée
énergétiquement.

1.6. Régulation de l’OTC

Plusieurs paramètres peuvent influencer l’efficacité enzymatique de l’OTC et donc affecter la

production de CIT. Lee et al. (Lee et al., 1989), ont montré chez E. coli, que contrairement à ce
qui était observé auparavant, l’OTC ne se lie pas toujours de manière coopérative. En effet, en
présence de Zn2+, le CP lie aussi l’enzyme libre de manière allostérique. En absence de
substrat, le zinc se comporte comme un inhibiteur lent en diminuant la vitesse d’isomérisation
de l’enzyme. Lorsque l’OTC est déjà liée au CP, le Zn se lie de manière coopérative au complexe
enzymatique binaire. Le Zn devient alors un inhibiteur réversible, non compétitif avec le CP
mais compétitif avec l’ORN. De ce fait, le profil de saturation de l’ORN devient sigmoïde. Le
déplacement du zinc allostérique par l’ORN est la raison d’une liaison coopérative au substrat.
Le zinc semble réguler l’OTC par deux voies : en tant qu’inhibiteur de l’enzyme libre et en tant
que cofacteur allostérique de l’enzyme lorsque celle-ci est liée au premier substrat. Ces
régulations sont observées pour des concentrations de zinc de l’ordre du micro-molaire.

L’implication de la LYS (Marshall et cohen et al., 1977), l’ARG (Marshall et cohen et al., 1980a ;
kuo et al., 1985) et la L-cystéine (CYS) (Marshall et Cohen et al., 1980b ; Goldsmith et al., 1991)
dans la liaison de l’OTC à son substrat a pu être mise en évidence. Plus tard, Yu et al. (Yu et al.,
2009), ont montré que l’acétylation du résidu Lys-88 de l’OTC entraine par conséquent
l’acétylation de l’OTC qui diminue l’affinité du CP pour l’OTC (sans affecter la liaison à l’ORN).
De plus, l’acétylation de la lys-88 est affectée par la disponibilité du glucose et des AAs
extracellulaires, ce qui signifie que l’activité de l’OTC peut être régulée par le statut
métabolique de la cellule.

La fonctionnalité de l’OTC est régulièrement altérée par plusieurs AAs structurellement

proches de l’ORN (Tableau 2). Cette inhibition par les AAs est d’ailleurs toujours compétitive

25
(Lusty et al., 1979). Parmi eux, la L-norvaline semble le plus efficace avec un Ki=71µM (Lusty
et al., 1979). Aussi, l’OTC peut être inhibée assez efficacement par le L-α-aminobutyrate et la
L-leucine (LEU) puis dans une moindre mesure par d’autres AAs comme la L-isoleucine ou la
L-valine.

Tableau 2. Constantes d'inhibitions des substrats de l'OTC dans le foie de rats (D'après Lusty et al.,
1979)

AAs inhibiteurs Ki (mM)

L-Norvaline 0,071
L-α-Aminobutyrate 0,58
L-Leucine 1,20
L-Isoleucine 10,5
L-Valine 12,5
L-Histidine 40
L-Methionine ≈ 50
L-Glutamine ≈ 50
L-Lysine NA
Pi 0,25

La L-norvaline est l’isomère linéaire de la Valine, et non protéinogène. Sa fixation sur le site
actif de l’OTC est forte lorsque le complexe binaire est formé par l’OTC et le CP. Il faut noter
que la fixation de l’ORN sur le complexe binaire OTC-CP est grandement favorisée et la liaison
d’autant plus forte lorsque le complexe binaire est formé par l’OTC et le phosphate
uniquement. Aussi, la formation du complexe OTC-CP est réversible et la présence de L-
norvaline diminue la constante de dissociation du CP à l’OTC (Marshall et Cohen, 1972).
De plus, Marshall et Cohen (Marshall et Cohen, 1972), ont montré que la LYS inhibait l’activité
de l’OTC, néanmoins, le Ki de cet AA n’a pu être établi car sa constante d’inhibition n’est pas
linéaire.
Plus tard, plusieurs acides carboxyliques (concentration testée 10 mM), nucléotides, ainsi que
des cofacteurs ont été testés pour évaluer leur pouvoir régulateur. Parmi eux, seul le Pi semble
inhiber la réaction ; néanmoins, c’est aussi un des produits de la réaction catalysée par l’OTC
(Lusty et al., 1979).

26
Des études sur l’OTC chez le mammifère montrent que l’enzyme n’est pas régulée de manière
allostérique. Les molécules inhibitrices se fixent directement sur le site actif en compétition
avec l’ORN mais n’induisent pas de changement conformationnel de l’enzyme. Ces
observations appuient le fait que l’activité de l’enzyme est principalement régulée par les
concentrations intra-mitochondriales de CP et d’ORN.

1.7. Mutations de l’OTC et conséquences

1.7.1. Mutations hépatiques

L’ensemble des mutations recensées actuellement pour le gène de l’OTC affecte le système
hépatique et plus spécifiquement le cycle de l’urée. Les déficiences en OTC (OTCd) sont des
erreurs innées du métabolisme et représentent environ 50% des troubles héréditaires du cycle
de l’urée conduisant à une hyperammoniémie engendrant, sans prise en charge
thérapeutique, une nuerotoxicité (Brusilow et Horwich, 2001 ; Seminara et al., 2010). Ces
déficiences ont été recensées et ont fait l’objet de nombreuses publications (Tuchman, 1993 ;
Tuchman et Plante, 1995 ; Tuchman et al., 2002 ; Yamagushi et al., 2006). La plus récente est
celle de Caldovic et al. (Caldovic et al., 2015), qui référence 417 mutations symptomatiques et
qui estime la prévalence de ces anomalies à 1/62000 - 77000. Cette déficience est liée au
chromosome X et donc, la manifestation des symptômes chez des patients OTCd est très
variable suivant le sexe de l’individu. Les femmes hétérozygotes ainsi que les hommes avec
une anomalie partielle peuvent déclarer des symptômes tardifs à l’âge adulte (McCullough et
al., 2000). Chez ces individus, les mutations peuvent être asymptomatiques ou bien
accompagnées de symptômes dont la gravité est variable. La plupart des patients OTCd sont
des hommes hémizygotes et seulement 20% des femmes porteuses d’une anomalie déclarent
des symptomes (Maestri et al., 1996 ; Maestri et al., 1998). Les symptômes résultant d’une
OTCd sont liés aux effets toxiques de l’excès d’ammoniac, ils se traduisent par des
vomissements chroniques, des altérations neurologiques et comportementales, des signes
cliniques simulant ceux observés dans le syndrome de Reye (Glasgow et Middleton et al.,
2001 ; case report, Yokoi et al., 1981 ; Mizogushi et al., 1990). Les cas les plus sévères peuvent
aller jusqu’au coma hyperammoniémique, l’œdème cérébral ou encore la mort de l’individu.

27
De plus, l’excès d’ammoniac plasmatique est couplé à d’autres modifications biochimiques
telles qu’une élévation de la concentration plasmatique en GLN et une hypocitrullinémie
(Yamagushi et al., 2006). L’excrétion urinaire élevée d’acide orotique permet la distinction
entre les patients OTCd et les autres troubles du cycle de l’urée (Yamagushi et al., 2006). Une
déficience complète s’exprime souvent par un coma hyperammoniémique sévère dans les
premières semaines de vie avec un retard de croissance aigu entrainant la mort de l’individu
(Hudak et al., 1985 ; McCullough et al., 2000). Aucune étude actuelle n’a encore relatée de
conséquences majeures de ces mutations sur le métabolisme intestinal de l’OTC.

1.7.2. Diagnostique et traitements

Actuellement, le diagnostic principalement utilisé pour la détection de l’OTCd se fait par

séquençage d’ADN, permettant de mettre en évidence les anomalies symptomatiques et
asymptomatiques de manière non invasives (caldovic et al., 2015). D’autres techniques
comme le dosage enzymatique sur des biopsies de foie ou le dosage d’acide orotique dans les
urines après ingestion de protéines (1 g/kg) sont utilisées (Tuchman et al., 2002).

Les thérapies actuelles sont basées sur des restrictions alimentaires protéiques associées à
des thérapies médicamenteuses permettant une clairance azotée. Généralement, ces patients
consomment de la CIT et/ou de l’ARG pour lutter contre l’hyperammoniémie. Mais à ce jour,
il n’existe pas de consensus pour savoir quelle approche est la plus pertinente pour ces
patients. Cependant, ces thérapies ne préviennent pas des crises hyperammoniémiques. Dans
les cas les plus sévères la greffe de foie peut être utilisée comme thérapie (Bryson et al., 2017).
Récemment une équipe s’est intéressée à la thérapie génique comme traitement de l’OTCd
par l’utilisation de vecteurs recombinant basés sur un virus adéno-associés de sérotype 8
(AAV8). Cette technique a été testée chez des souris Spfash, permettant de restaurer en partie
l’activité hépatique de l’OTC et diminuant l’excrétion d’acide orotique (Wang et al., 2012).
Wang et al., (Wang et al., 2017), montrent chez un modèle de souris KO pour le gène de l’OTC
que la mise en place de cette thérapie de manière précoce limite l’atteinte hépatique due à la
déficience (fibrose et cirrhose). Un essai clinique de phase 1 est d’ailleurs en cours afin
d’évaluer la tolérance et l’efficacité du vecteur AAV8 LDLR (NCT02651675) (Bryson et al.,
2017). Un second essai clinique est également en cours afin d’évaluer la tolérance de l’ARNm

28
MRT5201 (NCT03767270), encodant une OTC complète et fonctionnelle (Clinicaltrials.gov,
2019).

Physiologiquement, l’OTC est l’enzyme clé permettant la production de CIT intestinal à partir
d’ORN. Sa fonctionnalité est indispensable à la synthèse de CIT, et donc, cette enzyme à une
importance majeur dans le maintien de l’homéostasie de la CIT au niveau de l’organisme
entier.

Points essentiels

 Le gène de l’OTC se situe sur le chromosome X.

 Cette enzyme possède deux régions fonctionnelles, le site de liaison au CP codé par
l’exon 3, le site de liaison à l’ORN codé par l’exon 9.
 L’OTC mature est une enzyme mitochondriale.
 Son activité est notable dans le foie et l’intestin grêle. Dans le foie elle est intégrée
à un cycle métabolique fermé : le cycle de l’urée. Dans l’intestin, elle permet la
production de CIT biodisponible.
 La réaction catalysée par l’OTC se fait de manière séquentielle. L’enzyme se lie à son
1er substrat (CP), puis à son 2ème substrat (ORN). La libération des produits se fait de
la même manière (CIT puis Pi).

29
2. Métabolisme de la L-citrulline (CIT)

2.1. Propriétés générales

La CIT (C6H3N3O3) est un AA non protéinogène (Curis et al., 2005) (Figure 4). Dans
l’alimentation, elle a été identifiée chez plusieurs cucurbitacés, néanmoins, elle n’est
présente, en quantité importante, (de 0,7 à 3,6 mg/g de fruit frais) que dans la pastèque où
elle y joue un rôle d’antioxydant et de résistance au stress hydrique (Akashi et al., 2001). Dans
l’organisme humain, la concentration en CIT au niveau plasmatique est d’environ 40 µM dans
la population caucasienne (Curis et al., 2007). Néanmoins, des différences dans l’héritage
génétique inter-populationnelle et les habitudes alimentaires semblent faire varier ce taux.
En effet, la concentration plasmatique en CIT est deux fois moins élevée pour les populations
asiatiques (Jianfeng et al., 2005).

Figure 4. Formule topologique de la citrulline

2.2. Transport de la CIT

2.2.1. Transport intercellulaire

Il a été montré in vitro, dans plusieurs types cellulaires tumoraux que la CIT interagissait avec
le système de transport transmembranaire L (Vadgama et al., 1985). Plus tardivement, Bahri
et al. (Bahri et al., 2008), ont montré dans des cellules entérocytaires Caco-2 que le transport
de la CIT s’effectue par des transports Na+-dépendant et Na+-indépendant qui représentent
environ 2/3 du transport transmembranaire. La CIT utilise en majorité 2 systèmes de
transport, le système L et b0+ (Na+-indépendant) et B0+ (Na+-dépendant). Le fait que la lignée
Caco-2 ne produit pas de mucus pourrait cependant limiter ce champ d’exploration du
transport transmembranaire. Une étude portant sur des muscles lisses aortiques isolés de rat

30
a mis en évidence un autre système de transport de faible affinité semblable au transport de
type L (non détaillé dans l’étude) (Wileman et al., 2003). Dans ce type cellulaire, le transport
de la CIT semble être saturable, pH-indépendant partiellement Na+ dépendant, et non altéré
par l’état inflammatoire cellulaire. Ceci est en accord avec des résultats préalablement mis en
évidence dans une étude sur des macrophages (Baydoun et al., 1994). Le fait que la CIT utilise
un panel de transporteurs plus large que la ARG pourrait expliquer sa meilleure
biodisponibilité dans l’organisme, et ceci sans effets secondaires, même à haute dose (cf
partie 2.7.1) (Moinard et al., 2008 ; Cynober et al., 2007). Ces caractéristiques de transport
ont été retrouvées dans des cultures in vitro de tubules rénaux proximaux, précisant que le
transport de la CIT utilisait aussi les transporteurs des AAs cationiques et neutres (Mitsuoka
et al., 2009 ; Devés et al., revue, 1998). Elles ont de même été mises en évidence dans une
lignée de cellules endothéliales cérébrales (Lee et Kang, 2017), de cellules endothéliales
aortiques bovine en culture (Hilderman et al., 2000) ainsi que dans des cultures primaires
neuronales de rat (Schmidlin et al., 2000).

2.2.2. Transport intracellulaire

Dans la cellule, le transport de la CIT à travers la membrane mitochondriale a été étudié dans
le cycle de l’urée. Une étude sur des mitochondries hépatiques isolées de rat montre que son
transport transmembranaire semble se faire dans les deux sens, sans besoin d’énergie, soit de
manière passive (Gamble et al., 1973). Ce système nécessite donc la mise en jeu des substrats
spécifiques. En 1997, sur le même modèle d’étude, Indiveri et al., (Indiveri et al., 1997) ont
mis en évidence la présence d’un antiport ORN/CIT dont l’activité s’accompagne d’un transfert
d’ions H+ dans le même sens que celui de la CIT permettant un échange électroniquement
neutre. Ces données sont confirmées par la mise en évidence de transporteurs ORC (ornithine
carrier) 1 et ORC 2 dans le cycle de l’urée (Fiermonte et al., 2000 ; Indiveri et al., 2001).

31
 2.3. Synthèse

La production de CIT met en jeu 3 enzymes dont la distribution tissulaire permet de distinguer
les 3 voies métaboliques mettant en jeu la CIT, dans le foie, l’intestin et le rein.
L’argininosuccinate synthase (ASS) permet de transformer la CIT en argininosuccinate, tandis
que l’OTC et la NO synthase (NOS) permettent la production de CIT. La CIT permet la synthèse
de novo d’arginine et donc augmente le pool de cette dernière, améliorant ainsi sa
biodisponibilité pour l’organisme (Wakabayashi et al., 2004 ; Curis et al., 2005).

2.3.1. Synthèse de la CIT par l’OTC

La synthèse de CIT par l’OTC est décrite ci-avant (cf partie 1.4)

2.3.2. Synthèse de la CIT par les nitric oxide synthase (NOS)

Les NOS sont omniprésentes dans l’organisme et sont regroupées en trois isoformes dont
l’expression, la régulation et la localisation diffèrent. La nNOS (ou NOS-1), est située
principalement dans les cellules neuronales et la eNOS (ou NOS-3) dans les cellules
endothéliales, ces deux formes de NOS étant constitutives. La iNOS (ou NOS-2) est, quant-à
elle, inductible et se retrouve dans la plupart des cellules nuclées de l’organisme (Zhou et al.,
revue, 2009). Elle est activée en réponse à une infection par les endotoxines (ex.
lipopolysaccharides) ou les cytokines (ex. Tumor Necrosis Factor α (TNFα), Interleukines (IL),
Interferon γ (INFγ)) et donc, se retrouve notamment dans les cellules du système immunitaire
telles que les macrophages. Ces 3 isoformes partagent le même mécanisme de production de

NO et de CIT à partir d’ARG, selon la réaction d’oxydation suivante :


𝐴𝑅𝐺 + 𝑂2 → NO + CIT

Les NOS synthases étant des protéines hémiques, leur activité requière une consommation de
NADPH ainsi que la présence de FMN (flavine mononucléotide), FAD (flavine adénine
dinucléotide) et BH4 (tétrahydrobioptérine) en tant que cofacteurs (Futuko et Chaudhuri,
1995). Néanmoins, la production de CIT par les NOS ne constitue pas une source assez
importante pour augmenter la biodisponibilité de la CIT dans l’organisme. Cependant, sa

32
production est de l’ordre de 1% (Lirk et al., 2002 ; Kone et al., 2004) et ne joue pas un rôle
majeur dans le carrefour ARG- CIT-ARG au niveau du corps entier.

2.3.3. Catalyse de la CIT par l’agininosuccinate synthase (ASS)

L’ASS est une enzyme cytosolique ubiquitaire mais son activité est considérable uniquement
dans le foie et les reins alors qu’elle est négligeable dans l’intestin. La régulation de son activité
est connue au niveau post-transcriptionnel et est modulée par les nutriments, les hormones,
les endotoxines et les cytokines pro-inflammatoire (Husson et al., revue, 2003). L’ASS catalyse
la réaction suivante :

𝐶𝐼𝑇 + 𝐴𝑠𝑝𝑎𝑟𝑡𝑎𝑡𝑒 + 𝐴𝑇𝑃 → 𝐴𝑟𝑔𝑖𝑛𝑖𝑛𝑜𝑠𝑢𝑐𝑐𝑖𝑛𝑎𝑡𝑒 + 𝑝𝑦𝑟𝑜𝑝ℎ𝑜𝑠𝑝ℎ𝑎𝑡𝑒 + 𝐴𝑀𝑃

Son activité est directement liée à celle de l’ASL, dont la répartition tissulaire est semblable à
celle de l’ASS. Elle permet la production d’ARG de novo à partir du L-Argininosuccinate produit
à partir de la CIT selon la réaction suivante :

𝐴𝑟𝑔𝑖𝑛𝑖𝑛𝑜𝑠𝑢𝑐𝑐𝑖𝑛𝑎𝑡𝑒 → 𝐴𝑅𝐺 + 𝐹𝑢𝑚𝑎𝑟𝑎𝑡𝑒

2.4. Métabolisme tissulaire

2.4.1. Métabolisme hépatique de la CIT

Le cycle de l’urée, qui a lieu principalement dans le foie, est un mécanisme qui permet
l’élimination des AAs excédentaires afin d’éviter une potentielle neurotoxicité. En effet,
l’organisme met en place un système de régulation au niveau du foie afin de contrôler
l’homéostasie azotée, tant sur le plan qualitatif que quantitatif, en fonction des besoins de
l’organisme. En effet, en situation post-absorptive ou de jeûne, le foie est le lieu de synthèse
de la majeure partie des protéines circulantes (Elwyn et al., 1968) : il utilise les AAs pour la
néoglucogenèse (Jungerman et kietzmann, 1996). En revanche, à l’état post-prandial, le foie
capte 50% des AAs issus de la digestion (l’étape d’absorption intestinale n’étant pas limitante).
Parmi ce flux d’AAs, l’ARG agit comme l’AA signal du niveau d’apport protéique. En effet, l’ARG
intestinale va être acheminée au niveau hépatique où elle stimule l’uréogenèse et donc la

33
dégradation des AAs excédentaires et sa propre dégradation. Le foie est donc un organe
majeur dans la régulation physiologique de l’homéostasie protéino-énergétique (Schimke,
1962).

Concrètement, le cycle de l’urée s’établit suivant une phase mitochondriale et une phase
cytosolique (Figure 5). La phase cytosolique étant permise par l’action de 3 enzymes :
l'argininosuccinate synthase (ASS), l'argininosuccinate lyase (ASL) et l'arginase, la phase
mitochondriale étant permise par l’action de la Carbamoyl-phosphate synthase I (CPS I) et de
l’OTC.
Les deux premières étapes du cycle de l’urée prennent place dans la matrice mitochondriale.
L'étape initiale de l’uréogenèse catalyse la formation de CP à partir de l’hydrolyse du N-acétyl-
glutamate, de l’ATP et du CO2 grâce à la CPS1.

𝐴𝑇𝑃 + 𝐶𝑂2 + 𝑁𝐻3 → 𝐶𝑃 + 2 𝐴𝐷𝑃 + 𝑃𝑖

Ensuite, le radical –carbamyl est transféré sur l’ORN grâce à l’OTC pour former la CIT.

𝐶𝑃 + 𝑂𝑅𝑁 → 𝐶𝐼𝑇 + 𝑃𝑖

Les trois phases suivantes du cycle s’effectuent dans le cytosol de la cellule.

En présence d’ATP et de L-aspartate, la citrulline se condense sous l’action de l’ASS pour
former l’argininosuccinate qui est lui-même clivé en ARG + fumarate sous l’action de l’ASL.

𝐶𝐼𝑇 + 𝐿 − 𝑎𝑠𝑝𝑎𝑟𝑡𝑎𝑡𝑒 + 𝐴𝑇𝑃 → 𝑎𝑟𝑔𝑖𝑛𝑖𝑛𝑜𝑠𝑢𝑐𝑐𝑖𝑛𝑎𝑡𝑒 + 𝐴𝑀𝑃 + 𝑃𝑃𝑖

𝑎𝑟𝑔𝑖𝑛𝑖𝑛𝑜𝑠𝑢𝑐𝑐𝑖𝑛𝑎𝑡𝑒 → 𝐴𝑅𝐺 + 𝑓𝑢𝑚𝑎𝑟𝑎𝑡𝑒

L’ARG formée est alors clivée en urée + ornithine sous l’action de l’arginase.

𝐴𝑅𝐺 → 𝑢𝑟é𝑒 + 𝑂𝑅𝑁

Le cycle de l’urée, en tant que système majeur dans la régulation de l’homéostasie azotée, est
très finement régulé : Il est activé en cas d’excès d’AAs circulants, et inhibé en situation de
déficience en AAs. En effet, comme expliqué précédemment, l’ARG est capable d’activer le
cycle de l’urée en activant les N-acétylglutamate synthétase (NAGS). Le N-acétylglutamate
ainsi synthétisé va lui-même activer la CPS1, enzyme limitante du cycle de l’urée, et donc
accélérer le cycle de l’urée permettant une dégradation du surplus d’AAs (Hall et al., 1958 ;

34
Shigesada et al., 1978). En revanche, dans le cas d’un apport protéique faible, le flux portal
des AAs doit être limité, c’est-à-dire que l’uréogenèse doit être diminuée afin de préserver un
métabolisme protéique compatible avec la vie. Dans ce cas, l’ARG intestinale, via l’arginase,
est transformée en ornithine, précurseur de la CIT.

Figure 5. Cycle de l'Urée

(ARG : arginine ; ARGase : arginase ; ASL : argininosuccinate lyase ; ASS : argininosuccinate synthase ;
CPS1 : carbamoylphosphate synthétase 1 ; OTC : ornithine transcarbamylase)

L’ensemble de la CIT produite au cours de ce cycle est entièrement transformé en

argininosuccinate par l’argininosuccinate synthétase. En effet, la CIT est un pool localisé au
niveau hépatocytaire et il est non échangeable avec le reste de l’organisme. (Windmueller et
Spaeth, 1981 ; Jourdan et al., 2013).

35
 2.4.2. Métabolisme intestinal de la CIT

2.4.2.1. Synthèse intestinale de la CIT

Le rôle de la CIT en tant qu’intermédiaire dans le cycle de l’urée est connu depuis longtemps.
En revanche, la découverte de son métabolisme au niveau corps-entier est beaucoup plus
récente.

Le métabolisme de la citrulline au niveau intestinal s’effectue spécifiquement dans l’intestin

grêle et est localisé dans l’entérocyte, cellule composant 95% des villosités intestinales et
spécialisée dans le transfert des molécules provenant du bolus alimentaire depuis la lumière
intestinale jusque dans le milieu intérieur (Gardner et al., 1988).

Afin de maintenir l’intégrité tissulaire, l’intestin, et plus largement l’aire splanchnique, utilise
de façon non négligeable les AAs provenant de l’alimentation (Darmaun et Mauras, 2005). En
effet, le renouvellement de la muqueuse intestinale est très rapide, montrant un taux de
synthèse protéique variant de 30 à 80% par jour chez l’Homme en fonction de la fraction du
tractus intestinal considérée (Bouteloup-Demange et al., 1998 ; Nakshabendi et al., 1999). De
ce fait, il utilise une partie des AAs alimentaires pour son métabolisme et sa production
protéique.

Aussi, Windmueller et Spaeth (Windmueller et Spaeth, 1974 ; Windmueller et Spaeth, 1975),

ont montré l’importance du rôle de l’entérocyte dans la production de certains AAs (ARG, GLN,
CIT) sur des segments de jéjunum de rat isolés et perfusés. En 1981, ils mettent en évidence
que la CIT est largement produite par l’intestin. En effet, la CIT est synthétisée dans la
muqueuse des entérocytes intestinaux de manière endogène à partir de la GLN et de l’ARG
issus du bolus alimentaire (Windmueller et Spaeth, 1981 ; Blachier et al., 1991). Dans
l’entérocyte, la GLN est partie intégrante de plusieurs métabolismes, néanmoins, une partie
de celle-ci est hydrolysée en L-glutamate et ammoniac via la glutaminase (GLNase).
L’ammoniac va participer à la synthèse de CP tandis que le glutamate subit 2 réactions
successives de la pyrroline-5-carboxylate synthase et de l’OAT induisant la production
d’ornithine (Windmueller et Spaeth, 1975, 1976). Aussi, une partie d’ARG (environ 40%) est
catabolisée en ORN par l’ARGase (Castillo et al., 1993). L’ORN formée à partir de GLN ou d’ARG
est ensuite catabolysée en CIT par l’OTC dans la mitochondrie des cellules entérocytaires. Le

36
précurseur principal entre l’ARG et la GLN dans la production de CIT reste encore discuté
aujourd’hui (Lightart et al., 2011 ; Marini et al., 2012). De plus, Wu et al. (Wu et al., 1997), ont
montré dans des entérocytes de porcelet, que l’ORN provenait aussi de la L-proline subissant
2 réactions successives de la pyroline oxydase et de l’OAT. Ces données ont été confirmées
plus récemment chez l’Homme sain (Tomlinson et al., 2011).

La CIT produite par cette réaction ne peut être utilisée in situ car l’expression de l’ASS et ASL
est quasi inexistante au niveau intestinal (Husson et al., 2003). La CIT est donc libérée dans la
circulation portale et échappe à la captation hépatique (Windmueller et Spaeth, 1982 ;
Cynober et al., 1994) pour être captée de façon préférentielle par le rein. En revanche, cette
particularité métabolique spécifique de l’entérocyte n’est pas retrouvée dans les lignées
entérocytaires (type Caco-2). En effet, elles expriment bien l’ASS et l’ASL mais pas l’OTC
(Ventura et al., 2011).

2.4.2.2. Enzymes associées au métabolisme de la CIT

L’arginase (ARGase)

Il existe deux types d’ARGase. L’ARGase I hépatique, que nous ne détaillerons pas ici et
l’ARGase II mitochondriale, dont le rôle est de fournir l’ORN pour la synthèse de CIT dans
l’intestin (Morris et al., 2006). La réaction catalysée est la suivante :

𝐴𝑅𝐺 → 𝑂𝑅𝑁 + 𝑈𝑟é𝑒

Une étude portant sur l’expression génique de l’ARGase II a mis en évidence une présence
plus abondante de l’enzyme au niveau du jéjunum que dans les autres sections intestinales
(Ozaki et al., 1999). Aussi, ces auteurs ont montré que la régulation de l’ARGase II était
différente suivant l’organe étudié. Dans l’intestin, l’activité de l’ARGase II est stimulée par des
régimes hyperprotéiques de façon à dégrader l’ARG en excès (O’Sullivan et al., 2000 ; Mouillé
et al., 2004) et les glucocorticoïdes (Flynn et al., 1999).

La glutaminase (GLNase)

Tout comme l’ARGase, il existe deux isoenzymes de la GLNase. L’activité de la GLNase II étant
négligeable dans le métabolisme de la GLN, nous ne la détaillerons pas ici. La GLNase I est

37
retrouvée au niveau des reins et de l’intestin (Curthoys et al., 1995). Une étude sur des
biopsies humaines dans différents tissus a montré que la GLNase I était active dans l’intestin
grêle mais pas dans l’estomac et le gros intestin (James et al., 1998), où elle catalyse la réaction
suivante :

𝐺𝐿𝑁 → 𝐿 − 𝐺𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑒 + 𝑎𝑚𝑚𝑜𝑛𝑖𝑎𝑐

Le L-Glutamate (GLU) produit est un précurseur de l’ORN elle-même, précurseur de la CIT.

Dans l’intestin, une étude in vitro sur une lignée cellulaire intestinale (CaCo2) a montré que
l’activité de la GLNase était stimulée par les glucocorticoïdes (Sarantos et al., 1994). A
l’inverse, une hypoxie partielle induite par ischémie/reperfusion in vivo, induit une diminution
de l’activité de cette enzyme (Blennerhassett et al., 1998).

L’Ornithine aminotransférase (OAT)

L’OAT est une δ-aminotransférase utilisant un mécanisme de type ping-pong pour la réaction
qu’elle catalyse. C’est une enzyme ubiquitaire qui se trouve principalement dans le foie,
l’intestin, et le rein (Herzfeld et al., 1968), et qui est localisée dans la matrice mitochondriale
(Levillain et al., 2004). Dans l’intestin elle catalyse la réaction suivante :

𝑃5𝐶 + 𝐺𝐿𝑈 → 𝑂𝑅𝑁 + 𝛼 − 𝑐é𝑡𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑡𝑒

En effet, l’intestin est le seul organe à avoir une activité accrue de l-Δ1-Pyrroline-5-carboxylate
(P5C) synthétase, permettant la production de P5C à partir de GLU (Wakabayashi et al., 1991).
Dans l’intestin, un travail in vivo a montré qu’un régime hypoprotéique (5% caséine) pendant
1 à 4 semaines induisait une augmentation de l’activation de l’enzyme (Matsuzawa et al.,
1994). Ces résultats sont confirmés par le travail in vivo de Ventura et al. (Ventura et al., 2011),
chez le rat soumis à un régime hypoprotéique (10%) pendant 15 jours.

2.4.3. Métabolisme rénal de la CIT

Le rein est un médiateur clé dans les relations inter-organes permettant la régulation du flux
d’AAs. En effet, en plus du maintien de l’équilibre acido-basique et du flux d’électrolytes, il
participe au maintien de l’équilibre protéino-énergétique. En situation post-prandiale, il
permet l’excrétion d’urée provenant du métabolisme hépatique des AAs. En situation post-
absorptive, il permet la synthèse de novo d’ARG à partir de la CIT intestinale. En effet, la CIT,
qui n’est ni métabolisée dans l’intestin ni captée par le foie (Windmueller et al., 1982), est

38
libérée dans la circulation systémique puis captée par le rein qui possède les enzymes ASS et
ASL nécessaires à la production de ARG de novo (Van De Poll et al., review, 2004 ; Wu et al.,
2009).

2.5. Relation inter-organes

La communication inter-organe impliquée dans le turnover de la CIT est mise en évidence pour
la première fois en 1981 par Windmueller et Spaeth (Figure 6). Au préalable, ils avaient
démontré que l’ARG et la GLN étaient les deux sources principales permettant la production
intestinale de CIT (Windmueller et Spaeth, 1974, 1976). Le rein constitue l’organe majeur
métabolisant la CIT. En effet, 83% de la CIT libérée par l’intestin est recaptée par le rein et la
libération d’ARG issue de la CIT correspond à environ 75% de la CIT importée (Windmueller et
Spaeth, 1981).

Figure 6. Métabolisme inter-organes ARG– CIT – ARG (D’après Breuillard et al, 2015)
P5C l-Δ1-Pyrroline-5-carboxylate, OAT ornithine aminotransferase, OCT ornithine
carbamoyltransferase, ASS argininosuccinate synthetase, ASL argininosuccinatelyase

39
Cette relation intestin-rein est indispensable à la formation d’ARG de novo. En effet, ces deux
organes possèdent des enzymes complémentaires, ainsi la synthèse de CIT est permise dans
l’intestin, tandis que le rein catalyse son catabolisme en ARG sous l’action des enzymes ASS et
ASL (Husson et al., 1987 ; Curis et al., 2005). En condition physiologique, la production d’ARG
par le rein est proportionnelle au taux de CIT circulante suggérant ainsi que la concentration
plasmatique en CIT régule la production rénale de ARG (Dhanakoti et al., 1990). Aussi 60% de
l’ARG de novo circulante provient d’une synthèse rénale (ce pourcentage représente 10 à 15%
de la concentration totale d’ARG circulante). Une étude des tubes contournés proximaux a
montré que la réabsorption de CIT était unidirectionnelle et saturable (Dhanakoti et al., 1992).
D’ailleurs, les patients atteints d’insuffisance rénale sont caractérisés par une
hypercitrullinémie (4 à 5 fois supérieure à celle d’une personne saine) sans que les taux d’ARG
ne soient modifiés. Inversement, une insuffisance intestinale conduit à une hypocitrullinémie
(Lau et al., 2000 ; Tizianello et al., 1980).
Enfin, Morimoto et al., 1990, ont mis en évidence une augmentation de la production de CIT
intestinale lorsque les apports protéiques sont faibles. Ce résultat suggère donc une
implication du métabolisme de la CIT et donc de l’OTC dans la régulation protéino-
énergétique. Plus particulièrement, la disponibilité en AAs alimentaires semble déterminer la
quantité de CIT produite par l’intestin. En effet, en condition post-absorptive ou d’apports
protéiques faibles, l’ARG est métabolisée en CIT qui est libérée dans la circulation systémique.
Elle permet, par son métabolisme rénal, de couvrir les besoins en ARG de l’organisme.
Le métabolisme de l’ARG et de la CIT étant intrinsèquement liés l’un à l’autre, Hoogenraad et
al. (Hoogenraad et al., 1985), propose de spécifier le rôle physiologique de la CIT. Il
complémente l’eau de boisson de ratons avec une molécule de synthèse inhibant l’activité de
l’OTC, le delta-N-phosphonacetyl-L-ornithine (PALO) couplé à un régime alimentaire dépourvu
en ARG. Ceci induit une diminution des taux plasmatiques d’ARG et de CIT, un fort retard de
croissance ainsi qu’une augmentation du taux de mortalité. Dans une deuxième série
d’expériences, l’alimentation de ces animaux est complémentée soit en ARG, soit en CIT. Cette
complémentation en ARG permettait de restaurer partiellement les concentrations d’ARG
circulants et de palier partiellement au retard de croissance. Cependant, une
complémentation en CIT permettait de restaurer ces paramètres en totalité. Ce travail
souligne l’importance de cet axe ARG-CIT-ARG entre l’intestin et le rein. Néanmoins, il faut

40
noter que ce travail comporte une limite puisque le PALO induit une inhibition de l’OTC
intestinale mais aussi hépatique conduisant à une altération du cycle de l’urée dont le
fonctionnement est vital pour la survie de l’organisme. Ceci limite l’impact des résultats
obtenus.

2.6. Marqueurs de la fonctionnalité rénale et intestinale

2.6.1. Marqueur de la fonctionnalité rénale

Comme évoqué précédemment, la CIT est métabolisée au niveau rénal, et pourrait donc faire
un bon et simple marqueur de la fonctionnalité rénale. Levillain et al., (Levillain et al., 1997),
ont montré chez des rats ayant subi une néphrectomie (10 à 90%) que la concentration
plasmatique en CIT augmentait proportionnellement au pourcentage de résection rénale. De
manière plus intéressante, une altération de la citrullinémie est visible dès lors que la
néphrectomie atteint 10 à 33% sans modification des taux d’urémie et créatinémie
habituellement utilisés comme marqueurs de la dysfonction rénale. Cependant, si ce concept
a bien été validé expérimentalement, il ne l’est pas cliniquement.

2.6.2. Marqueur de la fonctionnalité intestinale

L’intestin grêle est le site principal de la synthèse de CIT et la source majeure de CIT circulante.
Sachant cela, il est raisonnable d’avoir proposé qu’une altération de la fonction intestinale
s’accompagne d’une diminution de la concentration plasmatique en CIT. Crenn et al. (Crenn
et al., 2000), ont confirmé cette hypothèse en montrant, chez des personnes atteintes du
syndrome du grêle court, que la concentration en CIT était proportionnelle à la longueur de
l’intestin. Ainsi, ils ont mis en évidence une relation directe entre la concentration plasmatique
en CIT et la masse entérocytaire fonctionnelle (Figure 7).

41
Figure 7. Degré de corrélation entre la concentration plasmatique en CIT et la longueur résiduelle de
l'intestin grêle (D’après Crenn et al., 2000).
(Equation de régression linéaire : CIT plasmatique (μmol/L) = 0,23 x taille intestin grêle (cm) + 5,68
(μmol/L. ●, patients avec défaillance intestinale permanente ; ○, patients avec défaillance intestinale
transitoire)

Ensuite, le concept a été étendu à des patients atteints de maladie cœliaque (malabsorption
intestinale variable en fonction de l’étendue des lésions de la muqueuse intestinale) avec plus
ou moins d’atrophies villositaires, la concentration plasmatique en CIT est corrélée avec
l’étendue de la défaillance intestinale. Ainsi, les patients atteints d’atrophies villositaires ont
une citrullinémie quasiment 2 fois plus faible que des sujets sains (24±13 µmol/L vs 40±10
µmol/L). De ce fait, la CIT peut être utilisée comme marqueur de la réduction de la masse
entérocytaire dans le cas de pathologies intestinales (Crenn et al., 2003). De plus, cette étude
a permis d’établir une valeur seuil de citrullinémie d’environ 20 µmol/L pour distinguer une
atteinte villositaire totale d’une atteinte villositaire partielle.
Aussi, la concentration en CIT semble être un paramètre plus sensible que certains paramètres
morphologiques (ex : renouvellement cellulaire) dans la détection d’une déficience intestinale
(Lutgens et al., 2003). Une étude chez des patients en unité de soins intensifs a montré une
diminution de la concentration plasmatique en CIT associée à une augmentation de la CRP et
du taux de mortalité (Piton et al., 2010). En effet, ces patients sont associés à une ischémie
partielle induisant une nécrose précoce des villi (Fiddian-Green et al., 1988). Cette diminution
plasmatique en CIT est retrouvée dans des cas de sepsis (Kao et al., 2009 ; Luiking et al., 2009 ;
Shen et al., 2015). Aussi, la chimiothérapie et la radiothérapie utilisées dans le traitement anti-

42
cancéreux engendrent une perte de l’intégrité entérocytaire ainsi qu’une inflammation
augmentant la perméabilité intestinale chez des patients sous traitement
immunosuppresseur, favorisant le développement de sepsis (Rubenstein et al., 2004).
L’utilisation de la CIT plasmatique en tant que biomarqueur dans ces situations a été mis en
évidence chez le rat, puis validée chez l’Homme sous radiothérapie (Lutgens et al., 2003,
Lutgens et al., 2004, Barzal et al., revue, 2014). Aussi, la CIT semble être un bon marqueur du
rejet cellulaire dans le cadre de transplantations intestinales, la CIT diminuant
proportionnellement à la sévérité du rejet (Pappas et al., 2001 ; Nadalin et al., 2007). En
conclusion, il apparait que la CIT plasmatique semble être un des meilleurs marqueurs
disponible de la fonction intestinale.

Points essentiels

 La CIT est un AA non protéinogène.

 Sa concentration plasmatique dans la population caucasienne est d’environ 40 µM.
 La CIT hépatique constitue un pool non-échangeable avec le reste de l’organisme.
 La CIT biodisponible est largement produite par l’intestin. Sa production est localisée
dans l’entérocyte.
 Les enzymes associées à la production intestinale de CIT sont : l’ARGase, la GLNase
et l’OAT.
 Le rein constitue l’organe majeur métabolisant la CIT. Il permet la production d’ARG
de novo via les enzymes ASS et ASL.
 La concentration plasmatique en CIT est proportionnelle à la masse entérocytaire
active et constitue l’un des meilleurs marqueurs de la fonctionnalité intestinale.

43
 2.7. Métabolisme corps entier de la CIT

La CIT est impliquée dans plusieurs voies métaboliques et semble être un marqueur de choix
dans la prise en charge précoce d’atteintes intestinale et rénale. Ainsi, cet AA pourrait être un
acteur important dans le fonctionnement du métabolisme global ainsi que pour la prise en
charge thérapeutique de certaines pathologies (Allerton et al., 2018) (Figure 8). Toutefois, il
convient en premier lieu de valider sa tolérance et ses caractéristiques pharmacocinétiques.

44
Figure 8. Métabolisme de la CIT au niveau de l'organisme entier (D’après Allerton et al., 2018)
La CIT est convertie en ARG de novo dans le rien sous l’action de l’ASS et de l’ASL. L’ARG stimule la
production de NO via l’activation de l’eNOS au niveau de l’endothélium vasculaire et induit une
vasodilatation. Dans le muscle, la CIT stimule la synthèse protéique musculaire via une action sur la
voie de signalisation mTORC1. Dans le tissu adipeux, la citrulline active la lipolyse ainsi que la β-
oxydation et augmente l’expression de UCP1. Dans les macrophages elle agit sur l’iNOS et augmente
la production de NO.

45
 2.7.1. Tolérance et caractéristiques pharmacocinétiques

L’évaluation de la tolérance et des paramètres pharmacodynamiques de la CIT est un

prérequis indispensable pour la mise en place d’études cliniques avec une complémentation
en CIT. Moinard et al. (Moinard et al., 2008), ont montré chez des volontaires sains
complémentés en CIT (2 g à 15 g) pendant 8h que la CIT était bien tolérée. Les volontaires
n’ont souffert ni de nausées, ni de diarrhées osmotiques ou d’autres effets secondaires
observés lors de complémentations en ARG ou ORN à haute dose (bolus > 10 g) (Grimble et
al., 2007), même avec des doses élevées de CIT (15 g) (Figure 9). Ces effets sont explicables
par la rapidité de la saturation de l’absorption de l’ORN et d’ARG lors de transfusion aiguë
(Grimble et al., 2007 ; Hellier et al., 1973). Ces observations supposent que l’absorption de la
CIT intestinale n’est pas limitante, d’où l’absence de troubles intestinaux. Au niveau rénal, la
perte urinaire de CIT est inférieure à 5%, même pour une forte concentration d’ingesta,
indiquant qu’une complémentation en CIT augmente sa biodisponibilité dans l’organisme
(Moinard et al., 2008). En effet, la concentration plasmatique en CIT augmente rapidement,
peu importe la quantité ingérée et sa clairance totale s’effectue en 5 à 8h avec une demi-vie
proportionnelle à la prise orale de CIT (Moinard et al., 2008).

46
Figure 9. Cinétique de la concentration plasmatique en CIT chez 8 sujets sains, après absorption orale
de (a) 2 g, (b) 5 g, (c) 10 g, (d) 15 g. (Moinard et al., 2008)

Il semblerait que l’étape limitante dans le métabolisme de la CIT se trouve au niveau rénal. En
effet, lors d’une prise orale importante de CIT (15 g), la quantité d’ARG plasmatique observée
n’est plus proportionnelle à la dose ingérée (contrairement à une ingestion de CIT < 15 g). Il
semblerait donc que 15 g de CIT soit la dose limitante lors de la prise orale. A cette dose, le
taux urinaire de ARG augmente et sa synthèse de novo est saturée (Moinard et al., 2008). Il
est intéressant de noter que cette complémentation en CIT n’affecte pas la concentration
plasmatique d’autres AAs (Moinard et al., 2008 ; Osowska et al., 2004). Aussi, chez des rats
ayant subi une résection intestinale massive, une complémentation en CIT semble restaurer
le pool de ARG circulant plus efficacement que ne le ferait une complémentation en ARG avec
une amélioration de la balance azotée (Osowska et al., 2004). De plus, une complémentation
chronique en CIT d’une semaine chez des adultes sains ne semble pas engendrer d’effets

47
secondaires et confirme les résultats observés lors d’une ingestion aiguë (Schwedhelm et al.,
2008 ; Thibault et al., 2011). Aussi la consommation de jus de pastèque pendant 3 semaines
chez des volontaires sains semble confirmer les observations pharmacocinétique citées ci-
avant (Collins et al., 2007).

2.7.2. CIT et dysfonction intestinale

Nous l’avons vu plus tôt, la CIT est reconnue comme l’un des meilleurs marqueurs de la
fonctionnalité intestinale. Ce concept a pu être validé dans plusieurs contextes d’atteintes
intestinales où le site majeur de la production de CIT est atteint. Néanmoins, la mise en place
d’une complémentation en CIT au cours de traitements lors d’une insuffisance intestinale
n’est que peu étudiée actuellement. Cependant certaines données scientifiques montrent que
la CIT pourrait être positive dans certains cas, comme le syndrôme du grèle court. Osowska et
al. (Osowska et al., 2004), ont étudié les conséquences d’une complémentation en CIT
(comparée à une complémentation en ARG) dans un modèle de grêle court, soit des rats
adultes ayant subi une résection intestinale de 80%. La forte diminution de la masse
intestinale active induisait une diminution des concentrations plasmatiques en CIT et ARG
ainsi qu’une perturbation de la balance azotée. Dans le groupe complémenté en CIT (1 g/kg/j),
la balance azotée était restaurée après 5j de complémentation (vs 7j dans le groupe
complémenté en ARG). De plus, la CIT permettait de restaurer les pools plasmatiques et
musculaires d’ARG de manière plus importante qu’une complémentation en ARG. Sur le
même modèle d’étude, la complémentation en ARG et CIT par voie parentérale a été étudiée.
Dans ces conditions, les bénéfices observés ci-avant lors d’une complémentation en CIT sont
différents de ceux observés par voir entérale (Osowska et al., 2008). Un récent travail a étudié
une complémentation orale en CIT (0,18 g/kg/j) pendant 7 jours chez des patients atteints du
syndrôme du grêle court (Jirka et al., 2019). Cette étude clinique confirme le fait que la CIT
augmente la biodisponibilité en ARG et CIT chez ces patients. Aussi, dans les cas où les patients
ont un état nutritionnel quasi-normal, une complémentation en CIT n’améliore pas
l’anabolisme protéique global de l’organisme. Cependant, dans les cas de dénutrition
importante avec une citrullinémie de base < 20 µM, une complémentation en CIT semble
améliorer le statut protéique global. Dans un modèle de rats soumis à une obstruction

48
intestinale, les auteurs ont montré qu’une complémentation en CIT permettait de préserver
l’épithélium intestinal, et donc diminuait la perméabilité intestinale et limitait la translocation
bactérienne (Batista et al., 2011). Ces données sont confirmées par une étude faite chez des
rats avec mucosite (complication courante des patients sous radiothérapie et chimiothérapie).
En effet, les auteurs ont montré qu’un pré-traitement avec de la CIT diminuait les dommages
morphologiques intestinaux et diminuait la perméabilité intestinale (Autunes et al., 2016). En
outre, les situations pathologiques d’occlusions intestinales et d’insuffisances vasculaires
entrainent au niveau de l’intestin des états d’ischémie/reperfusion pouvant conduire des
lésions ischémiques sévères (intestinal ischemic injury, i3). Lai et al., ont pu montrer que la CIT
(comparé à l’ARG et la GLN) améliorait de manière plus importante la quantité de masse
jéjunale active ainsi que le statut immunitaire en diminuant l’activité des NOS et la voie NFκB
(lai et al., 2017). De plus, outre les cas pathologiques, l’exercice physique intense induit une
hypoperfusion splanchnique induisant des troubles gastro-intestinaux, traduite par une
altération de la muqueuse intestinale. Dans ces cas, une complémentation en CIT en amont
de l’activité physique semble préserver les concentrations plasmatiques en CIT et ARG et donc
préserver la biodisponibilité de l’ARG et permettrait le maintien de la vascularisation
splanchnique (Van Wijck et al., 2014).

2.7.3. La CIT en tant que précurseur du NO

La CIT est connue pour être un précurseur dans le métabolisme du NO. Aussi il est établi que
ce dernier a une action modulatrice sur le système immunitaire par une action directe sur la
libération des cytokines pro et anti-inflammatoires. Breuillard et al, 2015, ont montré in vitro,
dans des macrophages issus de rats adultes diabétiques de type II (ZDF) qu’une
complémentation en CIT pendant 6h augmente la production de NO par les macrophages.
Ces effets ne sont cependant pas retrouvés dans des macrophages issus de rat âgés
complémentés en CIT (5 g/kg/jour pendant 5 jours) stimulés avec du LPS (lipopolysaccharide).
In vitro, la culture d’une lignée cellulaire lymphocytaire (Jukart) déplétée en ARG et
complémentée en CIT favorise la prolifération des lymphocytes et ainsi la captation de la CIT
par ces derniers et est associée à une augmentation de l’expression de l’ASS dans ces cellules
stimulant la fonction immunitaire (Bansal et al., 2004). Plus récemment, une étude a montré

49
que l’induction d’une infection myobactérienne pulmonaire chez la souris adulte augmente la
concentration pulmonaire en CIT (sans modification de sa concentration plasmatique),
parallèlement à une élévation de l’expression génique de l’iNOS et de l’ASS dans les cellules
myéloïdes. Parallèlement, dans un modèle innovant de souris dont la production d’ARG à
partir de la CIT est spécifiquement supprimée dans les cellules myéloïdes, ces mêmes auteurs
ont montré une élévation de la concentration de myobactéries pulmonaire (Lange et al.,
2019), mettant en évidence l’importance du système CIT/ARG dans le système immunitaire.
Des auteurs ont mis en évidence les effets de la CIT lors du développement intra-utérin. Dans
un modèle de fœtus soumis à une infection intra-amniotique induite par LPS, les auteurs ont
mis en évidence la capacité de la CIT à stimuler la croissance alvéolaire et vasculaire via
l’augmentation du facteur de croissance VEGF (Vascular endothelial growth factor) (Dedja et
al., 2018). Aussi, la CIT restaure les concentrations en ARG et son analogue ADMA (Asymmetric
dimethylarginine) effondrées par le LPS ainsi que celles des cytokines inflammatoires (IL-10 et
IL-1β).

50
 2.7.4. Fonction cardiovasculaire

Le dysfonctionnement endothélial est la cause primaire du développement de maladies

cardiovasculaires telle que l’hypertension, l’athérosclérose ou encore les lésions d’ischémie-
reperfusion. En cas de risque accru, le traitement est souvent chronique et une
complémentation en ARG s’avère peu efficace (Jeremy et al., 1996). La CIT, en tant que
précurseur de l’ARG et donc du NO, pourrait s’avérer bénéfique. Une revue récente met en
relief les effets de la citrulline sur le métabolisme cardiovasculaire (Allerton et al., 2018).

2.7.4.1. Effet vasoprotecteur

Une étude menée chez des rats adultes a pu montrer l’effet vasodilatateur de la CIT par une
amélioration la synthèse de NO ainsi que de la microcirculation de manière plus conséquente
que l’ARG (Wijnands et al., 2015). Une étude chez des patients âgés insuffisants cardiaques (±
65 ans) complémentés en CIT (3 g/jour pendant 4 mois) a montré une augmentation de la
fraction d’éjection systolique du ventricule gauche et droite (20,3% et 15,1% respectivement)
ainsi qu’une amélioration de la fonction endothéliale (Balderas-Munoz et al., 2012). Cette
dernière observation étant retrouvée chez des patients soumis aux même conditions de
traitements pendant 2 mois (Orea-Tejada et al., 2010). Une ingestion aiguë de CIT (10 g) chez
des patients insuffisant cardiaque montre déjà des bénéfices en augmentant la synthèse de
novo d’ARG et de NO et donc leur biodisponibilité, favorisant le maintien du tonus vasculaire
(Kim et al., 2015).
Un travail chez des rats adultes sous régime hyperlipidique et hypercholestérolémique
complémenté en CIT (0.1g/kg/ 3 fois par semaines pendant 8 semaines) a montré une
réversion de l’augmentation de la concentration plasmatique de deux enzymes hépatiques
(AST et ALT) indicatrices de stress. De plus, la CIT améliore le profil lipidique de ces animaux
(El Kirsh et al., 2011) avec amélioration de la structure endothéliale de l’aorte. Cette donnée
étant retrouvée chez le lapin sous régime hypercholestérolémique montrant une amélioration
de la fonction endothéliale avec la CIT (Hayashi et al., 2005).

51
 2.7.4.2. Effet anti-hypertenseur

Chez des patients pré-hypertendus et hypertendus obèses, une étude montre qu’une
complémentation CIT avec de l’extrait de pastèque lyophilisé (6 g / jour pendant 6 semaines)
permettrait de réduire la pression artérielle systolique et diastolique et d’améliorer le tonus
vasculaire périphérique (Figueroa et al., 2012). A plus court terme, une complémentation en
CIT chez des patients obèses d’âges moyens (5.6 g/jour) pendant 7 jours améliore le
métabolisme du NO ainsi que la compliance artérielle (Ochiai et al., 2012). Ce résultat est
retrouvé chez des femmes obèses hypertendues ménopausées complémentées en CIT (6 g/
jour pendant 6 semaines) (Figueroa et al., 2013). Récemment, Connolly et al. (Connolly et al.,
2019), ont montré chez des volontaires en surpoids et obèses, qu’une consommation
journalière de pastèque pendant 1 mois améliore le profil anthropométrique et lipidique
(diminution de la concentration en LDL et augmentation de la concentration en HDL) des
personnes, couplé à une diminution de la pression artérielle et une augmentation des
capacités oxydatives. Aussi, chez des patients souffrant d’angine de poitrine, un travail a mis
en évidence une amélioration de la fonction endothéliale avec une complémentation en CIT
(800 mg/ jour pendant 8 semaines) évaluée par une augmentation de la production de NO
et une diminution de l’oxydation de lipoprotéines (LDL et ApoB) (Morita et al., 2013). De plus,
une étude menée sur des cellules endothéliales aortiques bovines (BAEC) traitées avec de la
simvastatine et de la CIT pendant 24h augmente la production de NO endothéliale ainsi que
l’expression de eNOS (Berthe et al., 2011). Poduri et al. (Poduri et al., 2013), ont étudié chez
des souris hypercholestérolémiques déficientes pour le récepteur aux LDL, et donc déclarant
une athérosclérose sévère, qu’une complémentation en CIT sous forme d’extraits de
pastèques (2% vol/vol, pendant 1 semaine) diminue la cholestérolémie, améliore le statut
inflammatoire (diminution des cytokines pro-inflammatoires INF-γ et MCP-1 ; augmentation
de la cytokine anti-inflammatoires IL-10), et diminue l’expansion de l’athérosclérose (Pudori
et al., 2013).

52
 2.7.5. CIT et fonction cérébrale

La CIT étant capable de passer la barrière hémato-encéphalique, il est logique qu’elle puisse
moduler des mécanismes du système nerveux central (SNC). En effet, une étude menée chez
des rats âgés sains (20 mois) a montré qu’une complémentation en CIT (5 g/kg pendant 4
jours) permettait de détecter une concentration striatale en CIT de 1,5 mM alors qu’elle est
indétectable dans des conditions standards (Moinard et al., 2017). Ce travail a également
montré que la CIT stimule l’activité locomotrice des animaux âgés (test Y-maze) ainsi que la
voie dopaminergique caractérisée par une augmentation de la concentration striatale des
formes phosphorylées et totale de tyrosine hydroxylase (+171% et +126% respectivement),
enzyme limitante de cette voie. Ces effets pourraient être liés à la capacité de la CIT à générer

du NO. En effet, Yabuki et al. (Yabuki et al., 2013), ont mis en évidence qu’une
complémentation en CIT (50 ou 100 mg/jour pendant 10 jours) dans un modèle d’ischémie
cérébrale transitoire murin, augmente l’expression protéique de eNOS (+83%) dans
l’hippocampe de ces souris mettant en avant la capacité de la CIT a améliorer la vascularisation
cérébrale. Parallèlement, les auteurs ont pu montrer une capacité neuroprotectrice de la
citrulline observée grâce à l’augmentation de l’expression de CaMKII (Ca2+/calmodulin-
dependent protein kinase II), connue pour être effondrée dans les neurones ischémique et les
déficits d’apprentissages. Ces résultats sont retrouvés plus récemment dans une étude
combinant les effets d’une complémentation orale en CIT et en glutathione (GSH), dans ce
même modèle (Matsuo et al., 2017). Avec l’âge, la concentration cérébrale en CIT ainsi que la
production de NO est amoindrie, pouvant contribuer à une détérioration des fonctions
cognitives (apprentissage, mémoire, plasticité synaptique). Ainsi, une étude s’est intéressée à
la modulation des rafts lipidiques dans l’hippocampe de rats âgés sains (20 mois)
complémentés en CIT (1 g/kg/jour pendant 3 mois) (Marquet-de Rougé et al., 2013). En effet,
avec l’âge, les rafts lipidiques s’enrichissent en cholestérol, en cavéoline 1 et en amyloid
precursor protein (APP). La dérégulation de l’APP étant associée à une accumulation de
peptide amyloïde (Aβ) et donc à un risque de développement des plaques amyloïdes,
impliquées dans la maladie d’Alzheimer. Les auteurs ont montré qu’une complémentation en
CIT in vivo permet de retrouver une structure des rafts proche de celle trouvée chez le jeune.
In vitro, cette même équipe confirme l’effet protecteur de la CIT sur le métabolisme de l’APP
puisqu’une complémentation en CIT (5 mM pendant 24h) dans une lignée de neuroblastes

53
sur-exprimant l’APP diminue la production de Aβ (Guinguay et al., 2016) et par conséquent
l’APP. Ce dernier résultat est retrouvé in vivo dans un modèle de souris surexprimant l’APP,
où les auteurs montrent une diminution de la présence des plaques amyéloïdes dans
l’hippocampe et le cortex des animaux complémentés en CIT (Guinguay et al., 2013). Une
étude menée sur des patients atteint de la maladie d’Alzheimer montre une augmentation de
l’expression génique de l’OTC dans l’endothélium vasculaire cérébral ainsi que de son activité
dans le fluide cérébrospinal (Bensemain et al., 2009). Les auteurs mettent en avant la
susceptibilité de certains polymorphismes du gène de l’OTC à potentialiser le développement
de la maladie d’Alzheimer via une modulation de la méthylation du promoteur. D’ailleurs, une
étude clinique a rapporté un risque de développement plus grand de la maladie chez les
personnes possédant l’allèle récessif rs5963409 (Hansmannel et al., 2009).

Les troubles neurodégénératifs comme l’accident vasculaire cérébral, l'épilepsie ou encore la

sclérose en plaque sont caractérisés par un effondrement de la barrière hématoencéphalique
implicant une dysfonction endothéliale induite par une altération du métabolisme du
glutamate. Un travail in vitro de complémentation en [14C]-CIT (20 mM pendant 24h) dans une
lignée de cellules vasculaires cérébrales (TR-BBB) soumises à une toxicité induite par le
glutamate a montré que la CIT restaure la production de NO en augmentant l’expression
génique de eNOS et en diminuant celle de iNOS de manière comparable à celles observées en
condition de contrôle et restaure l’expression du récepteur rLAT1 (rat large neutral amino acid
transporter), principal transporteur de la CIT au niveau de la barrière hématoencéphalique
(Lee et Kang, 2017).

54
 2.7.6. CIT et fonction musculaire

La CIT en tant qu’acteur dans la régulation du métabolisme protéique musculaire a été

proposée par un travail mené dans un modèle murin de syndrome du grêle court montrant
qu’une complémentation en CIT améliore l’homéostasie azotée (Osowska et al., 2004). Le rôle
de la CIT en tant que stimulant de la synthèse protéique musculaire a été mis en évidence par
un travail princeps dans un modèle de rats âgés dénutris, puis complémentés en CIT (Osowska
et al., 2006). Dans ce modèle, les animaux sont soumis à une restriction alimentaire
équivalente à 50% de leur prise alimentaire spontanée pendant 12 semaines, puis renourris
avec un régime complémenté avec de la CIT ou un contrôle isoazoté représentant 90% de leur
prise alimentaire spontanée pendant 1 semaine. Les auteurs ont pu mettre en évidence
qu’une alimentation enrichie en CIT augmente la synthèse protéique musculaire (+80%) et
accroit le gain protéique net (+20%) chez ces animaux sans affecter la protéolyse myofibrillaire
(Figure 10).

Figure 10. Contenu protéique musclaire (mg/organe) (A) et synthèse protéique musculaire du tibialis
(mg protéine/heure) (B) (D’après Osowska et al., 2006).
Les trois groupes ont été sous restriction alimentaire (50% de la consommation ad libitum) pendant 12
semaines. Groupes : R, rats âgés soumis uniquement à une restriction alimentaire ; CIT, rats âgés
renourris pendant 1 semaine (90% des ingesta spontanés) et complémentés en CIT (5 g/kg/jour) ;
NEAA, rats âgés renourris pendant 1 semaine (90% des ingesta spontanés) et complémentés en acides
aminés non-essentiels (régime isoazoté et isocalorique entre le groupe CIT et NEAA). ANOVA + test
post-hoc de Duncan : *p<0,05 vs. R et NEAA.

55
En complément, dans ce même modèle, Faure et al. (Faure et al., 2012), ont montré que la
CIT augmentait de pair la masse et la force maximale musculaire avec une augmentation de la
motricité des animaux, donnant une dimension plus intégrée. Ces résultats sont également
retrouvés dans un modèle de rats adultes sains soumis à un jeûne de 18h, suivi d’un bolus de
CIT (1,80 mg/g de poids corporel). La diminution de synthèse protéique (-40%) pendant le
jeûne est totalement restaurée par l’apport de CIT (Le Plénier et al., 2012). Ces résultats sont
confirmés dans un modèle de rats adultes soumis à un régime hypoprotéique modéré (60%
de leur prise alimentaire spontanée) pendant 2 semaines montrant une préservation de la
synthèse des protéines myofibrillaires et un maintien de la force musculaire chez les animaux
complémentés en CIT (Ventura et al., 2013). Aussi, dans un modèle de limitation de la
croissance intra-utérine par restriction alimentaire maternelle, une complémentation en CIT
apparait comme stimulant la croissance intra-utérine via l’augmentation de la synthèse
protéique (Bourdon et al., 2016). En outre, les effets bénéfiques de la CIT sur la fonction
musculaire semblent être maintenus dans le temps. Une étude chez des rats âgés (20 mois)
sains sous régime complémenté en CIT montre une augmentation de 25% de la masse
musculaire liée à une accrétion protéique et une augmentation de la taille des fibres
musculaires (Moinard et al., 2015). Cependant, ces travaux évaluant l’impact de la CIT sur le
tissu musculaire sont mis en évidence dans des cas de restriction alimentaire.

Plus récemment, Goron et al. (Goron et al., 2017), ont étudié l’impact d’un régime standard
complémenté en CIT (1 g/kg/jour) ou placebo isoazoté dans un modèle de rats adultes sains.
Alors que l’augmentation de la synthèse protéique est retrouvée (+33%), aucun effet sur la
masse ou le contenu protéique musculaire n’a été mis en évidence. Néanmoins, les auteurs
ont montré que l’association d’une complémentation en CIT avec un exercice physique
d’endurance (course sur tapis) pendant 4 semaines, augmentait la performance des animaux
(temps de course : +14%).

Les capacités modulatrices de la CIT sur la synthèse protéique musculaire ont aussi pu être
mises en évidence chez l’Homme. Une étude de Jourdan et al. (Jourdan et al., 2015), a mis en
évidence qu’une consommation aiguë de 10 g de CIT (vs placebo isoazoté) augmentait la
synthèse des protéines musculaires (+25%) chez des adultes sains soumis à un régime hypo-
protéique (8%) pendant 3 jours (mais sans impact sur la synthèse protéique au niveau corps
entier). Plus tard, l’étude Ciproâge s’est intéressée à l’impact d’une complémentation en CIT

56
(10 g de CIT/jour pendant 3 semaines) au cours d’une renutrition chez le sujet âgé dénutri
hospitalisé (la renutrition était la prise en charge standard en vigueur dans l’établissement).
Ce travail a mis en évidence qu’une administration de CIT permet une augmentation de la
masse maigre (+1,7 kg de masse maigre; +1,1 kg de masse musculaire appendiculaire) ainsi
qu’une diminution de masse grasse (-1,3 kg) dans la population féminine, ce qui semble
cliniquement pertinent (Bouillanne et al., 2019). Néanmoins, le bénéfice de la CIT semble
spécifique au métabolisme protéique musculaire, comme le confirme plusieurs études faites
dans différentes conditions cliniques (volontaires sains : Thibault et al., 2011 ; Grèle court avec
statut nutritionnel stable : Jirka et al., 2019 ; Patients obèses dynapéniques âgés + exercices
physiques fractionnés: Buckinx et al., 2018). En effet, ces études montrent qu’une
complémentation en CIT améliore bien la concentration plasmatique en CIT mais ne semble
pas moduler la cinétique protéique globale de l’organisme.

Si la capacité de la CIT à moduler la synthèse protéique musculaire est avérée, les mécanismes
d’action impliqués restent peu étudiés. Le Plénier et al. (Le Plénier et al., 2017), ont mis en
évidence une action directe de la CIT dans la synthèse protéique musculaire grâce à un modèle
de muscle isolé perfusé de rat (Epitrochlearis) incubé avec ou sans CIT. Suite à l’augmentation
de la synthèse protéique musculaire observée en présence de CIT, l’addition de rapamycine
(inhibiteur de la voie de signalisation mTORC1 -mammalian target of rapamycin complex 1-,
voie principale de la synthèse protéique musculaire) dans le milieu de culture abolit ces effets,
ce qui laisse supposer que le bénéfice apporté par la CIT pourrait être lié à la stimulation de la
voie de signalisation mTORC1 (Julien et Roux, 2010) (Figure 11).

57
 Figure 11. Voie de signalisation mTORC1 (Adapté de Julien et Roux, 2010)

L’activation de la voie mTORC1 est confirmée dans le modèle in vivo de rat sous régime
hypoprotéique décrit ci-avant. Les animaux complémentés en CIT montrent une
augmentation de la phosphorylation et donc de l’activation de 4E-BP1 (eukaryotic initiation
factor 4E-binding protein 1) et S6K1 (p70 ribosomal protein S6 kinase 1), qui sont deux
substrats principaux de cette voie de signalisation. Ces données sont confirmées chez des rats
adultes sains complémentés en CIT pour lesquels la phosphorylation de 4EBP1 (+46%) et S6K1
(+57%) est augmentée (Goron et al., 2017). Cette activation semble d’ailleurs être
partiellement indépendante de la voie Akt/PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase) en amont de
ce système puisque l’inhibition de cette dernière n’altère pas l’activation de la protéine 4EBP1
(Le Plénier et al., 2017).

58
La CIT augmente spécifiquement la synthèse protéique musculaire, néanmoins, les
mécanismes sous-jacents restent peu étudiés. Faure et al. (Faure et al., 2013), dans un modèle
de rats âgés dénutris pendant 12 semaines puis complémentés en CIT pendant 1 semaine (5
g de CIT/kg/jour) ont mis en évidence une augmentation de l’expression de protéines
myofibrillaires ainsi qu’une adaptation des enzymes impliquées dans le métabolisme
énergétique musculaire. Aussi, ils ont pu mettre en évidence la capacité de la CIT à inhiber le
proteasome activator complex subunit 1, acteur de la protéolyse musculaire. La modulation
spécifique de certaines protéines par la CIT est répertoriée dans une revue générale par
Bourgoin-Voillard et al. (Bourgoin-Voillard et al., 2016).

Récemment, un travail a étudié les effets d’une complémentation en CIT (2 g/kg/jour pendant
3 jours) par voie entérale sur le métabolisme protéique musculaire dans 3 modèles
cataboliques murins; un modèle d’endotoxémie induit par injection de LPS, un modèle de
traumatisme cérébral induit par percussion hydrolique et un modèle de complications
infectieuses induit par E. coli (Kuçi et al., 2019). Les auteurs ont pu mettre en évidence des
effets variables de la CIT en fonction du type de lésion et du type de muscle ne permettant
pas de conclure quant au rôle de la CIT en situation catabolique.

Certains effets de la CIT référencés ci-dessus semblent être retrouvés en situation d’exercices.
Des auteurs ont mis en évidence qu’une complémentation chronique en CIT pendant plusieurs
jours améliorait les performances sportives, chez des athlètes entrainés, avec, notamment,
une augmentation du temps de résistance à la fatigue et une amélioration du temps de course
(Goron et Moinard, revue, 2018), mais aussi, chez des sujets âgés dynapenique obèses, avec
une amélioration de la vitesse de marche (Durée pour parcourir une distance donnée : -12% )
(Bucknix et al., 2018). Cependant, les effets d’une complémentation en CIT sur les
performances sportives restent actuellement peu étudiés.

Aussi, si les effets d’une complémentation en CIT sur la synthèse protéique sont bien
référencés, les effets de la CIT sur la protéolyse musculaire restent très parcellaires. Une
équipe a montrée chez des souris immobilisées, qu’une complémentation en CIT (0,81
mg/kg/jour), diminuait l’expression génique de Bnip 3, gène inducteur d’autophagie et
restorait le rapport LC3BII : LC3BI, marqueur de l’expansion des autophagosomes ; ces deux

59
paramètres étant augmentés lors d’une immobilisation (Ham et al., 2015). Néanmoins, le rôle
de la CIT dans la régulation de la protéolyse musclaire reste à explorer.

2.7.7. CIT et métabolisme lipido-énergétique

2.7.7.1. CIT et métabolisme énergétique

L’action de la CIT n’est pas limitée au métabolisme protéique mais s’étend aussi au
métabolisme énergétique. En effet, l’augmentation de la synthèse protéique musculaire est
permise grâce à l’activation de la voie mTORC1 et est donc dépendante du statut énergétique
de la cellule, c’est pourquoi des travaux se sont intéressés à l’impact d’une complémentation
en CIT sur le métabolisme énergétique. Une approche protéomique différentielle établie sur
le modèle de rats âgés dénutris décrit précédemment, a montré qu’une complémentation en
CIT induit une augmentation de l’expression des enzymes impliquées dans la glycogénolyse
(i.e., glycogène phosphorylase) et la glycolyse (i.e., phosphoglucomutase 1, 6-
phosphofructokinase, triosephosphate isomérase, ß-enolase et pyruvate kinase isozymes
M1/M2) ainsi qu’une sous-expression de certaines enzymes du cycle de Krebs (i.e., isocitrate
déshydrogénase et succinate déshydrogénase) et de la chaîne respiratoire mitochondriale
(i.e., complexe NADH déshydrogénase, NADH ubiquinone oxydoréductase, et ATP synthase)
(Faure et al., 2013). Une autre étude menée chez des rats âgés sains a mis en évidence qu’une
complémentation en CIT stimule l’expression du facteur de biogenèse mitochondriale TFAM
(Mitochondrial transcription factor A) ainsi que l’activité du complexe I de la chaine de
respiration mitochondriale (Moinard et al., 2015). Une autre approche protéomique menée
chez des rats adultes sains complémentés en CIT pendant 4 semaines a mis en évidence
l’activation d’enzymes impliquées dans la voie métaboliques génératrice d’acétyl-CoA à partir
de glucose et d’acides gras (Goron et al., 2017). Récemment, cette même équipe a pu apporter
des précisions sur le mécanisme sous-jacent à l’augmentation de la synthèse protéique induit
par l’apport de CIT (5 mM), dans une lignée cellulaire de myotubes soumis a différents types
de stress (énergétique et déficience en sérum et AAs) (Goron et al., 2019). En effet le maintien
de la synthèse protéique musculaire nécessite beaucoup d’énergie, sous forme d’ATP. Lors de
stress cellulaire, une inhibition hiérarchique des réactions cellulaires se met en place et les
réactions consommant le plus d’énergie (ATP) sont inhibées en priorité, ce qui est le cas de la

60
synthèse protéique musculaire. L’allocation de l’ATP pour une réaction est affectée par son
turn over et par son enthalpie libre (= énergie libre de Gibbs). L’enthalpie libre représente la
quantité d’énergie pouvant être délivrée par une molécule d’ATP, et est affectée par le ratio
ATP/ADP ainsi que le Pi libre. Or, les auteurs ont pu montrer qu’une complémentation en CIT
stimule la synthèse protéique musculaire sans affecter les paramètres bioénergétiques
cellulaires (respiration mitochondriale, ratio ATP/ADP, enthalpie libre, phosphorylation
oxydative, glycolyse aérobique, activation de l’AMPK). Ces résultats mettent donc en évidence
une réallocation de l’ATP produit par la chaine de respiration mitochondriale vers la synthèse
protéique musculaire. Les auteurs proposent que la CIT soit capable de diminuer l’énergie
d’activation (ΔG) d’une ou plusieurs des réactions chimiques impliquées dans la synthèse
protéique afin de restaurer celle-ci en condition de stress.

2.7.7.2. Le tissu adipeux blanc

Un premier travail du groupe de G. Wu (Wu et al., 2007), a pu montrer dans un modèle de

rats adultes obèses diabétiques (ZDF) complémentés avec du jus de pastèque pendant 4
semaines une diminution du TAB ainsi qu’une augmentation du TA brun. En effet, les auteurs
ont mis en évidence une diminution de l’agglomération des acides gras ainsi qu’une
diminution des concentrations plasmatiques en glucose et acides gras libres. Ces observations
étant couplées à une augmentation de la biodisponibilité en ARG et à une diminution des
concentrations plasmatiques des facteurs de risques cardiovasculaires. Par ailleurs, les effets
de la CIT sur le métabolisme énergétique musculaire ont pu être mis en lien avec une
diminution de la susceptibilité d’oxydation des LDL impliqués dans le développement de
l’athérosclérose ainsi que de la masse grasse sous-cutanée (-13%) et viscérale (-29%) (Moinard
et al., 2015). Cette dernière observation est en accord avec une étude de Joffin et al. (Joffin et
al., 2014a), montrant que la CIT a une action directe sur le métabolisme du tissu adipeux blanc
(TAB). En effet, ils ont montré, dans des explants de TAB issus de rats âgés sains, qu’une
complémentation du milieu de culture en CIT (2,5 mmol/L pendant 24h) entraine une
augmentation de l’activation de la lipase hormonosensible (x1,5 ; par phosphorylation) ainsi
qu’une augmentation de la libération des acides gras n-estérifiés (AGNE) (+50%) et du glycérol
(+50%), parallèlement à une diminution de la glycéronéogenèse (-40% à -70%) et de
l’expression de son enzyme clé, la PEPCK-C (cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase)
limitant la ré-estérification des AGNE. Ces effets ne sont cependant pas retrouvés dans les

61
explants de rats jeunes. En effet, dans le TAB de rats âgés, la glycéronéogenèse est diminuée
et associée à une β-oxydation stable ce qui favorise la libération des acides gras. De manière
intéressante, la β-oxydation ainsi que l’expression génique de CPT1 (Carnitine palmitoyl
transferase 1-b) impliquée dans le métabolisme des acides gras à chaine longue est fortement
augmentée chez le jeune rat sain (2 mois). Ces résultats sont aussi retrouvés dans un modèle
d’obésité chez le rat adulte (2 mois) (Joffin et al., 2014b). Une autre étude menée sur un
modèle d’explants de TAB issus de rat complémentés en CIT montre une augmentation de
l’expression génique et protéique de la protéine UCP1 (Uncoupling protein 1), protéine
induisant un découplage respiratoire et favorisant la libération des acides gras. De manière
concomitante, une amélioration du statut glucidique et lipidique est observée par une
augmentation de l’expression génique de PPARα (Peroxisome proliferator-activated receptor)
ainsi qu’une amélioration de la sensibilité à l’insuline et de la lipolyse indiquée par une
diminution de l’expression génique de PPARγ2.

Points essentiels

 Un apport en CIT est bien toléré.

 La CIT a des effets bénéfiques pléïotropiques. Elle module le système immunitaire
et améliore la fonction cardiovsculaire. Elle a une action sur la fonction cérébrale
ainsi que sur le métabolisme lipidique par une action direct sur le TAB.
 Lors de dysfonction intestinale, un apport de CIT restaure l’homéostasie azotéee.
 La CIT améliore la fonction musculaire. Elle stimule la synthèse protéique musculaire
et a une action directe sur cette dernière. Elle augmente la masse maigre et diminue
la masse grasse.
 La CIT a une action sur le métabolisme énergétique et permet une réallocation de
l’énergie produite par la chaine de respiration mitochondriale vers la synthèse
protéique musculaire.

62
BUT DE L’ETUDE

63
Ce travail a pour but de mieux comprendre le rôle et la régulation de l’OTC, et donc in fine,
celui de la CIT dans l’homéostasie protéino-énergétique.

Les modèles in vitro actuellement utilisés pour étudier le métabolisme intestinal ont des
métabolismes particuliers ne reflétant pas un métabolisme physiologique, ce qui limite leur
utilisation dans l’étude du métabolisme azotée. Afin de se rapprocher le plus possible de ce
qui se passe physiologiquement chez l’Homme, nous avons adapté un modèle d’explant
duodénal humain à l’exploration du métabolisme des AAs (Etude n°1). Cliniquement, une
hypocitrullinémie est retrouvée chez les patients en unités de soins intensifs, dans les
maladies respiratoires chroniques des voies aériennes ainsi que dans les cas de sepsis. Ces
situations étant associées à une inflammation et/ou une hypoxie chronique, des explants
duodénaux humains ont été incubés dans un environnement inflammatoire et/ou hypoxique
afin d’évaluer leurs effets directs sur la régulation de l’OTC intestinale (Etude n°2).

Par ailleurs, si la littérature met en évidence des effets bénéfiques d’une complémentation en
CIT, les connaissances concernant le rôle de la CIT endogène en condition
physiolopathologique restent très peu documentées. Afin d’étudier spécifiquement le rôle
métabolique de l’OTC intestinal, un nouveau modèle d’étude in vivo basé sur un système
Cre/Lox KO-inductible a été développé (réalisé en partie par la plate-forme de recombinaison
homologue de l’institut Cochin, Paris, France; El Marjou et al., 2004) et validé, permettant
d’inhiber le gène de l’OTC spécifiquement dans l’intestin (Etude n°3). Suite à cela nous avons
évalué, dans ce modèle, l’impact d’une perte de production de CIT par les entérocytes sur le
métabolisme protéino-énergétique chez des animaux adultes sains et des animaux âgés sains
(Etude n°3). Enfin, dans le but d’approfondir l’hypothèse développée par Moinard et Cynober,
(Moinard et Cynober, 2007), suggérant que la CIT aurait un rôle majeur en conditions de
dérégulations métaboliques, nous avons soumis ces souris adultes à un régime hypoprotéique
modéré (75%) (Etude n°3).

64
 TRAVAUX
EXPERIMENTAUX

65
 Etude n°1

Un modèle in vitro d’explant pour étudier le métabolisme intestinal des

acides aminés

Sandie Pestour, Morgane Couchet, Charlotte Breuillard, Christelle Corne, Nicolas Mathieu,
Frédéric Lamarche, Eric Fontaine, Moïse Coëffier et Christophe Moinard.

Soumis pour publication

Introduction

Le rôle principal de l’intestin grêle est l’absorption des nutriments provenant du bolus
alimentaire, incluant les protéines et les acides aminés (AA). Depuis plusieurs années,
l’entérocyte est considéré comme un acteur majeur dans la régulation de l’homéostasie des
AAs, notamment au niveau du carrefour glutamine – citrulline – arginine.
Actuellement, les lignées cellulaires d’épithélium intestinal permettant d’étudier le
métabolisme azoté, comme la lignée cellulaire Caco-2, possèdent des limites. En effet, ces
cellules ont un métabolisme particulier ne reflétant pas le métabolisme physiologique. Une
approche intéressante serait donc l’utilisation d’un modèle d’incubation d’explant duodénal
humain.

But de l’étude

Le but de cette étude a été de valider l’utilisation d’un modèle d’explant duodénal humain
pour l’exploration du métabolisme des AAs ainsi que de définir les conditions les plus adaptées
pour étudier ce dernier.

Méthodes

Huit biopsies duodénales ont été prélevées sur chaque patient inclus au cours d’une
endoscopie. Après analyses biologique et histologique, seuls les patients sans maladies
intestinales déclarées et avec une muqueuse saine ont été intégrés dans l’analyse des
résultats. Chaque biopsie est incubée pendant 23 heures dans du milieu de culture DMEM

66
complet. La viabilité cellulaire est évaluée après 1, 3, 6, 9 et 23 heures d’incubation grâce à la
concentration en LDH dans le milieu de culture. Aussi, La production de citrulline (CIT) par les
entérocytes (reflet de l’activité métabolique intestinale) est vérifiée ainsi que la présence des
enzymes impliquées dans la production de CIT par l’intestin (ARGase II, GLNase I, OAT et OTC).

Résultats

Le poids moyen d’une biopsie est d’environ 12,36 ± 1,00 mg. La mortalité cellulaire évolue de
manière progressive et linéaire pour atteindre environ 20% après 6h d’incubation et 50%
après 18h d’incubation. Les entérocytes humains en culture produisent bien de la CIT, la
libération de CIT dans le milieu de culture étant de 0,215 µM/mg de biopsie après 6h
d’incubation et de 0,300 µM/mg de biopsie après 18h d’incubation. Aussi, Les enzymes
ARGase II, GLN I, OAT et OTC sont exprimées dans ce modèle après 6h et après 18
d’incubation.

Conclusion

Une période d’incubation de 6h semble être la durée la plus appropriée pour éviter un taux
trop élevé de mortalité cellulaire. De plus, la stabilité de la concentration en CIT libérée dans
le milieu après 6h et 18h d’incubation renforce le fait de prioriser une période d’incubation de
6h. Finalement, ce modèle in vivo d’explant intestinal humain semble être un modèle
approprié à l’étude du métabolisme intestinal des AAs.

67
 An in vitro explant model for studies of intestinal amino acid metabolism

Sandie Pestourb*, Morgane Coucheta*, Charlotte Breuillarda, Christelle Cornea,b, Nicolas

Mathieub, Frédéric Lamarchea, Eric Fontainea,b, Moïse Coëffierc,d and Christophe Moinarda.

a-Laboratoire de Bioénergétique Fondamentale et Appliquée, INSERM U 1055, Université

Grenoble Alpes, France.
b-Centre Hospitalier Universitaire Grenoble Alpes, France.
c-Centre Hospitalier Universitaire de Rouen, France
d-Institut de Recherche et d’Innovation Biomédicale INSERM U 1073, Université de Rouen,
France.

* These 2 authors contributed equally to the work

Correspondence to:

Pr Christophe Moinard
Laboratoire de Bioénergétique Fondamentale et Appliquée, INSERM U 1055
Université Grenoble Alpes
CS 40700
38058 Grenoble Cedex 9
France
christophe.moinard@univ-grenoble-alpes.fr

Acknowledgments

This work was supported in part by a grant from the nonprofit association ‘Agir pour les
Maladies Chroniques’.
Grenoble University Hospital was promoter of the study. The authors thank the Endoscopy
Unit staff at the Hepato-Gastroenterology Department headed by Pr Leroy for their valuable
assistance, and in particular Dr Patrick Tuvignon, Dr Pierre-Yves Eyraud, Dr Nicolas Mathieu
and Dr Audrey Picot for their participation as investigators in the clinical strand of the study.

68
ABSTRACT

Introduction: The main role of the small intestine to absorb the bulk of dietary nutrients,
including proteins and amino acids (AA). Enterocytes have long been considered a major
player in amino acid homeostasis, especially the glutamine–citrulline–arginine crossroads. In
vivo intestinal epithelium cell lines for studies of nitrogen metabolism have now reached their
limitations. To push research forward, an interesting approach could be to use the explant
incubation model of intestinal tissue, involving in vitro incubation of duodenal tissue biopsy
specimens taken from human subjects.

Methods: Eight duodenal biopsies were taken during endoscopy from patients without
proven intestinal disease. Each biopsy was incubated in complete culture medium for 23 hours
then weighed, and cell viability was evaluated after 6 and 18 hours. We then explored L-
citrulline (L-CIT) production (reflecting metabolic activity) and the presence of the main
enzymes involved in AA metabolism in the intestine (arginase II, glutaminase I, ornithine
aminotransferase, and ornithine carbamoyltransferase).

Results: Mean weight of biopsies was 12.36 ± 1.00 mg. Mortality was around 20% after 6h and
50% after 18 h of incubation. CIT was amply produced by the biopsies, and enzymes implicated
in intestinal AA metabolism were expressed in this model.

Conclusion: This in vitro explant model of intestinal tissue emerges as a reliable model for
conducting ex vivo investigations on AA metabolism.

Keywords: ornithine carbamoyltransferase, amino acid, enterocyte, enzyme

69
Abbreviations:

AA: Amino acid

ARG: L-arginine
ARGase: Arginase
ASL: Argininosuccinate lyase
BMI: Body Mass Index
CIT: L-citrulline
DTT: Dithiothreitol
GLN: L-glutamine
GLNase: Glutaminase
GLU: L-glutamate
ICU: Intensive Care Unit
IFNγ: Interferon-γ
LDH: Lactate dehydrogenase
NO: Nitric oxide
OAT: Ornithine aminotransferase
OTC: Ornithine carbamoyltransferase
ORN: L-ornithine
SDS: Sodium dodecyl sulfate

70
INTRODUCTION

The small intestine is known to host the bulk of digestion and absorption of dietary nutrients,
including proteins and amino acids (AA). However, its metabolic role has gained increasing
research attention over the past two decades, bringing important insights into the properties
of the intestinal mucosa in AA metabolism and nitrogen homeostasis (Brosnan et al., 2003;
Breuillard et al., 2015). Enterocytes contain key enzymes for AA metabolism, such as arginase
(ARGase) and glutaminase (GLNase). Small intestine mucosa thus plays a key role in the
catabolism of several arterial and dietary AA like L-arginine (ARG), L-glutamine (GLN), proline,
and branched-chain AA (Figure 1; Wu, 1998). Moreover, dietary AA are required precursors
for intestinal synthesis of glutathione, nitric oxide (NO), polyamines, purine and pyrimidine
nucleotides, and for L-alanine, L-citrulline and L-proline (Figure 1; Wu, 1998). This makes
dietary AA essential, both for maintaining intestinal mucosal mass and integrity and for
intestinal motility and function (Wu, 1998; Breuillard et al., 2015; Moinard et al., 2007;
Ventura et al., 2011). The intestinal protein turnover represents about 15% of the total protein
turnover (Boirie & Beaufrère, 2005).

Any serious effort to explore intestinal nitrogen metabolism requires a reliable in vitro model,
which has prompted years of development of various different immortalized cell lines. Human
intestinal Caco-2 cell lines, derived from a human colon carcinoma, are a particularly popular
model of the intestinal epithelial barrier, but the model has limitations (Chougule et al., 2011).
First, immortalized cell lines have a specific metabolism that does not reflect physiological
metabolism. Second, peptides and AA transporters express differently in Caco-2 cells
compared to human gastrointestinal tract (Jochems et al., 2018). Caco-2 cells express a
different pattern of enzymes involved in AA metabolism, and crucially, they do not express
ornithine carbamoyltransferase (OTC) (which produces citrulline) but instead express
argininosuccinate synthase and argininosuccinate lyase (which are not expressed in humans).
For these reasons, Caco-2 cell lines are unsuitable for in vitro investigations of intestinal AA
metabolism (Ventura et al., 2011).

Primary cell cultures of human enterocytes could appear as an appropriate alternative model.
However, isolating and culturing human enterocytes from the small intestine is a notoriously
tricky technique that carries a number of challenges, including microbial infection risk, the

71
short lifespan of enterocytes, and complex interactions between enterocytes and extracellular
matrix (Chougule et al., 2012). Moreover, primary cell culture limits the scope of study to the
enterocytes and fails to account for potential environmental interactions. The intestinal
structure has a complex cell composition (i.e. enterocytes, goblet cells, immune cells, Paneth
cells, etc.) needed to ensure digestive, metabolic, immunologic and endocrine functions (Kong
et al., 2018).

An interesting approach could be to use an explant incubation model of intestinal tissue,

involving in vitro incubation of duodenal tissue biopsy specimens taken from human subjects.
This model has been already developed to explore intestinal function (Coëffier et al., 2001;
Lecleire et al., 2005; Coëffier et al., 2003) but without exploring the intestinal amino acid
crossroads. The aim of this work was to perform viability experiments on the explants in order
to define the best-adapted conditions of use for exploring AA metabolism and nitrogen
homeostasis.

72
METHODS

Patients

Patients followed by Grenoble–Alpes University Medical Center’s Gastroenterology

Department and requiring a gastro duodenal endoscopy were enrolled in the experimental
protocol after giving informed written consent.

This study was approved by the Grenoble–Alpes University Hospital institutional review board
(‘Comité de Protection des Personnes Sud-Est V’, 15-CHUG-44).

All 16 subjects enrolled required a gastroduodenal endoscopy based on clinical digestive

symptoms or biological data. Patients with known or suspected duodenal disease were ruled
out. After examination, only patients without altered intestinal mucosa and without proven
intestinal disease (based on biological and histological data) were selected for the study.

Endoscopy

During the endoscopy, 8 biopsy specimens were taken from each patient, from the second
duodenum using surgical pliers after testing several models to get the largest and well-shaped
biopsies. Large pliers (Captura serrated large 2.4-mm forceps, spiked 230 cm, DBF-2.4SL-
230SP-S, Cook Medical, Limerick, Ireland) were found to be adequate as they allowed to
obtain larger less fragmented biopsies, and were used for the experiments (Figure 2).

Biopsies were immediately transferred to separate vials containing complete cell culture
medium composed of standard medium with glucose 4.5 g/L (Dulbecco’s modified Eagle
medium, Dutscher, Brumath, France) supplemented with 1% non-essential AA (Minimum
Essential Medium–100X solution, Gibco, Invitrogen, Saint-Aubin, France), 2 mM L-GLN (PAN-
Biotech, Aidenbach, Germany), penicillin (100 U/mL; PAN-Biotech), streptomycin (0.1 mg/mL;
PAN-Biotech) and 10% fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO). Samples were
kept at 4°C throughout transport within 1h to the cell culture laboratory.

73
Biopsy culture

Biopsy specimens were transferred into separated plastic culture dishes (24-well plates)
containing 1 ml of the complete culture medium. Medium from tube transport was sampled
for viability analysis and snap-frozen at -80°C. Biopsies were put in an incubator in a humidified
atmosphere equilibrated with 21% O2/5% CO2 and incubated at 37°C for 23 hours. In order to
avoid damaging the tissue, biopsies were not handled with pliers but with a pipette (after
cutting the plastic cone tip) or with a spoon.

To measure cell viability, samples of culture medium were removed at different incubation
times (1, 3, 6, 9 and 23 hours) and immediately frozen at -80°C. After a 23h incubation period,
each biopsy (n=16) was removed from its medium and frozen at -80°C.

To measure CIT concentration and protein expression of AA metabolism, a second batch of

biopsies we cultured for 6 (n=18) or 18 hours (n=12). At the end of the incubation period,
culture media and biopsy specimens were removed and immediately frozen at -80°C.

Before each further experiment, biopsies were defrosted, any excess medium was removed
with Whatman paper, and the tissue was weighed (precision: 0.0001, Mettler-Toledo,
Viroflay, France). Given the tiny size of the biopsy specimens, it was impossible to perform all
the biological measurements on the same one sample, and so the number of samples per
experiment varies from 5 to 18 depending on the analysis.

Cell viability

For each biopsy, viability was checked based on LDH activity levels. LDH activity was measured
in each culture medium removed after transport and then at different incubation times (1, 3,
6, 9 and 23 hours) and in the biopsy lysate using an enzymatic activity assay kit (Sigma-Aldrich).
Each biopsy (n=16) was weighed, lysed in 1 mL of a 1% Triton solution, then centrifuged (15000
g for 10 minutes at 4°C) to collect the supernatants.

For each biopsy specimen, at each measurement timepoint, the ratio of LDH in the medium
to total LDH (LDH released in culture medium at 23 hours plus the LDH contained in the tissue)
was calculated and expressed as percent cell death.

74
CIT measurement

CIT concentration in the culture media was measured by ion exchange chromatography
followed by post-column derivatization with ninhydrin (Hitachi L8800 analyzer, Sciencetec,
Villebon-sur-Yvette, France) as previously described (Le Boucher et al., 1997) or by UPLC-MS
(Acquity UPLC H-Class QDa, Waters, Guyancourt, France) using a CORTECS UPLC C18 column
after a derivatization step (AccQTag Ultra®kit, Waters).

CIT concentration in the culture media was evaluated at 6 hours (n=18; n=9 with the Hitachi
L8800; n=9 by UPLC) and at 18 hours (n=12; n=5 with the Hitachi L8800; n=7 by UPLC) and was
ratioed to tissue weight for each biopsy specimen.

Protein expression

Western Blot analysis was performed to verify ARGase II (36 KDa), GLNase II (73 KDa),
ornithine aminotransferase (OAT) (49 KDa) and OTC (40 KDa) enzyme expression. Tissues were
lysed in a commercial RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 150 mM sodium chloride,
1.0% Igepal CA-630 (NP-40), 0.5% sodium deoxycholate, and 0.1% sodium dodecyl sulfate
added with protease inhibitor cocktail (both from Sigma-Aldrich) and phosphatase inhibitor
cocktail (Fischer Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France). Proteins were quantified by the
Pierce method using a BCA (bicinchoninic acid assay) kit (Interchim, Montluçon, France).
Proteins were then separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane.
Protein immunodetection was performed using anti-OTC antibodies (1:1000 dilution; Sigma
Aldrich) with anti-ARGase II (1:250 dilution, Sigma Aldrich), anti-GLNase I (1:1000, Abcam,
Cambridge, United Kingdom) and anti-OAT (1:200, Sigma Aldrich) as primary antibodies.
Membranes were incubated overnight with primary antibodies at 4°C. Primary antibodies
were detected with secondary anti-rabbit antibodies conjugated to horseradish peroxidase
(1:1000 dilution; Jackson ImmunoResearch, Ely, United Kingdom). Signals were revealed using
a chemiluminescence system (Amersham ECL Prime kit, GE Healthcare, France) and quantified
using Image J software (version 1.48, National institutes of Health, MD).

75
RESULTS

Clinical patient data

A histological analysis of the duodenal mucosa was performed for all patients. No duodenal
pathology was found. Clinical patient data was checked and recorded (Table 1).

Biopsy weight

Tissue weight was around 12.36 mg [7.3–27.0].

Cell viability

Mortality was around 20% at 6 h incubation and increased progressively throughout the
incubation period to reach around 50% at 18 h and 70% at 23 h incubation (Figure 3).

CIT concentrations

CIT release was around 0.215 µM/mg biopsy [0–9] over the 6 h period and 0.300 ± 0.040
µM/mg biopsy [0–7] at 18 h.

Protein expression

ARGase II, GLNase I, OAT and OTC enzymes were found in the biopsy specimens after 6 hours
(Figure 4) and 18 hours of incubation.

76
DISCUSSION

Here we repurposed a preexisting model of duodenal tissue previously used to study the
production of cytokines or other metabolic processes in the gut (Coëffier et al., 2001; Lecleire
et al., 2005; Coëffier et al., 2003) in order to explore AA metabolism in the intestine. The main
strength of this model is that it includes not only the epithelial enterocyte barrier but also the
lamina propria that contains other tissue elements (Achkar et al., 1986). It is consequently
more representative of real conditions in terms of functionality and metabolism. However,
this may make experimental results more difficult to interpret. For example, if the culture
medium shows altered release of an AA, then further experiments will be needed to
determine the metabolic pathways involved and whether these pathways take place inside or
outside the enterocyte.

The production of CIT by the biopsy is proof of enterocyte functionality (Crenn et al., 2003).
Indeed, a very small difference in CIT production is observed between 6 and 18 hours of
incubation, whereas mortality doubled over these two same timepoints, suggesting CIT
release is not due to cell mortality but reflects enterocyte functionality. Moreover, the
presence of the main enzymes of the CIT metabolism, such as OTC, ARGase II, GLNase I and
OAT, confirms enterocyte functionality. Quantifying enzyme activity would bring sharper
results but was impossible to do here due to the restrictive size of the biopsies. Another set
of experiments measured OTC enzyme activity and found that the enzyme was active and
stable in human enterocytes after 6 or 18 hours of incubation (personal data).

Based on the literature, duodenal biopsies can be cultured over 24–48 h with well-maintained
differentiation and metabolic activities (Coëffier et al., 2001). Here, viability was evaluated in
order to define the appropriate incubation time for further experimental studies on AA
metabolism. Cell mortality was still around 20% up to 6 h incubation and then increased to
reach 50% after 18 h and 60%–80% after 23 h. These figures are in the same range as those
described for other cell types in primary culture, such as Beta cells (Lablanche et al., 2015),
and our data is consistent with the rapid turnover of intestinal cell lines (i.e. between 24 and
48 h) (Darwich et al., 2014). Here we studied two incubation period: short term (6 hours) and
long-term (18 hours). Neither of these two incubation periods makes it possible to reach the
half-life of OTC, which is estimated at between 6 and 9 days (Wallace et al., 1986; Vargas et

77
al., 1987). Given the speed of intestinal turnover, it is practically impossible to capture the
half-specific activity of the enzyme. Indeed, a long half-life time masks the cell’s adaptation to
a changing environment as stress-induced damage. The advantage of 6 h incubation is mostly
the low percent mortality compared to 18 h incubation. However, the longer 18 h incubation
time could better serve to find out certain cell adaptations because the period is closer to OTC
half-life time found in light hepatocytes. Finally, incubation time should obviously be dictated
by the objectives of each study.

Here, a 6 h incubation period looks the most appropriate time window to avoid broad cell
death, but other incubation times can be employed and designed to meet other study
purposes. Stable CIT production over 6 and 18 hours of incubation further supports the use of
a 6 h incubation period for studies on AA metabolism.

This in vitro explant model of intestinal tissue emerges as a reliable model for conducting
further experiments on intestinal AA metabolism.

78
REFERENCES

Achkar E., Carey WD., Petras R., Sivak MV., & Revta R. (1986). Comparison of suction capsule
and endoscopic biopsy of small bowel mucosa. Gastrointestinal Endoscopy, 32(4), 278-
281. https://doi.org/10.1016/S0016-5107(86)71846-4

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80
Figure 1. AA metabolism in the intestine. (From Wu, 1998)

The enzymes that catalyze the indicated reactions are as follows : 1) phosphate-dependent
glutaminase; 2) Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase; 3) ornithine aminotransferase; 4) ornithine
carbamoyltransferase; 5) argininosuccinate synthetase; 6) argininosuccinate lyase; 7) arginase; 8)
ornithine decarboxylase; 9) nitric oxide synthase; 10) carbamoylphosphate synthetase; 11) proline
oxidase; 12) pyrroline-5-carboxylate reductase; 13) BCAA transaminase; 14) BCKA dehydrogenase; 15)
aspartate transaminase; 16) alanine transaminase; 17) α-KG dehydrogenase; 18) possibly via NADP-
linked malic enzyme, phosphoenolpyruvate carboxykinase/pyruvate kinase and oxaloacetate
decarboxylase; 19) pyruvate dehydrogenase; 20) Krebs cycle enzymes; 21) serine transaminase; 22)
serine hydroxymethyltransferase; 23) glutathione-synthesizing enzymes; 24) serine dehydratase; 25)
glucose-synthesizing enzymes; and 26) purine and pyrimidine-synthesizing enzymes. The symbol “?”
denotes unknown reactions in intestinal mucosa. Abbreviations: Asp, aspartate; BCAA, branched-chain
amino acids; BCKA, branched-chain α-ketoacid dehydrogenase; CP, carbamoyl phosphate; Glu,
glutamate; α-KG, α-ketoglutarate; MTF, N5,N10-methylenetetrahydrofolate; OAA, oxaloacetate; Pyr,
pyruvate; TF, tetrahydrofolate.

81
Figure 2. Endoscope and picking site in the intestine

A. Endoscope. B. The biopsy is removed from the second duodenum using large pliers.

100

80
% c e ll m o r t a lit y

60

40

20

0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

In c u b a t io n t im e ( h )

Figure 3. Cell viability over 23h

Biopsy specimens (n=16) were incubated for 23 hours. LDH activity was measured in culture media at
several timepoints (at 1h, 3h, 6h, 9h and 23h of incubation) and in each biopsy after tissue lysis. Cell
mortality percentages were calculated. Individual cell mortality values for each biopsy are given for
each incubation time. (- - -) corresponds to the percentage of cell mortality at 6h (approx. 20%) and
18h (approx. 50%).

82
Figure 4. Protein expression after 6h and 18h of incubation in tissue
Biopsy specimens (n=2) were incubated for 6 or 18 hours. Arginase II (ARG II), glutaminase I (GLNase
I), ornithine aminotransferase (OAT) and ornithine carbamoyltransferase (OTC) protein expression
were all verified.

Table 1. Clinical patient data

CLINICAL DATA
AGE (YEARS) Average 40
Range 19–73
GENDER Female 47%
Male 53%
BODY MASS INDEX (BMI)
Average 26
(KG/M2)
Range 18.0–31.1

83
 Etude n°2

Régulation de la synthèse de citrulline par les entérocytes humains :

Rôle de l’hypoxie et de l’inflammation

Morgane Couchet, Sandie Pestour, Charlotte Breuillard, Christelle Corne, John rendu, Eric
Fontaine et Christophe Moinard.

Soumis pour publication

Introduction

Les patients en unité de soins intensifs et les maladies inflammatoires chroniques des voies
aériennes sont caractérisés par une hypoxie et/ou une inflammation systémiques et
chroniques induisant une diminution de la libération de NO, due à une altération de
l’homéostasie de l’ARG (avec une hypocitrullinémie marquée). Considérant le fait que l’ARG
biodisponible provient en grande partie de sa synthèse de novo à partir de CIT, une altération
de la production intestinale de CIT via l’OTC pourrait être impliquée.

But de l’étude

Cette étude évalue, in vitro, les conséquences d’une hypoxie et/ou d’une inflammation sur la
régulation de l’OTC intestinale dans le modèle d’explant validé précédemment.

Méthodes

Huit biopsies duodénales ont été prélevées chez chacun des 18 patients sélectionnés et ont
été incubées pendant 6h après avoir été réparties de manière aléatoire dans 4 groupes
différents : contrôle, inflammation, hypoxie, hypoxie + inflammation. A la fin de la période
d’incubation, la concentration en CIT dans le milieu de culture a été dosée. L’activité
enzymatique de l’OTC ainsi que son expression génique et protéique ont été évaluées dans les
biopsies. Aussi, l’expression protéique des enzymes impliquées dans la voie intestinale de la

84
production de CIT a été mesurée, ainsi que l’expression protéique des enzymes majeures
impliquées dans la modulation du statut énergétique cellulaire.

Résultats

Les facteurs Inflammation, Hypoxie, Inflammation + Hypoxie n’affectent pas la production de

CIT par les entérocytes. De manière surprenante, l’activité enzymatique de l’OTC semble
augmenter en condition hypoxique (p= 0,023) alors que son expression génique et protéique
ne sont pas modifiées. L’expression protéique des enzymes ARGase II, GLNase I et OAT
impliquées dans la voie de synthèse intestinale de la CIT ainsi que celle de l’AMPK et de l’ACC
(reflet du statut énergétique) ne sont pas non plus affectées par l’inflammation et l’hypoxie.
Finalement, lorsque les données sont assemblées et divisées en quartiles dans le but de
mettre en relation la variabilité de chaque paramètre, l’augmentation de la concentration en
CIT au cours de l’évolution des quartiles (Q1 puis Q2, Q3, Q4) n’est corrélée avec aucune
modulation des autres paramètres de l’étude.

Conclusion

Ce travail suggère que les facteurs inflammatoires et hypoxiques ne sont pas des régulateurs
directs de l’activité de l’OTC et donc de la production intestinale de CIT. L’approche des
données par quartiles a permis de confirmer que le carrefour métabolique intestinal
permettant une production du pool de CIT biodisponible n’était pas un élément clé de la
régulation de la synthèse de CIT. Aussi, l’ensemble des résultats atteste de l’importance de
cet AA dans l’adaptation métabolique face à des situations d’hypercatabolisme.
L’hypocitrullinémie observée dans les états cliniques d’hypercatabolisme pourrait donc être
la conséquence d’une grande utilisation de la CIT biodisponible pour la synthèse d’ARG de
novo.

85
 Regulation of citrulline synthesis in human enterocytes:
role of hypoxia and inflammation

Morgane Coucheta*, Sandie Pestoura, b*, Charlotte Breuillarda, Christelle Cornea, b, John Rendub,
Eric Fontainea, b, Christophe Moinarda.

a- Laboratoire de Bioénergétique Fondamentale et Appliquée, INSERM U 1055,

Université Grenoble–Alpes, France.
b- Centre Hospitalier Universitaire Grenoble–Alpes, France.

* M. Couchet and S. Pestour contributed equally to this work.

Correspondence to:
Pr Christophe Moinard
Laboratoire de Bioénergétique Fondamentale et Appliquée, INSERM U 1055
Université Grenoble–Alpes
2280 rue de la Piscine
38000 Grenoble Cedex 9
France
christophe.moinard@univ-grenoble-alpes.fr.

Acknowledgments

This work was supported in part by a grant from the nonprofit association ‘Agir pour les
Maladies Chroniques’.
Grenoble University Hospital was promoter of the study. The authors thank the Endoscopy
Unit staff at the Hepato-Gastroenterology Department headed by Pr Leroy for their valuable
assistance, and in particular Dr Patrick Tuvignon, Dr Pierre-Yves Eyraud, Dr Nicolas Mathieu
and Dr Audrey Picot for their participation as investigators in the clinical strand of the study.

86
ABSTRACT

Objective: Intensive care unit patients and chronic airway inflammatory disease are
characterized by chronic systemic hypoxia and inflammation inducing a decrease in NO
release due to impaired L-arginine (ARG) homeostasis. As ARG is synthesized from circulating
L-citrulline (CIT), then an alteration of CIT homeostasis, particularly its production by ornithine
carbamoyltransferase (OTC) in small intestine mucosa, could be involved. Here we posit that
hypoxia and/or inflammation has effects on OTC regulation in enterocytes.
Methods: A duodenal explant incubation model was used. Biopsy specimens taken from 18
selected patients were incubated for 6 hours in 4 groups: control, inflammation, hypoxia, and
hypoxia + inflammation. At the end of the incubation period, we measured CIT concentration
in culture media, OTC activity, OTC protein and OTC gene expression, protein expression of
enzymes involved in the enterocyte CIT production pathway, and expression of energy status
proteins.
Results: Inflammation, hypoxia, and Inflammation + Hypoxia conditions did not affect CIT
production. OTC activity was increased in hypoxia conditions (p=0.023). Expression of
enzymes implicated in the CIT crossroads pathway and enzymes reflecting energy status
variation was not affected by inflammation and hypoxia. When datasets were pooled to
evaluate variability of the four quartiles for each parameter, CIT production was found to
increase over the quartiles whereas other parameters remained stable.
Conclusion: Our results showed that intestinal CIT production is preserved during
inflammation and/or hypoxia, thus confirming the significance of this metabolic pathway. This
suggests that the CIT deficiency observed in clinical hypercatabolic states could be a
consequence of high utilization for ARG synthesis.

Keywords: sepsis; citrulline; duodenum; ornithine carbamoyltransferase

87
Abbreviations

ACC: Acetyl-CoA-carboxylase
AMPK: AMP-activated protein kinase
ARG: L-arginine
ARGase: Arginase
ASL: Argininosuccinate lyase
ASS: Argininosuccinate synthase
ATP: Adenosine triphosphate
BMI: Body Mass Index
CIT: L-citrulline
COPD: Chronic obstructive pulmonary disease
CRP: C-reactive protein
DTT: Dithiothreitol
GLN: L-glutamine
GLNase: glutaminase
GLU: L-glutamate
HEPES: Hydroxyethylpiperazine ethane sulfonic acid
ICU: Intensive Care Unit
IFNγ: Interferon γ
IL-1β: Interleukin-1β
LDH: Lactate dehydrogenase
L-NAME: L-Nitroarginine methyl ester
NO: Nitric oxide
NOS: Nitric oxide synthase
OAT: Ornithine aminotransferase
OTC: Ornithine carbamoyltransferase
ORN: L-ornithine
PBS: Phosphate-buffered saline
SDS: Sodium dodecyl sulfate
TCA: Trichloroacetic acid
TNFα: Tumor necrosis factor α

88
Introduction

L-citrulline (CIT) is a non-essential amino acid synthesized in enterocytes from dietary L-

arginine (ARG) and L-glutamine (GLN) using the ornithine carbamoyltransferase (OTC)
enzyme. CIT gets released into the portal vein and, as it is not taken up by the liver, reaches
systemic circulation. Circulating CIT is then taken up by the kidneys and converted into ARG
by argininosuccinate synthase (ASS) and argininosuccinate lyase (ASL) (Figure 1.). This
pathway is a key source of endogenous ARG, as it represents up to 15% of circulating ARG and
60% of synthesized ARG (Breuillard et al., 2015; Moinard et al., 2007). CIT has long been
recognized as the most reliable marker of intestinal function, and hypocitrullinemia is
associated with impaired bowel function. ICU patients are characterized by hypocitrullinemia
proportional to the severity of the disease (Piton et al., 2010). Moreover, low plasma CIT and
ARG concentrations in patients with sepsis and trauma are inversely correlated with the
severity of inflammation (i.e. CRP concentration), but the cause of the relationship is not yet
established (Van Waardenburg et al., 2007). There is a rationale to suppose that a decrease in
plasma CIT concentration could be due to an alteration of CIT production by enterocytes or an
increase of CIT utilization for ARG synthesis.
To gain deeper insight into the regulation of CIT production by enterocytes, we posit that
hypoxia and inflammation, both generally observed in ICU patients and in chronic airway
inflammatory diseases, directly affect intestinal OTC and thus decrease intestinal CIT
production. This hypothesis is linked to the fact that the OTC-catalyzed reaction requires two
ATPs (Zheng et al., 1993; Sainz et al., 1998) which would make it very sensitive to any hypoxia
and/or inflammation-related alteration in energy status. However, to the best of our
knowledge, the effects of hypoxia and/or inflammation on human OTC regulation have never
been directly determined.
Here we evaluated, in vitro, the consequences of hypoxia and inflammation (alone or in
association) on human intestinal OTC regulation. As the classic intestinal cell lines (like Caco-
2 cells) do not express OTC (Ventura et al., 2011), we set up a duodenal tissue incubation
model (Coëffier et al., 2001; Coëffier, 2003; Ventura et al., 2011; Lecleire et al., 2005).

89
Material and Methods

Patients

Thirty patients followed by Grenoble University Medical Center’s Gastroenterology

Department and requiring a gastroduodenal endoscopy were enrolled in the study after giving
informed written consent. As some of them had already been used to develop experimental
protocols, 25 patients were enrolled in the final dataset. This study was approved by Grenoble
University Hospital’s institutional review board (‘Comité de Protection des Personnes Sud-Est
V’, 15-CHUG-44). For ethical reasons, we ruled out studying healthy volunteers and decided
to include subjects that required a gastroduodenal endoscopy based on clinical digestive
symptoms or biological data. Patients with COPD and with known or strongly suspected
duodenal disease were not included. After examination, only patients without altered
intestinal mucosa and without proven intestinal disease (based on biological and histological
data) were retained for the study and for biopsies.

Endoscopy

During the endoscopy, 8 biopsy specimens per patient were taken from the second duodenum
and immediately transferred to vials containing complete cell culture medium composed of
standard medium with glucose 4.5 g/L (Dulbecco’s modified Eagle medium, Dutscher,
Brumath, France) supplemented with 1% non-essential amino acids (Minimum Essential
Medium–100X solution, Gibco®, Invitrogen, Saint-Aubin, France), 2 mM GLU (PAN-Biotech,
Aidenbach, Germany), penicillin (100 U/mL; PAN-Biotech, Aidenbach, Germany), streptomycin
(0.1 mg/mL; PAN-Biotech) and 10% fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO).
Samples were processed within 1h for organ culture as previously described (Ventura et al.,
2013; Lecleire et al., 2005; Le Boucher et al., 1997).

Biopsy culture

After endoscopy, samples were transferred to plastic culture dishes containing 1 mL of

complete culture medium and placed in a chamber equilibrated with 21% O 2/5% CO2 and
incubated at 37°C for a 1h equilibration period. Biopsies were then randomized to each
condition group, with two biopsy specimens from one patient in each group (Figure 2): 1)

90
standard conditions (21% O2/5% CO2, 37°C; control group, n=44), 2) hypoxic conditions (n=44),
with a specific incubator devoted to hypoxia which is able to mix air, CO2 and N2 in order to
reach a 3% FiO2 (Lablanche et al., 2015), 3) inflammatory conditions (n=44), with a mix of
interleukin (IL)-1β (1 μg/l), Tumor Necrosis Factor (TNF)α (20 μg/l), interferon (IFN)γ (10 μg/l)
(Leblond et al., 2006) and 4) hypoxic + inflammatory conditions (n=44). We chose to use a 6h
incubation period based on results from a previous study (personal data) and to accommodate
the cell mortality pattern evaluated in other studies on intestinal biopsies (Coëffier, 2003;
Coëffier et al., 2001; Lecleire et al., 2005). At the end of the incubation period, each biopsy
was removed from its medium, rinsed with phosphate-buffered saline (PBS), then quick-dried
and immediately frozen in liquid nitrogen for storage at -80°C. The media were then collected
and centrifuged, and fractions were deproteinized with 10% sulfosalicylic acid then kept aside
for CIT concentration measurements (see below). All media (including deproteinized fractions)
were then stored at -80°C. Given the tiny size of the biopsy specimens, it was impossible to
perform all the biological measurements on the same sample, and so for each analysis,
number of samples per group varies from 5 to 22.

Nitric oxide synthase (NOS) inhibition

In order to evaluate the share of CIT produced by NOS, one duplicate of explants in each
condition was supplemented with 10 mM L-NAME (Nω-Nitro-L-arg-methyl, Sigma-Aldrich)
solution (n=7/condition). The same endoscopy and biopsy culture protocols described above
were used.

LDH activity measurement

In order to determine the percentage of cell mortality, LDH activity was measured in culture
media and in tissue lysates after a 6h incubation period (6h, n=17 per group) using a
cytotoxicity detection kit (Roche, Basel, Switzerland).
For each biopsy specimen, the ratio of LDH in medium at 6 h to total LDH (LDH released in
culture medium at 6 hours plus LDH contained in the tissue) was calculated and expressed as
percent cell death.

91
CIT concentration measurement

CIT concentration in the media was measured at the end of the incubation period (6h, n=22
per group) by ion exchange chromatography followed by post-column derivatization with
ninhydrin (Hitachi L8800 analyzer, Sciencetec, Villebon-sur-Yvette, France) as previously
described (Le Boucher et al., 1997) (n=7) or by UPLC-MS (Acquity UPLC H-Class QDa, Waters,
Guyancourt, France) using a CORTECS UPLC C18 column after a derivatization step (AccQTag
Ultra®kit, Waters) (n=15). The concentration was then ratioed to tissue weight for each biopsy
specimen.
Finally, calculations were applied to the whole dataset to obtain unmatched data and perform
statistical analysis with two factors (1: normoxia vs hypoxia; 2: inflammatory vs
noninflammatory conditions). This strategy allowed use to investigate a global effect of
hypoxia and inflammation on CIT production by increasing the number of samples in each of
the two conditions (6h, n=44).

OTC activity measurement

OTC activity was measured in biopsies at the end of the incubation period (n=17 per group)
using the OTC enzymatic assay (Ventura et al., 2003). Tissues were lysed in buffer containing
0.3M sucrose (Sigma-Aldrich), 5 mM hydroxyethylpiperazine ethane sulfonic acid (HEPES;
Sigma-Aldrich), 3 mM dithiothreitol (DTT; Sigma-Aldrich) and 0.5% triton X-100 (Sigma-
Aldrich). The enzymatic assay was performed after freezing/thawing cycles in order to release
OTC from mitochondria. The reaction mix was composed of 5 mM L-ornithine hydrochloride
(Sigma-Aldrich) and 5 mM carbamyl phosphate disodium salt (Sigma-Aldrich), diluted in a tris-
base buffer (10 mM, pH=8.5; Sigma-Aldrich). Addition of tissue lysate started the reaction.
After 30 minutes (T30) of incubation at 37°C, 6.25% trichloroacetic acid (TCA; Sigma-Aldrich)
was immediately added to the sample (w/w) to stop the reaction. A sample of the reaction
mixture was removed at the beginning (T0) and mixed with TC, to be used as reference.
Finally, CIT concentration was evaluated using a colorimetric assay with the following reagent
mixture: a sulfuric and phosphoric acid mixture, a redox mixture of ammonium iron (III) sulfate
dodecahydrate and ammonium iron (II) sulfate hexahydrate, and a solution of
diacetylmonoxime 0.75%. Absorbance was read at 490 nm and CIT concentration was

92
deduced from a standard curve obtained with CIT solution as calibration standard. CIT
production by tissue lysate was determined by subtracting T0 CIT from T30 CIT.
As the variability of the OTC measurements is dependent on cell viability, OTC activity/LDH
activity ratio was calculated for each sample (see above for LDH activity measurement).

mRNA expression

For each condition, total mRNAs were extracted from biopsies via a TRIZol protocol as
previously described (Monnier et al., 2001). Then 500 ng of total RNA was reverse-transcribed
into cDNA using SuperScript IV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) with random
priming. RT-qPCR was performed via the SYBR Green method with melt curve on a
StepOnePlus system (Thermo Fisher Scientific) using PowerUp SYBR Green Master Mix
(Thermo Fisher Scientific). OTC cDNA quantifications were amplified with
CTACTCCAAAGGGTTATGAGC and ATTAATACATTGCCTCCATGCG primers. Data were
normalized with the ΔΔCT quantification method using the housekeeping gene RPL27 with
cDNA amplified with CGCAAAGCTGTCATCGTG and GTCACTTTGCGGGGGTAG primers.

Protein expression

Western Blot analysis was performed to evaluate protein expression of enzymes involved in
intestinal CIT production and two enzymes reflecting energy status variation after the
incubation period (i.e. AMPK and ACC). This strategy was adopted as biopsies were too small
to directly measure energy status (ATP/ADP ratio). Each protein expression was ratioed to
total protein expression. OTC was specifically detected at 39 KDa (n=12), ARGase II at 40 KDa
(n=9), GLNase I at 73 KDa (n=10), OAT at 49 KDa (n=10), phospho-AMPKα (Thr172) and AMPK
α at 62 KDa (n=5), and phospho-ACC (Ser79) and ACC at 280 KDa (n=8). As biopsy specimens
are very small, it was impossible to perform all the protein expression quantifications on just
one biopsy, which explains the variation in number of replicates. Tissues were lysed in a
commercial RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 150 mM sodium chloride, 1.0% Igepal
CA-630 (NP-40), 0.5% sodium deoxycholate, and 0.1% sodium dodecyl sulfate, Sigma-Aldrich)
added with protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) and phosphatase inhibitor cocktail
(Fischer Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France). Proteins were quantified by the Pierce
method using a BCA (bibinchoninic acid assay) kit (Interchim, Montluçon, France). After
dilution in Blue loading buffer (Cell Signaling, Leiden, The Netherlands) to be standardized at

93
1 mg/mL and heated at 100°C for 5 min, proteins were separated by SDS-PAGE at 30 µg/lane
and transferred to a nitrocellulose membrane. Protein immunodetection was performed using
anti-OTC antibodies (1:1000 dilution; Sigma-Aldrich), anti-ARGase II (1:250 dilution, Sigma-
Aldrich), anti-GLNase I (1:1000, Abcam Cambridge, United Kingdom), anti-OAT (1:200, Sigma-
Aldrich), anti-phospho-AMPKα (Thr172) (1:1000, Cell Signaling), anti-AMPKα (Thr172)(1:1000,
Cell Signaling), anti-phospho-ACCp (Ser79) (1:1000, Cell Signaling) and anti-ACC (Ser79)(1:1000,
Cell Signaling) as primary antibodies. Ponceau S staining was used as reference. Membranes
were incubated overnight with primary antibodies at 4°C. Primary antibodies were detected
with secondary anti-rabbit antibody conjugated to horseradish peroxidase (1:1000 dilution;
Jackson ImmunoResearch, Ely, United Kingdom). Signals were revealed using a
chemiluminescence system (Amersham ECL Prime kit, GE Healthcare) and quantified using
Image J software (version 1.48, National institutes of Health, MD).

Statistical analysis

Data were expressed as median ± interquartile range and represented as boxplots. Data were
depicted as percentage related to the 100% of internal control condition for each patient.
Statistical analysis was performed on raw data using GraphPad Prism software (version 6.0,
San Diego, CA). Normal distribution and variance homogeneity (p>0.05) and if both
assumptions held true, we performed one way-ANOVA followed by a Šidák post-hoc test, or
otherwise we performed one-way ANOVA based on rank (Friedman test) followed by a Dunn’s
post-hoc test. The threshold for significance was set at p<0.05.
Global effect of hypoxia or inflammation on CIT production was captured by normalizing the
data to control values. Normality was under 0.05, but as two-way ANOVA has no equivalent
nonparametric test and is robust to normality, we performed a two-way ANOVA followed by
a Holm-Šidák post-hoc test, working with the risk that it could increase the probability of a
type-I error (α error).

94
Quartile evaluation

Datasets from all groups were pooled together for each parameter tested in the study, then
ranked into ascending order on CIT production. As data matching is patient-dependent, data
from each other parameter (OTC/LDH activity and protein expressions) was then organized
according to its fit with CIT production concentration, like a dynamic table. After quartiles (Q1,
Q2, Q3, Q4) were established, each quartile were compared on the various different
parameters (CIT production ntot=60 (nQ1=15, nQ2=15, nQ3=15, nQ4=15); OTC/LDH activity ntot=52
(nQ1=14, nQ2=12, nQ3=13, nQ4=13); OTC protein expression ntot=40 (nQ1=9, nQ2=9, nQ3=10
nQ4=12); ARGase II protein expression ntot=36 (nQ1=8, nQ2=8, nQ3=8, nQ4=8); GLNase I protein
expression ntot=36 (nQ1=8, nQ2=8, nQ3=8, nQ4=8); OAT protein expression ntot=36 (nQ1=8, nQ2=8,
nQ3=8, nQ4=8); phospho-AMPKα/AMPKα ratio ntot=10 (nQ1=4, nQ2=2, nQ3=4, nQ4=10); phospho-
ACC/ACC ratio ntot=28 (nQ1=7, nQ2=6, nQ3=9, nQ4=6). Statistical analysis was not performed on
phosphor-AMPKα/AMPKα ratio as there was not enough data in all quartiles.

95
RESULTS

Clinical patient parameters

Twenty-five patients were enrolled. Table 1 summarizes the key clinical population
characteristics. As no duodenal endoscopic lesion was found, we were able to take 8 biopsies
from each patients as described previously (median weight: 12 mg [5.25-18.8].

Cell viability

Percent cell viability was not modified by hypoxia and/or inflammation (data not shown).

CIT concentration measurement

CIT concentration in culture media was not significantly modified between the four incubation
conditions tested (Figure 3). Even modifying the dataset to evaluate a global effect of hypoxia
or inflammation failed to highlight any significant variation in CIT production by duodenal
explants (hypoxia vs normoxia, NS; inflammation vs normoxia, NS).
Since 20% of cells in biopsies are immune cells, we assessed their role in CIT production via
NO synthase. When L-NAME (NOS inhibitor) was added to the medium, the patterns of results
were not affected (data not shown).

OTC activity

OTC/LDH activity ratio was significantly increased in the group exposed to hypoxia vs control
group (p=0.023), whereas ratios between the other incubation conditions were unaffected
(Figure 4).

Protein expression

Hypoxia and inflammation had no effect on protein expression after 6h of incubation, whether
considering enzymes involved in CIT production (OTC, ARGase II, GLNase I, OAT) or enzymes
activated when energy status is altered (AMPK, ACC) compared to controls (Figure 5).
However, considering protein expression variation between the other groups, only GLNase I
expression was increased in the inflammation plus hypoxia group vs hypoxia alone (p=0.017).

96
OTC gene expression

OTC mRNA expression profiles were not modified by the conditions (data not shown).

Quartiles structured in ascending order depending on CIT production

CIT production progressively increased over the quartiles. Q3 and Q4 were significantly higher
than Q1 (p<0.001) and Q4 was significantly higher than Q2 (p<0.001). Considering OTC/LDH
activity, Q4 activity ratio was significantly less effective than Q3 activity ratio (p<0.001). All
other parameters remained stable (Figure 6).

97
Discussion
This in vitro study attempted to determine whether hypoxia and/or inflammation have
consequences on enterocyte CIT production and OTC regulation. First, in order to rule out the
possible role of immune cells in the production of CIT (via NOS), we evaluated their role
through NOS inhibition by L-NAME. As the inhibition of CIT production by NOS does not modify
CIT released by the biopsies, the results reflect CIT produced by enterocytes. This study
highlighted that hypoxia and inflammation do not directly affect CIT production in the model
used. Paradoxically, hypoxia seems to increase OTC/LDH activity ratio. Note however that the
OTC activity measurement does not directly reflect CIT production by the enterocytes during
the incubation period nor in physiological conditions, but instead reflects maximal OTC
enzyme capacity (at Vmax), as OTC activity is measured at the maximal velocity of the enzyme.
Furthermore, OTC protein expression was very stable over the incubation conditions, as other
enzymes are involved in CIT production from ARG and GLN precursor (ARGase II, GLNase I,
OAT). Note that GLNase I, which catalyzes the catabolism of GLN into glutamate (GLU), was
increased in the setting of inflammation coupled with hypoxia. This result is in line with the
previous reports of unchanged GLN uptake by the enterocytes and increased GLNase I activity
(Austgen et al., 1992; Noguchi et al., 1997). Considering our initial hypothesis, and based on
our CIT production and protein expression results, we can conclude that the hypocitrullinemia
found in clinical settings with hypoxia and/or inflammation cannot be related to a decrease in
CIT production by OTC in enterocytes. However, CIT deficiency in these hypercatabolic states
could be a consequence of high enterocyte death and an increase of CIT used to produce ARG
de novo. This hypothesis converges with findings from several studies, including in rats
exposed to hypoxia and in ICU patients (Pison et al., 1998; Piton et al., 2010). More recently,
Kaur et al.(2018), studying adult Göttingen minipigs exposed to moderate radiation presenting
sepsis-like symptoms, found an increase of enterocyte death with a proliferation of apoptotic
markers, impairment of the intestinal absorption capability, and a decrease in CIT production.
It is well known that CIT concentration is mostly dependent on its intestinal synthesis and its
renal catabolism, and so plasma CIT level is correlated to active enterocyte mass (Crenn et al.,
2011; Fragkos & Frobes, 2018). Also, in a hypercatabolic state such as sepsis or ICU care, ARG
demand is high (Luiking et al., 2009) and essential for the ARGase and NOS activity involved in
immune system response. Indeed, in all clinical cases with hypocitrullinemia, metabolism is
profoundly disturbed. However, even if hypocitrullinemia is classically observed in

98
pathological situations, Jonker et al. (2016) established that intestinal citrulline production
was increased in COPD patients (which is consistent with our observations).

An important question arising from our study is why OTC activity and CIT production remain
stable whereas there is a hierarchical arrangement of ATP-consuming processes in stress
situations (OTC enzyme is known to be a huge consumer of energy (two ATPs) which makes it
a highly sensitive marker of energy status variation (Goldsmith et al., 1993; Sainz et al., 1998).
The only explanation is that CIT production is an essential process for the body and that this
function is preserved by the enterocyte. AMPK, and consequently ACC, are generally rapidly
activated when energy balance is disturbed, i.e. when ATP/ADP ratio and AMP/ATP ratio are
profoundly modified in order to inhibit ATP-dependent reactions (Long & Zierath, 2006).
However, phospho-AMPKα/AMPKα and phospho-ACC/ACC ratio remained stable over the
conditions here, which is in line with the observation on CIT production. The situations studied
do not seem to affect energy balance. To confirm that CIT production is unaffected by energy
status, we proposed a second approach to the dataset in which we pooled samples together
for each of the parameters and established CIT production-based quartiles (Q1, Q2, Q3, Q4).
They were organized in ascending order to evaluate a potential link between CIT production
and other studied parameters. The increase in CIT production does not seem to be linked with
the evolution of other parameters, such as OTC activity and protein quantification, which is
consistent with the results discussed above. Accordingly, it is reasonable to posit that CIT
production could mainly be modulated with the precursor flux. Moreover, we conclude, based
on the different quartiles of CIT production, that AMPK and ACC were not modified. This adds
strength to our finding that CIT production is unrelated to energy status, but further
confirmation is required from other approaches (i.e. reduced cellular energy state using
mildly-uncoupled mitochondria).

To conclude, this study finds that hypoxia and inflammation are not direct regulators of OTC
activity and intestinal CIT production. The data quartiles strategy used here confirms that the
metabolic crossroads at the heart of CIT production is not the key element in regulating CIT
synthesis. Taken together, the data suggests that in a catabolic situation, the enterocytes
preserve their CIT synthesis function, confirming that CIT is an important amino acid in
metabolic adaptation (especially cardiovascular and NO synthesis).

99
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102
Figure 1. Interorgan L-arginine (ARG)–ornithine–L-citrulline (CIT) metabolism (Breuillard et al., 2015).
CIT synthetized by OTC from dietary argine and glutamine in enterocytes is released into systemic
circulation and converted into L-ARG by ASS and ASL in the kidneys. This ARG-CIT-ARG interorgan cycle
maintains ARG homeostasis by preventing the excessive ARG degradation in the liver.
GLN, glutamine; GLU, glutamate; ARG, arginine; ORN, ornithine; CIT, citrulline; GLNase, glutaminase;
ARGase, arginase; OAT, ornithine aminotransferase; OTC, ornithine carbamoyltransferase; ASS,
argininosuccinate synthetase; ASL, argininosuccinate lyase

Figure 2. Experimental design

IL-1β: interleukin-1β; TNFα: tumor necrosis factor α; IFNγ: interferon-γ

103
 600
L - C IT p r o d u c t io n ( % / 6 h )

400

200

0
C I Hx I + Hx

Figure 3. CIT release in culture media, as percentage of control condition

C: Control group; I: Inflammation group; Hx: Hypoxia group; I + Hx: Inflammation + Hypoxia group.
CIT concentration in culture media was measured at the end of the incubation period and ratioed to
tissue weight for each biopsy specimen (μM/mg/6h) (n=22). Then, for each biopsy, we ratioed the
percentage to its own control and plotted the figures (%/6h). X-axis represent the fourth conditions.

300
O T C / L D H a c t iv it y ( % )

*
200

100

0
C I Hx I + Hx

Figure 4. OTC/LDH activity in biopsy specimens

C: Control group; I: Inflammation group; Hx: Hypoxia group; I + Hx: Inflammation + Hypoxia group.
OTC activity was measured in each biopsy and ratioed to the LDH activity representing cell viability
after 6h of incubation. *p=0.023. X-axis represent the fourth conditions.

104
Figure 5. Protein expression of enzymes implicated in the regulation of CIT production
C: Control group; I: Inflammation group; Hx: Hypoxia group; I + Hx: Inflammation + Hypoxia group.
Protein expression was evaluated after a 6h incubation period. Protein expression was ratioed to total
protein expression, except for phosphorylated proteins which were ratioed to the corresponding non-
phosphorylated protein. Pictures of Blots and Ponceau S staining are presented in the same order as
graph one (1st line: C, 2nd line: I, 3rd line: Hx, 4th line: I + Hx). A. OTC expression (n=12, p>0.05). B. ARGase
II expression (n=9, p>0.05). C. GLNase I expression (n=10, Hx vs I+Hx #p=0.017). D. OAT expression
(n=10, p>0.05). E. AMPKp α/AMPK α expression ratio (n=5, p>0.05). F. ACCp/ACC expression ratio (n=8,
p>0.05).

105
 A. L - C IT p r o d u c t i o n B. O T C e n z y m e a c t i v it y
1 .5 §§§
0 .4
L - C IT p r o d u c t io n ( M / m g / 6 h )
###

O T C / L D H a c t iv it y
*** 0 .3
1 .0

0 .2

0 .5
0 .1
***

0 .0 0 .0
Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4

C. O T C e x p r e s s io n D. A R G II e x p r e s s io n

2 .5
O T C / t o t a l p r o t e in e x p r e s s io n

1 .5

A R G a s e II/ t o t a l p r o t e in
2 .0

1 .0

e x p r e s s io n
1 .5

1 .0
0 .5

0 .5

0 .0 0 .0
Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4

E. G L N a s e I e x p r e s s io n F. O A T e x p r e s s io n
8
O A T / t o t a l p r o t e in e x p r e s s io n

1 .5
G L N a s e I/ t o t a l p r o t e in

1 .0
e x p r e s s io n

0 .5
2

0 .0 0
Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4

G. P h o s p h o - A M P K /A M P K e x p r e s s io n H. P h o s p h o - A C C /A C C e x p r e s s i o n

1 .5 6
P h o s p h o - A C C / A C C e x p r e s s io n
P h o sp h o -A M P K /A M P K

1 .0 4
e x p r e s s io n

0 .5 2

0 .0 0
Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4

Figure 6. Quartiles of CIT production, OTC/LDH activity, and protein expression in biopsies
(Q1: 1st quartile; Q2: 2nd quartile; Q3: 3rd quartile; Q4: 4th quartile)
Datasets on each group (Control, Inflammation, Hypoxia, Inflammation + Hypoxia) for each parameter
were pooled together. Quartiles were established for each parameter depending on patient matches
and L-CIT production parameters organized in ascending order. Statistical analysis was performed

106
between quartiles of each parameter, except for AMPKp/AMPk expression ratio for which there was
not enough data in each quartile. A. CIT production ntot=60 (nQ1=15, nQ2=15, nQ3=15, nQ4=15)
***p<0.001 vs Q1, ###p<0.001 Q4 vs Q2. B. OTC/LDH activity ntot=52 (nQ1=14, nQ2=12, nQ3=13,
nQ4=13) §§§p<0.001 Q4 vs Q3. C. OTC protein expression ntot=40 (nQ1=9, nQ2=9, nQ3=10 nQ4=12) p>0.05.
D. ARGase II protein expression ntot=36 (nQ1=8, nQ2=8, nQ3=8, nQ4=8) p>0.05. E. GLNase I protein
expression ntot=36 (nQ1=8, nQ2=8, nQ3=8, nQ4=8) p>0.05. F. OAT protein expression ntot=36 (nQ1=8, nQ2=8,
nQ3=8, nQ4=8) p>0.05. G. AMPKp α/AMPK α ratio ntot=10 (nQ1=4, nQ2=2, nQ3=4, nQ4=10). H. ACCp/ACC
ratio ntot=28 (nQ1=7, nQ2=6, nQ3=9, nQ4=6) p>0.05.

Table 1. Clinical patient data

CLINICAL DATA
AGE (YEARS) Average 38
Range 19–73
GENDER Female 55%
Male 44%
BODY MASS INDEX (BMI)
Average 25
(KG/M2)
Range 18.0–38.1

107
 Etude n°3

La citrulline endogène contrôle-t-elle le métabolisme protéino-énergétique ?

Morgane Couchet, Charlotte Breuillard, Karine Couturier, Christelle Corne et Christophe

Moinard.

Introduction

La CIT exogène est connue pour ses effets pleïotropiques sur le métabolisme au niveau corps
entier. Plus particulièrement, une complémentation en CIT est un activateur puissant de
fonction musculaire, et plus particulièrement de la synthèse protéique. Physiologiquement, la
biodisponibilité de la CIT dans l’organisme dépend de sa production intestinale via son enzyme
clé l’OTC. A ce jour, il n’existe aucun modèle in vivo permettant d’explorer spécifiquement
l’impact d’une production endogène de CIT par l’intestin sur le métabolisme.

But de l’étude

Le premier objectif de cette étude est de développer et valider un nouveau modèle murin
dont le gène de l’OTC est spécifiquement muté dans l’intestin, grâce à une approche basée
sur la technologie Cre/Lox. Le second objectif étant donc d’utiliser ce modèle in vivo pour
évaluer l’impact d’une inhibition de la production intestinale de CIT sur le métabolisme
protéino-énergétique.

Méthodes

La délétion du gène de l’OTC a été activée chez des souris âgées de 10-11 semaines dans le
but d’inhiber la production intestinale de CIT. Les animaux ont été répartis dans 4 groupes
différents : femelle CTRL (control), femelle OTC-KO, mâle CTRL et mâle OTC-KO. Une partie
des animaux est maintenue in vivo pendant 14 semaines tandis que la seconde partie est
maintenue pendant 18 mois. In vivo, la capacité maximale d’endurance, l’activité locomotrice
spontanée ainsi que le métabolisme énergétique ont été évalués. Post mortem, les AAs
plasmatiques totaux, les données anthropométriques, le métabolisme glucidique et lipidique,

108
l’expression protéique des enzymes impliquées dans la production intestinale de CIT (OTC,
ARGaseII, GLNaseI, OAT) ainsi que la synthèse protéique musculaire et le contenu protéique
totale musculaire ont été évalués. Enfin, l’impact d’un régime hypoprotéique modéré (75%) a
été étudié et les données anthropométriques collectées.

Résultats

Tout d’abord, le modèle mis au point a été validé. Les souris adultes soumises à un régime
standard pendant 14 semaines ont été capable de compenser l’abscence de CIT endogène.
Chez des souris âgées soumises au même régime, quelques altérations métaboliques
mineures apparaissent telles qu’un ralentissement global de la prise de masse corporelle chez
l’ensemble des animaux OTC-KO, ainsi qu’une modification de la sensibilité à l’insuline et une
diminution de la synthèse protéique musculaire dans le soleus des mâles. De manière
intéressante, toutes les souris OTC-KO perdent une partie de leurs poils. L’induction d’un
régime hypoprotéique chez des souris adultes entraine une chute rapide et drastique de
l’ensemble des paramètres anthropométriques de l’organisme. Les animaux OTC-KO perdent
environ 30% de leur masse maigre ainsi que 80 à 85% de leur masse grasse. De plus, la masse
de l’ensemble des organes, et plus particulièrement, des muscles et du coeur, est fortement
diminuée.

Conclusion

Les souris adultes saines semblent capables de compenser l’absence de production de CIT par
l’intestin, alors que quelques prémices mineures d’altérations métaboliques apparaissent
chez des animaux âgés sains. En revanche, chez des souris adultes dénutries, le métabolisme
semble se dérégler totalement et être incapable de faire face à l’absence de CIT endogène.
Dans ces situations, la CIT, et donc son enzyme clé l’OTC, semble jouer un rôle majeur dans la
régulation métabolique.

109
 Does endogenous citrulline controls protein-energy metabolism ?

Morgane Coucheta, Charlotte Breuillarda, Karine Couturiera, Christelle Cornea,b and Christophe
Moinarda

a- Univ. Grenoble Alpes, Inserm, LBFA, 38 000 Grenoble, France.

b- Centre Hospitalier Universitaire Grenoble Alpes University Hospital, Avenue Maquis du
Grésivaudan, 38700 La Tronche, France.

Correspondence to:
Pr Christophe Moinard
Laboratoire de Bioénergétique Fondamentale et Appliquée, INSERM U 1055
Université Grenoble Alpes
2280 rue de la Piscine
38 000 Grenoble Cedex 9, France
christophe.moinard@univ-grenoble-alpes.fr.

Acknowledgments

The authors thank Cochin institute, Paris, and the plateform of animal high technology,
Grenoble for their contribution to establish and maintain mice model line. Also, the authors
thank Cindy Tellier, Pauline Durenbach, Amel Arouchi, Hervé Dubouchaud, Beatrice Morio,
Philippe Noirez, Geoffrey Maillard, Dany Mandala and Martin Boutiere for their implication in
the work. Then, we would thank AGIR foundation for their financial support.

Conflict of interest

Charlotte Breuillard and Christophe Moinard are shareholders of Citrage foundation.

110
ABSTRACT

Background: Exogenous L-Citrulline (CIT) has shown to have pleiotropic effect on the global
metabolism. Particularly, CIT complementation is a strong activator of muscle function, and
more specifically of protein synthesis. Physiologically, CIT bioavailability depends on its
intestinal production thanks to its key enzyme: ornithine carbamoyltransferase (OTC). To date,
there is no in vivo model to explore specific endogenous intestinal CIT production effects on
protein-energy metabolism. Thanks to an original Cre/Lox construction model, we evaluate in
vivo, the impact of an inhibition of the CIT production on the protein-energy metabolism.

Methods: 10-11 weeks old mice have been OTC-KO induced to stop intestinal CIT production
under standard diet. Four groups were implemented as female CTRL (control), female OTC-
KO, male CTRL and male OTC-KO. Animals were maintained for 14 weeks or 18 months. In
vivo, maximum endurance capacity, spontaneous locomotor activity and energy metabolism
were evaluated. After, plasma amino acids, anthropometric data, glucose and lipid
metabolism, intestinal protein expressions and muscle protein synthesis were explored. Then,
impact of a low protein diet (75% of daily requirement) was investigated on the four groups
described and anthropometric data were collected.

Results: First, the original mice model was validated. In healthy adult mice the effect of a lack
of CIT is limited, while minor alterations appeared in healthy old mice, as a decrease in global
weight gain in both sex, an insulin sensitivity improvement (+48%) and a decrease in soleus
protein synthesis (-79%), in old male. Interestingly, all OTC-KO mice lost hair probably due to
ARG deficiency. Using a low protein diet induces rapid and global anthropometric
disturbances. Animals lost approximately 30% of their lean body mass and 80 to 85% of the
fat one. Also, almost all organs weight and particularly muscles mass were strongly decreased.

Conclusion: Healthy adult mice seem to be able to compensate the lack of endogenous CIT
production, while some minor advertisements take place with edging in healthy conditions.
For the first time, this work underlines the key role of the endogenous CIT production in
situation of protein-energy disturbances. The precise mechanisms implicated remain to be
elucidated.

Keywords: citrulline; ornithine carbamoyltransferase; muscle; protein-energy metabolism

111
ABREVATIONS:

AA: Amino acid

ARG: L-arginine
ARGase: Arginase
ASL: Argininosuccinate lyase
ASS: Argininosuccinate synthase
AUC: Area under the curve
BAT: Brown adipose tissu
BC: Blood sample collection
CIT: L-citrulline
CYS: L-cystine
DNA: Deoxyribonucleic acid
DTT: Dithiothreitol
EDL: Extensor digitorus longus
EDTA: Ethylene-diamine-tetra-acetic acid
EE: Energy expenditure
ELISA: Enzyme-linkedimmunosorbent assay
GLN: L-Glutamine
GLNase: Glutaminase
GLU: L-Glutamate
HEPES: Hydroxyethyl-piperazine-ethane-sulfonic acid
IP: Intraperitoneal
KO: Knock-out
LEU: L-Leucine
LT: Long term
LYS: L-Lysine
MEC: Maximum endurance capacity
MPS: Muscle protein synthesis
NEFA: Non-esterified fatty acids
NO: Nitric oxide
OAT: Ornithine aminotransferase

112
OGTT: Oral glucose tolerance test
OTC: Ornithine carbamoyltransferase
ORN: L-Ornithine
PCR: Polymerase chain reaction
PBS: Phosphate Buffered saline
RQ: Respiratory quotient
SDS: Sodium dodecyl sulfate
SLA: Spontaneous locomotor activity
ST: Short term
TCA: Trichloroacetic acid
WAT: White adipose tissue

113
INTRODUCTION

For the last decade, new concepts have emerged concerning amino acid (AA) properties. In
addition to their contribution as protein precursor and energy metabolism, recent studies
have highlighted the role of AAs as signal molecules. Particularly, L-Citrulline (CIT) is shown to
have huge regulatory properties on protein-energy metabolism. Indeed, an original work in
old malnourished rats model supplemented with CIT has shown this AA increased muscle
protein synthesis (MPS) and muscle protein content (Osowska et al., 2006), with an
improvement of maximal muscle strength and motricity (Faure et al., 2012). This beneficial
effect of CIT on muscle could be due to a direct modulation of MPS through the mammalian
target of rapamycin complex 1 (mTORC1)/ phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/MAPK
pathways (Le Plénier et al., 2017). More recently, an in vitro study confirmed that CIT
stimulates MPS through its ablility to reallocate mitochondria fuel (ATP) to MPS (Goron et al.,
2019). Those results on MPS have been confirmed in humans, and particularly in healthy
humans under a low-protein diet (Jourdan et al., 2015) and in elderly people (Bouillanne et
al., 2018, Buckinx et al., 2018; Buckinx et al., 2019).
Nevertheless, interestingly, all this data on the effects of CIT on MPS and muscular function
were observed in protein-energy deficiency or malnutrition models. In healthy animals,
despite an increased MPS (+33%), CIT did not have any effect on muscle mass and muscle
protein content (Goron et al., 2015). This is in accordance with the hypothesis of Moinard and
Cynober (2007) which consists in the fact that CIT could be effective in postabsorptive state
or in a situation of low protein intake in order to maintain “a minimal protein synthesis level
(…) to be compatible with life”.
Since CIT benefits on muscle were highlighted, pleiotropic effect of CIT has been observed. CIT
has shown, indeed, to have benefic effects on cerebral function (Marquet-de Rougé et al.,
2011; Guingay et al., 2013, Moinard et al., 2017), immune system stimulation (Bansal et al.,
2004; Breuillard et al., 2015), cardiovascular metabolism (Romero MJ et al., 2006; Wijnands
et al, 2015; Figueroa et al., 2012) and insulin sensitivity (Capel et al., 2015). Moreover, CIT is
implicated in lipid metabolism with a direct stimulation on white adipose tissue (WAT) by
increasing non-esterifed fatty acid (NEFA) and glycerol released (Joffin et al., 2014a; Joffin et
al., 2014b).

114
Those properties evidence strong effects of exogenous supply of CIT, however, knowledges
about endogenous CIT role in metabolism are not well referenced. Physiologically, CIT
bioavailability depends on its synthesis by the intestinal mucosa and specifically on the
efficiency of its key enzyme: ornithine carbamoyltransferase (OTC). This latter, metabolizes
ornithine and carmaboyl phosphate into CIT (Curis, 2005). Several years ago, a team proposed
to use delta-N-(phosphonacetyl)-L-ornithine as specific inhibitor of OTC to evaluate the
importance of CIT at whole body level (Hoogenraad et al., 1985). Nevertheless, as OTC plays a
major role in hepatocytes urea cycle, it is not possible to discare the specific role of intestinal
CIT production and urea cycle impairment. Moreover, a mouse model of mild ornithine
carbamoyltransferase deficiency (spf-j) exists, but the mutation is not specific to the intestine
and also affects the liver (Tarasenko et al., 2015). To date, there is no in vivo model to explore
specific endogenous intestinal CIT production effects. Our team, developed the first intestinal
inducible OTC-knock-out (KO) mice model thanks to a Cre/Lox system, induced by tamoxifen
injection, to explore the role of the intestine in the regulation of protein-energy metabolism.
In the first part of the study, we evaluated the effect of CIT on metabolism in standard
conditions during short term (ST) and long term (LT). In the second part, we evaluated the
effects of this AA in case of imbalanced situation, because, as explained above, exogenous CIT
has beneficial effects in protein-energy deficiency or malnutrition models.

115
METHODS

Animals

The experimental protocol was approved by the Rhones-Alpes regional ethic committee and
authorized by the French Ministry of Research (#8706).
Study was performed on inducible KO mice for the intestinal OTC gene thanks to a Cre/Lox
system (Figure 1). This technic consists in two Lox-P sites integrated in the 3rd exon (catalytic
site) of the OTC enzyme of C57Bl6 mice. The mice also expresses the Cre recombinase gene
specifically induced in the intestine thanks to the Villin promotor. They also have a link domain
to steroid receptors (ERT2) which links tamoxifen and activates the genetic mutation leading
to OTC gene deletion in the intestine (El Marjou et al., 2004). Mice C57Bl/6N OTCfl/fl or fl/Y,

Villin- CreERT2tg/+ were used as OTC-KO group (OTC-KO) and C57Bl/6N OTCfl/fl or fl/Y, Villin-
CreERT2+/+ were used as control group (CTRL). As OTC gene is located on X chromosome,
experiments were performed on male and female. OTC-KO was induced on adult mice (10-11
weeks old) thanks to intraperitoneal (IP) injection of tamoxifen (1 mg/mouse/day) for 5
consecutive days (El Marjou et al, 2004). Both CTRL group and OTC-KO group received
tamoxifen injection.
Mice were housed on a 12-h light/dark cycle with free access to deionized water. Three or
four animals were distributed per cage.

Genotyping

Mice genotype was determined thanks to the following protocol or by the Neurocentre
Magendie facility (Bordeaux, France). Mice finger tissue was digested in specific lysis buffer
(DirectPCR Lysis Reageant, Euromedex, Souffelweyersheim, France) supplemented with
proteinase K 10mg/ml (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, United States) overnight, at 56°C,
followed by 1 hour at 85°C to denature proteinase K. DNA concentration was estimated thanks
to a NanoDrop spectrophotometer (Thermoscientific, France). Germline transmission was
detected by polymerase chain reaction (PCR) analysis. PCR amplification of OTClox/lox gene was
done with the sens primer « OTC-2F » 5’-ACATGAAGCTAAAAACTGAGGCTCATCAGA-3’, and the
antisens primer « OTC-1R » 5’-TAGAAATGCAGACTTCCCAGGAGGTCCCA-3’. PCR amplification
of Villin-CreERT2 transgene was done with the sense primer « 2kbseqS » 5’-
CAAGCCTGGCTCGACGGCC-3’, and the antisense primer « Cre198as » 5’-

116
CGCGAACATCTTCAGGTTCT-3’. Homozygous OTClox/lox gene generate a 1358 pb DNA segment
and Villin-CreERT2 transgene generate a 220 pb DNA segment.

Experimental design

Standard condition study

Mice phenotyping has been studied during 14 weeks after OTC-KO induction for the short
term (ST) study, and during 18 months after OTC-KO induction for the long term (LT) study.
After an acclimatization period, mice were divided into four groups for both ST and LT study:
female CTRL group (ST study, n=21; LT study, n=5), female OTC-KO group (ST study, n=25; LT
study, n=10), male CTRL group (ST study, n=17; LT study, n=6), and male OTC-KO group (ST
study, n=26; LT study, n=10).
The mice have an ad libitum access to standard diet A04 (16.1% proteins, 3.1% lipids, 64.3%
carbohydrates; Safe, Augy, France).
For the ST study, spontaneous locomotor activity (SLA), energy expenditure (EE) and
maximum endurance capacity (MEC) were evaluated every two weeks (wk 0, wk 2, wk 4, wk
6, wk 8, wk 10, and wk 12 after tamoxifen injection). EE measurement was followed by blood
sample collection (BC). Body weight and food intake were measured each intermediate weeks
(wk -1, wk 1, wk 3, wk 5, wk 7, wk 9, wk 11, and wk 13 after tamoxifen injection). At wk 13, an
oral glucose tolerance test (OGTT) was performed (see below) and the mice were euthanized
at wk 14 (Figure2A).
For the LT study, SLA, EE and MEC were measured every 3 months (mo 7, mo 10, mo 13, and
mo16 after tamoxifen injection). BC was done at mo 8, mo 11, mo 14, and mo 17 after
tamoxifen injection. Body weight and food intake were measured each week during the 18 th
months of the study. At 17th months an OGTT was performed (see below) and mice were
euthanized at 18 months (Figure2B).

Hypoprotein diet
After an acclimatization period, mice were divided into four groups: female CTRL group (n=4),
female OTC-KO group (n=8), male CTRL group (n=6), and male OTC-KO group (n=6), and
received a low protein (75% of their requirements) isocaloric diet (based on semi-purified diet
(AIN93G); 12% proteins, 7.3% lipids, 65.9% carbohydrates; SAFE).
Body weight and food intake were measured weekly. After 3 weeks of diet, animals were
killed.

117
Energy expenditure (EE)

EE was measured using an indirect open circuit calorimeter in individual cages. Oxygen
consumption (VO2), carbon dioxide production (VCO2) and respiratory quotient (RQ) were
monitored using a gas analyser (LE 405, Panlab-Bioseb). Airflow rate is obtained from a gas
pump and a flow meter (Panlab-Bioseb). Data were recorded using a computer-assisted data
acquisition program (Metabolism Software, Version 2.0.2). EE was calculated according to the
following formula: EE = (3.815 + 1.232 x VO2/VCO2) x VO2 x 1.44 (kcal.day -1.kg-1). Mice were
acclimatized individually in specific calorimetry cages the previous evening of the recording
start (approx. 14 hours) and the parameters were recorded for 24 hours.

Spontaneous locomotor activity (SLA)

SLA was evaluated thanks to a video tracking system using a digital camera (Switch Grip II,
Samsung Electronics, Seoul, Republic of Korea) fixed on a tripod and oriented above the cage
(Chabert et al., 2016). Acquisition rate set was 1 picture/sec and data processing were
analyzed with the software MATLAB 9.5 (MathWorks R2018b, Natick, MA) (Chabert et al.,
2016). Mice were acclimatized individually in housing cages the evening before the recording
start (approx. 14 hours) and SLA was monitored for 24 hours.

Maximum endurance capacity (MEC)

Mice were acclimatized with a motorized rodent treadmill (CONTROL LE8710, Bioseb,
Vitrolles, France), thanks to running sessions for 5 days (5 min/day; 15m/min). After
acclimatization, mice performed a MEC test (5 minutes at 15 m/min; 25 minutes at 18m/min
and 20m/min until the end of the test) until exhaustion, which is defined as the first
occurrence of failing to keep up with the treadmill speed more than three times in ten seconds
despite mild electrical shock stimulation to maintain the running motivation. MEC test
measured the maximal running time of each animal and should be performed as close as
possible to the activity period of the mice.

118
Blood sample collection

Blood was collected on conscious mice from the submandibular vein allowing to obtain a
significant plasma volume with minimal trauma for the animal. Plasma CIT concentration will
then be determined to confirm the inhibition of OTC. Animal recovery should be at least 4
weeks after this procedure.

Plasma AAs concentration

Plasma AAs concentration was measured by ion exchange chromatography followed by post-
column derivatization with ninhydrin (Hitachi L8800 analyzer-Sciencetec) as previously
described (Le Boucher et al., 1997) or with UPLC-MS (Acquity UPLC H-Class QDa) using a
CORTECS UPLC C18 column after a derivatization step (AccQTag Ultra®kit Waters).

Functional test of glucose homeostasis

Oral glucose tolerance test (OGTT) was performed 1-2 weeks before euthanasia to evaluate
glucose homeostasis in adult mice. Animals received a glucose solution (2mg/g) by gavage
after 15 hours of fasting. Blood samples were collected from the tail vein, before, and 15, 30,
60, 90 and 120 minutes after glucose administration (Jacquet et al., 2019). Blood glucose
concentration was measured with an Accu-Chek glucometer (Roche Di-agnostics, Mannheim,
Germany). The area under curve (AUC) was obtained from the integrated curve of glucose
variation against time thanks to trapezoidal method.

Plasma insulin level

Plasma insulin concentration was evaluated before and 15 minutes after glucose-stimulated
state thanks to a Mouse Ultrasensitive Insulin Elisa kit (Alpco, Salem, New Hampshire, United-
States). The difference of plasma insulin concentration between before and 15 min after OGTT
was calculated.

119
Euthanasia

In order to measure MPS thanks to the SUnSET method (Goodman et al., 2011), 30 minutes
before euthanasia, the animals were injected (IP injection) with a puromycine (40 nmol/g;
Sigma-Aldrich) solution (dissolved in PBS). Then, they were euthanized with Xylazine
(10mg/kg)/ketamine (100mg/kg) IP injection followed by exsanguination. Blood was collected
from abdominal vein or cardiac ventricle.
Rapidly after exsanguination, organs (liver, heart, spleen, thymus, left kidney, left adrenal
gland), muscles (extensor digitalis longus -EDL-, tibialis, soleus, plantaris, and gastrocnemius)
adipose tissue (urogenital, retroperitoneal, subcutaneous white adipose tissue (WAT) and
brown adipose tissue (BAT)) were dissected and weighed. Carcass, skin and the remainder of
the viscera were also weighed. Retroperitoneal tissue is immediately put in a simple Krebs
Ringer buffer saline (KREBS) medium (NaCl 6,3g/L, KCl 0,32g/L, CaCl2 0,14g/L, KH2PO4 0,15g/L, MgSO4
0,25g/L, NaHCO3 2g/L, pH 7.4) and other organs were conserved at -80°C for further analysis.

Body composition

Lean body mass was measured by the addition of the weight of the following organs: liver,
heart, spleen, thymus, left kidney, left adrenal gland, EDL, tibialis, soleus, plantaris,
gastrocnemius, BAT, carcass, skin and the remainder of the viscera. The fat mass was
calculated by the addition of the urogenital, retroperitoneal and subcutaneous WAT.

Adipose tissue explants culture

Retroperitoneal WAT from CTRL and OTC-KO groups were used for in vitro experiments. Two
hundred mg of tissue were cut in about 10 fragments in a full KREBS medium (NaCl 6,3g/L, KCl
0,32g/L, CaCl2 0,14g/L, KH2PO4 0,15g/L, MgSO4 0,25g/L, NaHCO3 2g/L, Glucose 5mM (Sigma-
Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France)), penicillin (100 U/ml; PAN-Biotech), streptomycin (0.1
mg/ml; PAN-Biotech) and 1% of fetal calf serum (Sigma-Aldrich)). Tissues were in a 21% O2 /
5% CO2 chamber and incubated at 37°C. After 24h of equilibration, medium was renewed for
24h incubation. At the end of the incubation period, WAT and medium culture were conserved
at -80°C for further analysis.

120
Non-esterified fatty acids (NEFA) release

NEFA released by mice retroperitoneal WAT was measured thanks to a free fatty acid
quantification kit (Sigma-Aldrich) using a photometric method as previously described
(Cadoudal et al., 2007).

Glycerol release

Glycerol release by mice retroperitoneal WAT was evaluated thanks to enzymatic assay
BioAnalysis/Food Analysis-Kit R-BIOPHARM (Boehringer, Mannheim, Germany) using a
photometric method, as previously described (Cadoudal et al., 2007).

OTC enzyme assay

OTC activity was measured in liver, jejunum and ileum with an enzymatic and colorimetric
assay (Ventura et al., 2013). Tissues were lysed in buffer containing 0.3M sucrose (Sigma-
Aldrich), 5mM hydroxyethyl-piperazine-ethane-sulfonic acid (HEPES; Sigma-Aldrich), 3mM
Dithiothreitol (DTT; Sigma-Aldrich) and 0,5% triton X-100 (Sigma-Aldrich). After
freezing/thawing cycles in order to release OTC from mitochondria, enzymatic assay was
performed. Reaction mix was composed of 5mM L-ornithine hydrochloride (Sigma-Aldrich)
and 5mM carbamoyl phosphate disodium salt (Sigma-Aldrich), diluted in a tris-base buffer
(10mM, pH=8.5; Sigma-Aldrich). Addition of tissue lysate started the reaction. After 15
minutes (T15) of incubation at 37°C, 6.25% trichloroacetic acid (TCA; Sigma-Aldrich) was
immediately added to the sample (w/w) to stop the catalyzed reaction. A sample of the
reaction mixture has been removed at the beginning (T0), and mixed with TCA, to be used as
reference.
Finally, CIT concentration was evaluated by a colorimetric assay with the following reagents
mixture: a sulfuric and phosphoric acid mixture, a redox mixture of ammonium iron (III) sulfate
dodecahydrate and ammonium iron (II) sulfate hexahydrate and a solution of
diacétylmonoxime 0.75%. Absorbance was read at 490 nm and CIT concentration was
deduced thanks to a standard curve obtained with CIT solution used as calibration standard.
CIT production by tissue lysate was determined by substracting T0 CIT concentration to T15
CIT concentration.

121
Tissue Protein content

Frozen jejunum, ileum and muscles (EDL, tibialis, soleus, plantaris, and gastrocnemius) were
homogenized in 10% trichloroacetic acid (10 volumes) with a glass/glass potter at 4°C. After
centrifugation, the precipitate was used for protein content determination. After delipidation
with acetone, the precipitate was dissolved in 1N NaOH (4 mL/100 mg tissue) for 12h at 37°C.
Total protein content was assayed by Pierce method using a BCA (BiCinchoninic acid Assay) kit
(Interchim, Montluçon, France) and expressed in mg of protein/muscle.

Protein quantification

Protein expression was analyzed by Western Blot to evaluate protein expression of enzymes
implicated in CIT intestinal production and MPS. Tissues (approximately 100mg of jejunum,
ileum or EDL, tibialis, soleus, plantaris and gastrocnemius) were lysed in a commercial RIPA
buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 150 mM sodium chloride, 1.0% Igepal CA-630 (NP-40),
0.5% sodium deoxycholate, and 0.1% sodium dodecyl sulfate; Sigma-Aldrich), added with
protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) and phosphatase inhibitor cocktail (Fischer
Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France). Proteins were quantified by Pierce method using a
BCA kit (Interchim). After having been diluted in Blue loading buffer (Cell Signaling, Leiden, The
Netherlands) to be standardized at 1mg/ml and heated at 100°C for 5 min, proteins, at
30µg/lane, were separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane.
Protein immunodetection was performed using anti-OTC antibodies (1:1000 dilution; Sigma-
Aldrich), anti-ARGase II (1:250 dilution, Sigma-Aldrich), anti-GLNase I (1:1000, Abcam,
Cambridge, United-Kingdom), anti-OAT (1:200, Sigma-Aldrich), and anti-puromycine (1:5000,
Millipore, France) as primary antibodies. Ponceau S staining was used as reference.
Membranes were incubated overnight with primary antibodies at 4°C. Primary antibodies
were detected with secondary anti-rabbit or anti-mouse antibodies conjugated to horseradish
peroxidase (1:1000 dilution; Jackson ImmunoResearch, Ely, United Kingdom). Signals were
revealed using chemiluminescence system (Amersham ECL Prime kit, GE Healthcare) and
quantified with the Image J software (version 1.48).

122
Statistical analysis

As OTC is an X chromosom-linked gene, it was important to take in consideration the sex factor
in addition to the KO effect in the statistical analysis, even if differences between sexes were
not highlighted in this paper. Normal distribution and variance homogeneity were verified (p
> 0.05). Due to small number of animals in several groups, normality was not reached at all
time. However, as two-way ANOVA does not have equivalent nonparametric test and is robust
to normality, a two-way ANOVA was performed followed by a Holm-Šidák post-hoc test to
evaluate the OTC-KO effect, considering the risk that it may increase the probability of a type-
I error (α error). Most of the data sets are expressed as mean ± SEM. But, due to MEC, SLA
and protein expression heterogeneity, they were expressed as median ± interquartile and
represented as box plot to make the high disparity more visible.

123
RESULTS

Model validation

Plasma AAs concentration

Plasma CIT was largely decreased (approximatively 10 fold) in OTC-KO group compared to the
CTRL group in both sexes and both ST and LT study (ST study: female p<0.0001, male p<0.0001;
LT study: female p=0.0053, male p<0.0001) (Figure 3).

Plasma ARG is decreased in OTC-KO group in both sexes in the ST study, and only in male in
the LT study compared to the CTRL group (Table 1). ORN, CYS and LYS are only decreased
compared to the CTRL group, in female from the ST study. Otherwise, all essential AAs are
unaffected in both ST and LT study whatever the gender and genetic modification (Table 1).

OTC enzyme activity

OTC enzyme activity was strongly diminished in the OTC-KO group vs CTRL group for each sex
in jejunum (ST study: female p<0.0001, male p<0.0001; LT study: female p=0.0053, male
p<0.0001) and in ileum (ST study: female p<0.0001, male p<0.0001; LT study: female
p<0.0001, male p<0.0001) whatever the time of the study (Figure 4).
OTC enzyme activity was the same in the liver of each group in both studies (NS) (Figure 4).

OTC protein expression

In the ST study, OTC protein expression in jejunum and ileum was almost non-detectable in
the OTC-KO group (p<0.0001), while it was restored as the CTRL group (NS) at the end of the
LT study (Figure 5).
In the liver, OTC protein expression was not different in the OTC-KO groups (female and male)
compared to their respective CTRL group, both in ST and LT study (Figure 5).

124
ST and LT study under standard diet

Mortality

Mice mortality was not different between CTRL group and OTC-KO group in both sexes, over
the ST study and the LT study period (data not shown).

Body weight and food intake

In the ST study, OTC-KO female had a higher body weight compared to the CTRL group
(p<0.0001), whereas no differences were observed in male groups (Figure 6). Inversely, in the
LT study OTC-KO group had a lower body weight than the CTRL group in female (p=0.0038)
and in male group (p<0.0001) (Figure 6).
Food intake was similar between the groups in the ST and the LT study (data not shown).

Energy expenditure (EE) and respiratory quotient (RQ)

The phenotype of the animals had no effects on EE and RQ, whatever the sex of the mice and
the time of the study (data not shown).

Spontaneous locomotor activity (SLA)

The motricity of the mice remained stable between CTRL and OTC-KO group all along the time
of the studies in both sexes (Figure 7).

Maximum endurance capacity (MEC)

Endurance capacity was not modified with the KO activation at each time the test was
performed whatever the time, the sex and the genotype of the animals. However, a global
decrease in endurance performance was observed in female of the ST study (p=0.0017) (Figure
8).

Body composition

Body composition (lean body mass and fat body mass) of the animals were the same whatever
the gender of the animals or the time of the study (Figure 9).

125
Organ weight

Muscle mass (EDL, tibialis, soleus, plantaris and gastrocnemius) were not different in OTC-KO
groups compared to CTRL groups in female and male and ST and LT studies (Table 3).
Adipose tissues were also identical in KO and CTRL mice in both studies (Table 3).
Liver, heart, spleen, kidney, thymus and adrenal gland were not modified by the phenotype
of the animals (Table 3).

Tissue protein content

Muscle protein content were the same whatever the sex of the animals or the time of the
study, except for the plantaris of the male OTC-KO mice whose protein content was lower
than those of CTRL mice in ST study (Table 3).
Considering liver and intestine protein content, there was no difference between OTC-KO and
CTRL animals in LT study, except ileum protein content which was lower in OTC-KO male
compared to CTRL ones (data not shown).

Muscle protein synthesis

In ST study, muscles protein synthesis was not modified by the phenotype of the animals in
soleus and gastrocnemius (Figure 10).
In LT study, the only differences were a lower MPS in EDL of female OTC-KO compared to CTRL
animals and a lower MPS in soleus for the male OTC-KO animals compared to CTRL ones
(Figure 11).

Glucose homeostasis

AUC of OGTT was not significantly modified in OTC-KO male group compared to CTRL male
group in the ST study, however, it was significantly lower in OTC-KO male (AUC 5681 ± 887
mg/min/dL) compared to CTRL male (11053 ± 1914 mg/min/dL) in LT study, while it was not
modified in female (Figure 12).
The increased of plasma insulin after OGTT was not different in male and female in both
studies (ST study: [CTRL female 0.49 ± 0.04], [OTC-KO female 0.56 ± 0.06] ; [CTRL male 0.67 ±
0.12], [OTC-KO male 0.69 ± 0.16]), (LT study: [CTRL female 1.29 ± 0.25], [OTC-KO female 1.28
± 0.26] ; [CTRL male 2.62 ± 0.68], [OTC-KO male 2.08 ± 0.40]).

126
ST study (CTRL female n=6, OTC-KO female n=8; CTRL male n=6, OTC-KO male n=10); LT study
(CTRL female n= 5, OTC-KO female n=10; CTRL male n=6, OTC-KO male n=10).

NEFA and glycerol release from WAT

Free fatty acid release was stable between CTRL and OTC-KO group in both sexes and studies
(Table 2).
Glycerol release was stable in male of both groups and studies. Its concentration was also
similar in female mice of the LT study, while it is decreased in the female OTC-KO group
compared to the CTRL group of the ST study (Table 2).

Intestine enzyme expression

ARGase II protein expression in jejunum and ileum is decreased in OTC-KO female compared
to the CTRL female in both ST and LT study, while, its expression is stable in male groups
(Figure 13, Figure 14). GLNase I protein expression is stable over the sex, the genotype and the
time of the study (Figure 13, Figure 14). OAT protein expression is stable over the sex and
genotype in the ST study. In the LT study, OAT protein expression is stable in ileum whereas it
is increased in OTC-KO female compared to the CTRL female and decreased in OTC-KO male
compared to the CTRL male in the LT study (Figure 13, Figure 14).

Skin characteristic

As an unexpected result, LT study OTC-KO mice were losing hair whatever the sex unlike the
CTRL mice (Figure 15). Hair lost was not observed in adult state but start with aging and
progress quite rapidly.

127
Study under low protein diet (75% of daily requirement)

Body weight

Body weight of CTRL female and male decreased to 5% the first week and stayed stable until
the end of the study. In contrast, body weight of OTC-KO female and male decreased from
approximatively 10% every week to reach 70% and 76% (respectively) of their initial body
weight, respectively, in 3 weeks (Figure 16). The animals were euthanatized after 3 weeks for
ethical reasons.

Body composition

Lean body mass of OTC-KO female and male mice was around 30% lower than CTRL ones, and
fat mass was approximatively 80% and 85% lower, respectively (Figure 17).

Organ weight

All the organs (muscles -EDL, tibialis, soleus, plantaris and gastrocnemius-, adipose tissues -
urogenital, retroperitoneal, subcutaneous and BAT-, liver, heart, spleen, kidney and thymus)
weighed, except adrenal gland and the liver of the female, were lower in OTC-KO mice
compared to the CTRL mice (Figure 18, Figure 19).

To sum up OTC-KO effects over the three studies, see Table 4.

128
DISCUSSION

This study evaluated the importance of the endogenous intestinal CIT production in the whole-
body homeostasis. To answer the question, an OTC-KO induced mice model was elaborated
to inhibit specifically intestinal OTC synthesis without impairing hepatic OTC function.

Mice model was first validated considering OTC protein expression, OTC activity and the
bioavailability of the reaction product, CIT. As expected, liver protein expression and activity
are maintained to physiological values whereas they are collapsed in intestine of OTC-KO mice.
The restoration of protein expression observed in LT study is due to the fact that it is an
induced-KO, which means KO could be controlled in time, since the activity is still strongly
diminished. Those previous results are confirmed by the loss of plasma CIT bioavailability as
plasma CIT concentration reflects its intestinal production (for review, see Guiguay and De
Bandt, 2019).
Also, as CIT is a precursor for ARG de novo synthesis (Wu et al., 2009) and 60% of the whole-
body de novo ARG synthesis comes from its renal production from CIT (Castillo et al., 1993), it
is not inconsistent to find a decrease in plasma ARG concentration too.

In healthy adult mice (ST study), morphologic, physiological and metabolic parameters are not
affected by the lack of endogenous CIT, which suggest that in steady-state, the role of CIT is
very limited. Moreover, if the organism is able to switch this step without side effects, then,
in healthy body, CIT should not play a primary role to maintain nitrogen homeostasis and
nitrogen supply from diet should be sufficient. Those results are consistent with the fact that
CIT is mainly produced and released by the intestine in post-absorptive states or low protein
diet (Wakabayashi et al., 2004).

In healthy old mice (LT study), signs of metabolism deregulation start to take place. Ageing is
characterized by a change in body composition and metabolism alteration, especially, loss of
muscle function. In healthy old rats, Moinard et al. (Moinard et al., 2015) have evidenced that
CIT complementation diminished mortality level, increased lean body mass and decreased fat
body mass. Here, in healthy old mice, alteration of endogenous CIT production induced a
global decrease in body weight evolution of mice over the study period without any alterations
of organ mass or body composition at the end of the study, which is quite surprising and needs
further investigations. However, global organism alteration is a consequence of several

129
previous dysregulations. This work has evidenced primary sign on muscle, as a decrease of
MPS in male soleus, which is surprinsing, in relation to studies that evidence effect of CIT
supplementation on other muscles but not in soleus. So, this result must be explored.
Nevertheless, the impact of a lack of bioavailable CIT seems to be limited.
It is well known that muscle and fat metabolism alteration in ageing play an important role in
metabolism disturbance as insulin resistance and dyslipidemia. However, adipose tissue
function has not been affected over the study period and, surprisingly; OTC-KO male seem to
be more sensitive to insulin which is not in accordance with literature (Allerton et al., 2018).
Indeed, most of the studies show insulinosensitivity under CIT complementation associated
with statines. However, Verdam et al., (Verdam et al., 2011) evidence in a clinical study that,
plasma CIT is increased (+34%) in chronic hyperglycemia obese patients. Moreover, recently,
unpublished results show that CIT complementation in obese mice increases obesity-induced
glucose intolerance and tends to worse insulin sensitivity (Miloud Eshreif, thesis, 2019). So, this
paradoxical result must be explored.
Besides those effects, old mice phenotype has found to be altered and mice have lost hair.
This late results could be easily linked to the decrease in plasma ARG concentration. A team
working on the sparse fur-abnormal skin and hair (SPF-ASH) mouse model of global OTC
deficiency, characterized by low CIT and ARG plasma level, delayed in hair growth, abnormal
skin and hyperammonemia, has indeed, inserted to these mice the recombinant rat OTC which
induced a 2 to 6 time higher OTC activity. In those last mice, CIT and ARG plasma level have
been restored and hair growth has been normalized (Shimada et al., 1994). This last study
highlights the importance of OTC functionality to maintain AAs bioavailability.
In addition, a decrease in ARGase II protein expression in the intestine of adult female could
be due to a high peripheral need of ARG and so, could be a first sign of hair-lost in aging state.
Surprisingly, ARGase II protein expression seems to be restored in aging mice. Considering
enzymes implicated in intestinal CIT production (GLNase I, OAT), it seems that in healthy state,
an alteration of CIT production does not affect protein expression of those precursor enzymes.
This observation means that the reactions upstream the ornithine catabolism by the OTC
enzyme may remain important to maintain metabolism homeostasis. Then, in an unexpected
way, OAT protein expression seems to be modified only in jejunum of aged mice.
The slight effects of endogenous CIT on whole-body metabolism could be explained by a
metabolism adaptation which needs to be investigated. But results are also consistent with

130
the hypothesis of Moinard and Cynober (Moinard and Cynober, 2007). In fact, for these
authors, CIT availability would not have any effect on MPS in fed state and would be increased
only in the postabsorptive state or in the situation of low protein intake in order to maintain
a minimal protein synthesis, to be compatible with life. To sum up, in healthy condition, the
organism should be able to maintain metabolism homeostasis thanks to a sufficient supply of
metabolic precursor. Besides, under malnourished-state it should not be able to properly
answer metabolic disturbances.

To test this hypothesis, the animals were nourished with a “light hypoprotein diet” (i.e.75% of
their nutritional requirements). Physiological characteristics of adult mice unable to produced
CIT (OTC-KO group) under low protein diet have been reported to be rapidly and strongly
impaired. All organs mass were, indeed, altered and mice lost approximately 30% of their
initial body weight within 3 weeks. Effectively, even organ normally preserved as far as it is
possible in strong impairment states, as the heart, are hugely affected (Heart mass: female -
15 %, male -19 %). This is in accordance with the hypothesis that CIT is essential during low
protein intake situations, and allows us to explain why exogenous CIT has beneficial effect,
principally in imbalanced situations (Bouillanne et al., 2018; Faure et al., 2012; Osowska et al.,
2006).
Moreover, those first results observed under low protein intake could be the in vivo
adaptation of the in vitro study of Goron et al. (Goron et al., 2019). It is well known, under
energy status alteration that MPS is decreased. Goron et al. (Goron et al., 2019), evidence
that CIT complementation under energy stress or AA deficiency increases MPS without
modification of the bioenergetics parameters (mitochondria respiration, ATP/ADP ratio, Gibbs
free energy, oxidative phosphorylation, aerobic glycolysis, AMPK activation) but seems to
prioritize reallocation of mitochondria fuel to MPS. So, in vivo, energy status would be
decreased by malnutrition. However, in CTRL group, CIT would limit the decrease of MPS,
whereas, in OTC-KO group, the lack of CIT would accelerate the decrease of MPS as well as
muscle and body mass loss. So, all these aspects must be explored.
Such a situation of hypocitrullinemia associated to undernourishment, inducing weight-loss,
are found in several clinical cases as non-treated Short bowel syndrome (Parrish et al., 2017),
weight-losing cancer patients (Levin et al., 1983) and trauma (Costa et al., 2017) without
alteration of the urea cycle. As Osowska et al. (Osowska et al., 2006), show CIT

131
complementation is able to restore nitrogen balance in old malnourished rats, then
metabolism alteration should be investigated in those cases.

Finally, as it has been shown, an alteration of intestinal CIT production does not impair
metabolism in healthy conditions, however under imbalanced situations, it seems to play a
major role, and OTC could be the key enzyme of this metabolic crossroad.

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137
Figure 1. Genetic construction of the inducible OTC-KO mice model, based on Cre/Lox technic.

138
Illustrations of the short term (ST) and long term (LT) study

Figure 2. Experimental design of the study.

A. ST study design. B. LT study design. wk: week, mo: month, SLA: spontaneous locomotor activity, EE:
energy expenditure, BC: blood collection, MEC: maximum endurance capacity.

A. S T stu d y B. LT stu d y

35 35

30 30
[ C IT ] p la s m a ( µ m o l/ L )
[ C IT ] p la s m a ( µ m o l/ L )

25 25

20 20

15 15

10 10
*** *** *** ***
5 5

0 0
f e m a le m a le f e m a le m a le

Figure 3. Plasma citrulline concentration (µmol/L).

Blood was collected from the abdominal vein or cardiac ventricle during euthanasia. The white pattern
represents the CTRL group, the dot pattern represents the OTC-KO group. A.ST study, female: CTRL
n=20, OTC-KO n=22; male: CTRL n=16; OTC-KO n=25. B. LT study, female CTRL n=5; OTC-KO n=10; male
CTRL n=6; OTC-KO n=10.
Data are represented as mean ± SEM. OTC-KO vs CTRL ***p< 0.0001.

139
 A. S T s t u d y , liv e r B. L T s t u d y , liv e r

4 10
O T C a c t iv it y / g o f liv e r

O T C a c t iv it y / g o f liv e r
8
3

6
2
4

1
2

0 0
f e m a le m a le f e m a le m a le

C. S T s t u d y , je ju n u m D. L T s t u d y , je ju n u m
4 2 .5

O T C a c t iv it y / g o f je ju n u m
O T C a c t iv it y / g je ju n u m

2 .0
3

1 .5
2
1 .0
**
1
0 .5
*** *** ***
ND
0 0 .0
f e m a le m a le f e m a le m a le

E. S T s t u d y , ile u m F. S T s t u d y , ile u m
4 2 .5
O T C a c t iv it y / g o f ile u m
O T C a c t iv it y / g o f ile u m

2 .0
3

1 .5
2
1 .0
***
1 ***
0 .5
***
***
ND
0 0 .0
f e m a le m a le f e m a le m a le

Figure 4. OTC enzyme activity in liver, jejunum and ileum.

OTC enzyme activity was measured in liver, jejunum and ileum thanks to 15min enzymatic assay
followed by colorimetric assay. The white pattern represents the CTRL group, the dot pattern
represents the OTC-KO group.
A, C, E: ST study; B, D, F: LT study. A and B: activity in the liver. C and D: activity in the jejunum. E and
F: activity in the ileum.
A, C, E. CTRL female n=15; OTC-KO female n=14 ; CTRL male n=11 ; OTC-KO male n=17. B, D, F. CTRL
female n=5; OTC-KO female n=10; CTRL male n=6; OTC-KO male n=10.
Data are represented as median [min-max]. OTC-KO vs CTRL **p= 0.0053, ***p< 0.0001.

140
Figure 5. OTC protein expression in liver, jejunum and ileum.
Protein expression was evaluated thanks to the Westernblot technic. The white pattern represents the
CTRL group, the dot pattern represents the OTC-KO group.
A, C, E: ST study; B, D, F: LT study. A and B: protein expression in the liver. C and D: protein expression
in the jejunum. E and F: protein expression in the ileum. A, C, E. CTRL female n=11; OTC-KO female
n=12; CTRL male n=11; OTC-KO male n=12. B, D, F. CTRL female n=5; OTC-KO female n=10; CTRL male
n=6; OTC-KO male n=10. Data are represented as median [min; max]. OTC-KO vs CTRL ***p< 0.0001.

141
 A. S T s t u d y , fe m a le B. S T s t u d y , m a le

35 35
CTRL

30 30

B o d y m a s s (g )
B o d y m a s s (g )

O T C -K O
O T C -K O
25 25

CTRL
20 20

O T C - K O e f f e c t p < 0 .0 0 0 1
15 15

11

13
0

11

13
0

9
W eek W eek

C. L T s t u d y , fe m a le D. L T s t u d y , m a le
55 CTRL
55

50 50

CTRL 45
45
B o d y m a s s (g )

B o d y m a s s (g )

40 40
O T C -K O
35 35
O T C -K O
30 30

25 25

20 20
O T C -K O e ffe c t p = 0 .0 0 3 8 O T C -K O e ffe c t p < 0 .0 0 0 1
15 15
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
68
72
76
80
84
0
4
8
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
68
72
76
80
84

W eek W eek

Figure 6. Body weight evolution all along the sudies time.

Body mass was measured each week all along the study period. The black pattern represents the CTRL
group, the grey pattern represents the OTC-KO group. A and B represent the ST study (A. female body
mass [CTRL group nfinal=22; OTC-KO group nfinal=24]. B. male body mass [CTRL group nfinal=16; OTC-KO
group nfinal=25].). C and D represent the LT study (C. female body mass [CTRL group nfinal=5; OTC-KO
group nfinal=10]. D. male body mass [CTRL group nfinal=6; OTC-KO group nfinal=10]).
Data are represented as mean ± SEM.

142
 A. L T s t u d y , fe m a le , r e s t in g p h a s e B. L T s t u d y , m a le , r e s t in g p h a s e

250 250

S p o n t a n e o u s lo c o m o t o r
S p o n t a n e o u s lo c o m o t o r

200 200

a c t iv it y ( m / 1 2 h )
a c t iv it y ( m / 1 2 h )

150 150

100 100

50 50

0 0
10 13 16 10 13 16

M o n th M o n th

C. L T s t u d y , fe m a le , a c t iv it y p h a s e D. L T s t u d y , m a le , a c t iv it y p h a s e

600 600

S p o n t a n e o u s lo c o m o t o r
S p o n t a n e o u s lo c o m o t o r

500 500

a c t iv it y ( m / 1 2 h )
a c t iv it y ( m / 1 2 h )

400 400

300 300

200 200

100 100

0 0
10 13 16 10 13 16

M o n th M o n th

Figure 7. Long term study spontaneous locomotor activity

After, overnight adaptation, spontaneous locomotor activity was measured for 24 hours. The white
pattern represents the CTRL group, the dot pattern represents the OTC-KO group.
A and B represent female and male, respectively, during the resting phase (7 a.m. to 7 p.m). C and D
represent female and male, respectively, during the activity phase (7 p.m. to 7 a.m.). CTRL female nfinal=
5, OTC-KO female nfinal=10; CTRL male nfinal=6, OTC-KO male nfinal=10. Data are expressed as median
[min-max].

143
 A. S T s t u d y , fe m a le B. S T s t u d y , m a le
O T C - K O e f f e c t p = 0 .0 0 1 7 250
250

R u n n in g t im e ( m in )
200
R u n n in g t im e ( m in )

200
150
150
100
100
50
50
0
0 0 2 4 6 8 10 12
0 2 4 6 8 10 12
w eek
w eek

C. L T s t u d y , fe m a le D. L T s t u d y , m a le

100 100

R u n n in g t im e ( m in )
R u n n in g t im e ( m in )

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0
7 10 13 16 7 10 13 16

M o n th M o n th

Figure 8. Maximum endurance capacity evaluation during the ST and the LT study.
After 5 days of acclimatization, mice practice a maximum endurance capacity test on a treadmill (5min
at 15m/min; 25min at 18m/min and 20m/min until exhaustion. The white pattern represents the CTRL
group, the dot pattern represents the OTC-KO group.
ST study (CTRL female nrange= [5-8], OTC-KO female nrange=[5-9]; CTRL male nrange= [4-8], OTC-KO male
nrange= [4-10]); LT study (CTRL female nfinal= 5, OTC-KO female nfinal=10; CTRL male nfinal=6, OTC-KO male
nfinal=10). Results are presented as median [min;max].

144
 A. S T stu d y B. LT stu d y

40 40
fa t b o d y m a s s
35 le a n b o d y m a s s 35
B o d y c o m p o s it io n ( g )

B o d y c o m p o s it io n ( g )
30 30

25 25

20 20

15 15

10 10

5 5

0 0
f e m a le m a le f e m a le m a le

Figure 9. Body composition of the mice in the ST and LT study.

Body composition was evaluated at the euthanasia. The clean pattern represents the CTRL group, the
dot pattern represents the OTC-KO group. The White color represents the lean body mass, while the
grey color represents the fat body mass.
ST study (CTRL female n=15, OTC-KO female n=14; CTRL male n=11, OTC-KO male n=18); LT study (CTRL
female n= 5, OTC-KO female n=10; CTRL male n=6, OTC-KO male n=10). Results are expressed as mean
± SEM.

Figure 10. Muscle protein synthesis of mice from the ST study.

Muscle protein synthesis was evaluated thanks to the Westernblot technic. The white pattern
represents the CTRL group, the dot pattern represents the OTC-KO group.
CTRL female n=11; OTC-KO female n=12; CTRL male n=11; male n=12. A. Soleus. B. Gastrocnemius.
Results are expressed as median [min-max]. The left side of each illustration represents densiometry
of ongoing total protein synthesis (sUnSET method), and the right side represents total protein
expression (ponceau S). Results are expressed as median [min-max].

145
Figure 11. Muscle protein synthesis of mice from the LT study.
Muscle protein synthesis was evaluated thanks to the Westernblot technic. The white pattern
represents the CTRL group, the dot pattern represents the OTC-KO group.
CTRL female n=5; OTC-KO female n=10; CTRL male n=6; OTC-KO male n=10. A. EDL. B. Tibialis. C.
Plantaris. D. Soleus. E. Gastrocnemius. The left side of each illustration represents densiometry of
ongoing total protein synthesis (sUnSET method), and the right side represents total protein expression
(ponceau S). Results are expressed as median [min-max]. vs CTRL ***p< 0.0001.

146
 A. S T s t u d y , fe m a le O G T T B. S T s t u d y , m a le O G T T

400 400

)
)

-1
-1

B lo o d g lu c o s e le v e l ( m g .d L
B lo o d g lu c o s e le v e l ( m g .d L

350 350

300 300

250 250

200 200
CTRL
150 O T C -K O 150

100 100 O T C -K O
50 CTRL 50

0 0
0 15 30 60 90 120 0 15 30 60 90 120

t im e a f t e r o r a l g lu c o s e a d m in is t r a t io n ( m in ) t im e a f t e r o r a l g lu c o s e a d m in is t r a t io n ( m in )

C. S T stu d y, A U C 14000

12000
A re a u n d e r th e c u rv e

.d l )

10000
-1

8000
-1
( m g .m in

6000

4000

2000

0
f e m a le m a le

D. L T s t u d y , fe m a le O G T T E. L T s t u d y , m a le O G T T

400 400
)

)
-1

-1
B lo o d g lu c o s e le v e l ( m g .d L

B lo o d g lu c o s e le v e l ( m g .d L

350 350

300 300

250 250

200 200
CTRL
150 CTRL 150

100 100 O T C -K O
O T C -K O
50 50
O T C -K O e f f e c t p = 0 .0 0 6
0 0
0 15 30 60 90 120 0 15 30 60 90 120

t im e a f t e r o r a l g lu c o s e a d m in is t r a t io n ( m in ) t im e a f t e r o r a l g lu c o s e a d m in is t r a t io n ( m in )

F. L T stu d y , A U C 14000

12000
A re a u n d e r th e c u rv e

.d l )

10000
-1

8000 *
-1
( m g .m in

6000

4000

2000

0
f e m a le m a le

Figure 12. Effect of OTC-KO on glucose tolerance

Following a 15h fast, 2g/kg grlucose was orally administered. The black pattern represents the CTRL
group, the grey pattern represents the OTC-KO group. The white pattern represents the CTRL group,
the dot pattern represents the OTC-KO group. A, B, D, E. Variation of blood glucose over time. C, F.
Area under the curve (AUC). A, B, C. St study. D, E, F. LT study. ST study (CTRL female n=6, OTC-KO
female n=8; CTRL male n=6, OTC-KO male n=10); LT study (CTRL female n= 5, OTC-KO female n=10;
CTRL male n=6, OTC-KO male n=10). Results are expressed as mean ± SEM. *p= 0.006.

147
Figure 13. Jejunum enzyme expression of ARGase II, GLNase I and OAT in mice from the ST and LT
study.
Protein expression was evaluated thanks to the Westernblot technic. The white pattern represents the
CTRL group, the dot pattern represents the OTC-KO group.
ST study [CTRL female n=11; OTC-KO female n=12; CTRL male n=11; male n=12]. LT study [CTRL female
n=5; OTC-KO female n=10; CTRL male n=6; OTC-KO male n=10]. A. ST study, ARGase II protein
expression; OTC-KO female vs CTRL ***p< 0.0001. B. LT study, ARGase II protein expression. C. ST
study, GLNase I protein expression. D. LT study, GLNase I protein expression. E. ST study, OAT
expression. F. LT study, OAT expression; OTC-KO female vs CTRL *p= 0.0323, OTC-KO male vs CTRL
*p=0.0125. Results are expressed as median [min-max].

148
Figure 14. Ileum enzyme expression of ARGase II, GLNase I and OAT in mice from the ST and LT study.
Protein expression was evaluated thanks to the Westernblot technic. The white pattern represents the
CTRL group, the dot pattern represents the OTC-KO group.
ST study [CTRL female n=11; OTC-KO female n=12; CTRL male n=11; male n=12]. LT study [CTRL female
n=5; OTC-KO female n=10; CTRL male n=6; OTC-KO male n=10]. A. ST study, ARGase II protein
expression; OTC-KO female vs CTRL ***p< 0.0001. B. LT study, ARGase II protein expression. C. ST
study, GLNase I protein expression. D. LT study, GLNase I protein expression. E. ST study, OAT
expression. F. LT study, OAT expression. Results are expressed as median [min-max].

149
Figure 15. Skin characteristic of mice from the LT study.
Hair loss was observed with ageing. Pictures were taken from 17 months old mice. LT study [CTRL
female nfinal=5; OTC-KO female nfinal=10; CTRL male nfinal=6; OTC-KO male nfinal=10]. Mice were
approximately 19-20 months old (17 months after tamoxifem injection).

150
Illustrations of the study under low protein diet

A. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , fe m a le B. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , M a le

40 40

* **
35 35
B o d y m a s s (g )

B o d y m a s s (g )
30 30
* **
25 25

20 20

15 15

10 10
0 1 2 3 0 1 2 3

W eek W eek

Figure 16. Body weight evolution under low protein diet.

Body mass was measured each week. The black pattern represents the CTRL group, the grey pattern
represents the OTC-KO group. A. Female [CTRL group n=4, OTC-KO group n=8], *p= 0.0217, **p=
0.0065. B. Male [CTRL group n=6, OTC-KO group n=6], *p= 0.0327, **p= 0.0018. Data are presented as
mean ± SEM.

40 fa t b o d y m a s s
35 le a n b o d y m a s s
B o d y c o m p o s it io n ( g )

30

25
****
20
****
15

10

0
fe m ale m ale

Figure 17. Body composition of mice under low protein diet.

Body composition was evaluated at the euthanasia. The clean pattern represents the CTRL group, the
dot pattern represents the OTC-KO group. The White color represents the lean body mass, while the
grey color represents the fat body mass. Female [CTRL group n=4, OTC-KO group n=8]. B. Male [CTRL
group n=6, OTC-KO group n=6], ****p<0.0001. Data are presented as mean ± SEM.

151
 A. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , L iv e r m a s s B. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , K id n e y m a s s

1 .5 0 .4

K id n e y m a s s ( g )
0 .3
L iv e r m a s s ( g )

1 .0
**** ****
****
0 .2

0 .5
0 .1

0 .0 0 .0
f e m a le m a le f e m a le m a le

C. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , H e a r t m a s s D. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , T h y m u s m a s s

0 .1 5 0 .0 6

T h y m u s m a s s (g )
H e a rt m a s s (g )

0 .1 0 *** 0 .0 4
**

0 .0 5 0 .0 2 ****

****
0 .0 0 0 .0 0
f e m a le m a le f e m a le m a le

E. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , P a n c r e a s m a s s F. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , S p le e n m a s s
0 .3 0 .1 5
P a n cre a s m a ss (g )

S p le e n m a s s ( g )

0 .2 * 0 .1 0

***
***
0 .1 0 .0 5

0 .0 0 .0 0
f e m a le m a le f e m a le m a le

G. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , A d r e n a l g la n d H. L o w p r o t e in d ie t s t u d y , B r o w n a d ip o s e

m ass t is s u e ( B A T ) m a s s

0 .0 1 0 0 .1 5
A d r e n a l g la n d m a s s ( g )

0 .0 0 8
B A T m a ss (g )

0 .1 0
0 .0 0 6

****
0 .0 0 4
0 .0 5

0 .0 0 2

0 .0 0 0 0 .0 0
f e m a le m a le f e m a le m a le

Figure 18. Organs weight of mice under low protein diet.

Organs mass was evaluated at the euthanasia. The white pattern represents the CTRL group, the dot
pattern represents the OTC-KO group. Female [CTRL group n=4, OTC-KO group n=8], male [CTRL group
n=6, OTC-KO group n=6].A. Liver mass, vs CTRL male ****p<0.0001. B. Kidney mass, vs CTRL female
and vs CTRL male respectively ****p< 0.0001. C. Heart mass vs CTRL female **p=0.0041, vs CTRL male
***p= 0.0002. D. Thymus mass, vs CTRL female and vs CTRL male respectively ****p< 0.0001. E.
Pancreas mass, vs CTRL male *p= 0.0379. F. Spleen mass vs CTRL female and vs CTRL male respectively
***p= 0.0003. G. Adrenal gland mass. H. BAT mass, vs CTRL male ****p<0.0001. Data are presented
as mean ± SEM.

152
Figure 19. Muscle mass of mice under low protein diet.
Muscle mass was evaluated at the euthanasia. The white pattern represent the CTRL group, the dot
pattern represent the OTC-KO group. Female [CTRL group n=4, OTC-KO group n=8], male [CTRL group
n=6, OTC-KO group n=6].A. EDL mass, vs CTRL female and male respectively ****p<0.0001. B. Tibialis
mass, vs CTRL female **p= 0.0015 and vs CTRL male ****p< 0.0001. C. Soleus mass vs CTRL female
****p< 0.0001, vs CTRL male **p= 0.0015. D. Plantaris mass, vs CTRL female ***p= 0.0007 and vs CTRL
male ***p= 0.0003. E. Gastrocnemius mass, vs CTRL female and male respectively ****p<0.0001.
Data are presented as mean ± SEM.

153
 Table 1. Plasma amino acids concentration at the end of the in vivo ST and LT study (µmol/L).
Plasma AA concentration was evaluated from blood collection from the abdominal vein or cardiac ventricle. ST study (CTRL female n=20; OTC-KO female
n=22; CTRL male n=16; male n=.25). LT study (CTRL female n=5; OTC-KO female n=10; CTRL male n=6; OTC-KO male n=10). Values are expressed as mean
± SEM.

154
 Table 2. Lipid metabolism data from the ST and LT study.
After 24h of adipose tissue culture, medium was collected and free fatty acid and glycerol release were evaluated. ST study (CTRL female n=6, OTC-KO
female n=8; CTRL male n=6, OTC-KO male n=10); LT study (CTRL female n= 5, OTC-KO female n=10; CTRL male n=6, OTC-KO male n=10). Results are
expressed as mean ± SEM.

155
 Table 3. Anthropometric data of the ST and the LT study.
Organs mass was measured at the euthanasia, and protein content was evaluated on muscles. ST study (CTRL female n=15, OTC-KO female n=14; CTRL
male n=11, OTC-KO male n=18); LT study (CTRL female n= 5, OTC-KO female n=10; CTRL male n=6, OTC-KO male n=10). Results are expressed as mean ±
SEM. Muscles mass are expressed as mean of the left and right muscles.

156
Table 4. Summary of OTC-KO effect over the ST study, the LT study and the low protein diet study

OTC-KO effect Sex affected

ST study
↘ global body mass ♀
↘ global maximum endurance capacity ♀
↘ ARGase II protein expression in jejunum and ileum ♀
↘ plasma ARG concentration ♀+♂
↘ plasma CYS concentration ♀
↘ plasma LYS concentration ♀
↘ glycerol release level ♀
LT study
↘ global body weight ♀+♂
↘ OAT protein expression in jejunum ♂
↗ OAT protein expression in jejunum ♀
↘ soleus protein synthesis ♂
↗ insulinosensitivity ♂
Hair-lost ♀+♂
Low protein diet
↘ body mass ♀+♂
↘ lean body mass ♀+♂
↘ fat body mass ♀+♂
↘ kidney mass ♀+♂
↘ heart mass ♀+♂
↘ thymus mass ♀+♂
↘ spleen mass ♀+♂
↘ liver mass ♂
↘ pancreas mass ♂
↘ BAT mass ♂
↘ muscle mass (EDL, tibialis, soleus, plantaris, ♀+♂
gastrocnemius)

157
DISCUSSION
GENERALE

158
Depuis plusieurs années, l’intérêt s’est porté sur les propriétés métaboliques des AAs. Ainsi,
en plus de son rôle dans le cycle de l’urée, la CIT a tout d’abord été mise en évidence comme
acide aminé diagnostic puisqu’il est l’un des meilleurs marqueurs de la fonction entérocytaire
(Crenn et al., 2000). Par la suite, plusieurs équipes ont pu mettre en évidence ses propriétés
nutritionnelles et métaboliques. En effet, l’apport de CIT à l’organisme a permis de mettre en
avant ses effets pleïotropiques, en particulier, comme précurseur du monoxyde d’azote
radicalaire (NO) (Goodwin et al., 1994 ; Nussler et al., 2004) et modulateur de la fonction
musculaire.
En effet, plusieurs travaux ont révélé la capacité de la CIT à réguler l’homéostasie protéino-
énergétique (pour revue, voir Breuillard et al., 2018). En effet, la CIT est capable de stimuler
l’accrétion protéique ainsi que la synthèse protéique musculaire (plus particulièrement celle
des protéines myofibrillaires) (Faure et al., 2012 ; Faure et al., 2013 ; Osowska et al., 2006 ;
Jourdan et al., 2015). Depuis près de 15 ans, les données de la littérature permettent de faire
un continuum entre son action moléculaire et son efficacité clinique.
L’ensemble de ces travaux se sont intéressés aux effets induits par un apport exogène de CIT.
Cependant, la CIT est aussi produite de manière continue par l’intestin et aucune donnée ne
permet de déterminer si la CIT endogène joue un rôle dans la régulation de l’homéostasie
protéino-énergétique.
L’ornithine transcarbamylase étant l’enzyme clé du métabolisme de la CIT, nos travaux ont
essayé de comprendre quelle était le rôle de cette enzyme, avec 2 objectifs :
→ Mieux comprendre sa régulation.
→ Mieux comprendre son importance dans la régulation de l’homéostasie protéino-
énergétique.

Actuellement, les données scientifiques spécifiques au rôle de la production intestinale de CIT

restent très parcellaires. In vitro, la lignée intestinale couramment utilisée, Caco2, n’exprime
pas l’OTC et exprime l’ASL et l’ASS, deux enzymes non exprimées par les entérocytes humains
adultes et impliquées dans la synthèse d’ARG à partir de la CIT.
In vivo, Hoogenraad et al. (Hoogenraad et al., 1985), ont inhibé l’activité d’OTC en
complémentant l’eau de boisson de ratons avec un inhibiteur de cette enzyme, le PALO,
couplé avec une alimentation dépourvue en ARG. Ils ont observé une diminution de la
concentration plasmatique en ARG et CIT, ainsi qu’une forte diminution de la croissance et

159
une augmentation de la mortalité. L’apport exogène d’ARG dans l’alimentation prévenait
partiellement cette diminution de croissance alors que l’apport exogène de CIT la prévenait
totalement. Plus tard, Tarasenko et al. (Tarasenko et al., 2015), ont développé un modèle
murin déficient pour le gène de l’OTC, les souris spf-J, caractérisées par une concentration
élevée de GLN et diminuée en CIT et ARG.
Cependant, les résultats de ces études doivent être utilisés avec précaution. En effet, ces
modèles in vivo en place aujourd’hui inhibent la production de CIT endogène grâce à une
inhibition totale de l’OTC. Les résultats observés peuvent donc être liés à une baisse de la
production intestinale de CIT, comme à la perturbation du cycle de l’urée.

Afin d’étudier l’importance de la CIT dans le métabolisme protéino-énergétique, nous avons

dû adapter un modèle in vitro d’explant duodénal humain préalablement décrit (Coëffier et
al., 2001; Lecleire et al., 2005; Coëffier et al., 2003) pour évaluer le métabolisme des AAs
impliquées dans le carrefour métabolique de la production de la CIT.

Tout d’abord, il a fallut valider ce modèle in vitro. La survie des explants est en accord avec le
turn over intestinal (Darwich et al., 2014). Aussi, ils expriment l’ensemble des enzymes
impliquées dans la production de la CIT (ARGase II, GLNase I, OAT, OTC) avec une enzyme OTC
active confirmée par la production de CIT mesurée dans le milieu de culture. Par ailleurs, nous
avons également pu montrer que cette CIT provenait bien d’une néosynthèse endogène,
puisque la CIT libérée lors de la mort cellulaire entérocytaire représente moins de 10% de la
CIT totale libérée. Ce modèle est donc bien approprié à l’étude de la régulation de l’OTC. Aussi,
les données cliniques indiquent que la concentration en CIT biodisponible est diminuée dans
des situations pathologiques caractérisées par une inflammation et/ou une hypoxie (Piton et
al., 2010 ; Van Wardenberg et al., 2007). Cependant, le rôle direct de ces deux facteurs sur
l’OTC reste encore inconnu.
La production de CIT à partir d’ORN est une réaction énergivore, la rendant très sensible aux
variations du statut énergétique (Goldsmith et al., 1993; Sainz et al., 1998). Lors de
dérégulation métabolique, la cellule engage une inhibition hiérarchique des réactions
biochimiques en commençant par inhiber celles qui sont les plus couteuses sur le plan
énergétique. Or, cette étude a pu mettre en évidence un maintien de la fonctionnalité de l’OTC
malgré l’induction de stress métabolique (Inflammation et/ou Hypoxie) suggérant un rôle
fondamental de l’OTC et de son produit la CIT dans le maintien de l’homéostasie azotée.

160
In vivo, l’importance de la CIT a déjà été mis en évidence par Osowska et al. (Osowska et al.,
2006), montrant que l’apport de CIT exogène est capable de restaurer l’homéostasie azotée
chez des rats âgés dénutris. Ceci est par ailleurs confirmé par plusieurs travaux. De plus, en
situation d’endotoxémie, une complémentation en CIT améliore le métabolisme du NO ainsi
que la microcirculation intestinale (Wijnands et al., 2012).
Aussi, il semblerait que l’hypoxie et/ou l’inflammation ne soient pas des régulateurs directs
de l’activité de l’OTC et de la production intestinale de CIT. En effet, si la production de CIT
semble être fortement diminuée dans des états cataboliques sévères, caractérisés par une
inflammation et une hypoxie chronique, que ce soit dans des modèles in vivo (Kaur et al.,
2018) ou chez l’Homme (Piton et al., 2010) ; elle semble au contraire augmentée dans des
états cataboliques stables (Jonker et al., 2016). Cette dernière équipe a montré chez des
patients atteints de maladies respiratoires obstructives chroniques (BPCO,
Bronchopneumopathie chronique obstructive), que la CIT était augmentée ainsi que le taux
d’ARG néosynthétisé, indispensable pour le bon fonctionnement du système immunitaire
dans ces situations (Luiking et al., 2009).
Afin de préciser les mécanismes impliqués dans la régulation de l’OTC intestinale, il est
indispensable de comprendre le rôle intégré de l’OTC et donc de la CIT endogène sur le
métabolisme et notamment l’homéostasie protéino-énergétique.

In vivo, une nouvelle lignée murine OTC-KO inductible a été développée selon un système
Cre/Lox, et validée, permettant d’inhiber le gène de l’OTC spécifiquement dans l’intestin. Deux
sites Lox-P ont été intégrés au niveau de l’exon 3 (site catalytique) de l’enzyme chez des souris
C57Bl6 (Institut Cochin, Paris, France). Ces dernières ont été croisées avec des souris C57Bl6
transgéniques exprimant le gène de la Cre recombinase spécifiquement induit dans l’intestin
grâce au promoteur Villin et exprimant un domaine de liaison aux récepteurs stéroïdes (ERT2)
(El Marjou et al., 2004). Ce dernier se lie au tamoxifène, induisant l’activation de la mutation,
et donc, la délétion du gène de l’OTC spécifiquement dans l’intestin. Ceci entraine donc une
perte de production intestinale de CIT et permet ainsi d’étudier les conséquences d’une
absence de CIT au niveau du métabolisme protéino-énergétique global.

161
Tout d’abord, ce modèle d’étude étant novateur, le phénotype des animaux avant activation
de la mutation a été vérifié et s’avère être stable (WT vs OTCfl/fl VillinCreERT2+/+ vs OTCfl/fl
VillinCreERT2tg/+). Par la suite, le modèle d’étude a été validé. L’induction de la délétion du gène
de l’OTC induit bien une perte de l’expression protéique et de l’activité enzymatique
uniquement dans l’intestin (elle est préservée dans le foie) et est associée à un effondrement
de la concentration en CIT plasmatique. Cette délétion est d’ailleurs durable dans le temps
puisque la concentration en CIT plasmatique est toujours quasi-nulle 18 mois après l’injection
de tamoxifène. Toutefois, l’expression protéique de l’enzyme étant restaurée à la fin de cette
durée d’étude, la citrullinémie devrait être évaluée à plusieurs temps intermédiaire afin de
programmer une seconde série d’injection de tamoxifène dans le but d’assurer une délétion
totale du gène tout au long des études qui se feront à long terme.
Finalement, ce modèle est donc parfaitement approprié pour étudier l’importance de l’OTC,
et in fine celle de la CIT, dans le métabolisme global et plus particulièrement protéino-
énergétique.

Chez des souris adultes saines, l’impact de l’effondrement de la biodisponibilité en CIT a des
conséquences très limitées sur le métabolisme protéino-énergétique. En condition
physiologique, l’organisme semble être capable de s’adapter pour compenser cette
diminution accrue de CIT plasmatique, laissant supposer que, dans ces conditions, le
métabolisme de la CIT ne joue pas un rôle primordial pour assurer l’homéostasie protéino-
énergétique. En effet, en condition post-prandiale la L-leucine est capable d’activer la
synthèse protéique musculaire (Moinard et Cynober, 2007). De plus ces résultats sont en
accord avec la littérature (Wakabayshi et al., 2004), mettant en avant le fait que la libération
de CIT par l’intestin s’opère principalement à l’état post-absorptif ou avec une alimentation
pauvre en protéines.

En situation physiologique, le vieillissement constitue une source de changements de

composition corporelle ainsi qu’une altération métabolique globale. Notre étude a permis de
mettre en évidence qu’une diminution quasi-totale de la biodisponibilité en CIT chez des
souris âgées saines induit des prémices de dérégulations métaboliques, bien que ceux-ci
restent limités. Ces premiers signes s’observent au niveau du poids corporel diminué chez les
animaux OTC-KO, ainsi que sur la synthèse protéique musculaire (soleus). Une
complémentation en CIT chez des rats âgés sains et chez l’Homme âgé obèse est connue pour

162
améliorer la composition corporelle ainsi que la fonction musculaire (Moinard et al, 2015 ;
Buckinx et al., 2018). Néanmoins, une récente étude chez l’Homme âgé a montré que les effets
combinés d’une complémentation en CIT et d’une activité physique sont liés au niveau
d’apport protéique. En effet, l’action de la CIT est d’autant plus marquée que le niveau
d’apport protéique est faible (Buckinx et al., 2019), ce qui pourrait expliquer la limitation des
effets d’une absence de CIT plasmatique chez des animaux âgés sains. Par ailleurs, dans notre
travail, ces effets semblent affecter les mâles de manière plus importante, ce qui n’est pas
incohérent considérant le fait que l’OTC se trouve sur le chromosome X. De plus, ces effets
sont associés à une amélioration de l’insulinosensibilité. Cette observation est surprenante
puisque une étude chez des souris obèses diabétiques a mis en évidence une amélioration du
profil glucidique et lipidique ainsi qu’une amélioration de l’insulinosensibilité lors d’une
complémentation en CIT (Capel et al., 2015). Néanmoins, il faut noter que dans cette étude,
l’apport de CIT se fait en complément de celui de statine et que l’apport de CIT seul n’entraine
qu’une faible amélioration de la sensibilité à l’insuline. De plus, nos résultats sont en accord
avec, une étude clinique réalisée chez des sujets obèses morbides. Ainsi, les patients ont été
classés en fonction de leur valeur d’Hémoglobine (Hb) glyquée. Ceux ayant une Hb1ac > 7 ont
une CIT plasmatique qui est fortement augmentée (+34%) (Verdam et al., 2011). Cette
augmentation de la concentration plasmatique en CIT est d’ailleurs retrouvée dans une étude
faite sur un modèle de souris obèses (Sailer et al., 2013). Puis, récemment, des travaux de
thèses encore non publiés ont mis en évidence qu’une complémentation en CIT chez des
souris obèses augmente l’intolérance au glucose et tend à déteriorer la sensibilité à l’insuline
(Miloud Eshreif, thèse, 2019).

Aussi, la déficience en CIT est associée à une diminution de la concentration en ARG

plasmatique, ce qui n’est pas illogique puisque la quantité de CIT convertie en ARG de novo
par le rein correspond à la quantité nette de production de CIT libérée par l’intestin (Castillo
et al., 1993). De plus, la perte de poil observée chez ces souris OTC-KO est en accord avec la
diminution de la concentration plasmatique en ARG et CIT. En effet, Shimada et al., (Shimada
et al., 1994) ont montré que les souris SPF-ASH, caractérisées par un retard de croissance de
la pilosité, ont une concentration plasmatique en CIT et ARG diminuée. Ces résultats
s’expliquent par le fait que l’ARG est le précurseur direct de proline pour la synthèse de
collagène. L’absence de CIT et la diminution d’ARG déjà en place chez les souris adultes

163
semblent donc être à la base de la perte de pilosité observée avec le vieillissement, mettant
en avant l’un des rôles de la CIT en situation de dérégulation métabolique. De plus, la CIT et

l’ARG sont des précurseurs du NO impliqué dans la régulation du métabolisme
cardiovasculaire (Romero et al., 2006) et la présence de NO synthase dans les kératinocytes
épidermaux de peaux normales appuie l’importance de la CIT et de l’ARG dans la régulation
de ce métabolisme (Shimizu et al., 1997).

Les effets mineurs sur le métabolisme global mis en avant par ces deux premiers travaux in
vivo sont en accord avec l’hypothèse exposée par Moinard et Cynober (Moinard et Cynober,
2007) selon laquelle la CIT aurait un rôle limité en condition physiologique mais que celui-ci
prendrait toute son importance en situations d’apports protéiques faible ou à l’état post-
absorptif, afin de maintenir une synthèse protéique minimale pour le bon fonctionnement de
l’organisme.

Afin d’évaluer cette hypothèse et de préciser l’importance de l’OTC, et donc de la CIT dans de
telles situations, un régime hypoprotéique modéré (75% des apports requis) a été mis en place
dans ce modèle murin OTC-déficient.

Un régime hypoprotéique, couplé à une absence de CIT biodisponible, induit une profonde et
rapide perturbation métabolique. En effet, ces animaux perdent en 3 semaines en moyenne
30% de leur poids corporel et 85% de leur tissu adipeux. Aussi, une forte diminution du poids
des muscles, du thymus, du rein, de la rate et du cœur (organe normalement préservé au
maximum lors de dénutrition) laisse entrevoir un rôle primordial de la CIT dans le maintien du
métabolisme protéino-énergétique musculaire, du métabolisme cardiovasculaire et du
système immunitaire. Considérant l’aspect protéino-énergétique, ces résultats pourraient
être les premières observations in vivo d’une récente étude menées in vitro sur des myotubes
en cultures. Goron et al. (Goron et al., 2019), ont mis en évidence qu’une complémentation
en CIT suite à l’induction d’un stress énergétique ou d’une déficience en AAs induit une
augmentation de la MPS sans modification des paramètres bioénergétiques, indiquant une
réallocation de l’énergie délivrée par la mitochondrie sous forme d’ATP, pour la MPS. La CIT
pourrait donc permettre de limiter l’atteinte de la MPS induite par un stress énergétique,
comme celui de la dénutrition. Pour conforter notre hypothèse, il faudrait déterminer si un
régime modérément hypoprotéique affecte le rapport ATP/ADP. Cliniquement, plusieurs

164
situations sont caractérisées par une hypocitrullinémie et associées à une dénutrition ainsi
qu’une perte de poids, sans altération du cycle de l’urée. C’est le cas de patients cancéreux
(Levin et al., 1983), de choc septique (Crenn et al., 2014), de trauma (Costa et al., 2017), ou
encore de grêle court non sevré (Parrish et al., 2017). Il est possible d’imaginer qu’un
effondrement de la production intestinale de CIT dans ces conditions pathologiques pourrait
accélérer l’altération du métabolisme global de l’organisme et qu’une restauration de la
biodisponibilité en CIT pourrait améliorer la survie ou encore la récupération dans ces
situations.

Bien sûr, des explorations mécanistiques sont nécessaires afin de comprendre les mécanismes
impliqués dans de telles régulations et de proposer une vision intégrée du rôle de la CIT
endogène dans l’adaptation du métabolisme protéino-énergétique aux variations
nutritionnelles.

165
CONCLUSION ET
PERSPECTIVES

166
Ces travaux ont permis, dans un premier temps, d’adapter un modèle d’étude d’explant
duodénal humain à l’exploration du métabolisme des AAs (Etude n°1). Dans ce modèle in vitro,
nous avons pu mettre en évidence un rôle fondamental de l’OTC et de son produit, la CIT, dans
le maintien de l’homéostasie azotée. De plus, il a été possible de préciser que l’hypoxie et/ou
l’inflammation, ne semblent pas être des régulateurs directs de l’activité de l’OTC et donc de
la production intestinale de CIT (Etude n°2). In vivo, un modèle murin authentique permettant
une inhibition spécifique de l’OTC dans l’intestin a été créé et validé, permettant ainsi,
d’explorer l’importance de la biodisponibilité de la CIT sur le métabolisme protéino-
énergétique (Etude n°3). Ce travail a permis d’appuyer l’hypothèse proposée par Moinard et
Cynober (Moinard et Cynober, 2007) selon laquelle, le rôle de la CIT en condition
physiologique serait mineur mais que celui-ci prendrait toute son importance lors de
dérégulations métaboliques. En effet, nous avons pu mettre en évidence que l’effondrement
de la biodisponibilité en CIT a des conséquences limitées sur le métabolisme protéino-
énergétique en conditions physiologiques chez des souris adultes et âgées. Cependant, lors
d’un stress énergétique induit par une malnutrition (régime hypoprotéique modéré (75% des
apports nécessaires)), nous assistons à un effondrement de la réponse de l’organisme face à
de telles dérégulations (Etude n°3). Ces premiers résultats mettent en avant l’importance du
métabolisme de la CIT dans le maintien de l’intégrité du métabolisme et la survie de
l’organisme.

Ce dernier travail précise les connaissances concernant la régulation du métabolisme

intestinal de la CIT endogène, et laisse imaginer pour la première fois l’ampleur du rôle de la
CIT au niveau de l’organisme entier. Néanmoins, ces travaux nécessitent d’être approfondis
et certains domaines restent à explorer :

o Des études ont montrées que l’importance des précurseurs (ARG et GLN), dans la
production intestinale de CIT, pouvait être variable en fonction de l’état alimentaire
(post-prandial ou post-absorptif) (Marini et al., 2017 ; Tomlinson et al., 2011).
Considérant l’importance de ce métabolisme, et l’hypocitrullinémie observée dans
plusieurs cas cliniques, ce modèle d’explant duodénal pourrait être utilisé afin
d’explorer l’impact d’un stress énergétique ou encore d’une déficience en AAs sur
l’activité de l’OTC et donc la production de CIT. De plus, les flux d’ARG et de GLN

167
 pourraient être évalués dans le but d’évaluer l’implication de chacune de ces voies
métaboliques ascendantes, dans la régulation de l’activité de l’OTC.
o De manière intégrée, l’induction d’un état inflammatoire et hypoxique pourrait être
envisagée chez nos souris n’exprimant plus l’OTC afin de valider les résultats obtenus
in vitro mais aussi de les appréhender au niveau d’un organisme entier. De plus, au vu
des résultats de masses musculaires obtenus dans notre modèle murin OTC-KO
dénutris, il est indispensable d’explorer les paramètres évalués, in vivo et post-
euthanasie, en condition physiologique, afin d’évaluer les conséquences d’une telle
situation (hypocitrullinémie + dénutrition), représentative d’états cliniques, sur le
métabolisme protéino-énergétique.
o De plus, l’ensemble de la composition corporelle des souris sous régime
hypoprotéique est grandement altérée et laisse supposer une atteinte globale de
l’organisme. La biodisponibilité en ARG étant déjà modifiée en conditions
physiologique, et le cœur, organe privilégié, étant atrophié sous régime
hypoprotéique, les conséquences cardiovasculaires d’une absence de citrulline
semblent être de grande importance. En outre, connaissant les effets pleïotropiques
d’une complémentation en CIT, plusieurs pistes restent à étudier : le système
immunitaire, l’homéostasie glucidique, ainsi que le métabolisme lipidique.

Finalement, in vitro, nos travaux ont contribué à préciser les connaissances quant à la
régulation de l’activité de l’OTC et ont permis de confirmer l’importance du métabolisme
intestinale de la CIT. De plus, l’induction d’une déficience intestinale en OTC in vivo, a
permis de mieux comprendre l’importance de l’OTC et donc de la CIT endogène dans le
métabolisme protéino-énergétique.

168
 REFERENCES
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193
ANNEXES

194
 L’Ornithine transcarbamylase :

Rôle et régulation dans l’homéostasie protéino-énergétique

Outre son rôle d’intermédiaire dans le cycle de l’urée, de nombreux travaux mettent en
évidence les effets pléïotropiques de la citrulline dans le métabolisme et notamment dans le
métabolisme protéino-énergétique. En effet, cet acide aminé est capable de stimuler la
synthèse protéique musculaire. Cependant les études menées jusqu’alors ne permettent pas
de conclure spécifiquement quant à l’importance de la production endogène de citrulline par
les entérocytes. En effet, dans l’organisme, la citrulline est produite par une enzyme clé,
l’ornithine transcarbamylase (OTC), donnant à la fonctionnalité de cette dernière une
implication toute aussi importante dans le maintien de l’homéostasie protéino-énergétique.
Les travaux présentés ici mettent en place un modèle d’étude in vitro d’explants duodénal
humain ainsi qu’un nouveau modèle murin de knock out spatio-temporel du gène de l’OTC. Les
résultats obtenus in vitro ont permis de mieux préciser sa régulation chez l’Homme. Par ailleurs
les travaux réalisés in vivo montrent que les conséquences d’une déficience en OTC intestinale
sont limitées en conditions physiologiques. En revanche, en cas de rupture de l’homéostasie
protéique, le déficit en OTC entraine de profondes altérations métaboliques.

Mots clés : citrulline, ornithine transcarbamylase, homéostasie azotée, intestin, muscle,

dénutrition

Ornithine carbamoyltransferase:

Role and regulation in proteino-energy homeostasis

Beyond its transitional role in the urea cycle, numerous works have evidenced pleïotropic
effects of citrulline in the metabolism, especially in the proteino-energy metabolism. This
amino acid is, indeed, able to stimulate muscle protein synthesis. Nevertheless, studies
conducted until now do not allow to conclude about the importance of the specific endogenous
citrulline production by the enterocytes. In fact, in the organism, citrulline is produced thanks
to a key enzyme, the ornithine carbamoyltransferase (OTC), giving to its functionality a huge
implication in the regulation of the proteino-energy homeostasis. Works presented here set up
an in vitro model of human duodenal explants, as well as, an in vivo murine model of conditional
knock out through space and time for the OTC gene. In vitro results obtained have allowed to
precise its regulation in human. In addition, in vivo studies have shown that the consequences
of an OTC intestine deficiency are limited under physiological states. However, in case of
protein homeostasis alteration, an OTC deficiency leads to strong metabolic alterations.

Keywords: citrulline, ornithine carbamoyltransferase, nitrogen homeostasis, intestine, muscle,

malnutrition