ANNE 2014

THSE
Pour lobtention du Grade de
DOCTEUR DE LUNIVERSITE PARIS.DIDEROT (Paris 7) SORBONNE PARIS CITE
Spcialit : Toxicologie
Ecole Doctorale 436 Mdicament Toxicologie Chimie Environnement

Mlanie LOVERA-LEROUX
Etude des mcanismes de rgulation de la mort cellulaire apoptotique
par les particules atmosphriques et leurs composs mtalliques.
Soutenue le 31 mars 2014
Laboratoire Rponses Molculaires et Cellulaires aux Xnobiotiques
Unit de Biologie Fonctionnelle et Adaptative
CNRS UMR 8251

Composition du jury :
Pr Guillaume GARON
Professeur, Universit de Lille 2
Dr Christophe LEMAIRE
MCU HDR, Universit de Versailles Saint-Quentin
Dr Laurent ALLEMAN
Matre-Assistant, Ecole Mines de Douai
Dr Dominique LAGADIC-GOSSMANN
DR2 CNRS, Universit de Rennes 1
Pr Armelle BAEZA-SQUIBAN
Professeur, Universit de Paris Diderot
Dr Karine ANDRAU
MCU HDR, Universit de Paris Diderot

Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinatrice
Prsidente
Directrice de thse

Remerciements
Les travaux de cette thse ont t raliss au sein du laboratoire des Rponses
Molculaires et Cellulaires aux Xnobiotiques de lunit de Biologie Fonctionnelle et
Adaptative. Elle a t finance par une bourse du Ministre de lEnseignement Suprieur et
de la Recherche de lEcole Doctorale Mdicament, Toxicologie, Chimie, Environnement et
en partie par lAgence Nationale de la Recherche dans le cadre du projet MEGATOX.
Jexprime ma profonde reconnaissance aux Professeurs Francelyne Marano et JeanMarie Dupret pour mavoir accueillie dans leur laboratoire.
Avant toute chose, je tiens adresser ma gratitude et mes sincres remerciements au
Docteur Karine Andrau pour mavoir encadr depuis mon Master 2 et mavoir permis de
mener bien mon projet de thse. Elle a su me donner confiance en moi et me transmettre sa
passion pour la recherche et la rigueur scientifique quelle ncessite. Je la remercie surtout du
soutien quelle ma apport aussi bien sur le plan professionnel que personnel et la patience
dont elle a fait preuve.
Je remercie galement le Professeur Armelle Baeza-Squiban pour sa confiance, son
soutient et ses conseils prcieux, surtout en cette fin de thse, et qui me fait lhonneur de
prsider ce jury.
Je remercie tous les membres du Jury : le Professeur Guillaume Garon et le Docteur
Christophe Lemaire de me faire lhonneur dtre les rapporteurs de ma thse ainsi que les
Docteurs Laurent Alleman et Dominique Lagadic-Gossmann.
Jadresse des remerciements particuliers Belinda Crobeddu (avec un seul b nestce pas ?) qui a t ma stagiaire depuis son stage de Licence 3 et qui est aujourdhui devenue
Ingnieure avec fiert. Je la remercie de mavoir aid dans mes expriences et davoir gay
nos salles de travail de son grain de folie avec Mathilde Delaval, Audrey Ridoux, et depuis
peu Leticia Santiago (et mavoir permis den faire autant !), sans oublier les Docteurs Ioana
Ferecatu et Ada Bouharrour qui mont aide, soutenue et transmis leur passion pour la
recherche. Je les remercie aussi de mavoir cout et soutenue dans les moments difficiles,
jespre garder ces liens damiti qui se sont crs.

A toutes les personnes du laboratoire aussi bien celles qui sont parties que celles encore
prsentes: Sonja Boland, Florent Busi, Julien Dairou, Fernando Rodrigues-Lima merci pour
votre aide scientifique et technique ; Rina Guanagnini, Sandra Vranic, Anglique Cocaign,
Laura Boublil, Isabelle George, Ccile Mathieu, Romain Duval, Linh-Chi Buy, Ximing Xu,
Amine Manaa, merci pour votre aide scientifique et technique ainsi que les petits goters
partags ; Emile Petit , Roseline Nila, Olja Kascanski et Franoise Contamina merci pour
votre aide, votre gentillesse et nos discussions culturelles, scientifiques et amicales.
Je tiens galement remercier les personnes qui mont forme : Violaine Simon pour
mavoir initie la Flexstation, Nicole Boggetto et Blandine Gaussers pour mavoir form
lutilisation de la cytomtrie en flux et Nadim Kassis pour mavoir transmis son savoir sur
la ralisation et linterprtation des RT-qPCR. Enfin, je remercie les partenaires du projet
MEGATOX: Laurent Martinon, Jean Sciare, Isabelle Baudrimont
Enfin, je remercie ma famille et mes amis (en particulier Jeni et Alix) de mavoir
soutenue et motive dans les moments difficiles et davoir eu confiance en moi.

ii

 Dans la vie, rien nest craindre, tout est comprendre.

Marie Curie

Tout obstacle renforce la dtermination. Celui qui s'est fix un but n'en change pas.
Lonard De Vinci

A mes parents, Philippe et Catarina, qui ont fait de moi ce que je suis aujourdhui, qui
mont appris toujours donner le meilleur de soi-mme et qui mont appris cette devise
quand on veut, on peut qui ma accompagne dans tous mes projets.
A mon frre Adrien de qui je suis fire et qui ma apport un grand soutien.
A mon mari Ange, aujourd'hui li moi pour la vie, et notre fille Lucia, des petits
bonheurs et du soutient au quotidien.
Aujourdhui cette thse vous est ddie car cest grce vous que jai pu en arriver l.
Mel, Ninie, NamZ

iii

iv

SOMMAIRE
REMERCIEMENTS .............................................................................................................................................. I
SOMMAIRE ..........................................................................................................................................................V
VALORISATIONS SCIENTIFIQUES........................................................................................................... VIII
ABREVIATIONS..................................................................................................................................................X
LISTE DES FIGURES .......................................................................................................................................XII
LISTE DES TABLEAUX .................................................................................................................................. XV
AVANT-PROPOS ........................................................................................................................................... XVI
I.

INTRODUCTION........................................................................................................................................ 1
I.1) La pollution atmosphrique ............................................................................................................ 2
I.1.1) La pollution particulaire .......................................................................................................................2
I.1.2) Rglementation de la qualit de lair .............................................................................................8
I.2) Les voies respiratoires : cible principale des particules atmosphriques .................. 11
I.2.1) Caractristiques de lappareil respiratoire............................................................................. 11
I.2.2) Dposition des particules dans lappareil respiratoire.................................................... 14
I.2.3) Devenir des particules dans lappareil respiratoire et lorganisme.......................... 17
I.3) Effets des particules atmosphriques sur la sant humaine ............................................ 20
I.3.1) Etudes pidmiologiques .................................................................................................................. 20
I.3.2) Les pathologies respiratoires ......................................................................................................... 22
I.3.3) Les pathologies cancreuses............................................................................................................ 24
I.4) Mcanismes dactions biologiques des particules atmosphriques .............................. 26
I.4.1) La raction inflammatoire ................................................................................................................ 26
I.4.2) Le stress oxydant.................................................................................................................................... 28
I.4.3) Le mtabolisme des xnobiotiques.............................................................................................. 35
I.4.4) La cancrognse ................................................................................................................................... 36
I.5) La mort cellulaire par apoptose .................................................................................................. 41
I.5.1) Gnralits................................................................................................................................................. 41
I.5.2) La voie intrinsque ............................................................................................................................... 42
I.5.3) La voie extrinsque ............................................................................................................................... 48
I.5.3) Rle du calcium dans le processus apoptotique ................................................................... 49
I.5.4) Rle du stress oxydant dans le processus apoptotique .................................................... 51
I.5.5) Apoptose intrinsque induite par les particules atmosphriques ............................ 51
I.5.6) Effets cytoprotecteurs des PM et de leurs composants .................................................... 56
I.6) Objectifs de ltude ........................................................................................................................... 59

II.

MATRIEL ET MTHODES ................................................................................................................. 63

II.1) Mise en culture et traitement des cellules ............................................................................. 64
II.1.1) Culture cellulaire .................................................................................................................................. 64
II.1.2) Traitements des cellules .................................................................................................................. 64
II.2) Particules et composs mtalliques ......................................................................................... 66

II.2.1) Les mthodes de prlvement des PM ..................................................................................... 66

II.2.2) Particules de Paris 2003 .................................................................................................................. 67
II.2.3) Particules de Paris et Ouagadougou 2009 ............................................................................. 68
II.2.4) Composs mtalliques ....................................................................................................................... 70
II.2.5) Extraits organiques et aqueux des PM-AW ............................................................................ 70
II.3) Evaluation de la cytotoxicit des particules par cytomtrie en flux............................. 71
II.4) Etude de la voie de signalisation anti-oxydante .................................................................. 73
II.4.1) Mesure de la production despces ractives de loxygne par les PM: test DTT
....................................................................................................................................................................................... 73
II.4.2) Etude de leffet des anti-oxydants par cytomtrie en flux ............................................. 73
II.4.3) Dosage du Glutathion ......................................................................................................................... 74
II.4.4) Quantification des ARN messagers par PCR quantitative en temps rel (rtqPCR) ......................................................................................................................................................................... 74
II.4.5) Immunomarquage de Nrf2 .............................................................................................................. 76
II.5) Etude de la voie de signalisation calcique .............................................................................. 77
II.5.1) Mesure du calcium intracellulaire par FlexStation ........................................................... 77
II.5.2) Mesure du calcium intracellulaire par cytomtrie en flux............................................ 78
II.6) Etude des altrations morphologiques ................................................................................... 78
II.6.1) Observation de lactine en Microscopie lectronique fluorescence .................... 78
II.6.2) Microscopie lectronique balayage (MEB) ......................................................................... 78
II.6.3) Culture des cellules en milieu glifi (METHOCELTM) ...................................................... 79
II.7) Analyse statistique.......................................................................................................................... 79

III. RSULTATS : RLE DE LA COMPOSITION PHYSICO-CHIMIQUE DES PARTICULES DANS

LA RGULATION DE LAPOPTOSE ............................................................................................................ 81
III.1) Introduction..................................................................................................................................... 82
III.1.1) Contexte de ltude ............................................................................................................................ 82
III.1.2) Rappel sur les particules tudies ............................................................................................ 83
III.2) Rsultats ........................................................................................................................................... 84
III.2.1) Etude de linduction dapoptose ................................................................................................. 84
III.2.2) Etude de linhibition de lapoptose ........................................................................................... 92
III.3) Conclusion ......................................................................................................................................102

IV. RSULTATS : MCANISMES MOLCULAIRES IMPLIQUS DANS LEFFET ANTIAPOPTOTIQUE DES PARTICULES ..........................................................................................................103
IV.1) Contexte de ltude ...................................................................................................................... 104
IV.2) Rle de la voie anti-oxydante Nrf2 dans le mcanisme anti-apoptotique induit par
les composs particulaires mtalliques ......................................................................................... 105
IV.2.1) Rsum .................................................................................................................................................. 105
IV.2.3) Article soumis .................................................................................................................................... 106
IV.2.3) Rsultat supplmentaire & Discussion................................................................................ 153
IV.3) Rsultats supplmentaires .......................................................................................................159
IV.2.1) Rle du calcium dans leffet anti-apoptotique ................................................................. 159
IV.2.2) Interaction particules / cytosquelette ................................................................................. 161

vi

IV.2.2) Discussion ............................................................................................................................................ 167

IV.4) Conclusion ......................................................................................................................................169

V.

CONCLUSIONS GENERALES & PERSPECTIVES...........................................................................171

VI. ANNEXES ................................................................................................................................................179

ANNEXE 1: .................................................................................................................................................. 181
Polycyclic aromatic hydrocarbon components contribute to the mitochondria-antiapoptotic
effect of fine particulate matter on human bronchial epithelial cells via the aryl hydrocarbon
receptor .
Ioana Ferecatu, Marie-Caroline Borot, Camille Bossard, Melanie Leroux, Nicole Boggetto,
Francelyne Marano, Armelle Baeza-Squiban, Karine Andreau.
Particle and Fibre Toxicology 2010, 7:18
ANNEXE 2 : ................................................................................................................................................. 199
Health and cellular impacts of air pollutants: from cytoprotection to cytotoxicity.
Karine Andreau, Melanie Leroux and Ada Bouharrour
Biochemistry Research International 2012, 493894

VII. BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................................................219

vii

VALORISATION SCIENTIFIQUE

ACL1.

Articles publis dans des revues avec comit de lecture (ACL)

Andreau K., Leroux M., Bouharrour A., Health and cellular impacts of air pollutants:
from cytoprotection to cytotoxicity. Biochem Res Int. 2012; 2012: 493894.

ACL2.

Ferecatu I., Borot MC., Bossard C., Leroux M., Boggetto N., Marano F., Baeza-Squiban
A., Andreau K., Polycyclic aromatic hydrocarbon components contribute to the
mitochondria-antiapoptotic effect of fine particulate matter on human bronchial
epithelial cells via the aryl hydrocarbon receptor. Part Fibre Toxicol. 2010 Jul
21;7:18.

ACL3.

Articles soumis dans des revues avec comit de lecture (ACL)

Lovera-Leroux M., Crobeddu B., Kassis N., Baeza-Squiban A., Andreau K. Urban fine
PM and their metallic compounds protect human bronchial epithelial cells from
apoptosis: Role of Nrf2. Soumis

ACL4.

Leroux M., Ferecatu I., Bouharrour A., Andreau K., Rle des composs organiques et
mtalliques dans la rsistance la mort cellulaire confre par des particules fines
(PM2.5) urbaines. Soumis Pollution Atmosphrique.

COMMUNICATIONS ORALES

Communication orales sans actes dans un congrs international ou national

(COM)

COM1.

Leroux M., Ferecatu I., Bouharrour A., Andreau K., Role of organic compounds and
metals in the resistance to cell death conferred by urban fine particles (PM2.5). 2nd
European doctoral college on environment and health, Rennes, 2012.

COM2.

Leroux M., Ferecatu I., Bouharrour A., Andreau K., Rle des composs organiques et
mtalliques dans la rsistance la mort cellulaire confre par des particules fines
(PM2,5) urbaines. Journes interdisciplinaires de la Qualit de lair, Lille, 2012.

COMMUNICATIONS PAR AFFICHES

C-ACTI1.

Communication par affiche avec actes dans un congrs international (C-ACTI)

Andreau K., Ferecatu I., Leroux M., Baeza-Squiban A., Marano F., Polycyclic aromatic
hydrocarbon components contribute to the mitochondria-antiapoptotic effect of fine
particulate matter on human bronchial epithelial cells via the aryl hydrocarbon
receptor. Tox Lett. 2011, 205S: P2001.

viii


C-AFF1.

Communications par affiche sans actes dans un congrs national (C-AFF)

Leroux M., Ferecatu I., Andreau K., Les lments traces mtalliques et les composes
HAP contribuent leffet anti-apoptotique des particules fines atmosphriques
(PM2.5). 7me Congrs des Jeunes Chercheurs-Prix Ren Descartes 2011, Paris,
2011.

C-AFF2.

Ferecatu I., Borot MC., Bossard C., Leroux M., Boggetto N., Marano F., Baeza-Squiban
A., Andreau K., Polycyclic aromatic hydrocarbon components contribute to the
mitochondria-antiapoptotic effect of fine particles on human bronchial epithelial
cells via the aryl hydrocarbon receptor. Confrence Nano 2011 de lInstitut National
de Recherche et de Scurit, Nancy, 2011.

C-AFF3.

Ferecatu I., Borot MC., Leroux M., Marano F., Baeza-Squiban A., Andreau K., Les
composs HAP contribuent leffet anti-apoptotique des particules fines
atmosphriques (PM 2.5) par la voie du rcepteur Aryl Hydrocarbone (AhR).
Congrs de la Socit Franaise de Toxicologie, Paris, 2010.

C-AFF4.

Ferecatu I., Borot MC., Leroux M., Marano F., Baeza-Squiban A., Andreau K.,
Polycyclic aromatic hydrocarbon components contribute to mitochondria-anti
apoptotic effect of fine particulate matter on human bronchial epithelial cells via the
AhR pathway. Congrs de la Socit de Pharmaco-Toxicologie Cellulaire
Toxicologie Prdictive : les Voies du Futur , Paris, 2010.

C-AFF5.

Ferecatu I., Borot MC., Leroux M., Marano F., Baeza-Squiban A., Andreau K., Les
composs HAP contribuent leffet anti-apoptotique des particules fines
atmosphriques (PM 2.5) par la voie du rcepteur Aryl hydrocarbone (AhR).
Journes Nano Biotechnologie Nano Toxicologie Nano et Socit, Orsay, 2010.

ix

ABREVIATIONS
8-OHdG : 8-hydroxydeoxyguanine

Cyt c : Cytochrome c

A23187 ou A23 : ionophore calcique

DD : Death Domain

Aex : extrait aqueux des PM-AW

DED : Death Effector Domain

AhR : Aryl hydrocarbon Receptor

DiOC6(3) ou DiOC :

AIF : Apoptosis Inducing Factor

3,3'Dihexyloxacarbocyanine Iodide

AIP : AhR Interecting Protein

DISC : Death Inducing Signaling Complex

AnnV : Annexine V-FITC

DTNB : 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)

ANT : Adnine Nuclotide Translocator

DTT : dithiothritol

AP-1 : Apoprotine 1

EC : carbone lmentaire

Apaf1 : Apoptotic peptidase activating

EMX : Enzymes du Mtabolisme des

factor- 1

Xnobiotiques

APHEA : Air Pollution and Health: a

EndoG : endonuclase G

European Approach

ERO : Espces Ractives de lOxygne

APHENA : Air Pollution and Health: a

ESCAPE : European Study of Cohorts for Air

European and North American Approach

Pollution Effects

AR : Amphirguline

ETM : lment traces mtalliques

ARE : lments de rponse aux anti-oxydants

F : Particules Fines

Arnt : Aryl hydrocarbon receptor nuclear

FADD : Fas-Associated Death Domain

translocator

FZ : Fongizone

B2M : 2 microglobuline

GAPDH : Glycraldhyde-3-phosphate

BaP : Benzo(a)pyrene

dshydrognase

BPCO : Broncho-pneumopathie chronique

Glx : GlutaMAXTM

obstructive

GM-CSF : Granulocyte Macrophage Colony

BPDE : anti-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxy-

Stimulating Factor

benzo[a] pyrene

GPx : Glutathion Peroxydase

BSA : Bovine Serum Albumin

GR : Glutathion Reductase

CAD : Caspase-Activated DNase

GSH : glutathion rduit

Caspases: cysteinyl aspartate specific

GSSG : glutathion oxyd

proteases

GST : Glutathion S-transferase

CB: Carbon Black

GSTP1 : G lutathione S-transferase pi gene

CBP: cancers broncho-pulmonaires

HAP : Hydrocarbures Aromatiques

CITEPA: Centre Interprofessionnel Technique

Polycycliques

d'Etudes de la Pollution Atmosphrique

HE : hydrothidine

CNPC: Carcinomes Non Petites Cellules

HK-II : Hexokinase II

COV: Composs Organiques Volatils

HO1 : Hme oxygnase 1

Cp: Crossing point

Htra2 : High temperature requirement

CPC: Carcinome Petites Pellules

protein A2

Ct: Cycle threshold

IAP : Inhibitor Apoptosis Proteins

CYP: cytochromes P450

IARC : International Agency for Research on

Cyp-D: Cyclophiline-D

Cancer

ICAD : Inhibitor of Caspase Activated

PM10 : PM infrieures 10 m de diamtre

DNase

arodynamique

ICRP : International Commission on

PM2.5 : PM infrieures 2,5 m de diamtre

Radiological Protection

arodynamique

IEM : Indicateur d'exposition moyenne

PM-AS : PM Auteuil Summer

IL-6 : Interleukine 6

PM-AW : PM Auteuil Winter

Iono : ionomycine

PMM : permabilisation des membranes

IP ou PI : Iodure de Propidium

mitochondriales

LAURE : Loi sur lAir et lUtilisation

PM-VS : PM Vitry Summer

Rationnelle de lEnergie

PM-VW : PM Vitry Winter

MAM : Mitochondrial-associated

PN : Polynuclaires Neutrophiles

endoplasmic reticulum membranes

PTP : Pore de Transition de Permabilit

MAPK : Mitogen-activated protein kinase

RE : Rticulum Endoplasmique

MCU : Mitochondrial Calcium Unipoter

ROFA : Residual Oil Fly Ash

MEB : Microscopie lectronique balayage

RT-qPCR : Real Time Quantification

MEGATOX : MEGacity Aerosols chemical

Polymerase Chain Reaction

characterization and TOXicity

SMAC/DIABLO : Second Mitochondria-

MOMP : Mitochondrial Outer Membrane

derived Activator of Caspases

Permeabilization

SOD : superoxyde dismutase

MRP : Multidrug Resistance Protein

STS : staurosporine

NAT : arylamine N-acetytransfrase

TCDD : 2,3,7,8-ttrachlorodibenzo-p-dioxine

NMMAPS : National Morbidity, Mortality,

TNB :2-nitro-5 thiobenzoique acide

and Air Pollution Study

TNF-R : Tumor Necrosis Factor Receptors

NQO-1 : NADPH Quinone Oxydoreductase

TNF : Tumor Necrosis Factor

TR : particules Trafic

Nrf2 ou NFE2L2 : Nuclear factor (erythroid-

TRAIL : TNF-related apoptosis inducing

derived 2)-like 2

ligand

OB : particules Ouagadougou Biomasse

TSP : Total Suspended Particles

OC : carbone organique

TSPO : Translocator protein

Oex : extrait organique des PM-AW

UF : particules ultrafines

OMS : Organisation mondiale de la sant

UG : Ultroser G

OP : partiucles Ouagadougou Photochimie

UGT : UDP-glucuronosyltransfrase

PAPS : adenosine 3-phosphate 5-

VDAC : Voltage-dependent anion channel

phosphosulphate

WB : particules Wood Burning

PCB : Polychlorinated biphenyl

XB : xnobiotique

pDi : particules Diesel

XIAP : X-linked inhibitor of apoptosis

P-gp : glycoproteine P

protein

PM : Particulate Matter

XRE : lments de rponse aux xnobiotiques

PM0.1 : PM infrieures 0,1 m de diamtre

m : potentiel transmembranaire

arodynamique

mitochondrial

xi

LISTE DES FIGURES

CHAPITRE I
Figure I.1: Classification des particules atmosphriques en fonction de leur diamtre
arodynamique ...................................................................................................................................................................3
Figure I.2: Distribution granulomtrique moyenne dun arosol urbain en fonction du nombre
de PM, de leur surface ou de leur volume ................................................................................................................3
Figure I.3: Classification des particules atmosphriques en fonction de leur pntration et
dposition dans lappareil respiratoire ....................................................................................................................4
Figure I.4: Sources dmissions de particules atmosphriques en France mtropolitaine pour les
TSP. ..........................................................................................................................................................................................4
Figure I.5: Emissions dans lair de particules atmosphriques en France mtropolitaine en
kilotonnes (kt) par an.......................................................................................................................................................5
Figure I.6: Structure schmatise dune particule fine. ....................................................................................6
Figure I.7: Caractristiques physiques des particules atmosphriques. ...................................................7
Figure I.8 : Anatomie de lappareil respiratoire................................................................................................ 11
Figure I.9: Coupe histologique dune bronche extra-pulmonaire humaine .......................................... 13
Figure I.10: Schma de lpithlium alvolaire ................................................................................................. 14
Figure I.11: Diffrents mcanismes de dposition des PM dans le tractus respiratoire ................. 15
Figure I.12: Modle de prdiction du dpt fractionne des particules inhales .............................. 16
Figure I.13: Voies dlimination et de translocation des particules dposes dans le tractus
respiratoire ........................................................................................................................................................................ 19
Figure I.14: Coupes de parenchymes pulmonaires de femmes ayant vcu Vancouver ou Mexico
City ........................................................................................................................................................................................ 20
Figure I.15: Apparence de la muqueuse respiratoire dans lasthme et la BPCO. ................................ 24
Figure I.16: Coupes histologiques de tumeurs broncho-pulmonaires. ................................................... 25
Figure I.17: Schma de la raction inflammatoire induite par les particules Diesel (pDi) au
niveau de la muqueuse bronchique......................................................................................................................... 27
Figure I.18: Ractions de rduction de l'oxygne et de production dERO in vivo ............................. 28
Figure I.19: Ractions en chaines avec le Fer, formation de l'ion oxoferryle trs ractionnel ..... 29
Figure I.20: Ractions de production des ERO et systmes de dtoxification enzymatique ......... 30
Figure I.21: Modle de rponse hirarchise au stress oxydant induit par les particules ............. 33
Figure I.22: Reprsentation schmatique de la voie Nrf2 ............................................................................ 34
Figure I.23: Reprsentation schmatique du mtabolisme des xnobiotiques................................... 36
Figure I.24: Processus multi-tapes de lvolution dune cellule cancreuse ...................................... 37
Figure I.25: Les 10 caractristiques acquises par les cellules cancreuses .......................................... 37
Figure I.26: Mcanismes daltration et de rparation de lpithlium respiratoire ........................ 39
Figure I.27: Schma hypothtique des cellules souches de l'pithlium respiratoire
responsables de linitiation des tumeurs pulmonaires ................................................................................... 39

xii

Figure I.28: Les caractristiques morphologiques de l'apoptose, de loncose, et de la ncrose... 42

Figure I.29: La chaine respiratoire mitochondriale ........................................................................................ 43
Figure I.30: Mcanismes hypothtiques de la permabilisation de la membrane externe
mitochondriale ................................................................................................................................................................. 44
Figure I.31: Structure et fonctions des caspases .............................................................................................. 46
Figure I.32: Les protines de la famille Bcl-2..................................................................................................... 47
Figure I.33: Voies extrinsque et intrinsque de lapoptose ....................................................................... 49
Figure I.34: Apoptose dpendante et indpendante des ERO induite par les PM .............................. 52

CHAPITRE II
Figure II.1: Impacteur en cascade ........................................................................................................................... 67
Figure II.2: Fonctionnement dun cytomtre en flux ...................................................................................... 71
Figure II.3: Le principe de quantification en RT-qPCR .................................................................................. 76

CHAPITRE III
Figure III.1: Effet de l'exposition PM2.5 prleves en 2003 ........................................................................ 85
Figure III.2: Effet de l'exposition aux particules TR ........................................................................................ 86
Figure III.3: Effet de l'exposition aux particules WB ...................................................................................... 87
Figure III.4: Effet de l'exposition aux particules OB........................................................................................ 88
Figure III.5: Effet de l'exposition aux particules OP ........................................................................................ 89
Figure III.6: Composition chimique des particules OB3................................................................................ 90
Figure III.7: Potentiel pro-inflammatoire de diffrents lots de PM2.5 ..................................................... 91
Figure III.8: Reprsentation en radars, des effets des PM sur lexpression des gnes de
linflammation .................................................................................................................................................................. 91
Figure III.9: Effet anti-apoptotique de particules de diffrentes tailles ................................................. 92
Figure III.10: Effet anti-apoptotique des diffrents composs particulaires ....................................... 93
Figure III.11: Corrlation entre la composition des PM en HAP................................................................ 95
Figure III.12: Corrlation entre la composition des PM en mtaux ......................................................... 97
Figure III.13: Effet anti-apoptotique des composs mtalliques des PM............................................... 99
Figure III.14: Effet anti-apoptotique des composs ferreux des PM ..................................................... 100

CHAPITRE IV
Figure IV.1: Effet des PM et de leurs composs mtalliques et organiques sur la prolifration des
cellules 16HBE en milieu semi-solide.................................................................................................................. 158
Figure IV.2: Effet des PM2.5 sur le pic de calcium induit par A23 .......................................................... 159
Figure IV.3: Effet des PM-AWsur le calcium intracellulaire...................................................................... 160

xiii

Figure IV.4: Effet des inducteurs dapoptose sur lactine et la tubuline .............................................. 162
Figure IV.5: Effet des PM-AW sur lactine......................................................................................................... 163
Figure IV.6: Effet des PM-AW et de lA23 sur le cytosquelette ................................................................ 165
Figure IV.7: Effet des PM-AW et du STS sur le cytosquelette des cellules 16HBE........................... 166

CHAPITRE V
Figure V.1: Modle hypothtique mcaniste de l'effet anti-apoptotique de PM2.5 ......................... 177

xiv

LISTE DES TABLEAUX

CHAPITRE I
Tableau I.1: Normes europennes et franaises de qualit de lair.......................................................... 10
Tableau I.2: Paramtres influenant la dposition des PM. ........................................................................ 15
Tableau I.3: Comparatif entre lasthme et la BPCO ......................................................................................... 22
Tableau I.4: Classification histologique selon lOMS (2004) des carcinomes bronchopulmonaires
................................................................................................................................................................................................ 25
Tableau I.5: Mcanismes gntiques et pigntiques daltrations des oncognes et gnes
suppresseurs de tumeurs ............................................................................................................................................ 40

CHAPITRE II
Tableau II.1: Traitements des cellules 16HBE. ................................................................................................. 65
Tableau II.2: Protocole et modes dactions des traitements. ...................................................................... 66
Tableau II.3: Prlvements des particules atmosphriques. ...........................................................69 et 83
Tableau II.4: Composs mtalliques des PM de 2003 et doses utiliss dans les expriences
.....................................................................................................................................................................................70 et 98
Tableau II.5: Mesure de lapoptose par cytomtrie en flux. ........................................................................ 72
Tableau II.6: Squence des amorces utilises pour la RT-qPCR. ............................................................... 75

CHAPITRE III
Tableau III.1: Composition en HAP des PM de 2003. Daprs Baulig et al. 2004. ............................... 94
Tableau III.2: Leffet anti-apoptotique des diffrents des PM-AW est li aux HAP ayant cinq
cycles benzniques ou plus ......................................................................................................................................... 96

CHAPITRE IV
Tableau IV.1: Rcapitulatif des effets des inducteurs sur le calcium ................................................... 167

xv

AVANT-PROPOS
Ds la fin du XVIIme sicle, les prmisses de la rvolution industrielle favorisent les
premires proccupations concernant la pollution atmosphrique, avec notamment la ptition
de John Evelyn adresse au roi Charles II en 1661 demandant la relocalisation des industries les
plus polluantes de Londres hors de la capitale (Evelyn 1661; Seaton 2011). Les scientifiques
commencent sintresser la composition de lair et aux effets des diffrents polluants sur la
sant et lenvironnement. Au XVIIIme sicle, lopinion scientifique saccorde admettre leffet
nfaste de certains polluants comme les fumes et le gaz sulfureux, mais nest pas unanime sur
laspect toxicologique de la pollution gnrale des villes (Davenport et al. 1954; Halliday 1961).
En 1914 est publi un premier article indiquant que les cancers sont plus frquents dans les
villes pollues (Halliday 1961). La recherche sur la pollution atmosphrique connait une
recrudescence dans les annes 1950 suite aux pisodes dramatiques de fortes pollutions dues
des fumes noires. Ces fumes noires, ou smogs (contraction de smoke , fume, et fog ,
brouillard), contiennent notamment des molcules gazeuses irritantes ou toxiques (acide
sulfureux, goudrons, gaz nitreux) trs nfastes pour lHomme. Ces pisodes de forte pollution
ont eu lieu dans la valle de la Meuse, en Belgique, en 1930 (du 1er au 5 dcembre), causant plus
de 60 morts (Friket 1931; Haldane 1931; Nemery et al. 2001), en octobre 1948 (les 30 et 31
octobre) Donora, en Pennsylvanie (20 morts, Helfand et al. 2001), et Londres, en Angleterre
en 1952 (du 5 au 9 dcembre), causant plus de 4000 morts (Stegeman et al. 2002). Ces trois
pisodes sont lis une pollution latente due aux industries mtallurgiques (cas de Donora) ou
une combustion excessive du charbon (cas de la Meuse et Londres). La formation de ces smogs
hivernaux est associe des conditions climatiques exceptionnelles o linversion des
tempratures atmosphriques cre une couche d'air plus chaud en altitude qui pige la pollution
dans une couche d'air froid prs de la surface. De nombreux autres smogs se sont dclars
jusqu aujourdhui.
Parmi les polluants atmosphriques, les particules en suspension sont trs dltres
pour lHomme. Depuis les annes 1950, de nombreuses tudes pidmiologiques ont permis
dtablir un lien vident entre la pollution particulaire et laugmentation de la mortalit et de la
morbidit dorigines respiratoires et cardio-vasculaires (Mills 1951; Mahoney 1976; Schwartz
1994). Les recherches les plus rcentes ont permis de dmontrer clairement que ces effets sur la
sant apparaissent des concentrations modres de polluants, rencontres dans les grandes
villes. A long terme, la pollution particulaire peut exacerber certaines pathologies pulmonaires,
les troubles du dveloppement de la fonction pulmonaire chez lenfant et les cancers du poumon.
De nos jours, l'Organisation Mondiale de la Sant (OMS) estime que la pollution
atmosphrique par les particules (PM) contribue environ 800.000 dcs prmaturs chaque
anne, ce qui la classe au 13me rang des causes de mortalit dans le monde. De plus, en octobre
2013, lIARC (International Agency for Research on Cancer) a class la pollution
atmosphrique extrieure comme cancrigne certain pour lHomme, les particules fines ont t
galement values et classes sparment comme cancrigne certain. Cest pourquoi il est
indispensable de poursuivre les recherches sur la composition de la pollution de lair et sur ses
mcanismes dactions toxiques.

xvi

Dans ce contexte le but de ma thse a t :

Dtudier et de comparer la cytotoxicit de particules de diffrentes tailles et de

diffrentes sources.

Dtudier leffet des particules atmosphriques sur la rgulation de la mort cellulaire par
apoptose.

Didentifier les composs impliqus dans la rsistance lapoptose cause par certaines
particules fines tudies.

De dcrypter les mcanismes molculaires conduisant cette rsistance lapoptose.

xvii

xviii

I. INTRODUCTION
I.1) La pollution atmosphrique ............................................................................................................ 2
I.1.1) La pollution particulaire ........................................................................................................... 2
I.1.2) Rglementation de la qualit de lair.................................................................................... 8
I.2) Les voies respiratoires : cible principale des particules atmosphriques .................. 11
I.2.1) Caractristiques de lappareil respiratoire..................................................................... 11
I.2.2) Dposition des particules dans lappareil respiratoire .............................................. 14
I.2.3) Devenir des particules dans lappareil respiratoire et lorganisme ...................... 17
I.3) Effets des particules atmosphriques sur la sant humaine ............................................ 20
I.3.1) Etudes pidmiologiques ....................................................................................................... 20
I.3.2) Les pathologies respiratoires ............................................................................................... 22
I.3.3) Les pathologies cancreuses................................................................................................. 24
I.4) Mcanismes dactions biologiques des particules atmosphriques .............................. 26
I.4.1) La raction inflammatoire ..................................................................................................... 26
I.4.2) Le stress oxydant ...................................................................................................................... 28
I.4.3) Le mtabolisme des xnobiotiques .................................................................................... 35
I.4.4) La cancrognse ...................................................................................................................... 36
I.5) La mort cellulaire par apoptose .................................................................................................. 41
I.5.1) Gnralits .................................................................................................................................. 41
I.5.2) La voie intrinsque................................................................................................................... 42
I.5.3) La voie extrinsque .................................................................................................................. 48
I.5.3) Rle du calcium dans le processus apoptotique............................................................ 49
I.5.4) Rle du stress oxydant dans le processus apoptotique .............................................. 51
I.5.5) Apoptose intrinsque induite par les particules atmosphriques ......................... 51
I.5.6) Effets cytoprotecteurs des PM et de leurs composants............................................... 56
I.6) Objectifs de ltude ........................................................................................................................... 59

I.1) LA POLLUTION ATMOSPHERIQUE

Dans le Code de lEnvironnement, la pollution atmosphrique est dfinie comme tant
l'introduction par l'homme, directement ou indirectement, ou la prsence, dans l'atmosphre
et les espaces clos, d'agents chimiques, biologiques, ou physiques, ayant des consquences
prjudiciables de nature mettre en danger la sant humaine, nuire aux ressources
biologiques et aux cosystmes, influer sur les changements climatiques, dtriorer les biens
matriels, provoquer des nuisances olfactives excessives (article L. 220-2). Par consquent, la
pollution atmosphrique correspond la prsence indsirable de polluants ou l'lvation
excessive de la proportion de certains constituants de l'atmosphre.
Lair que nous respirons est principalement compos dazote (78 %) et doxygne (21
%), dans les 1% restant sont prsents des gaz rares (Argon, Non, Hlium,...), de la vapeur d'eau,
du dioxyde de carbone (CO2), et de nombreux polluants plus ou moins nocifs pour lHomme et
son environnement. Ces polluants peuvent tre dorigines naturelles telles que les vgtaux,
bactries, les cendres et les gaz issus des ruptions volcaniques (dioxyde de soufre (SO2), sulfure
dhydrogne (H2S),), lrosion naturelle des sols (sable, terre), etc. ; ou dorigines anthropiques
telles que les industries, les transports (usure de pneus, carburants,), le chauffage (au bois ou
au gaz), la production dnergie, etc. Les polluants atmosphriques peuvent tre de nature
gazeuse (90 % des masses globales de polluants rejets dans lair) ou particulaire (particules en
suspension dans lair). La pollution partiuclaire est aujourdhui reconnue comme trs nfaste
pour la sant.

I.1.1) La pollution particulaire

I.1.1.i) Classification des particules atmosphriques
Il existe plusieurs classifications possibles des particules atmosphriques selon les effets
qu'elles induisent sur la sant humaine, leurs sources, ou leurs caractristiques physicochimiques. Cependant, elles sont communment rparties en fonction de leur taille, qui est
mesure grce au diamtre arodynamique permettant de dcrire le comportement dune
particule en suspension. Le diamtre arodynamique dune particule est dfini comme le
diamtre dune sphre de masse volumique 1 g/cm3 qui a la mme vitesse de chute dans l'air
que la particule considre, dans les mmes conditions de temprature, de pression et
dhumidit (AFNOR 1985).
Selon la dnomination mtrologique, les particules atmosphriques inhalables sont
appeles PM pour Particulate Matter , avec un indice de taille (Choi et al. 2004), alors que la
dnomination toxicologique utilise les adjectifs grossires, fines, ultrafines et/ou
nanoparticules (Figure I.1). Ainsi, les particules peuvent tre classes en quatre catgories
selon leur diamtre arodynamique :

les PM0.1 ont un diamtre arodynamique infrieur ou gal 0,1 m et correspondent aux
particules ultrafines (UF) ;

les PM2.5 ont un diamtre arodynamique infrieur ou gal 2,5 m, dans cette catgorie
sont regroupes les particules ultrafines (UF) et fines (F) ;

les PM10 ont un diamtre arodynamique infrieur ou gal 10 m, cest un mlange de

particules ultrafines (UF), fines (F) et grossires (G);

les TSP ( Total Suspended Particles ) ont un diamtre arodynamique compris entre
0,01 et 100 m, comprenant tout larosol.
Figure I.1: Classification des particules
atmosphriques en fonction de leur
diamtre arodynamique.
Suivant la terminologie toxicologique, les
particules sont classes selon leur diamtre
arodynamique : les particules entre 10 et
2,5 m sont dites grossires, celles entre 2,5
et 0,1 m sont les particules fines, celles
infrieures 0,1 m sont nommes
particules ultrafines.
En
mtrologie,
les
particules
atmosphriques sont aussi appeles
Particulate Matter ou PMx avec en x la
taille limite des particules : PM10 pour les
particules infrieures ou gales 10m,
PM2.5 pour les particules infrieures ou
gales 2,5m, PM0,1 pour les particules
infrieures ou gales 0,1m.

Les PM sont aussi caractrises par : leur nombre, leur surface et leur volume. Ainsi, la
figure 1.2 illustre le fait que mme si la distribution en taille des PM stend largement, les
particules ultrafines dominent largement larosol en rfrence leur nombre et leur surface.
Figure I.2 : Comparaison de la
distribution
granulomtrique
moyenne dun arosol urbain en
fonction du nombre de PM (noir),
de leur surface (rouge) ou de leur
volume (bleu).
La distribution des particules de
diffrentes tailles varie suivant lordre
de grandeur tudi. Les particules
ultrafines dominent entirement les
autres tailles de particules en termes
de nombre et de surface : elles sont
beaucoup plus nombreuses et
reprsentent une grande surface de
contact. En terme de volume la
distribution est rpartie entre les
particules grossires et ultrafines, les
particules fines reprsentant un
volume plus faible. Daprs INRS 2005.
Diamtre de particules (dp) (m)

Enfin, dans les domaines professionnel et mdical, les particules sont dfinies en fonction
de leur capacit pntrer et se dposer dans les diverses rgions du tractus respiratoire :
particules inhalables, thoraciques ou alvolaires (Figure I.3) en lien avec leurs effets sur la sant
humaine (voir I.2.3 et I.3).

Figure I.3 : Classification des particules

atmosphriques en fonction de leur
pntration et dposition dans lappareil
respiratoire. La fraction inhalable des particules
de larosol correspond aux PM qui pntrent
par le nez et la bouche. La fraction thoracique est
la portion des particules inhalables passant par
le larynx et pntrant dans la trache et les
bronches suprieures. Enfin, les particules
respirables (ou alvolaires) sont les particules
pntrant dans les rgions profondes des
poumons (bronchioles et alvoles). Daprs TSI
2013.

I.1.1.ii) Sources
Chaque anne depuis 1961, le CITEPA (Centre Interprofessionnel Technique d'Etudes de
la Pollution Atmosphrique) ralise des inventaires nationaux d'missions de polluants
atmosphriques et de gaz effet de serre, conformment aux engagements internationaux de la
France (voir I.1.4.3). Les figures I.4 et I.5 montrent que tous les secteurs d'activit
contribuent aux missions de particules avec, pour l'anne 2011, par ordre d'importance :
l'agriculture/sylviculture (52%, cultures, herbicides et pesticides), l'industrie manufacturire
(31%, essentiellement le BTP), le secteur rsidentiel/tertiaire (10%, principalement d au
chauffage), le trafic routier (5%), et enfin, moindre part, les autres modes de transport hors
routier (1%) et la distribution/transformation d'nergie (1%) (CITEPA 2013).

Figure I.4 : Sources dmissions de particules atmosphriques en France

mtropolitaine pour les TSP. Daprs Sullivan et al. 2010; CITEPA 2013.

Figure I.5: Emissions dans lair de particules atmosphriques en France mtropolitaine en

kilotonnes (kt) par an. TSP : Ensemble des particules ( Total suspended particles ), PM 10 : particules
atmosphriques de diamtre arodynamique infrieur 10 m, PM 2.5 : particules atmosphriques de
diamtre arodynamique infrieur 2,5 m, PM1: particules atmosphriques de diamtre arodynamique
infrieur 1 m. Emissions inventories entre 1990 2011. Les donnes pour lanne 2012 sont une
estimation prliminaire. Daprs CITEPA 2013.

On observe une diminution nette des missions de particules atmosphriques en France

mtropolitaine de 1990 2011 (-359 kt pour les TSP, Figure I.5). Celle-ci est dautant plus
marque pour les PM de petite taille (respectivement -51%, -58% et -63% pour les PM10, PM2.5,
PM1, CITEPA 2013). Il est noter que tous les secteurs participent la diminution observe
depuis 2000, sauf pour le secteur agricole/sylvicole qui domine de plus en plus les missions de
TSP et PM10 (respectivement 52% et 20% en 2011, Figure I.4). Les sources dmissions des
particules fines (PM2.5 et PM1) sont domines par le secteur rsidentiel, l'industrie et le
transport routier, respectivement 45%, 24%, et 18% des missions de PM2.5 en 2011 (Figure

I.4). Cette observation est reprsentative de la composition particulaire, puisque les particules
Diesel (pDi), ainsi que les suies issues de la combustion dnergies industrielles et rsidentielles,
sont des polluants primaires carbons (un noyau de carbone suie avec des composs organiques
adsorbs), principalement retrouvs dans les fractions fines et ultrafines de larosol.
I.1.1.iii) Composition et structure
La pollution particulaire est un mlange htrogne de particules, dont la composition
varie suivant leur granulomtrie, leurs origines (sources dmissions), les conditions
mtorologiques (temps, vents, saisons), leurs transformations dans lair (photochimie,
hydrolyse, catalyse) et leurs interactions avec dautres composs atmosphriques (Lelieveld et
al. 2002; Perrone et al. 2013).
Prsents dans des proportions variables dans les 3 fractions granulomtriques des PM,
les principaux composs identifis sont :

Des composs carbons

Les composs carbons sont constitus dune fraction lmentaire et dune fraction

organique. Le carbone lmentaire (EC), aussi appel noir de carbone ou carbone suie, est
principalement dorigine primaire et rsulte de la combustion complte de la matire organique,
tandis que, le carbone organique (OC) est dorigine primaire et secondaire et provient de la
combustion incomplte de la matire organique. LEC est constitu de petites particules qui
sagrgent en chapelet, cette structure se rapproche du graphite (avec des microcristaux relis
par des hydrocarbures satur ou insaturs) et forme un cur carbon sur lequel sadsorbent
dautres composs, notamment des composs organiques (Figure I.6, Ebner et al. 2005; PerneletJoly 2008).
Ce sont principalement des PM2.5, produites lors de la combustion de carburants comme
le fioul, lessence, le krosne et le Diesel, qui forme des suies essentiellement carbones et
parfois soufres (Figure I.7A-E). Ainsi, les pDi sont les particules modles pour ltude des
PM2.5. Elles sont structures autour dun cur carbon sur lequel sadsorbent plus de 400
espces, parmi lesquelles des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), des quinones,
des aldhydes, des mtaux, des sulfates, etc. (Figure I.6)
Figure I.6: Structure schmatise dune
particule fine.
Avec pour exemple une particule Diesel, la
structure gnrale dune particule fine est:
un cur carbon sur lequel peuvent
sadsorber des composs organiques tels que
les quinones et hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAP);
des
composs
biologiques comme les pollens et les
endotoxines ; des mtaux (lourds ou de
transition).

2 m

2 m

10 m

2 m

1 m

2 m

50 m

10 m

10 m

Figure I.7: Caractristiques physiques des particules atmosphriques (Paris 2003). Les particules
atmosphriques contiennent des suies (A-C), des cendres volantes (D et E), des particules dusure (F) ou
des particules biologiques (G-I). Les photos A et B montrent des suies agrges en paquet dune dizaine de
m ou en forme de chapelet (C). Pour tous, llment de base est une structure sphrique denviron 100
nm de diamtre. Les cendres volantes de charbon sont caractrises par une surface lisse (D) alors que
celles issues du fioul sont reconnaissables par leur aspect trou (E). Des particules terrignes (G), des
pollens (H) ou dautres particules probablement dorigine vgtale peuvent aussi exister (I). Lensemble
des photos ont t prises en microscopie lectronique balayage. Daprs Baulig et al. 2004.

Des composs organiques

Les composs organiques contiennent au moins un atome de carbone associ des

atomes d'hydrogne, oxygne, azote, soufre, nitrates et/ou sulfates. Ils sont issus de
phnomnes de combustions (industrielle et rsidentielle), vaporations de solvants (peintures,
produits dentretien), vaporations de composs organiques (carburants) et ractions
biologiques Parmi ceux-ci, sont retrouvs les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP),
les hydrocarbures aliphatiques et nitro-aromatiques, les quinones, les aldhydes, etc. (Yu, J.Z. et
al. 2011; Val et al. 2013). Une attention particulire est porte aux HAP de par leurs effets
cancrognes, gnotoxiques, et perturbateurs endocriniens pour lHomme (Bekki et al. 2013;
Kim, K.H. et al. 2013) ainsi que leur prsence dans les fractions fines et ultrafines de larosol
(Jeng 2010; Val et al. 2013).

Des composs minraux

Les particules minrales sont principalement des particules terrignes, issues de

lrosion des sols et des routes (Figure I.7F-G), de la remise en suspension de poussires
dsertiques, des embruns, et des travaux de chantiers. Ce sont aussi des sels tels que le
carbonate de calcium et le chlorure de sodium provenants notamment de lvaporation de leau
de mer et des exploitations minires (Pernelet-Joly 2008). Ces composs sont retrouvs
essentiellement dans la fraction grossire des particules atmosphriques (Lelieveld et al. 2002).

Des composs inorganiques

Les composs inorganiques sont essentiellement des polluants secondaires, parmi

lesquels les sulfates (SO2, SO4), les halognures, l'acide sulfurique (H2SO4) et les nitrates, issus de
la transformation des particules et de loxydation du soufre et de lazote ; des acides
chlorhydriques (HCl) et bromhydriques (HBr), dus lhydrolyse des halognures, bromures et
chlorures de plomb mis par les gaz dchappement ; de lozone O3, qui rsulte, sous l'action du
rayonnement solaire, de la transformation chimique des oxydes dazote NOx (NO et NO2) et des
composs organiques. Ces composs sont principalement de petite taille, et peuvent sadsorber
sur le carbone (particules fines et ultrafines, Figure I.6).

Des mtaux
Les mtaux et mtallodes sont des lments inorganiques naturellement prsents dans

lenvironnement (crote terrestre et arosols marins) et ltat de traces dans les sols (moins de
1 g/kg), do leur noms dlment traces mtalliques (ETM, nomination prfrentielle
mtaux lourds couramment utilise et dsignant les mtaux ayant une masse volumique
suprieure 5 g/cm3). Les ETM sont galement largement utiliss dans lindustrie depuis la
rvolution industrielle.
Les rejets dlments mtalliques tels que Pb, Hg, Zn, Cd, Cu et Cr ont t multiplis par
trois, depuis le dbut de l're industrielle (INERIS 2006). Ainsi, les sources dmissions
anthropiques sont principalement lindustrie mtallurgique (sidrurgie, etc..), les phnomnes
abrasifs (freinage des vhicules, usure de la chausse, remise en suspension, etc.), et la
combustion (chauffage, incinration, etc., Pernelet-Joly 2008). Certains mtaux peuvent
galement tre des traceurs spcifiques dmissions dorigines anthropiques comme le zinc, le
potassium et le soufre, marqueurs de combustions de biomasse.
Parmi les mtaux adsorbs sur les particules, sont retrouvs : du vanadium (V), du
cadmium (Cd), du mercure (Hg), du plomb (Pb), de laluminium (Al), du titane (Ti), du cuivre
(Cu), du zinc (Zn), etc. (Andreau et al. 2012). En gnral les PM ne contiennent que dinfimes
quantits dETM (quelques g/g de PM), nanmoins, certaines catgories de particules sont
connues pour tre riches en mtaux, telles que les ROFA ( Residual Oil Fly Ash = cendres
volantes rsiduelles dhuile, Baulig et al. 2004).

Des composs biologiques

Des composs biologiques comme des pollens (Figure I.7 H-I), des spores et divers

micro-organismes (algues, champignons, bactries, virus ) sont gnralement retrouvs dans

la fraction grossire de larosol (Pernelet-Joly 2008).

I.1.2) Rglementation de la qualit de lair

Les pisodes majeurs de pollution de lair extrieur ayant eu lieu au dbut du XXme sicle
en Belgique, Pennsylvanie et Londres, ont conduit les autorits internationales, europennes et
franaises lgifrer afin de limiter la prsence de polluants dans latmosphre et damliorer la
qualit de lair via la dfinition de diffrentes valeurs :

 Les valeurs limites dexposition sont les valeurs atteindre dans un dlai donn et
ne pas dpasser ;
Les valeurs cibles sont les valeurs atteindre dans la mesure du possible afin dviter
les effets nocifs sur la sant et/ou lenvironnement ;

Les seuils dinformation et de recommandation sont les niveaux au-del desquels une
exposition de courte dure prsente un risque pour la sant pour des personnes
sensibles et qui ncessitent linformation immdiate de ces personnes ainsi que des
recommandations pour rduire certaines missions ;

Les seuils dalerte sont les niveaux de pollutions au-del desquels une exposition de
courte dure prsente un risque pour la sant humaine dans son ensemble, ou pour
l'environnement, et partir desquels des mesures de restriction des activits polluantes
doivent tre prises durgence (AirParif).

LOrganisation Mondiale de la Sant (OMS) recommande des valeurs limites d'exposition

pour certains polluants dont les particules atmosphriques : 50 g/m3/jour et 20 g/m3 de
moyenne annuelle pour les PM10 ; 25 g/m3/jour et 10 g/m3 de moyenne annuelle pour les
PM2.5. Ces lignes directrices, dont la dernire mise jour date de 2005, sappuient sur des tudes
scientifiques montrant quil n'a pas t observ d'effets nuisibles sur la sant en-dessous de ces
valeurs seuils. Elles constituent lvaluation la plus reconnue et la plus actuelle des effets de la
pollution atmosphrique sur la sant humaine et prconisent des objectifs de qualit de lair qui
rduisent fortement les risques sanitaires (OMS 2006; Respire ).
Sur la base des recommandations de lOMS, la Communaut Europenne tablit des
directives, notamment celles du 14 avril 2008 (2008/50/CE) et du 15 dcembre 2004
(2004/107/CE) qui visent : valuer la qualit de lair selon des mthodes dfinies, dfinir des
objectifs de qualit afin de prvenir ou rduire les effets de la pollution atmosphrique sur la
sant et lenvironnement, prserver une bonne qualit de lair, et informer le public. Cette
lgislation concerne un certain nombre de polluants dont les particules PM10 et PM2.5 (Tableau
I.1).
Au niveau national, les critres de qualit de l'air sont retranscrits dans la Loi n96-1236
du 30 dcembre 1996 sur lAir et lUtilisation Rationnelle de lEnergie (LAURE) et le Code de
l'environnement (articles R221-1 R221-3) rgulirement mis jour, conformment aux
directives europennes relatives la pollution atmosphrique (Tableau I.1). Ainsi, afin de lutter
contre la pollution particulaire et de rduire les polluants prcurseurs (oxydes dazote,
ammoniac), la France redouble defforts et un plan particules , a t publi en juillet 2010 la
suite du Grenelle de lEnvironnement (Grenelle 2). Il donne notamment pour objectif la
diminution de 30% des missions de PM2.5 en 2015 (Tableau I.1).

Tableau I.1: Normes europennes et franaises de qualit de lair. Daprs Union Europenne 2008;
AirParif .
Polluants

Valeurs limites

Objectifs

Seuil de
recommandation et
d'information

Seuil dalerte

Normes europennes
PM10

PM2.5

En moyenne
annuelle : 40 g/m.
En moyenne
journalire :
50 g/m ne pas
dpasser plus de 35
jours par an.
En moyenne
annuelle :
Phase 1 : 28 g/m
pour l'anne 2008,
dcroissant
linairement chaque
anne pour atteindre
25 g/m en 2015.
Phase 2 : 20 g/m en
2020 .

Valeur cible pour la

protection de la
sant : 25 g/m en
moyenne annuelle
(devait tre respecte
le 1er janvier 2010)
Concentration qui
doit tre respecte
en 2015 : 20 g/m
pour l'IEM (indice
dexposition
moyenne)

Normes franaises
PM10

PM2.5

En moyenne
annuelle
40 g/m
En moyenne
journalire : 50
g/m ne pas
dpasser plus de 35
jours par an.
En moyenne
annuelle :
28 g/m pour
l'anne 2008,
dcroissant
linairement chaque
anne pour atteindre
25 g/m en 2015.

30 g/m en moyenne
annuelle

50 g/m en moyenne
journalire

80 g/m en moyenne
journalire

20 g/m pour l'IEM

2015 $

10 g/m en moyenne
annuelle

valeur limite indicative qui sera rvise par la commission europenne en 2013 la lumire des
informations complmentaires sur l'impact sanitaire et environnemental, la faisabilit technique et
l'exprience acquise en matire de valeur cible dans les tats membres
$ IEM 2015 : Indicateur d'exposition moyenne de rfrence, correspondant la concentration moyenne
annuelle en g/m sur les annes 2013, 2014 et 2015.

10

I.2) LES VOIES RESPIRATOIRES : CIBLE PRINCIPALE DES PARTICULES ATMOSPHERIQUES

Lors de la respiration, un adulte au repos inspire et expire environ 6 10 litres d'air par
minute et peut atteindre 200 litres par minute lorsque la respiration s'acclre pendant leffort.
Chaque jour, nous inspirons en moyenne 15 m3 d'air. Les particules atmosphriques sont en
suspension dans lair que nous respirons, le tractus respiratoire est donc la principale voie
dentre des PM dans lorganisme.

I.2.1) Caractristiques de lappareil respiratoire

I.2.1.i) Anatomie de lappareil respiratoire
Dun point de vue anatomique, le tractus respiratoire stend des fosses nasales
jusquaux alvoles pulmonaires. Il est constitu : du nez et des fosses nasales, du pharynx, du
larynx, de la trache, des bronches, des bronchioles, des poumons, de la plvre, et des muscles
respiratoires (muscles intercostaux et diaphragme, Figure I.8).
Les voies ariennes peuvent tre spares en deux parties :
les voies ariennes suprieures ou extra-thoraciques, qui vont du nez jusqu la partie
extra-thoracique de la trache ;
les voies ariennes infrieures stendent de la partie thoracique de la trache aux
bronchioles pulmonaires, elles contiennent larbre bronchique dans lequel ont lieu les
changes gazeux caractristiques de la respiration.

Figure I.8 : Anatomie de lappareil respiratoire.

Dun point de vue physiologique, lappareil respiratoire est subdivis en trois parties :
La zone de conduction : des fosses nasales jusquaux grosses bronches.

11

 La zone de transition qui comprend des bronches et bronchioles partiellement

alvoles.
La zone respiratoire ou zone de diffusion, constitue des sacs alvolaires.
La zone de conduction a pour rle le conditionnement de lair. Les fosses nasales sont
constitues de prominences osseuses, nommes cornets, permettant daugmenter la surface de
contact entre lair inspir et la muqueuse nasale, la surface de contact atteignant ainsi 120 cm2.
Lair est ensuite transport travers la zone de conduction, dans les bronches, qui se
subdivisent en bronches et bronchioles de plus en plus petites, atteignant une surface de 1 2
m2. Lair va finir sa course dans les alvoles pulmonaires o la surface dchange gazeux est
suprieure 80 m2. Les changes gazeux permettant de fournir loxygne au sang et djecter le
dioxyde de carbone se font grce un processus de diffusion passive travers les parois
alvolaires.
I.2.1.ii) Histologie de lappareil respiratoire
La muqueuse respiratoire est prsente des fosses nasales jusquaux bronchioles
terminales intra-pulmonaires. La muqueuse respiratoire est constitue de : lpithlium
respiratoire ; dune lame basale constitue par un tissu conjonctif dense riche en Collagne IV
(lamina densa) et en laminine (lamina lucida) et du chorion qui comprend un tissu conjonctif
lche, vascularis et innerv reposant sur une couche fibro-cartilagineuse constituant le
squelette du larynx, de la trache et des bronches.
Lpithlium respiratoire tapisse larbre respiratoire des fosses nasales jusquaux
alvoles, il constitue une barrire physique entre lintrieur et lextrieur de lorganisme.
Lintgrit de cette barrire repose sur lexistence de plusieurs types de jonctions entre les
cellules pithliales et/ou la matrice extracellulaire (jonctions adhrentes, desmosomes,
hmidesmosomes) qui maintiennent lunit structurale et mcanique de lpithlium ; les
jonctions gap quant elles permettent le passage de petites molcules entre les cellules.
Lpithlium exerce dautres fonctions essentielles comme la dfense contre les
agressions et les infections via la scrtion de cytokines pro-inflammatoires, et llimination des
particules inhales via le transport mucociliaire.
Lpithlium respiratoire est constitu de divers types cellulaires qui diffrent non seulement
dans leur localisation mais aussi dans leurs fonctions et leur sensibilit aux toxiques. La
structure cellulaire des voies ariennes suprieures et des bronches est trs diffrente de celle
des alvoles pulmonaires : lpithlium des fosses nasales jusquaux bronchioles respiratoires
est cylindrique, pseudostratifi, cili et muco-scrteur ; tandis que lpithlium des alvoles est
monostratifi et ne secrte pas de mucus (Figures I.9 et I.10).
Lpithlium respiratoire
Constitu de cellules cilies, cellules scrtrices, cellules de Clara, cellules caliciformes et
cellules basales (Figure I.9) au sein de la muqueuse respiratoire, lpithlium nest pas
uniforme. Les deux bronches souches ont la mme structure que la trache, puis, au fur et
mesure de la diminution de leur diamtre, les bronchioles prsentent de moins en moins de

12

cartilage, de cils et de cellules mucus, leur structure histologique se modifie pour ressembler
de plus en plus celle des tissus de la zone dchange gazeux au niveau des alvoles
pulmonaires.
Figure I.9: Coupe histologique
dune bronche extra-pulmonaire
humaine. Lpithlium respiratoire
est un pithlium pseudostratifi
compos de cellules cilies, de
cellules scrtrices de mucus, de
cellules basales reposant sur une
membrane basale et de glandes sousmuqueuses. Le tapis muqueux est
form dune couche viscolastique :
le mucus et dune couche aqueuse : le
liquide pri-ciliaire. La lame basale
est constitue de protines et
glycoprotines
(notamment
la
laminine et le collagne) scrtes
par les cellules. Grossissement :
x1000. Daprs UMPC 2006 .

Les cellules basales reprsentent un tiers des cellules pithliales. Ce sont de petites
cellules plates natteignant pas le ple apical et sont relies par des hmidesmosomes la
matrice extracellulaire. Les cellules basales sont considres comme les cellules souches
pithliales capables de gnrer tous les autres types cellulaires de lpithlium (Sullivan et al.
2010).
Les cellules cilies sont les cellules les plus abondantes de lpithlium, elles sont
retrouves des fosses nasales jusquaux bronchioles. Chaque cellule cilie contient environ 200
cils (de 5 7 m de long pour 0,2 m de diamtre), ainsi que des microvillosits (de 0,2 0,3
m de long) insres entre les cils vibratiles. Le battement coordonn des cils, tourns vers la
lumire bronchique, permet la propulsion du mucus vers le larynx. Le nombre de cellules cilies,
la vitesse de battement et la longueur des cils diminuent en descendant dans larbre bronchique.
Les cellules scrtrices de mucus, ou cellules caliciformes, sont semblables celles
retrouves au niveau de lintestin. Dissmines parmi les cellules cilies, elles contiennent des
granules de scrtion et contribuent, avec les glandes sous-muqueuses, la production du
mucus. Le nombre de cellules caliciformes diminue en descendant dans larbre bronchique et
elles sont progressivement remplaces par les cellules de Clara au niveau des bronchioles.
Les cellules de Clara sont des cellules de transition entre celles des voies de
conduction et celles de la zone dchange gazeux. Ce sont des cellules pyramidales, avec des
microvillosits courtes et irrgulires, elles contiennent des grains de scrtion. Leur rle est de
protger et maintenir lpithlium bronchique en secrtant notamment des protines, des
oxydases, ainsi que des composants du surfactant alvolaire. Ces cellules prsentent galement
des potentialits de cellules souches (Sullivan et al. 2010).
La paroi alvolaire
Afin de permettre la diffusion optimale des gaz et leur transport entre les poumons et le
sang, la paroi alvolaire est trs mince et troitement relie aux capillaires sanguins (Figure

13

I.10). La surface de la paroi alvolaire est tapisse dune simple couche de cellules
pavimenteuses, nommes pneumocytes de type I qui reprsentent 90% de la surface des
alvoles (mais 40% en terme de nombre de cellules) et jouent un rle essentiel dans les
changes gazeux entre lair des alvoles et les capillaires sanguins. Il existe galement des
pneumocytes de type II, de forme cubique ou ronde, qui occupent 10% de la surface des
alvoles (mais 60% du nombre de cellules) et qui sont capables de se multiplier et se
diffrencier en pneumocytes de type I. Les pneumocytes de type II scrtent le surfactant, une
substance tensioactive tapissant la face luminale, pour faciliter l'expansion des alvoles
l'inspiration et les maintenir ouvertes pendant lexpiration. Enfin, les alvoles contiennent
galement des fibroblastes responsables de la synthse du collagne, des lymphocytes, et des
macrophages jouant un rle fondamental dans les mcanismes de dfense et de clairance
alvolaire (voir I.2.3.i).

Figure I.10: Schma de lpithlium alvolaire. En continuit avec la muqueuse respiratoire,

lpithlium alvolaire contient des pneumocytes de type I qui recouvrent environ 90% de la surface des
alvoles et jouent un rle essentiel dans les changes gazeux entre lair des alvoles et les capillaires
sanguins. Il existe galement des pneumocytes de type II qui scrtent du surfactant. Les fibroblastes
synthtisent et scrtent des protines de la matrice extracellulaire comme le collagne et le
protoglycane. Les macrophages alvolaires permettent la phagocytose des particules atmosphriques
inhales, des micro-organismes et des dbris cellulaires.

I.2.2) Dposition des particules dans lappareil respiratoire

I.2.2.i) Mcanismes de dposition des particules dans lappareil respiratoire
La dposition des particules dans le tractus respiratoire se fait par 4 types de
mcanismes (Figure I.11, Heyder 2004; depoussierage.fr ).

14

Figure I.11 : Diffrents mcanismes de dposition des PM dans le tractus respiratoire Humain.
La dposition des particules dans le tractus respiratoire se fait par 4 types de mcanismes :
A) Interception : la particule entre en contact avec la paroi respiratoire lorsquelle se dplace proche de
la paroi ou lors des bifurcations des voies ariennes, cela concerne surtout les particules fibreuses
(comme lamiante) ou les agrgats.
B) Impaction : au niveau des bifurcations bronchiques, les particules en suspension peuvent schapper
du flux dair en raison de leur inertie et continuer leur chemin pour simpacter sur la paroi se trouvant sur
leur trajectoire. La probabilit dimpaction dpend de la vitesse de lair inspir et de la taille de la
particule, ce phnomne touche surtout les particules de taille suprieures 0,5 m.
C) Sdimentation : en raison des forces de frottements de lair, les PM finissent par perdre leur
flottabilit dans lair et tombent sur la paroi sous leffet de la gravit. Ce phnomne est li la masse
des particules et concerne essentiellement les particules de taille suprieures 0,5 m.
D) Diffusion : ce phnomne concerne les particules les plus fines (inferieures 0,5 m), qui ont un
mouvement alatoire, semblable au mouvement brownien. Plus la particule est petite, plus cette agitation
est nergique et peut provoquer le dpt de particules sur les parois de manire alatoire, essentiellement
dans les bronchioles et les alvoles.

Le dpt des particules inhales dans les voies respiratoires est influenc par de
nombreux facteurs tels que lge, la respiration, les conditions mtorologiques et les proprits
des particules, rsums dans le Tableau I.2.
Tableau I.2 : Paramtres influenant la dposition des PM.
Paramtres influenant la dposition
des PM

Rfrences bibliographiques

Les conditions mtorologiques.

Fernandez Tena et al. 2012; Xi et al. 2013

La vitesse et intensit de la respiration : rapide ou

lente, forte ou faible, par le nez ou la bouche, au repos
ou pendant un effort physique.

Kim, C.S. et al. 1998; Oravisjarvi et al.

2011

La gomtrie des voies ariennes : lanatomie de

lappareil respiratoire est notamment diffrente chez
lhomme et la femme ainsi que chez lenfant et ladulte.

Kim, C.S. et al. 1998; Bennett et al. 2003;

Bennett et al. 2008

Les conditions physiques de lindividu (ge, tat de

sant).

Kim, C.S. et al. 1997; Darquenne 2012;

Horemans et al. 2012; Londahl et al. 2012

La taille, la forme et les proprits physico-chimiques

des PM.

Carvalho et al. 2011; Fernandez Tena et

al. 2012 (Figures I.11 et I.12)

15

I.2.2.ii) Modles mathmatiques

Il existe plusieurs modles mathmatiques permettant de prdire le dpt des particules
dans lappareil respiratoire. Le plus reconnu est celui de l International Commission on
Radiological Protection (ICRP, Figure I.12, Oberdorster et al. 2002; Oberdorster et al. 2005). Ce
modle s'applique pour une respiration nasale, au repos, chez un homme, et pour un arosol
monodispers sans agrgats. Ainsi, dans ce contexte, les particules suprieures 1 m se
dposent quasi-exclusivement dans la rgion nasopharynge (principalement par interception)
de mme que les particules ultrafines infrieures 1 nm (d leur mouvement similaire des
gaz). Enfin, les particules capables de se dposer au niveau trachal et alvolaire ont des tailles
comprises entre 1 nm et 0,1 m.
Tous les modles mathmatiques tiennent compte au maximum des facteurs influenant
la dposition des PM (Tableau I.2), ce qui leur permet dtre gnralement trs concordant avec
les observations in vivo (Churg et al. 1997; Farhadi Ghalati et al. 2012). Ainsi, les tudes de mme
que les modles mathmatiques montrent que la dposition des particules est trs ingale et
prsente des zones de dpt trs localises appeles hot spot (Balashazy et al. 2003; Phalen et
al. 2010).

Figure I.12: Modle de prdiction du dpt fractionne des particules inhales dans le nasopharynx
(bleu), la rgion trachobronchique (vert) et la rgion alvolaire (rouge) au repos, chez lhomme, pour un
arosol monodispers. Bas sur les donnes de lInternational Commission on Radiological Protection
(ICRP) (1994). Dessin de J. Harkema. Daprs Oberdorster et al. 2005.

16

I.2.3) Devenir des particules dans lappareil respiratoire et lorganisme

Les particules dposes dans lappareil respiratoire peuvent tre i) pures via la
clairance respiratoire (mucociliaire et alvolaire) ; ii) phagocytes par les cellules pithliales ;
iii) transloques vers dautres rgions de lorganisme ; ou iv) retenues au sein de lappareil
respiratoire (Figure I.13).
I.2.3.i) Elimination par la clairance respiratoire
La clairance respiratoire comprend une premire phase rapide (moins de 36 heures) : la
clairance mucociliaire, qui a lieu dans la zone de conduction et la zone de transition de larbre
respiratoire, et une phase plus lente (jusqu plusieurs mois) : la clairance alvolaire, qui a lieu
dans la zone respiratoire. En effet, des tudes ralises chez lHomme ont mis en vidence une
rtention bronchique de 11% (Roth et al. 1997) et parmi ces particules retenues, la moiti est
pure de manire rapide (24 heures aprs inhalation) grce lpithlium mucociliaire et
lautre moiti est retenue long terme (plusieurs mois).
La clairance mucociliaire
La clairance mucociliaire, qui est un processus de limmunit inne, est assure, dans
larbre trachobronchique, grce au mucus, produit par les cellules scrtrices et les glandes
sous-muqueuses, et au battement coordonn des cils des cellules cilies.
Le liquide de surface des voies ariennes comprend 2 phases :
La phase GEL ou mucus est une couche visco-alcoolique dans laquelle saccrochent
les impurets et les agents pathognes de lair inspir. Son paisseur varie de 7 70 m,
et lextrmit des cils baigne dedans (Figure I.9). Le mucus est compos deau ( plus de
95%) et dlectrolytes comme les ions sodium et chlore (1%), permettant de maintenir
ltat dhydratation des voies ariennes ; de glycoprotines filamenteuses riches en
sucres (2%) : les mucines qui forment un rseau macromolculaire ; de protines (1%),
possdant des proprits antimicrobiennes (IgA, lysozyme, transferrine) ; de lipides et
lipoprotines (1%). Cette composition donne des proprits viscolastiques et
antibactriennes au mucus.
La phase SOL ou liquide pri-ciliaire est une fine couche aqueuse dans laquelle
baignent les cils et sur laquelle repose la couche GEL . Son paisseur est lgrement
plus fine que la longueur des cils ( peu prs 7 m, Figure I.9). Sa composition comprend
de leau et des lectrolytes qui permettent de maintenir lpaisseur ncessaire au
mouvement mucociliaire puisque le mucus est travers seulement par les pointes
ciliaires lors la phase de propulsion (Sleigh 1983). Ainsi, une paisseur trop importante
de liquide pri-ciliaire empcherait les cils datteindre le mucus, tandis quune trop faible
paisseur bloquerait le mouvement des cils pigs dans trop de mucus. Ce liquide
contient galement des anti-oxydants, comme le glutathion, la superoxyde dismutase
(SOD) et la catalase, qui contribuent aux mcanismes de dfense contre les agents
infectieux, les xnobiotiques et les radicaux libres.

17

La majorit des impurets de lair inspir iront se fixer sur le mucus qui sera transport
vers le larynx, une vitesse denviron 15 mm/min, grce au battement des cils, puis sera
expector ou aval. Les cils battent une vitesse de 100 1500 battements/min, mais la
prsence de certains toxiques peut influer sur la vitesse de battement des cils ainsi que la
production de mucus.
La clairance alvolaire
Si des impurets ou des agents pathognes arrivent jusquaux alvoles pulmonaires, la
clairance alvolaire se met en place, les macrophages et les pneumocytes coordonnent leurs
actions de dfense pour produire des mdiateurs pro-inflammatoires (notamment des cytokines
et des protines du surfactant), grce au :
systme immunitaire inn o les macrophages phagocytent les impurets et les agents
pathognes puis remontent dans lescalator mucociliaire, ou traversent la paroi
alvolaire vers linterstitium et le systme lymphatique ;
systme immunitaire acquis, o les cellules pithliales et les macrophages prsentent
un antigne spcifique aux lymphocytes T induisant leur prolifration et la rponse
immunitaire, par la production de cytokines (interleukines, interfrons, TNF) capables
de stimuler limmunit humorale et/ou cellulaire (production de lymphocytes B et
anticorps).
I.2.3.ii) Phagocytose par les cellules pithliales
Lorsque les mcanismes de clairance sont dpasss ou que les PM passent au travers, les
cellules pithliales respiratoires peuvent elles aussi phagocyter les particules (Churg 1996). La
phagocytose des particules par les cellules pithliales respiratoires augmente avec la dose des
PM et est observe plus frquemment l o la clairance est faible, c'est--dire au niveau des
bronchioles pulmonaires et des bifurcations.
Plusieurs tudes ont montr que la liaison des PM la surface cellulaire et lactivation de
la phagocytose est lie la charge des particules, la liaison avec des rcepteurs, la prsence de
protines la surface des PM, et limplication du cytosquelette et des microtubules (Churg 1996;
Gehr 2010). Les espces ractives de loxygne (ERO) jouent aussi un rle important dans
linternalisation des PM. En effet, dans des conditions normales, la faible production de peroxyde
dhydrogne (H2O2) par les cellules pithliales a pour consquence une activation autocrine et
involontaire des mcanismes dinternalisation, le mme effet est observ avec les ERO produits
par les PM et les cellules de linflammation (Davis et al. 1994; Gehr 2010).
I.2.3.iii) Translocation
Une fois dposes dans le tractus respiratoire et phagocytes, les particules peuvent
transloquer rapidement vers dautres organes via linterstitium puis la circulation sanguine, ou
bien via le systme lymphatique (Oberdorster et al. 2002; Oberdorster et al. 2005; Gehr 2010,
Figure I.13). Ainsi des PM ont t retrouves dans le foie, les reins, la rate et le cur (Moller et
al. 2008; Furuyama et al. 2009). Les particules plus fines peuvent aussi transloquer directement

18

via les neurones sensoriels, et atteindre dautres organes, notamment le cerveau par le nerf
olfactif (Oberdorster et al. 2005; Elder et al. 2006).

Figure I.13: Voies dlimination et de translocation des particules dposes dans le tractus
respiratoire. GI=Gastro-intestinal, AM=Macrophages alvolaires. Les particules inhales peuvent tre
limines par la clairance mucociliaire (turquoise) puis expectores ou avales vers le systme gastrointestinal (jaune). Dans les sacs alvolaires, les particules peuvent tre limines grce la clairance
alvolaire assure par les macrophages alvolaires (vert). Au niveau des voies ariennes inferieures, les
particules peuvent transloquer rapidement vers dautres organes via linterstitium (violet) le systme
lymphatique (bleu) et la circulation sanguine (rouge). Au niveau des voies ariennes suprieures, les
particules de petite taille peuvent transloquer directement via les nerfs sensitifs, notamment du nerf
olfactif vers le cerveau (mauve). Daprs Oberdorster et al. 2005.

I.2.3.vi) Rtention
Les particules inhales saccumulent rapidement dans les cellules de lappareil
respiratoire. Plusieurs tudes ralises chez lHomme avec des particules marques
radioactivement ont permis de montrer que les particules dposes dans lappareil respiratoire
ne sont pures que partiellement par les mcanismes de clairance : entre 20% et 80% de PM
sont pures suivant les tudes (Churg et al. 1997; Brauer et al. 2001; Moller et al. 2008). Ainsi,
une tude de Churg et Brauer a permis lobservation de coupe de parenchymes pulmonaires de
femmes ayant vcu Vancouver, ville peu pollue (14 g/m3 de PM10), ou Mexico, ville trs
pollue (66 g/m3 de PM10). Cette tude met en vidence une accumulation de PM dix fois plus
grande chez les habitantes de Mexico, ainsi quun remodelage des parois bronchiques (Brauer et
al. 2001; Churg et al. 2003, Figure I.14).

19

Figure I.14: Coupes de parenchymes pulmonaires de femmes ayant vcu Vancouver (A) ou
Mexico City (A, B, C). Le poumon de Vancouver a une paroi trs mince, tandis que celui de Mexico City
prsente une paroi paissie avec une accumulation de particules. Grossissements : x50 pour A, B et C,
x200 pour D. Daprs Churg et al. 2003.

I.3) EFFETS DES PARTICULES ATMOSPHERIQUES SUR LA SANTE HUMAINE

Les effets sanitaires de la pollution atmosphrique ont t valus en premier lieu par les
tudes pidmiologiques qui ont mis en vidence des liens statistiques entre lexposition aux PM
(lors dun pisode de pollution leve par exemple) et divers paramtres de la sant humaine
(comme laugmentation des maladies respiratoires dans une mme ville). Les tudes
pidmiologiques prsentent lavantage dobserver les individus dans leur environnement, bien
que celui-ci puisse tre complexe, mais apportent plusieurs facteurs confondants aux
interprtations obtenues. Dans un second temps, les tudes toxicologiques exprimentales in
vitro (sur des cultures de cellules) et in vivo (sur des animaux de laboratoire ou sur des
volontaires lors de tests cliniques) permettent de confirmer les liens de causes effets, de mieux
comprendre et de dcrypter les mcanismes biologiques impliqus. Le principal inconvnient
rside dans ltude dune variable unique (prsence ou absence de la molcule toxique) pouvant
tre responsable des effets observs. Ces deux approches scientifiques ont nanmoins
clairement dmontr les effets dltres de la pollution atmosphrique, en particulier la
pollution particulaire, sur la sant humaine (Boland, Sonja et al. 2001).

I.3.1) Etudes pidmiologiques

I.3.1.i) Effets des pics de pollution
Depuis les annes 1950, de nombreuses tudes pidmiologiques ont permis dtablir un
lien vident entre la pollution particulaire et laugmentation de la mortalit et de la morbidit
(admission lhpital) dorigines respiratoires et cardio-vasculaires (Mills 1951; Mahoney 1976;
Schwartz 1994). Ainsi, Chicago entre 1988 et 1993, le nombre dhospitalisations a montr une
corrlation entre une augmentation de 10 g/m3 en PM10 et la morbidit pour causes

20

cardiaques (+ 1,3%), dobstructions pulmonaires (+ 1,4%) et de pneumonies (+ 2%) (Schwartz

2001). De plus, une tude sur les habitants de lUtah a mis en vidence une augmentation de
16% de la mortalit journalire lorsquil y a une augmentation de 100 g/m3 en PM10 durant 5
jours daffile (Pope et al. 2002).
Le premier projet APHEA ( Air Pollution and Health: a European Approach ) a
clairement montr que, pour tous les polluants tudis (les particules en suspension, le SO2, les
oxydes d'azote et l'ozone), une lvation du polluant de 10 g/m3 provoque une augmentation
de la mortalit journalire toutes causes confondues, dorigines cardiovasculaires ou dorigines
respiratoires de 0,52%, 0,76% et 0,71%, respectivement (Katsouyanni et al. 1997). Le second
projet APHEA2, initi en 1998, a permis de corrler une augmentation de 10 g/m3 du niveau
journalier de PM10 avec une augmentation des hospitalisations pour asthme et BPCO entre 1 et
1,2% (Atkinson et al. 2001). Une tude plus rcente appele APHENA ( Air Pollution and Health:
a European and North American Approach ) sest base sur les donnes des projets europens
APHEA1 et 2, de ltude amricaine NMMAPS ( National Morbidity, Mortality, and Air Pollution
Study ) et dune tude canadienne (Katsouyanni et al. 2009). Les estimations des risques en
provenance d'Europe et des tats-Unis taient similaires, mais celles du Canada taient
sensiblement plus leves. L'effet combin des PM10 sur la mortalit, toutes causes et tous ges
confondus, varie de 0,2% 0,6% pour une augmentation de 10 g/m3.
Concernant les particules fines, une tude de 2006 a galement mis en vidence une
corrlation entre une hausse de la mortalit journalire de 0,6 % et une augmentation de 10
g/m3 de la concentration en PM2.5 (Ostro et al. 2006).
I.3.1.ii) Effets de la pollution de fond
Les tudes long terme explorent leffet dune exposition constante aux PM sur les
fonctions pulmonaires, le developpement de bronchites chroniques, le risque de cancer du
poumon et la mortalit dorigine cardiorespiratoire. Ainsi, il a t mis en vidence que les effets
de l'exposition long terme la pollution atmosphrique sont plus importants que ceux lis
l'exposition court terme (INVS Extrapol 2006). En 2002, Pope et collaborateurs montrent pour
la premire fois quune augmentation de 10 g/m3 en PM2.5, long terme, est lie
laugmentation de la mortalit toutes causes confondues, dorigines cardio-pulmonaires ou
dorigines respiratoires de 4%, 6% et 0,71%, respectivement. Les auteurs soulignent galement
que 8% de la mortalit par cancers du poumon seraient imputables aux particules fines (Pope et
al. 2002).
Par la suite, les tudes pidmiologiques ont montr quune exposition chronique la
pollution atmosphrique augmente la prvalence des maladies respiratoires chroniques telles
que lasthme (Rage et al. 2009), la BPCO et les ractions allergiques (rhinites, toux, otites)
(Lindgren et al. 2009), ainsi que les maladies cardiovasculaires (infarctus du myocarde). En effet,
une mta-analyse de 36 tudes pidmiologiques a montr que parmi les dclencheurs les plus
frquents dinfarctus, la pollution de lair arrive en tte de liste, devant leffort physique et la
consommation dalcool (Nawrot et al. 2011). Enfin, une tude prdictive suggre que 11% des
dcs par cancer du poumon serait attribuable la pollution atmosphrique en Ile de France
(AFSSE 2005).

21

Les recherches les plus rcentes ont permis de dmontrer clairement que ces effets sur
la sant apparaissent des concentrations modres de polluants que l'on retrouve dans toutes
les villes de l'Union Europenne et quil n'existerait pas de seuil dcelable en de duquel l'ozone
et les particules fines polluants sont sans effets sur la sant humaine.

I.3.2) Les pathologies respiratoires

Les pathologies respiratoires peuvent tre aiges, causes directement par un toxique ou
une inflammation, comme la bronchite, la rhinite allergique et la pneumonie ; ou chroniques,
causes par une inflammation persistante ou la rtention des particules, comme lasthme et la
BPCO (Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive).
Lasthme et la BPCO sont deux pathologies respiratoires qui ont en commun une
inflammation chronique et lobstruction des bronches, dues la diminution du calibre des
conduits respiratoires et lhyperscrtion de mucus. Cependant, la BPCO est une pathologie
volutive partiellement irrversible, qui se dclare aprs 40 ans et touche principalement les
fumeurs ; tandis que lasthme, qui touche des personnes plus jeunes, se caractrise par des crises
rcurrentes et peut tre contenu par un traitement adapt (Tableau I.3).
Tableau I.3 : Comparatif entre lasthme et la BPCO. Daprs Swissweb sant publique .
Population touche
Symptmes

ASTHME
Les non-fumeurs sont touchs. La
fume est le plus souvent mal tolre.
Les symptmes commencent souvent
pendant lenfance.
Les symptmes surviennent par crises.
Plus de la moiti des patients souffre
dallergies.
Toux, surtout nocturnes, plutt sches.

BPCO
Frappe en gnral les grands
fumeurs.
Les symptmes se dclarent partir
de 40 ans.
Les symptmes augmentent
sournoisement.
Elle nest pas lie des allergies.
Toux, en particulier le matin, souvent
avec expectoration.
Difficult respiratoire seulement
leffort.

Difficult respiratoire au repos, surtout

le matin et la nuit.
Caractristiques physiopathologiques :
Epithlium
Fragile
Mtaplasique
RBM
Epaissie
Non paissie
Fibroses
Possible
Prsent
Vaisseaux sanguins
Angiogense
Angiogense possible
Muscles lisses
Epaissi
Epaissi
bronchiques
Glandes sousHypertrophies
Hypertrophies
muqueuses
Emphysme
Observe seulement chez les fumeurs
Caractristique de la BPCO svre
RBM= membrane basale pithliale rticulaire ; Emphysme : destruction des parois alvolaires.

La BPCO : Elle touche 5% 19% de la population adulte de plus de 40 ans. Sa prvalence

a augment de plus de 41% depuis 1982, et son taux de mortalit a augment de plus de 100%
entre 1970 et 2002 (Ling et al. 2009). 80 90% des BPCO sont dues au tabagisme, actif ou passif,
mais la pollution de lair ainsi que les infections des voies respiratoires sont aussi des facteurs de

22

risques importants (OMS 2012). De rcentes tudes associent plus prcisment la pollution
particulaire (notamment les PM10) lexacerbation de la BPCO (Gan et al. 2013).
Lasthme : Les causes de cette maladie sont un complexe mlange entre des
prdispositions gntiques et des stimuli environnementaux. Cette complexit se traduit au
niveau clinique par diffrents types dasthmes : allergique, intrinsque, deffort, etc. (Di
Giampaolo et al. 2011). Linhalation de substances allergnes, de fume de tabac et de produits
chimiques irritants sont autant des facteurs dclencheurs de crises, que des facteurs de risque
pour le dveloppement de lasthme (OMS 2013). Ainsi, de nombreuses tudes pidmiologiques
ont montr quil existe un lien entre lexposition la pollution atmosphrique particulaire et le
dveloppement de lasthme (principalement lexposition pendant lenfance, Jacquemin et al.
2012) ainsi que la survenue des crises (Schwartz et al. 1993; Di Giampaolo et al. 2011; To et al.
2013).
Le remodelage bronchique : Lasthme et la BPCO sont caractrises par :
linflammation, le remodelage bronchique et lhyperscrtion de mucus (rversibles pour
lasthme et irrversibles pour la BPCO). Ces trois caractristiques sont troitement lies : une
inflammation chronique ou rpte peut conduire un remodelage bronchique, qui lui-mme
peut conduire linflammation chronique et lhyperscrtion de mucus (Enomoto et al. 2009;
Girodet et al. 2011). Le remodelage bronchique joue un rle important dans ces deux maladies. Il
est dfini comme lpaississement de la paroi bronchique due une varit de changements
structurels tels que des lsions pithliales, une fibrose de lpithlium, laugmentation des
dpts de protines de la matrice extracellulaire, l'angiogense, lhypertrophie des cellules
mucus et des glandes sous-muqueuses et l'augmentation de la masse musculaire lisse des voies
ariennes (ASM) (Girodet et al. 2011). Nanmoins, il existe des diffrences entre ces deux
maladies : le processus de remodelage, le type de cellules inflammatoires et de cytokines
impliques, ainsi que les localisations anatomiques prdominantes o ces changements se
produisent (Tableau I.3, Figure I.15, Jeffery 2001).
Les allergies : La raction allergique est une raction anormale, inadapte et excessive
de lorganisme lors dun contact avec une substance trangre (allergne). Elle se manifeste par
diffrents symptmes : asthme, rhinite, eczma, urticaire, conjonctivite, etc., qui peuvent tre
prsents de faon isole, coexister, devenir chroniques, ou se succder au fil du temps (Kim, B.J.
et al. 2012; Lee et al. 2013). Gnralement, lallergie survient chez des individus gntiquement
prdisposs bien que des facteurs environnementaux jouent galement un rle important dans
le dveloppement des allergies. Des tudes chez l'animal ont montr qu'une large gamme de
particules en suspension, y compris la fume de cigarette, les particules Diesel, des mtaux, des
composs organiques et des produits de combustion peut interfrer avec les processus normaux
de dfense du poumon et contribuer la sensibilit aux infections respiratoires ou aggraver des
maladies allergiques (Gilmour et al. 2001). Les tudes pidmiologiques ont largement dmontr
le rle de la pollution atmosphrique particulaire, lie principalement au trafic automobile
(Polosa et al. 1999), dans le developpement des allergies et la sensibilit aux allergnes (Heinrich
et al. 2004; Di Giampaolo et al. 2011; Higgins, T.S. et al. 2012), notamment chez les enfants

23

(Schwartz 2004; Morgenstern et al. 2008; Kim, B.J. et al. 2012). Les mcanismes impliqus dans
ces ractions sont : linflammation, le stress oxydant et les modifications pigntiques (Kim, B.J.
et al. 2012; Lee et al. 2013).

Figure I.15: Apparence de la muqueuse respiratoire dans lasthme et la BPCO. Coupes longitudinales
observes en microscopie. (A) Muqueuse atopique dun asthmatique, caractrise par la diminution de
lpithlium de surface et lpaississement de la lame basale rticulaire. (B) Muqueuse mtaplasique chez
un patient gros fumeur, atteint de BPCO, caractrise par une mtaplasie squameuse de lpithlium et
une lame basale rticulaire fine dpaisseur normale. Modifi daprs Jeffery 2001.

I.3.3) Les pathologies cancreuses

Parmi les pathologies cancreuses lies la pollution atmosphrique, les cancers
pulmonaires sont les plus courants. Parmi eux, sont distingus le msothliome (cancer primitif
de la plvre) et les cancers broncho-pulmonaires (CBP) qui reprsentent la premire cause de
dcs par cancer chez lhomme en France et dans le monde (Registre des Cancers-Observatoire
rgional de la sant Poitou-Charentes 2013). Lincidence des CBP reste en augmentation,
notamment chez les femmes, en relation directe avec une augmentation du tabagisme, premire
cause tiologique (Socit franaise de pathologie 2012).
I.3.3.i) Classification des cancers broncho-pulmonaires
Sur le plan histologique, les CBP se divisent en deux grands groupes, le carcinome
petites cellules (CPC, 17% des CBP primitifs) et les carcinomes non petites cellules (CNPC, 83%
des CBP primitifs). Cette dernire catgorie comprend, selon la classification de l'OMS 2004
toujours en vigueur, les carcinomes cellules squameuses ou pidermodes, les
adnocarcinomes, les carcinomes grandes cellules, les carcinomes sarcomatodes, les tumeurs
carcinodes et les tumeurs des glandes salivaires (Tableau I.4, Figure I.16). Les tumeurs
primaires du poumon font des mtastases prfrentiellement vers les glandes surrnales, le foie,
le cerveau et les os (INC 2011; Travis et al. 2013).

24

Figure I.16 : Coupes histologiques de tumeurs broncho-pulmonaires de type adnocarcinome (A) et

carcinome cellule squameuse (B). Coloration Hmatoxyline et osine (Travis et al. 2013).
Tableau I.4 : Classification histologique selon lOMS (2004) des carcinomes broncho-pulmonaires.
Daprs INC 2011; Travis et al. 2013.
Carcinomes Pulmonaires Carcinome petites
Petites Cellules
cellules composite
(SCLC, 17%)

Carcinomes Pulmonaires
NON Petites Cellules
(NSCLC, 83%)

Carcinomes cellules
squameuses (ou
pidermodes, SCC)

o
o
o

papillaire
cellules claires
basalode

Adnocarcinomes

o
o
o
o

de type mixte
acineux
papillaire
solide avec production de mucine

Carcinomes Bronchoalvolaire

o
o
o

non-mucineux
mucineux
mixte non mucineux et mucineux ou
intermdiaire

Carcinomes grandes
cellules

o
o
o
o
o
o

neuroendocrine grandes cellules

neuroendocrine grandes cellules
composites
basalode
lympho-pithlioma-like
cellules claires
grandes cellules rhabdodes

Carcinomes
sarcomatodes

o
o
o
o
o

Carcinome pliomorphe
Carcinome cellules gantes
Carcinome cellules fusiformes
Carcinosarcome
Blastome pulmonaire

Carcinodes

o
o

typique
atypique

Tumeurs de Type
glandes salivaires

o
o
o

Carcinome muco-pidermode
Carcinome adnode kystique
Carcinome pithlial-myopithlial

Lsions pr-invasives

o
o
o

Dysplasie et carcinome in situ

Hyperplasie alvolaire atypique
Hyperplasie neuroendocrine diffuse
idiopathique

Carcinomes
adnosquameux

25

Les carcinomes pulmonaires drivent du tissu pithlial respiratoire sain qui va subir
plusieurs lsions pr-noplasiques de svrit croissante. Ces diffrentes tapes de la
cancrognse des CBP se traduisent par des volutions histologiques associes une
augmentation de lpaisseur du tissu pithlial, la perte de la progression de maturation des
cellules, de lanisocytose et du plomorphisme (changement de taille et de forme des cellules)
(Kerr 2001).
I.3.4.ii) Effet des particules atmosphriques
De nombreuses tudes pidmiologiques, ralises depuis les annes 1950 jusqu
aujourdhui, tablissent un lien certain entre la pollution particulaire et les CBP (Greenburg et al.
1967; Higgins, I.T. 1976; Yanagi et al. 2012). Ainsi, une tude pidmiologique grande chelle,
nomme ESCAPE ( European Study of Cohorts for Air Pollution Effects ), a permis de
dterminer une augmentation du risque de CBP en Europe avec un odds ratio (OR) de 1,22 suite
llvation de 10 g/m3 en PM10, et avec un OR de 1,18 suite llvation de 5 g/m3 en PM2.5
(Raaschou-Nielsen et al. 2013). Des tudes chinoises calculent un OR de 2.66, 3.05, et 1,42 pour le
risque de CBP lis, respectivement, lexposition aux fumes de charbon utilis pour le
chauffage ou la cuisson (Zhao, Y. et al. 2006), la fume de cigarette, et la pollution atmosphrique
(Li, H. et al. 2013). Enfin, des tudes rcentes tablissent galement un lien avec dautres types
de cancers (foie, reins, uterus, leucmies, Raaschou-Nielsen et al. 2011; Vinceti et al. 2012).
Le 17 octobre 2013, les nombreuses recherches scientifiques montrant un lien de cause
effet entre la pollution atmosphrique et les CBP ont conduit lOMS classer la pollution de lair
extrieur comme cancrogne certain pour lhomme (groupe 1) selon lIARC (IARC 2013).
Cette notation est base sur plus de 1000 articles au niveau mondial et porte une attention
particulire aux PM2.5, qui aprs avoir t values sparment, sont elles-mmes
classes cancrogne certain pour lHomme. En effet, on estime que l'exposition aux particules
fines a contribu mondialement 3,2 millions de dcs prmaturs en 2010 dont 223 000 dcs
par cancer du poumon.

I.4) MECANISMES DACTIONS BIOLOGIQUES DES PARTICULES ATMOSPHERIQUES

I.4.1) La raction inflammatoire
Dans un tissu vivant et vascularis, le processus inflammatoire est l'ensemble des
phnomnes ractionnels dclenchs par une agression (agent pathogne, agent physique ou
chimique, ncrose tissulaire, rponse allergique, auto-immunit, ...). Linflammation est
habituellement bnfique : son but est damener les phagocytes (polynuclaires neutrophiles
PN, monocytes et macrophages) sur le site de lagression, dliminer lagent pathogne et de
rparer les lsions tissulaires. Cependant, elle peut tre parfois nfaste du fait de lagressivit ou
de la persistance de lagent pathogne, du lieu de linflammation, ou danomalies de rgulation
du processus inflammatoire.
Il existe deux types dinflammation : aigu et chronique. Linflammation aigu reprsente
la rponse immdiate (quelques jours ou semaines), qui peut gurir spontanment ou grce un

26

traitement, mais peut aussi causer des squelles si la destruction tissulaire est importante.
Linflammation chronique na aucune tendance la gurison spontane, elle volue en persistant
ou en saggravant pendant plusieurs mois ou plusieurs annes. Une inflammation aigu peut
voluer en inflammation chronique lorsque lagent agresseur persiste dans les tissus ou lorsque
le tissu subit des agressions et des inflammations rptes en entranant chaque pisode des
destructions tissulaires de moins en moins bien rpares (Collge Franais des Pathologistes
2011).
Les donnes de la littrature ont largement document limpact inflammatoire des
particules atmosphriques (PM10, PM2.5 ou pDi) sur lpithlium respiratoire. En effet, suite aux
suspicions issues des tudes pidmiologiques, des expriences dexposition humaine sur des
volontaires sains ont montr que les pDi provoquent une augmentation des cytokines
inflammatoires de type TH1 et TH2, des chimiokines et des IgE, ainsi que la prsence de PN et
lymphocytes dans la muqueuse respiratoire (Diaz-Sanchez et al. 1997). De plus, il a t montr
que les pDi agissent comme un adjuvant des ractions aux allergnes environnementaux (Li, N.
et al. 2003a). Le mcanisme de dveloppement dune raction inflammatoire pulmonaire induite
par les PM dbute par linternalisation des particules par les cellules pithliales respiratoires
(nasales, bronchiques et alvolaires) ainsi que par les macrophages qui sont responsables de
cette production accrue de chimiokines (Figure I.17, Bayram et al. 1998; Boland, S. et al. 1999).
Figure I.17 : Schma
de
la
raction
inflammatoire
induite
par
les
particules
Diesel
(pDi) au niveau de la
muqueuse
bronchique.
Le dpt des pDi
dans
les
voies
respiratoires induit le
relargage de cytokines,
dont des chimiokines,
notamment par leurs
cellules cibles que sont
les cellules pithliales.
Les
chimiokines
peuvent attirer des
cellules
de
linflammation et
lexpression
de
molcules dadhrence
permet
la
transmigration
des
leucocytes
.
Lactivation de ces cellules peut alors induire la scrtion dautres cytokines impliques dans lactivation
des osinophiles et des lymphocytes B . La synthse accrue des IgE qui en rsulte peut, en prsence
dallergnes, provoquer lactivation de mastocytes aboutissant au relargage dhistamine, responsable
dune contraction du muscle lisse bronchique et dune augmentation de la scrtion de mucus, deux
facteurs contribuant lobstruction bronchique . B: Lymphocyte B ; CPA: cellule prsentatrice
dantignes; Eo: osinophile ; MC: mastocyte ; mono: monocyte; NP: neutrophile ; Th: lymphocyte T
Helper. Daprs Boland, Sonja et al. 2001.

27

I.4.2) Le stress oxydant

Les effets pro-inflammatoires ainsi que de nombreux effets des PM sont troitement lis
au stress oxydant, caus notamment par les composs organiques et mtalliques.
I.4.2.i) Dfinition et origines du stress oxydant
Le stress oxydant se dfinit comme tant le rsultat dun dsquilibre cellulaire entre les
espces ractives de loxygne (ERO) et les systmes de dfense anti-oxydante. Bien que
considrs comme messagers de voies de signalisation et indispensables au bon fonctionnement
cellulaire, les ERO prsents en forte quantit peuvent tre dltres pour la survie des cellules.
Les ERO comprennent des radicaux libres tels que lanion superoxyde (O2-), le radical hydroxyle
(OH) et le monoxyde d'azote (NO) ainsi que des drivs oxygns non radicalaires comme
loxygne singulet (1O2), le peroxyde d'hydrogne (H2O2) et le proxynitrite (ONOO-).
Lorigine principale des ERO rside dans la rduction de loxygne molculaire (O2), qui
est une espce bi-radicalaire possdant deux lectrons libres, pour donner lanion superoxyde
(O2-, Figure I.18 A). In vivo, cette raction est catalyse par les NADPH oxydases notamment au
niveau mitochondrial (NADPH oxydase) o environ 2% des lectrons sont perdus lors de leur
transfert partir des complexes I et III de la chane respiratoire mitochondriale (voir Figure
I.29 page 43). En milieu aqueux, lO2- est un accepteur de protons dune dure de vie trs
courte car il subit une raction de dismutation, acclre par la superoxyde dismutase (SOD),
pour former du proxyde dhydrogne (H2O2), qui sera ensuite limin par la catalase (Figure
I.18 A). LERO le plus ractif est le radical hydroxyle (HO) qui peut tre form partir du H2O2
et du O2-, ou via la dcomposition du proxynitrite (ONOO-) qui peut tre issu du peroxyde
d'hydrogne (H2O2) (Rahman et al. 2006, Figure I.20).
A

Figure I.18 : Ractions de rduction de l'oxygne et de

production dERO in vivo. (A) la rduction de loxygne en
eau se fait par des ractions successives, comprenant une
tape de synthse de lanion superoxyde (flche rouge),
catalyse par une enzyme du type oxydase. (B) Raction
d'Haber-Weiss. (C) Le cycle de Fenton. Daprs Deby et al. .

28

I.4.2.ii) Les mtaux et le stress oxydant

La particularit chimique des mtaux de transition est dtre incompltement saturs en
lectrons, ils peuvent donc former des ions avec une grande varit d'tats d'oxydation (de -3
+8). Ceci les rend capables de ragir avec des molcules donneuses dlectrons (dont des

protines, loxygne, les radicaux libres ) pour former des liaisons faibles (liaisons de
coordination, notamment avec les protines) ou pour prendre un lectron (Deby et al. ). Ces
liaisons de coordination entre un mtal et une protine ou un ligand non-protique a pour but
dassurer une fonction catalytique ou structurelle, les plus connues tant les protines fer-soufre
de la respiration mitochondriale : la NADH dshydrognase (complexe I), la succinate
dshydrognase (complexe II), la coenzyme Q cytochrome c rductase (complexe III), etc. (voir
Figure I.29).
Les mtaux de transition (Fe2+ ou Cu+) peuvent gnrer des ERO par la raction dHaberWeiss qui a longtemps t considre comme responsable de la gnration du radical hydroxyle
(OH) partir dH2O2 et O2- (Figure I.18 B). Des arguments de cintique chimique et de
thermodynamique ont depuis contredit cette raction, qui est en ralit un bilan de deux
ractions dues aux mtaux de transition, formant le cycle de Fenton (Figure I.18 C). La raction
de Fenton est une raction de rduction dH2O2 par le fer ferreux (Fe2+) complex grce des
liaisons de coordination, aboutissant la formation dOH et de fer ferrique (Fe3+), ensuite rduit
en Fe2+ par l'anion superoxyde, et le cycle continue (Figure I.18 C, Deby et al. ). Ce cycle
ractionnel peut aussi tre ralis par dautres mtaux de transition tels que le cuivre,
laluminium, etc.
De plus, les liaisons de coordination, peuvent induire un remaniement lectronique du
complexe form et favoriser le transfert dlectrons du mtal vers loxygne pour former des
molcules trs instables telles que lion oxoferryle (2(FeIV=O)2+) qui peut former le radical
hydroxyle, en prsence de proton, par une raction trs rapide (Figure I.19, Deby et al. )

Figure I.19 : Ractions en chaines avec le Fer, formation de l'ion oxoferryle trs ractionnel. L'ion
oxoferryle est trs ractionnel grce un atome d'oxygne uni par une liaison de coordination plus lche
qu'une covalence, son tat singulet et sa haute densit lectronique. Cette ractivit leve se
manifeste en milieu non-aqueux comme en milieu aqueux; dans ce dernier cas, il pourrait se former, en
raction flash avec des protons H+, des radicaux OH ragissant sur le lieu mme de leur formation.
Daprs Deby et al.

29

I.4.2.iii) Les systmes de dfense anti-oxydante

Les ERO peuvent interagir avec tous les composants cellulaires (protines, lipides, ADN)
et causer des dommages tels que : des pertes ou modifications de fonction des protines, des
dommages lADN (cassures simple brin, mutations, adduits, oxydations telles que la 8-hydroxydoxyguanosine (8-OhdG), pontages, modifications de structure), la proxydation lipidique
(mcanisme de dgradation des lipides formant des radicaux hydroproxydes ROOH),
laugmentation du calcium intracellulaire, des modifications du cytosquelette, etc. (Rahman et al.
2006). Pour pallier ces effets dltres, des systmes de dfense anti-oxydante existent, ce sont
des systmes enzymatiques et non-enzymatiques qui ont pour but de diminuer la quantit
dEAO prsente dans la cellule.
Les systmes de dfense non-enzymatiques comprennent des molcules de petite taille
qui agissent principalement en squestrant les ERO, comme des vitamines (A, C, E, B12), des
carotnodes, des ubiquinones et le glutathion ; des protines (transferrine, ferritine,
cruloplasmine) qui maintiennent les mtaux de transition dans un tat inactif pour la
production dERO ; et certains oligo-lments comme le fer, le cuivre, le zinc et le slnium, cofacteurs indispensables pour lactivit des enzymes anti-oxydantes (CuZn-SOD, MnSOD, SeGPx,
mtallothionines) (Pincemail et al. 2002). Cependant, les oligo-lments tant aussi des mtaux
de transition, peuvent aussi tre pro-oxydant via des ractions de type Fenton (ractions
dHaber-Weiss) (Figure I.18).
Les enzymes anti-oxydantes ont pour fonction de transformer les ERO en espces moins
ractives et/ou augmenter la quantit danti-oxydants dans la cellule. Les principales sont la
superoxyde dismutase (SOD), la catalase, la glutathion peroxydase (GPx) et la glutathion
rductase (GR), qui agissent ensemble pour rduire les ERO en eau (Figure I.20). Il existe
dautres enzymes qui prennent part au systme anti-oxydant, dont lhme-oxygnase 1 (HO-1),
la NADPH quinone oxydase 1 (NQO-1), une enzyme de dtoxification (voir I.4.3), et la
glutamate cystine ligase (GCL), qui participe la synthse du glutathion.

Figure I.20 : Ractions de production des ERO (en rouge) et systmes de dtoxification enzymatique
(en vert).

30

La superoxyde dismutase (SOD) est une mtalloprotine catalysant la dismutation de

lanion superoxyde O2- en peroxyde dhydrogne H2O2 (Figure I.18 A et I.20). La SOD existe
sous trois isoformes ncessitant des cofacteurs mtalliques:

la Cu-Zn-SOD, ou SOD1 est localise dans le cytoplasme et le noyau. Elle est exprime
principalement de manire constitutive, mais peut aussi tre induite dans les cellules
pithliales bronchiques et alvolaires, les pneumocytes de type II, les fibroblastes, les
macrophages alvolaires, et les cellules endothliales des capillaires pulmonaires
(Rahman et al. 2006).

la Mn-SOD ou SOD2 est situe dans la mitochondrie. Elle est inductible par de nombreux
facteurs retrouvs notamment dans lair, elle est donc trs abondante dans les cellules
pithliales bronchiques, les macrophages alvolaires et les pneumocytes de type II
(Rahman et al. 2006). Cette enzyme joue un rle important dans la survie cellulaire
puisque lextinction de ce gne induit lapoptose (Comhair et al. 2005). De plus, des
modifications de la SOD2 par oxydation et nitration ont t identifies dans des poumons
dasthmatiques (Comhair et al. 2005).

la Cu-Zn-SOD ou SOD3 est extracellulaire. Elle est prsente dans les fluides et les espaces
interstitiels des poumons, dans les vaisseaux sanguins et autour des alvoles et des
capillaires sanguins. Elle est exprime et scrte par les macrophages alvolaires, les
cellules pithliales bronchiques, les cellules endothliales vasculaires, les pneumocytes
de type II et la matrice extracellulaire (Rahman et al. 2006). Une tude rcente a montr
que lexpression de la SOD3 est rduite dans les cancers du poumon, ce qui peut
participer linvasion tumorale rgule par le statut redox (Rahman et al. 2006).

Les SOD sont largement rpandues dans lappareil respiratoire. Les SOD1 et 2 sont les formes les
plus abondantes dans les cellules.
La catalase (CAT) est un homottramre qui dcompose le H2O2 en H2O + O2 (Figure
I.20). Elle est abondante dans les globules rouges et les cellules hpatiques mais est aussi
prsente dans les peroxysomes et le cytoplasme des cellules pulmonaires notamment les
pneumocytes de type II et les macrophages. Certaines tudes ont montr que sa transcription
peut tre induite par lhypoxie et les oxydants, mais dautres le contredisent (Rahman et al.
2006).
La glutathion peroxydase (GPx) et le glutathion rduit (GSH) : La GPx a pour fonction
dliminer le H2O2 en le transformant en H2O + O2 grce au glutathion rduit GSH qui est oxyd
en glutathion disulfure GSSG. Le glutathion oxyd est nouveau rduit par la glutathion
rductase (GR, Figure I.20) afin de rtablir le pool de glutathion. Le gluthation a uassi pour
fonction de squestrer les xnobiotiques dont les metaux lourds pour quils soient excrts sans
dommages. Ainsi le dosage de pool de glutathion ou du rapport GSH/GSSG est assez
reprsentatif du stress oxydant cellulaire. Il existe de nombreuses formes de GPx dont plusieurs
formes ncessitent un cofacteur mtallique (slnium). Ces enzymes sont prsentes de manire
ubiquitaire dans le cytoplasme de la plupart des cellules. Dautres types de GPx ont t dcrits
dont la GPx4 ( Phospholipid-hydroperoxide glutathionne peroxidase ) qui rduit la

31

peroxydation lipidique, une GPx3 extracellulaire prsente dans les fluides pulmonaires, et une
GPx1 mitochondriale (Rahman et al. 2006).
Lhme oxygnase (HO) catalyse la dgradation de lhme en biliverdine par une
raction qui gnre du monoxyde carbone et du fer, la biliverdine et le monoxyde carbone
gnrs ayant des proprits anti-oxydantes et anti-inflammatoires. Il existe trois isoformes
dhme oxygnase (1, 2, et 3) dont seule HO1 (anciennement connue sous le nom de HSP32) est
inductible. HO1 est exprime dans lpithlium de lappareil respiratoire, les macrophages
alvolaires, et les cellules inflammatoires, son expression est induite par de nombreux stimuli
dont le stress oxydant, lhypoxie et la dpltion de GSH. Enfin, cette enzyme semble jouer un rle
dans la survie cellulaire puisquil a t dcrit quelle empche lapoptose induite par le TNF
( Tumor Necrosis Factor ) dans les fibroblastes (Rahman et al. 2006).
I.4.2.iv) Les particules atmosphriques et le stress oxydant
Associ lexacerbation de certaines pathologies, la formation dun stress oxydant induit
par les particules a t largement dcrite dans la littrature. En effet, il a t dmontr que les
PM2.5 peuvent gnrer des ERO (HO, O2- et H2O2) ainsi que lexpression de gnes de
linflammation tels que lAR, le GM-CSF et lIL-6 (Baulig et al. 2009; DiStefano et al. 2009;
Danielsen et al. 2011; Diabate et al. 2011; Dergham et al. 2012). Les dommages causs par ces
ERO sont la peroxydation lipidique des membranes ainsi que des lsions ou des adduits lADN
(Tao et al. 2003; Valavanidis et al. 2008).
La composition des particules est dterminante pour la production de stress oxydant par
les PM. Les composs organiques (notamment les quinones et les HAP) et mtalliques
(notamment les mtaux de transition) des particules sont de forts producteurs dERO
(Valavanidis et al. 2008). En effet, les mtaux de transition tels que le fer, le cuivre et le vanadium
peuvent produire le radical hydroxyle (HO) via la raction dHaber-Weiss (Figure I.18). Une
tude de Ball et collaborateurs en 2000, a prouv que les mtaux prsents sur les particules sont
biodisponibles et peuvent se solubiliser dans leau et gnrer des ERO (Ball et al. 2000). Des
tudes ralises avec lextrait organique des particules Diesel, ont montr quil gnre une
quantit dERO proche de celle des particules entires dans des macrophages (Hiura et al. 1999)
et des cellules pithliales bronchiques humaines (Baulig et al. 2003). De plus, les composs
organiques, lorsquils sont transforms par les enzymes du mtabolisme des xnobiotiques
comme le CYP1A1 peuvent former des ERO si la raction est incomplte.
Parmi les lsions causes par composs particulaires, les oxydations et les adduits
lADN sont particulirement dltres car ils peuvent induire des mutations gntiques ou des
modifications de la transcription, et conduire la mort ou la cancrogense de la cellule (voir
I.4.4). Notamment, les attaques oxydatives de l'ADN conduisent des mutations de paires de
bases, des dltions ou des insertions, communment observes dans les oncognes et les gnes
suppresseurs de tumeurs muts. Actuellement, plus de 100 types de lsions de l'ADN lis
l'oxydation ont t dcrits, parmi lesquels la 8-hydroxydoxyguanosine (8-OHdG) est
probablement la plus connue et la plus tudie, elle sert de biomarqueur de lsions ADN.
Plusieurs particules sont connues pour induire des 8-OHdG, y compris lamiante, la silice

32

cristalline, les cendres volantes de charbon, et les PM (Andre et al. 2011). Les ERO sont
galement bien connu pour causer des cassures de lADN, par oxydation du dsoxyribose, ce qui
entrane la rupture des brins simples. Ces ruptures simple brin ont t montres par divers
particules dont l'amiante, le quartz, les pDi, le noir de carbone, et le TiO2 (Donaldson et al. 2007).
Les HAP ainsi que les amines aromatiques forment des adduits dits encombrants qui conduisent
une forte dformation locale de la double hlice d'ADN et au blocage la transcription et la
rplication de l'ADN). Le rle des ERO dans les effets gnotoxiques des PM est important puisque
de nombreuses tudes ont montr que des anti-oxydants ou des inhibiteurs des radicaux libres
rduisent les effets mutagnes des particules (Donaldson et al. 2007).
I.4.2.v) Thorie de la rponse hirarchise au stress oxydant
Selon lintensit du stress oxydant, les rponses cellulaires peuvent aller de lactivation
de mcanismes de protection lapparition deffets dltres pour les cellules. Lquipe de Nel A.
a observ cette hirarchie dans les effets biologiques induits par le stress oxydant lors de
lexposition des cellules aux particules Diesel. En effet, des expriences in vitro, sur des
macrophages de rat, ont montr que les pDi induisent lexpression denzymes anti-oxydantes
lorsque le stress oxydant est modr, puis activent les MAP kinases et la scrtion de cytokines
lorsquil augmente, et enfin finissent par induire lapoptose lorsque quil est trop fort (Li, N. et al.
2002). Ces rsultats ainsi que les donnes de la littrature ont permis Li N. et collaborateurs de
dcrire la thorie de la rponse hirarchise au stress oxydant (Li, N. et al. 2003a, Figure I.21).
Ainsi, une faible production dERO (Step I, Figure I.21) active les systmes anti-oxydants
et cytoprotecteurs, principalement via la voie de signalisation Nrf2, qui induit la transcription
des enzymes anti-oxydantes et des enzymes du mtabolisme des xnobiotiques. Un stress
oxydant modr (Step II, Figure I.21) provoque une inflammation via lactivation des voies de
signalisation des MAPK, de NF-B et dAP-1, induisant la transcription de cytokines et
chimiokines pro-inflammatoires. Enfin, un stress oxydant trs lev (Step III, Figure I.21),
dpassant les capacits de dfense de la cellule, conduit la mort de la cellule par apoptose via
lactivation de protines pro-apoptotiques.
Figure I.21 : Modle de rponse
hirarchise au stress oxydant
induit par les particules. Une
faible production dERO (bleu)
induit lactivation des systmes
anti-oxydants cellulaires. Si cette
protection
est
insuffisante,
laugmentation du stress (vert)
provoque
une
rponse
inflammatoire. Lorsque dans une
dernire tape (rouge) tous les
systmes de dfenses sont
dpasss, il peut conduire la
mort cellulaire par apoptose ou
par ncrose. Ces rponses
dpendent de la balance pro/anti-oxydants qui varie dun
individu lautre.
Daprs Andreau et al. 2012.

33

I.4.2.vi) La voie de signalisation Nrf2/Keap1

Nrf2 (ou NFE2L2, Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 ) est un facteur de
transcription squestr dans le cytoplasme par la protine Keap1, qui conduit lubiquitination
de Nrf2 par la Cullin-3 (Itoh et al. 1999; Sekhar et al. 2010). Lorsque la protine Nrf2 est
ubiquitine, elle est transporte vers le protasome, o elle est dgrade. Ainsi, dans des
conditions normales, Nrf2 a une demi-vie de seulement 20 minutes (Kobayashi et al. 2004).
Keap1 est une protine riche en cystine dont trois (C151, C273 et C288) sont modifies en
situation de stress oxydant, ce qui mne un changement de conformation de Keap1 et la perte
de son interaction avec Nrf2, qui migre vers le noyau. Dans le noyau, Nrf2 forme un complexe
avec la protine adaptatrice Maf et se lie l'lment de rponse anti-oxydant (ARE) pour activer
la transcription de ses gnes cibles, dont les gnes des protines anti-oxydantes et les gnes du
mtabolisme des xnobiotiques, tels que la NADPH quinone oxydorductase 1 (NQO1), l'hme
oxygnase 1 (HO1), le glutamate cystine ligase (GCL) et les glutathion S-transfrases (GST)
(Figure I.22).
Nrf2 peut aussi activer sa propre transcription (Miao et al. 2005; Hayes et al. 2008). Par
ailleurs, la voie Nrf2 semble tre connecte dautres voies de signalisations telles que la voie
AhR ( Aryl hydrocarbon Receptor ), NFB et Notch1 (Niestroy et al. 2011). Notamment, Nrf2 et
AhR peuvent interagir physiquement pour former un cofacteur (Wang, L. et al. 2013) ; et le
benzo(a)pyrne peut rguler ngativement la transcription de Keap1 et donc participer
l'activation de Nrf2 (Nguyen et al. 2010).

Figure I.22 : Reprsentation schmatique de la voie Nrf2. Daprs Mitsuishi et al. 2012

De par son rle central dans lhomostasie redox des cellules, en diminuant le niveau
dERO, Nrf2 participe la protection des cellules normales mais aussi la formation et au
maintien de cellules tumorales (Ramos-Gomez et al. 2001; Xu et al. 2006; Loignon et al. 2009). En
effet, l'implication de la production dERO, ainsi que l'activation de Nrf2 dans l'initiation et le
maintien de la cancrogense, a t dmontre, en particulier dans les cancers du poumon
(Sporn et al. 2012; Bauer et al. 2013; Ganan-Gomez et al. 2013).

34

I.4.3) Le mtabolisme des xnobiotiques

I.4.3.i) Les diffrentes phases du mtabolisme des xnobiotiques
Un xnobiotique (XB) est dfini comme tant une substance trangre la cellule. Il peut
sagir de molcules exognes comme les drogues, les polluants ou la nourriture, ou endognes
telles que la bile, les strodes et certains acides. Pour lutter contre les agressions par les XB
lorganisme humain s'est dot de trois systmes enzymatiques spcialiss et complmentaires
(les enzymes du mtabolisme des xnobiotiques : EMX) conduisant la dtoxification des
composs entrs dans la cellule, en vue de leur limination. Le mtabolisme des XB se droule en
3 phases dfinies : la fonctionnalisation (phase 1), la conjugaison (phase 2), et lefflux (phase 3,
Figure I.23).
Phase 0 : Lentre des XB dans la cellule peut se faire de diffrentes manires : par
translocation travers la membrane, par endocytose, ou via les transporteurs membranaires.
Une fois entr dans la cellule, le XB peut tre rejet immdiatement par des transporteurs
membranaires tels que la glycoprotine P ou tre pris en charge par les EMX (Figure I.23).
Phase 1 : Si le XB persiste dans la cellule, il est pris en charge par les enzymes de phase 1
telles que les cytochromes P450 et les mono-oxygnases. Cette phase 1 consiste transformer le
XB en un driv plus polaire, en ajoutant un groupement -OH, -NH2 ou -COOH sa structure
chimique, pour le rendre plus fonctionnel (Figure I.23). Les enzymes de phase 1 les plus
rpandues sont les cytochromes P450 (CYP), avec 57 gnes identifis chez lHomme. Ces
enzymes catalysent des ractions de N- et O-dalkylation, hydroxylation aliphatique et
aromatique, N- et S-oxydation, et damination (Omiecinski et al. 2011).
Cette phase, qui a pour but de fonctionnaliser le XB afin de lliminer, peut aussi produire
des ERO (voir Figure I.18) ainsi que des mtabolites plus toxiques que la molcule native ; cest
le cas des HAP oxyds tels que les poxydes et les cations radicalaires capables de causer des
adduits lADN, ou les poxyde-diols et les O-quinones, trs mutagnes.
Phase 2 : La phase 2 ou phase de conjugaison, vise neutraliser un groupement ractif
(thiol, amine, aldhyde), dj prsent sur le XB ou rsultants de sa prise en charge par les
enzymes de phase 1. Les EMX de phase 2 catalysent des ractions de (Omiecinski et al. 2011) :

Rduction des quinones en hydroquinones (qui peuvent ensuite tre glucuronides) par la
NADPH quinone oxydorductase (NQO-1)

Glucuronidation :

le

XB

est

conjugu

avec

lacide

glucuronique

par

lUDP-

glucuronosyltransfrase (UGT);

Sulfation : ajout dun groupement sulfate, le donneur du groupement est ladenosine 3phosphate 5-phosphosulphate (PAPS) ;

Actylation : conjugaison avec lactyle coenzyme A par les N-acetyltransfrases (NAT),

Mthylation :

la

S-methionnine

donne

son

groupement

mthyl

mthyltransfrases;

Conjuguaison avec le glutathion (grce la glutathion S-transfrase (GST);

Conjugaison avec la glutamine.

35

grce

aux

Phase 3 : Une fois conjugus par les EMX de phases 1 et 2, les XB sont ensuite expulss
de la cellule par des protines defflux comme la P-gp (glycoprotein P) et la MRP ( Multidrug
Resistance Protein ) (Figure I.23).

Figure I.23 : Reprsentation schmatique du mtabolisme des xnobiotiques. x: xnobiotique, P-gp:

P-glycoprotine, MRP: Multidrug Resistance Protein , P450: cytochromes P450. Source : CEA.

I.4.3.ii) Rgulation de lexpression des EMX

Les EMX sont gnralement exprimes de manire constitutive mais galement induites
grce des facteurs de transcription sensibles aux XB ou aux ERO produits au cours de leur
mtabolisation. Ces facteurs de transcription vont se fixer une squence spcifique des gnes,
appele llment de rponse aux xnobiotiques (XRE), et activer leur transcription. Parmi eux,
les particules atmosphriques sont connues pour activer le rcepteur Aryl hydrocarbon
(AhR), grce leurs composs organiques tels que les HAP. LAhR est maintenu dans le
cytoplasme par sa liaison avec les protines de choc thermique HSP90, la protine AIP ( AhR
Interecting Protein ), ainsi que Src-1. Lorsque lAhR se lie un XB, il se dtache des protines
HSP90 et AIP pour transloquer dans le noyau o il se lie son rcepteur nuclaire Arnt ( Aryl
hydrocarbon receptor nuclear translocator ) et se fixe la squence XRE des gnes cibles,
codants pour des enzymes de phase 1 (les CYP).

I.4.4) La cancrognse
Des tudes sur les particules telles que les DEP, le noir de carbone et les PM, ont montr
que linflammation, le stress oxydant, ainsi que les dommages lADN (adduits et oxydation)
sont impliqus dans les diffrentes tapes de la cancrogense (Donaldson et al. 2007).
I.4.4.i) Les processus de cancrogense
La cancrognse est un processus conduisant la transformation des cellules normales
et qui comprend initialement une phase dinitiation puis une phase dite de promotion.
Linitiation correspond laccumulation datteintes gntiques et pigntiques conduisant la
perte de lhomostasie et limmortalit de ces cellules qui sont alors dites inities. Sensuit la

36

phase de promotion o les cellules inities prolifrent de manire non contrle (hyperplasie).
ce stade, le cancer est infraclinique: c'est une masse de cellules qui survit dans l'organisme mais
qui dpend de son microenvironnement. Ltape suivante de progression tumorale ou
tumorogense correspond au dveloppement de la tumeur primaire (dysplasie), grce
notamment au stroma environnant, et la dissmination des mtastases (Figure I.24).

Figure I.24 : Processus multi-tapes de lvolution dune cellule cancreuse. Daprs Hourioux 2010

Ainsi, les cellules cancreuses se caractrisent par lacquisition de 10 proprits

remarquables (Figure I.25, Hanahan et al. 2000; Hanahan et al. 2011) :
Indpendance aux signaux
extrieurs de prolifration

Insensibilit aux signaux

anti-prolifratifs

Reprogrammation du
mtabolisme nergtique

Echappement du systme
immunitaire

Rsistance lapoptose

Potentiel rplicatif illimit

Instabilit gnomique
No-angiogense

Tumorognse active
par linflammation
Invasion et diffusion mtastatique

Figure I.25 : Les 10 caractristiques acquises par les cellules cancreuses. Daprs Hanahan et al.
2011.

lindpendance aux signaux extrieurs de prolifration, peut tre acquise par : une
stimulation autocrine, la production de facteurs de croissance par des cellules normales
adjacentes, laugmentation ou laltration structurale des rcepteurs aux facteurs de
croissance, lactivation constitutive des voies de signalisation situes en aval de ces
rcepteurs ;
linsensibilit aux signaux antiprolifratifs a lieu notamment par lentre des cellules en
phase de quiescence G0 et limplication de mutations des protines Rb et p53 qui ont pour
fonction de bloquer le cycle cellulaire ;
le potentiel rplicatif illimit li une augmentation de lexpression de la tlomrase ;
linvasion et la diffusion mtastatique dues la transition pithlio-msenchymateuse ;
la no-angiogense assure par les molcules angiogniques, telles que VEGF et FGF, et
active par les mdiateurs pro-inflammatoires (Valavanidis et al. 2008) ;
la rsistance lapoptose (voir I.5) ;

37

 la tumorogense active par linflammation ;

linstabilit gnomique ;
la reprogrammation du mtabolisme nergtique normal vers un fort taux de glycolyse
suivie d'une fermentation lactique dans le cytosol (effet Warburg) ;
lchappement au systme immunitaire ;
A noter que les 4 dernires proprits ont t rcemment nonces et sont encore sujettes
controverse (Hanahan et al. 2011). De plus, linflammation chronique est implique dans
lmergence

de

certaines

de

ces

caractristiques

comme

la

no-angiogense

et

limmunosuppression qui permet aux cellules cancreuses de se soustraire la dtection par le

systme immunitaire et activer la progression tumorale (Valavanidis et al. 2008).
Limpact des PM sur le processus de cancrogense, provient des impacts cellulaires
causs par une exposition prolonge mais aussi aige. En effet, les PM peuvent agir directement
sur lpithlium respiratoire et le dtriorer de manire variable ; laltration de la muqueuse
respiratoire peut ainsi aller jusqu la desquamation totale de lpithlium respiratoire (Figure
I.26A). Afin de pallier la perte dintgrit de lpithlium respiratoire, un mcanisme de
rparation se met en place : la mtaplasie pidermode (Figure I.26 B). Ce processus
correspond la prolifration des cellules scrtrices et basales, conduisant une stratification et
une perte de polarit des cellules pithliales. Quelques cellules se diffrencient et remplacent
progressivement les foyers pidermodes par un pithlium mucociliaire normal. Cependant, les
processus de prolifration, de diffrenciation, et dapoptose, qui interviennent au cours de cette
mtaplasie pidermode, peuvent chapper tout contrle et conduire lapparition dun
carcinome pidermode. En effet, la perte dhtrozygotie au niveau de certains chromosomes
(ex : 3p, 9p, 17p), le raccourcissement des tlomres puis la ractivation de la tlomrase (Hou
et al. 2012), les mutations doncognes ou de gnes suppresseurs de tumeurs (TP53, KRAS,
EGFR, P16INK4A), et des altrations pigntiques ont directement t mis en cause dans la
cancrognse broncho-pulmonaire (Lantuejoul et al. 2009).
Initialement, les altrations gntiques et pigntiques interviendraient au sein des
cellules basales de lpithlium bronchiques, des cellules neuroendocrines pulmonaires (NEB)
au niveau des bronchioles, des cellules de Clara, et des cellules souches de la jonction bronchoalvolaire, actuellement considres comme les populations cellulaires impliques dans lautorenouvellement de l'pithlium pulmonaire. Lapparition de mutations (ex : activation
doncognes) dans ces cellules pourraient donner naissance aux diffrents types histologiques
des tumeurs pulmonaires (Figure I.27, Sullivan et al. 2010).

38

Figure I.26 : Mcanismes daltration et

de
rparation
de
lpithlium
respiratoire. A) Schma reprsentant les
diffrents stades des altrations de la
muqueuse respiratoire. : Perte des
jonctions serres. - : Cils fusionns ou
composs. : Internalisation des cils. :
Perte des cils. : Desquamation de
lpithlium avec maintien des cellules
basales. : Desquamation complte de
lpithlium. Daprs Gaillard et al. 1992. B)
Mcanisme de la mtaplasie pidermode.
Suite une abrasion de lpithlium, une
premire phase de rparation se met en
place et correspond la migration et
ltalement des cellules rsiduelles. Lors
dune seconde phase, les cellules basales et
scrtrices prolifrent en un foyer
pidermode
et
se
diffrencie
progressivement en un pithlium
mucociliaire normal. Si certaines cellules
chappent aux processus de contrles de
prolifration et de diffrenciation et
dapoptose, le foyer pidermode peut
voluer en carcinome.

Figure I.27 : Schma hypothtique des cellules souches de l'pithlium respiratoire responsables de
linitiation des tumeurs pulmonaires. Les cellules basales de lpithlium bronchique, les cellules
neuroendocrines pulmonaires (NEB), les cellules de Clara rsistants au naphtalne (variant), et les cellules
souches de la jonction broncho-alvolaire sont toutes proposes pour tre les cellules de lautorenouvellement de l'pithlium pulmonaire. L'accumulation de mutations activant des oncognes (clairs)
dans les diffrentes cellules souches du poumon sont suspectes de donner naissance aux diffrents types
histologiques des tumeurs pulmonaires (SCLC : carcinomes pulmonaires petites cellules). Daprs Sullivan
et al. 2010.

39

Au niveau cellulaire et molculaire, linitiation et la promotion des cancers pulmonaires

par les PM10 et les PM2.5 sont lies aux voies biochimiques du stress oxydant et des dommages
oxydatifs de l'ADN (voir I.4.2), la stimulation des macrophages, linstabilit des tlomres
(Hou et al. 2012), la modulation de l'expression des gnes et l'activation des facteurs de
transcription ayant un rle important dans la carcinogense (Valavanidis et al. 2013).
I.4.4.ii) La mutagense
Au cours de la phase dinitiation, lacquisition des caractristiques cancreuses par les
cellules est lie linduction dun stress oxydant (voir I.4.2) et lactivation mtabolique des
molcules pro-cancrognes par les EMX (voir I.4.3); mais galement laccumulation
danomalies gntiques et pigntiques qui conduisent lactivation doncognes et
linactivation de gnes suppresseurs de tumeurs (Tableau I.5).
Contrairement lactivation des oncognes, pour perdre la fonction dun gne
suppresseur de tumeur, la mutation doit se faire pour les 2 allles selon le modle de Knudson ;
bien que la perte sur un seul allle dit haplo-insuffisante puisse galement augmenter le risque
de tumeur. Dans le cas des gnes suppresseurs, les processus gntiques de dltion, perte dun
chromosome par non-disjonction lors de la mitose et la recombinaison mitotique peuvent
conduire une perte dhtrozygotie (PdH) frquemment dcrite dans les cancers du poumon
(Lantuejoul et al. 2009).
Tableau I.5 : Mcanismes gntiques et pigntiques daltrations des oncognes et gnes
suppresseurs de tumeurs. Daprs Lantuejoul et al. 2009; Hourioux 2010.
Activation doncognes
Inactivation de gnes suppresseurs de
tumeurs
Mcanismes
gntiques

Mutation de la squence codante

expression normale dune protine
hyperactive
Dltion expression dune protine
hyperactive
Amplification gnique surexpression
dune protine normale
Rarrangement chromosomique
surexpression dune protine normale
sous linfluence dun promoteur fort ou
expression dune protine de fusion
hyperactive

Mutation de la squence codante

expression normale dune protine
hypo-active
Dltion du gne (PdH)
Perte dun chromosome par nondisjonction lors de la mitose (PdH)
Recombinaison mitotique (PdH)

Mcanismes
pigntiques

Hypomthylation de promoteur leve

de linhibition de transcription
Modifications dhistones activation de
la transcription normalement inactive

Modifications dhistones perte

dexpression de la protine
Hypermthylation du promoteur
perte dexpression de la protine

Ces mutations conduisent lactivation de voies de signalisation normalement actives

par des facteurs de croissance. Ainsi, 40% des mlanomes humains contiennent des mutations
affectant la structure de la protine B-Raf, rsultant dans la signalisation constitutive de la voie
des MAPK ( Mitogen Activated Protein Kinase ) et lactivation de la mitose. De la mme
manire, dans plusieurs tumeurs, des mutations dans la sous-unit catalytique de la PI3K

40

( Phosphoinositide 3-Kinase ) ont t retrouves, conduisant lhyperactivation de cette voie

de signalisation et de son effecteur Akt/PKB, qui contrecarre lapoptose.
Dautres mutations permettent aux cellules dchapper aux inhibiteurs de croissance
telles que linactivation des protines RB et TP53. En effet, dans une cellule normale, la protine
RB a pour rle de permettre ou de bloquer la croissance et la division cellulaire de la cellule en
rponse de nombreux stimuli intra- et extracellulaires variables. De mme, TP53 est un facteur
de transcription rpondant au stress et aux anomalies des systmes intracellulaires : le degr de
dommages gntiques, le nombre de nuclotides, les niveaux de glucose et doxygnation Ainsi,
TP53 peut bloquer le cycle cellulaire si les facteurs favorables la croissance sont sub-optimaux
ou induire lapoptose dans le cas o il y a de trop gros dommages des systmes cellulaires
(Hanahan et al. 2011).

I.5) LA MORT CELLULAIRE PAR APOPTOSE

I.5.1) Gnralits
Depuis les avances scientifiques remarquables sur la connaissance des processus de
mort cellulaire, les polluants atmosphriques sont considres comme des inducteurs possibles
dapoptose comme de ncrose (Orrenius et al. 2011). En effet, les impacts sur l'activation ou la
rpression de l'apoptose sont maintenant mieux dcrits et de nombreuses tudes in vitro ont
dmontr la modulation de l'apoptose par les polluants atmosphriques, y compris les mtaux
lourds ou de transition, le monoxyde de carbone, et les PCB ( Polychlorinated biphenyl , pour
revue, voir Andreau et al. 2012).
Lapoptose est parfois appele, mort cellulaire programme . Cependant, ce terme
dsigne la mort cellulaire spatio-temporelle observe au cours du dveloppement et lors de
lembryogense ; hors, aujourdhui, les tudes ont prouv que cette mort cellulaire nest pas de
nature apoptotique (pour revue, voir Kroemer et al. 2009). L'apoptose est une mort cellulaire
dfinie par des altrations morphologiques dont larrondissement des cellules, la rtractation
des pseudopodes, la diminution du volume cellulaire et nuclaire (pyknosis), la fragmentation
nuclaire (karyorrhexis), le bourgeonnement de la membrane ( blebbing ) qui garde son
intgrit jusqu la fin du processus, puis la formation de corps apoptotiques qui seront
phagocyts par les macrophages et les cellules voisines (Figure I.28). Ces altrations
morphologiques tardives sont accompagnes par des modifications biologiques, telles que la
modification de la permabilit et de la composition lipidique de la membrane plasmique, ou
l'activation de diffrentes enzymes (par exemple la phospholipase A2, la DNase II, CAD
( Caspase-Activated Dnase ), l'endonuclase G (EndoG), le facteur d'induction d'apoptose
(AIF)) conduisant la fragmentation de l' ADN (Andreau et al. 2012).
Lapoptose peut tre subdivise en 3 phases successives : la phase dinitiation (active
par un stimulus intra- ou extracellulaire), la phase effectrice (le point de non-retour ) et la
phase finale de dgradation (les modifications morphologiques). Le processus apoptotique est
rgul par des protines pro-apoptotiques et anti-apoptotiques, dont laction est contrle par

41

des stimuli externes ou internes la cellule. On distingue donc deux grand types de voies
apoptotiques : extrinsque et intrinsque.

Figure I.28 : Les caractristiques morphologiques de l'apoptose, de loncose, et de la ncrose. Une

cellule apoptotique subit une diminution de son volume, une condensation de la chromatine, une
fragmentation du noyau, et le bourgeonnement ventuel de sa membrane plasmique conduisant la
formation de corps apoptotiques. Ces changements morphologiques sont considrs comme
caractristiques de lapoptose. Inversement, loncose constitue un vnement passif o le gonflement
cellulaire marqu, la perturbation des organites, et le bourgeonnement de la membrane plasmique
prdominent. Il y a peu ou pas de preuves de remodelage de la chromatine au cours de loncose, et la
cellule succombe rapidement une cytolyse. Cette cytolyse est ltape terminale de la dsintgration
cellulaire caractristique de la ncrose. Daprs Hail et al. 2006.

I.5.2) La voie intrinsque

I.5.2.i) Rle centrale de la mitochondrie
La voie intrinsque, aussi appele voie mitochondriale, peut tre induite par de
nombreux stimuli intracellulaires dont les dommages lADN, le stress oxydant, une
augmentation du calcium, l'excitotoxicit (lie la sur-stimulation des rcepteurs au glutamate
dans le systme nerveux), l'accumulation de protines non replies dans le rticulum
endoplasmique (RE), etc. La voie intrinsque repose sur la permabilisation des membranes
mitochondriales externes et internes (PMM) constituant le point de non-retour dans le
processus de mort cellulaire apoptotique. Dans les cellules saines, la membrane mitochondriale
interne est impermable aux protons, afin de maintenir le gradient de H+ et le potentiel
transmembranaire mitochondrial (m) ncessaires aux phosphorylations oxydatives de la
respiration mitochondriale (Figure I.29, Andreau et al. 2012). Au repos, le gradient

42

lectrochimique entre le cytoplasme et lintrieur des mitochondries est gnralement compris

entre -150 mV et -200 mV.

Figure I.29 : La chaine respiratoire mitochondriale. Un flux lectrons est gnr au niveau des complexes
I (NADH dshydrognase) et II (succinate dshydrognase), les lectrons sont transports travers la
membrane interne mitochondriale grce quatre complexes protiques (I, II, III (ubiquinone cytochrome c
oxydo-reductase) et IV (cytochrome c oxydase)) et deux navettes (lubiquinone Q et le cytochrome c) jusqu'
l'oxygne fondamental. Les complexes I, III, et IV, sont galement des pompes protons qui font sortir des
H+ de la matrice vers l'espace intermembranaire, crant ainsi un potentiel transmembranaire mitochondrial
(m). Ce gradient de protons permet de faire fonctionner lATP synthase (ou complexe V) qui synthtise
lATP partir dADP + Pi. Modifi daprs Ow et al. 2008.

Dans les cellules mourantes, la PMM peut rsulter de deux mcanismes molculaires
distincts, mais qui se chevauchent partiellement : i) les canaux forms par les protines proapoptotiques de la famille Bcl-2 (par exemple BAX ou BAK, voir I.5.2.iv) pourraient favoriser
slectivement la permabilisation de la membrane externe mitochondriale (MOMP,
Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization) ; ii) les inducteurs de mort cellulaire tels
que la surcharge en Ca2+ et le stress oxydant augmentent la permabilit de la membrane interne
aux soluts de moins de 1,5 kDa (processus connu sous le nom de transition de permabilit
mitochondriale) en favorisant louverture dun complexe multi-protique appel pore de
transition de permabilit (PTP) (Galluzzi et al. 2009).
Malgr l'absence de consensus sur la composition exacte du PTP, une des hypothses le
dcrit comme comprenant le canal anionique voltage-dpendant (VDAC) insr dans la
membrane externe mitochondriale, l'ANT ( Adnine Nuclotide Translocator ) situ dans la
membrane interne et la Cyclophiline-D (Cyp-D) localise dans la matrice mitochondriale (Figure
I.30). Il existe quatre isoformes de l'ANT et trois isoformes de VDAC qui ont des effets
antagonistes sur l'apoptose. En effet, VDAC1, ANT1, et ANT3 sont pro-apoptotiques, alors que
VDAC2, ANT2 et ANT4 sont capables de protger les cellules contre la mort.

43

Plusieurs rgulateurs interagissent troitement avec les protines du PTP, dont

lHexokinase II (HK-II) et les protines de la famille Bcl-2, la protine de translocation TSPO, et la
cratine kinase qui interagissent avec VDAC dans le cytosol, la membrane externe, et l'espace
intermembranaire, respectivement. Cependant, plusieurs tudes ont rapport qu'aucun d'entre
eux ne ferait partie du PTP, mme si ANT et Cyp-D en sont des rgulateurs (Figure I.30).

Figure I.30 : Mcanismes hypothtiques de la permabilisation de la membrane externe

mitochondriale. A) VDAC est le composant du complexe PTP. Dans ce modle, les protines proapoptotiques (Bax et Bad) interagissent avec VDAC pour acclrer son ouverture, alors que Bcl- XL se lie
VDAC directement pour la refermer. VDAC peut causer indirectement la libration du Cyt c par le
gonflement et la rupture de la membrane externe mitochondriale (OMM). B) Dans les cellules saines, les
molcules anti-apoptotiques (HK-II et Bcl-xL) se lient VDAC et le maintiennent en configuration ouverte
faible conductance pour l'change des nuclotides adnine (ATP/ADP), prservant ainsi l'intgrit de
lOMM. LHK-II est en concurrence avec Bcl-xL pour le site de liaison VDAC. Dans un tat proapoptotique, HK-II se dtache de VDAC ce qui favorise la liaison de la protine Bcl-xL VDAC et libre
ainsi la protine Bax. Bax et Bak peuvent former des pores dans lOMM permettant la libration du Cyt c .
Dans ce modle, la protine tBid a t montre pour induire la fermeture VDAC qui rduit les changes de
nuclotides d'adnine, et la cration d'un dysfonctionnement mitochondrial qui peut provoquer la
permabilisation de la membrane externe mitochondriale. Le canal VDAC, mme l'tat ferm,
permettrait toujours le passage des soluts < 1,5 kDa. Daprs Suh et al. 2013.

44

La PMM a pour consquence i) la chute du m avec larrt subsquent de la production

dATP et la modification des transports intermembranaires mitochondriaux, ii) la sortie de
facteurs pro-apoptotiques contenus dans lespace intermembranaire tels que le Cytochrome c
(Cyt c), considre comme un point de non-retour, lAIF, lEndo G, les protines bloquant les
inhibiteurs de caspases (IAP, Inhibitor Apoptosis Proteins ) comme SMAC/DIABLO ( Second
Mitochondria-derived Activator of Caspases ) et Htra2 ( High temperature requirement
protein A2 ), iii) linhibition de la chaine respiratoire mitochondriale, induisant une
surproduction dERO et laugmentation du signal de mort (pour revue voir Galluzzi et al. 2012).
Aprs sa libration dans le cytoplasme, le Cyt c participe la formation dun
mgacomplexe protique, appel apoptosome, comprenant Apaf1 et dATP, et qui permet
lactivation de la Caspase-9 puis de la Caspase-3. En parallle lADN est fragment de manire
indpendante des caspases par les enzymes pro-apoptotiques comme AIF et EndoG, et les
protines SMAC/DIABLO et HTRA2 inhibent les protines anti-apoptotiques IAP. Htra2 exerce
aussi une fonction de dgradation des protines grce son activit srine-protase (pour revue
voir Galluzzi et al. 2012).
Ainsi, deux types de signalisation, pour la voie intrinsque de lapoptose, peuvent tre
diffrencis : une voie dpendante des caspases et une voie indpendante des caspases (via les
protines de lespace intermembranaire mitochondrial (dont AIF, EndoG, HTRA2, et
SMAC/DIABLO). De plus, des protases autres que les caspases, participent la signalisation
apoptotique telles que les calpanes.
I.5.2.ii) Les caspases
Les caspases ( cysteinyl aspartate specific proteases ) sont des protases trs
spcifiques qui clivent leurs substrats aprs des motifs ttrapeptidiques spcifiques (P4 - P3- P2
- P1) o P1 est un rsidu Asp. Dans les cellules saines, les caspases sont exprimes sous forme de
zymognes ayant un prodomaine N-terminal de longueur variable (Figure I.31). La famille des
caspases comprend quatorze membres identifis chez les mammifres et ayant des fonctions
dans la diffrentiation (Caspase-14), linflammation (Caspases-1, -4, -5, -11, -12 et -13) et
lapoptose (Caspases -2, -3, -6, -7, -8, -9, -10). Les caspases de lapoptose sont dites initiatrices ou
excutrices. Les caspases initiatrices -2, -8, -9 et -10, possdent un prodomaine long et sactivent
de manire auto-catalytique en formant une enzyme ttramrique constitue de 2 grandes (~20
kDa chacune) et 2 petites sous-units (~10 kDa chacune) (Taylor et al. 2008) qui peuvent
protolyser et activer les caspases excutrices (-3 , -6 et -7). Ces caspases excutrices clivent la
grande majorit des substrats (~400 substrats identifis) au cours de l'apoptose et modifient
ainsi plusieurs fonctions cellulaires telles que la rparation de l'ADN (DNA-PK, U1-70 kDa,
PARP), la condensation de la chromatine (ICAD), ou la stabilit du cytosquelette (-fodrine ,
Lamin A, actine) (Andreau et al. 2012).

45

Figure I.31 : Structure et fonctions des

caspases. Toutes les caspases possdent un
pro-domaine N-ter de longueur variable et
qui dans le cas des caspases initiatrices
contient soit une squence CARD ( Caspase
Recruitment Domain ) soit une squence
DED ( Death Effector Domain ) suivie par
la grande et la petite sous-unit.
Fait intressant, la Caspase-12 est exprime
sous forme tronque, catalytiquement
inactive chez la plupart des humains
(Caspase-12S*). Cependant, un sousensemble de personnes d'ascendance
africaine exprime la forme longue de la
Caspase-12 (Caspase-12L*) et semble tre
plus sensible aux maladies inflammatoires.
Adapt de Taylor et al. 2008; MacKenzie et al.
2012.

I.5.2.iii) Les calpanes

Les calpanes sont des protases cystine, non-lysosomiales, dont l'activit de type
papane, est dpendante du calcium. La famille des calpanes est compose de deux isoformes
majeures, I et II, structures en htrodimres constitus d'une grande sous-unit catalytique
(80 kDa) et dune petite sous-unit rgulatrice (30 kDa) contenant une squence de liaison au
calcium. Dans les conditions normales la concentration en Ca2+ dans les cellules est de 50 100
nM, les calpanes I et II sont actives lorsque les concentrations en Ca2+ sont de lordre du M et
du mM, respectivement. Une fois actives, les calpanes dgradent des substrats membranaires,
cytosoliques et nuclaires, conduisant des modifications morphologiques, la dtrioration de
larchitecture cellulaire et finalement l'apoptose (pour revue voir Momeni 2011).
I.5.2.iv) Les protines de la famille Bcl-2
La phase effectrice de lapoptose peut tre module positivement ou ngativement par
les protines de la famille Bcl-2 ( B-cell lymphoma-2 ), qui agissent principalement par la
rgulation de la permabilisation de la membrane externe mitochondriale et la libration du Cyt

46

c. La famille Bcl-2 est compose de trois groupes correspondant des protines de survie (Bcl-2,
Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, et A1/Bfl1), des effecteurs pro-apoptotiques (Bax, Bak), et une troisime
sous-famille appele BH3-only (Bad, Bik, HRK, Bid, Bim, Bmf, NOXA, et Puma) qui module
l'activation des deux premiers groupes (Figure I.32). Les facteurs pro-apoptotiques de la famille
Bcl-2 sont inactifs dans le cytosol, tandis que la majorit des facteurs anti-apoptotiques sont
insrs dans la membrane externe mitochondriale o ils peuvent inhiber la PMM ou interagir
avec Apaf-1 dans le cytosol, conduisant une diminution de formation de l'apoptosome. Bcl-2
empche galement la production excessive dERO et les impacts ultrieurs sur le stress
oxydant. Lors de linitiation de lapoptose, les protines pro-apoptotiques sont actives et
migrent la mitochondrie, tandis que les protines anti-apoptotiques sont inactives. Cette
activation/inactivation peut tre post-traductionnelle (changement de conformation, activation
des protines pro-apoptotiques), ou bien post-transcriptionnelle (augmentation de lexpression
du gne bax et diminution de lexpression du gne bcl-2 par la protine p53).
Figure I.32 : Les protines de la famille
Bcl-2. La famille Bcl-2 comprend trois sousfamilles qui contiennent entre 1 et 4
domaines dhomologie (BH).
La sous-famille des protines antiapoptotiques comprend quatre domaines
BH et un domaine transmembranaire (TM)
lexception de Bcl-2A1.
Les protines pro-apoptotique de la sousfamille BAX sont dpourvues du domaine
BH4 et favorisent l'apoptose par la
formation de pores dans la membrane
externe mitochondriale.
La sous-famille BH3-only est un groupe
structurellement diversifi de protines qui
possdent uniquement le domaine BH3.
Daprs Taylor et al. 2008.

47

I.5.3) La voie extrinsque

Le terme voie extrinsque regroupe les cas de mort cellulaire par apoptose induite
par des signaux de stress extracellulaires, dtects et propags par des rcepteurs
transmembranaires spcifiques qui conduisent lactivation des caspases. Lapoptose
extrinsque peut tre active par des rcepteurs de morts sur lesquels se lient des ligands
spcifiques tels que FAS/CD95L, le TNF et le TRAIL ( TNF-Related Apoptosis Inducing
Ligand ) ; ou par des rcepteurs dpendance (comme DCC et UNC5B), qui nexercent
leurs fonctions ltales que lorsque la concentration de leurs ligands spcifiques est infrieure
un niveau de seuil critique (pour revue voir Galluzzi et al. 2012).
Le fonctionnement des rcepteurs de mort de la superfamille des TNF-R ( Tumor
Necrosis Factor Receptors ) tels que Fas et TNF-R1, est bien connu : la liaison du ligand induit
loligomrisation des rcepteurs puis le recrutement dune protine adaptatrice FADD ( FasAssociated Death Domain ) qui possde des domaines DD ( Death Domain ) et DED ( Death
Effector Domain ) capables de se lier aux dommaines DD des rcepteurs et DED des caspases,
respectivement. Le recrutement de la procaspase initiatrice -8 ou -10, forme le complexe DISC
( Death Inducing Signaling Complex ) qui permet lauto-activation des caspases initiatrices
(Figure I.33).
Concernant les rcepteurs dpendance, ils constituent une nouvelle classe de
rcepteurs capables, en absence de leur ligand, d'induire l'apoptose. Les mcanismes
apoptotiques induits par les rcepteurs dpendance restent encore sujet dinvestigation mais
semblent ncessiter de manire consensuelle des rcepteurs sous forme monomrique localiss
au sein des rafts, et linteraction avec une protine adaptatrice pour activer certaines caspases
initiatrices (Thibert et al. 2010, Galluzzi et al. 2012).
Trois cascades de signalisation, pour la voie extrinsque de lapoptose, ont t dcrites
(Figure I.33, pour revue voir Galluzzi et al. 2012) : i) la signalisation par les rcepteurs de mort,
puis lactivation des caspases initiatrices et excutrices, ii) le clivage de la protine proapoptotique Bid en t-Bid par la Caspase-8, qui induit la PMM et lactivation de la Caspase-9 puis
des caspases excutrices, iii) la signalisation par la privation de ligand des rcepteurs
dpendance, puis lactivation directe (ou indirecte) de certaines caspases initiatrices, comme la
Caspase-9.

48

Figure I.33 : Voies extrinsque et intrinsque de lapoptose. Les deux voies majeures dactivation sont
illustres : une active via des rcepteurs membranaires ( extrinsque ), lautre active par le stress
mitochondrial ( intrinsque ). Dans la voie extrinsque, deux types de recepteurs sont reprsents : les
rcepteurs de mort (TNF-R), qui aprs lisaison de son ligand (TNF-L) induit le recrutement et lactivation de la
caspase-8, et les recepteurs dpendance, comme le DCC qui en labscence de ligand extracellulaire, recrute et
active la caspase-9 dans le cytsol. Dans la voie intrinsque, le stress mitochondrial induit une perturbation dans
le fonctionnement de la mitochondrie et la permamibilasation des membranes mitochondriales (PMM), puis le
relargage subsquent de protines pro-apoptotiques dans le cytosol (cytochrome c, AIF, EndoG, HTRA2,
DIABLO). Les caspases initiatrices-8 et -9 activent ensuite les caspases effectrices (cascade des caspases),
conduisant lapoptose. Modifi daprs MacFarlane et al. 2004 et Galluzzi et al. 2012.

I.5.3) Rle du calcium dans le processus apoptotique

Le calcium est un messager intracellulaire universel dans les cellules de mammifres, les
voies de signalisation calcique sont nombreuses et peuvent sinterconnecter pour crer une
large gamme de signaux spatiaux temporels. Le Ca2+ peut provenir de lintrieur ou de lextrieur
de la cellule et rguler de nombreuses fonctions dont la viabilit. Dans la cellule, le calcium est en
grande partie stock dans le rticulum endoplasmique (RE), la mitochondrie, les lysosomes et le
noyau, soit complex des protines, soit sous forme libre. Bien que lhomostasie calcique soit
connue depuis longtemps pour tre implique dans l'initiation et le droulement de la mort

49

cellulaire, cest seulement ces dernires annes que le rle du calcium dans la signalisation de
lapoptose a t tudi. Lapoptose peut tre provoque par une perte totale du contrle de
lhomostasie calcique, mais peut aussi tre finement rgule, positivement ou ngativement,
par des changements plus subtils en calcium dans sa concentration et sa distribution au sein des
diffrents compartiments cellulaires. Ainsi, le calcium peut aussi bien protger les cellules que
provoquer leur mort.
I.5.3.i) Le rticulum endoplasmique
Dans la cellule, le stockage du calcium et la signalisation calcique, ainsi que le repliement,
la modification et le tri des protines nouvellement synthtises, sont parmi les principales
fonctions du RE. Des perturbations dans une de ces fonctions peuvent conduire ce qu'on
appelle le stress du RE. Ainsi, un excs autant quun dfaut de Ca2+ dans le RE peut entraner des
changements dans le repliement des protines (qui vont se replier trop ou insuffisamment) et
induire un stress du RE. La rponse ce stress est progressive (comme celle du stress oxydant) :
il implique dabord les protines chaperons du RE pour replier correctement les protines, puis
induit la production de cytokines et interfrons qui aident llimination des protines mal
replies et/ou accumules dans le RE. Enfin un stress prolong peut conduire lactivation de la
Caspase-12, localise dans le RE, par une calpane pralablement active par le Ca2+ (pour revue
voir Orrenius et al. 2003)
I.5.3.ii) La mitochondrie
Dans les mitochondries, les entres et sorties de calcium sont contrles par des canaux,
localiss dans les membranes mitochondriales internes et externes. Lentre du calcium dans la
mitochondrie est rgule par le canal VDAC au niveau de la membrane externe mitochondriale
et par un canal proton appel uniport calcique mitochondrial (MCU Mitochondrial Calcium
Uniporter ) travers la membrane interne mitochondriale (Hajnoczky et al. 2006).
Le MCU est un canal calcium hautement slectif localis dans la membrane interne
mitochondrial. Ce complexe est compos dune sous unit MCU de 40 kDa formant le pore
proprement dit ainsi que des protines MICU1 ( Mitochondrial Calcium Uptake 1 ) et MCUR1
( Mitochondrial Calcium Uniporter Regulator 1 , Chaudhuri et al. 2013). Le MCU permet
l'accumulation de Ca2+ dans les mitochondries, ce qui, dans certaines conditions pathologiques,
peut protger les cellules contre diffrents stress (Smaili et al. 2013). Une fois accumuls, les
ERO causent des dommages cellulaires par oxydation des constituants cellulaires y compris les
acides gras polyinsaturs, les acides amins, et les nuclotides, qui peuvent induire lapoptose
(Smaili et al. 2013).
Par ailleurs, llvation de Ca2+ dans le cytosol peut conduire louverture du PTP,
induisant la PMM, la libration des facteurs apoptognes et linduction de la voie intrinsque de
lapoptose. Cette PMM semble avoir lieu via lactivation des protines de la famille Bcl-2. En effet,
dans le cytosol, llvation de calcium active les calpanes qui peuvent cliver et activer Bid, ou
encore rduire lactivit des protines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-xL en les clivant dans leur
partie Nterminale. L'lvation de Ca2+ cytosolique active aussi la Calcineurine (phosphatase

50

dpendante du calcium, galement connue comme PP2B) qui dphosphoryle Bad et active la
voie mitochondriale intrinsque. Enfin, les membranes du RE et des mitochondries sont en
contact troit et forment des microdomaines (nomms MAM, Mitochondrial-Associated
endoplasmic reticulum Membrane ), enrichis en protines transmembranaires permettant des
changes rapides de calcium entre ces deux compartiments (Bonneau et al. 2013).

I.5.4) Rle du stress oxydant dans le processus apoptotique

Les principales sources dERO cellulaires sont les mitochondries de par les
phosphorylations oxydatives (Figure I.29). Ainsi, la concentration danion superoxyde dans la
matrice mitochondriale a t estime tre de 5 10 fois plus leve que dans le cytosol. La MnSOD, localise dans la matrice mitochondriale dismute rapidement O2- en H2O2 qui son tour
peut former dautres ERO trs ractifs comme le radical superoxyde HO (voir I.4, Andreau et
al. 2012).
La production d'ERO mitochondriaux peut tre responsable de l'activation des voies de
mort par : i) linduction de dommages lADN nuclaire et mitochondrial (notamment formation
de 8-OHdG) conduisant la mort cellulaire dpendante de la protine p53, ii) l'activation des
voies de signalisation impliquant NF-B , JNK ou p38 MAPK, iii) la PMM lie une augmentation
de Ca2+ intracellulaire et louverture du PTP (voir I.5.3), et iv) la libration du Cyt c par
oxydation des lipides membranaires mitochondriaux (cardiolipine). Nanmoins, la production
dERO au niveau de la mitochondrie peut galement participer la protection contre l'apoptose
par activation des systmes anti-oxydants tels que le GSH, la GPx, la GST.

I.5.5) Apoptose intrinsque induite par les particules atmosphriques

Pour revue voir Annexe2, (Andreau et al. 2012)
L'apoptose est l'une des consquences possibles de l'exposition aigu ou chronique aux
polluants atmosphriques, qui sont capables de cibler la mitochondrie directement ou
indirectement. Bien que de nombreuses tudes dcrivent la capacit des PM induire certaines
caractristiques de l'apoptose, seules quelques tudes mcanistiques dtailles ont t publies,
montrant une induction de l'apoptose associe : un stress cellulaire, la production dERO, la
baisse du m, lactivation des caspases, et la fragmentation de l'ADN. La mort cellulaire
demontre dans des cellules pithliales pulmonaires ou respiratoires humaines est une
apoptose mitochondriale carcatrise par la rduction de l'activit des dshydrognases
mitochondriales, la libration du Cytochrome c, lactivation des caspases -9 et -3, en corrlation
avec l'induction d'un stress oxydant (Figure I.34).

51

Figure I.34: Apoptose dpendante et indpendante des ERO induite par les PM. Les PM ou leurs
composs (HAP et mtaux) provoquent la mort cellulaire par apoptose via la voie intrinsque EROdpendante (zone rose) ou indpendante (zone bleue). Les PM sont considres comme des gnrateurs
puissants dERO (ROS) dus leurs composs organiques (HAP) ou mtalliques et menant un stress
oxydant, rsultat du dsquilibre entre la production de dERO (ROS) et l'activation des dfenses antioxydantes. Selon Senft et al. 2002, l'activation du AhR pourrait rguler la fonction de la chane respiratoire
mitochondriale et induire la production de O2- et H2O2 partir des mitochondries . Le stress oxydant a
pour consquence des lsions de l'ADN mitochondrial , la peroxydation des lipides membranaires
mitochondriaux, et l'ouverture du PTP . La permabilisation des membranes mitochondriales (MMP) et
l'ouverture du PTP pourraient galement tre des effets directs des PM , comme dmontr par les
particules Diesel sur des mitochondries isoles (Xia et al. 2004). L'activit apoptogne dAIF peut tre
induite par les PM, ou leurs drivs oxyds . D'autres voies de signalisation indpendantes des ERO ont
t identifies comme laugmentation des protines pro-apoptotiques et/ou la rpression des protines de
survie de la famille Bcl-2 . Enfin, de rcentes publications suggrent galement un mcanisme de
l'apoptose dclench par des modifications de la composition et le remodelage de la membrane plasmique
. Modifi daprs Andreau et al. 2012.

52

I.5.5.i) Rle du stress oxydant induit par les composs organiques des PM
Les polluants particulaires sont considrs comme des oxydants puissants, et linduction
de la voie intrinsque de l'apoptose peut tre due un stress oxydant gnr par les composs
organiques (tels que les HAP, les nitro-HAP et les quinones) et inorganiques (tels que les
mtaux) adsorbs sur la surface des particules.
Les composs organiques sont capables davoir le mme effet apoptogne que les PM
dans divers types cellulaires via lactivation du rcepteur Aryl hydrocarbone (AhR). LAhR est
un facteur de transcription cytoplasmique qui, aprs liaison de son ligand, transloque dans le
noyau en vue de fixer llment de rponse aux xnobiotiques (XRE, Xenobiotic Responsive
Element ) au niveau des promoteurs de ses gnes cibles, conduisant l'activation de la
transcription des enzymes de phase I et II du metabolisme des xnobiotiques. Ces enzymes de
phase I telles que le cytochrome P450 1A1 produisent du H2O2 en mtabolisant par exemple le
benzo(a)pyrne (BaP) en un intermdiaire ractif BPDE (anti-7,8-dihydrodiol-9,10-poxybenzo(a)pyrne) connu pour dclencher des dommages de l'ADN et la carcinogense (voir
I.4.2.iv et I.4.3).
Parmi les dioxines et dioxines-like, la TCDD (2,3,7,8-ttrachlorodibenzo-p-dioxine) est
lune des plus ractives. Des tudes in vivo chez des souris exposes la TCDD ont montr une
rponse oxydative importante en corrlation avec la haute affinit de la liaison TCDD-AhR, ce qui
suggre un lien troit entre le stress oxydant et lAhR. Notamment, lexposition de souris la
TCDD (15 mg/kg) pendant trois jours conscutifs induit la production dERO mitochondrial (O2et de H2O2) en prsence de succinate, la dpltion dATP, ainsi que lactivation de la GPx et de la
Glutathion Reductase. A linverse, lextinction du gne AhR par Knock-Out, protge de ces effets,
ce qui suggre que la source majeure de stress oxydant induit par lAhR a pour origine la
respiration mitochondriale (Senft et al. 2002).
En consquence d'un stress oxydant, les mitochondries sont souvent endommages,
conduisant la PMM. Des expriences ralises sur des cellules HepG2 (ligne cellulaire de
carcinome hpatique humain) ont clairement montr que lanion superoxyde O2- peut lui seul
induire l'apoptose suite la sortie rapide et importante du Cyt c dans le cytosol
indpendamment de l'ouverture du PTP mais plutt par une permabilisation VDAC-dpendante
de la membrane externe mitochondriale (Madesh et al. 2001). Linduction de la PMM par les
particules semble au contraire tre dpendante de louverture du PTP puisquune tude ralise
sur des mitochondries isoles de foies de souris a montr que la fraction aromatique des
particules Diesel induit le gonflement ( swelling ) de la mitochondrie et la dpolarisation des
membranes mitochondriales, qui sont contrecarrs par lutilisation dun inhibiteur du PTP, la
cyclosporine A (CsA), suggrant que les composs organiques peuvent directement induire la
PMM via louverture du PTP (Xia et al. 2004).
En outre, dautres dommages mitochondriaux peuvent avoir lieu en consquence du
stress oxydant comme loxydation de la cardiolipine qui peut tre un vnement crucial de la
mort cellulaire dclenche par les XB. En effet, laccumulation dhydroproxydes de cardiolipine
et leurs drivs hydroxyls ont t mis en vidence dans des conditions de stress oxydant,

53

dinflammation, et lors de lapoptose. Outre la proxydation des lipides mitochondriaux, lO2- et

le H2O2 peuvent endommager les protines ainsi que l'ADN mitochondrial. LADN mitochondrial
(ADNmt) est l'une des principales cibles des ERO en raison de la proximit du site de production
et labsence

dhistones protecteurs.

Notamment,

la

TCDD

faibles

doses

induit

prfrentiellement une gnotoxicit au niveau mitochondrial plutt que nuclaire, induisant la

formation de 8-OHdG, la rduction du nombre de copies dADNmt, et des mutations par dltion
dans lADNmt (Andreau et al. 2012).
I.5.5.ii) Rle du stress oxydant induit par les composs mtalliques des PM
En plus des composs organiques, des mtaux lourds et de transition (tels que le
vanadium, le cadmium, le mercure, le plomb, laluminium, le titane, le chrome, le fer, le cobalt, le
nickel, le cuivre et le zinc) sont souvent trouvs dans les polluants atmosphriques et font partie
des composs inorganiques adsorbs sur les PM, principalement F et UF. Certains mtaux ont un
double rle en tant quinducteurs important dERO et en tant que cofacteurs essentiels pour
certaines enzymes anti-oxydantes. Les mtaux de transition peuvent promouvoir l'apoptose par
la gnration dERO, laltration des mitochondries, l'activation des MAP Kinases, de p53, et des
caspases, ou la rgulation de protines de la famille Bcl-2.
Les mtaux et la fraction soluble des PM sont galement connus pour causer
l'inflammation et la carcinognse principalement en raison de dommages l'ADN suite la
production dERO par la raction de Fenton (voir I.4.2.ii et iii). En effet, les mtaux
carcinognes (tels que larsenic, le cadmium, le chrome, le nickel, etc.) induisent des
modifications des bases, des cassures et des rarrangements de lADN pouvant conduire
lapoptose ou la cancrogense (voir I.4.4). Larsenic induit lapoptose via la gnration
dERO, la diminution de GSH intracellulaire, l'accumulation de Ca2+, la chute du m,
laugmentation de la Caspase-3, la rgulation ngative de la protine Bcl-2, et linhibition de la
protine p53. Dans le cas du cadmium, l'expression de la mtallothionine dtermine le type de
mort cellulaire induite (entre lapoptose et la ncrose), lapoptose est induite suite l'inhibition
des enzymes anti-oxydantes, des altrations mitochondriales et l'ouverture du PTP,
probablement par le biais de son interaction avec les groupes thiols de l'ANT. Enfin, la
gnration dERO et lactivation de p53 contribuent l'apoptose provoque par le chrome et le
slnium. Nanmoins, les PM contenant des niveaux levs de mtaux non cancrignes (tels
que le cobalt, le plomb, le fer et le zinc) ont aussi t associs la gnration dERO (notamment
lH2O2) conduisant l'apoptose par la voie mitochondriale. Lors de lapoptose, le zinc est
galement capable daugmenter lexpression et la fonctionnalit de p53, probablement en
stabilisant cette protine qui contient un atome de zinc ncessaire son activit de liaison
l'ADN.
De plus les ERO peuvent induire une autre voie dapoptose via l'activit de la protine
apoptogne AIF. AIF est une flavoprotine situe dans membrane interne de la mitochondrie,
elle est bi-fonctionnelle : essentielle pour le mtabolisme nergtique et pour l'induction de
l'apoptose indpendante des caspases. AIF est implique dans linduction de l'apoptose en
provoquant la fragmentation de l'ADN, la condensation de la chromatine, et la PMM. AIF peut

54

aussi avoir une fonction oxydorductase sous sa forme rduite et dimrise (formant un
complexe avec FADH2-NAD (Sevrioukova 2009). Les monomres oxyds ont une plus grande
affinit avec lADN que les dimres rduits, ainsi, les ERO participent loxydation dAIF et
lactivation subsquente de lapoptose indpendante des caspases. De plus, une rcente tude a
dmontr que lAIF a une activit rductase qui est environ mille fois infrieure celle du
cytochrome P450 ou de la NADPH quinone oxydorductase (NQO1) impliqus dans les phases I
et II du processus de dtoxication des XB (voir I.4). Ceci suggre que l'interaction dAIF avec
les XB ou leurs drivs pourrait promouvoir sa forme oxyde et renforcer son activit
apoptogne. En ce sens, l'apoptose induite par les PM ou les extraits de fume de bois dans les
macrophages alvolaires humains et les cellules endothliales de l'artre pulmonaire a t
associe la rgulation positive dAIF et sa translocation au noyau (Liu, P.L. et al. 2005).
I.5.5.iii) Autres voies impliques dans lapoptose induite par les PM
Grce tous les exemples cits prcdemment, il est clair que la cytotoxicit des
polluants atmosphriques (PM, HAP, mtaux, ou herbicides), dans divers types cellulaires,
incrimine principalement la production excessive dERO capables de cibler les mitochondries
par diffrents mcanismes (Figure I.34). Dautre part, les PM sont capables dactiver dautres
voies de signalisation dapoptose indpendandes du stress oxydant. Ainsi, diffrentes PM
peuvent activer l'expression de rgulateurs puissants comme p53, p21, Noxa, Bax, Bad, Bim et en
parallle la rpression de Bcl-2 et Mcl-1. En outre, de rcentes tudes soulignent limportant rle
des modifications membranaires (fluidit membanaire, raft lipidiques, ) dans les mecanismes
de mort celulaires et de cancrogense. En effet, plusieurs etudes ont dmontr un lien entre
lapoptose induite par certains HAP, tels que le B(a)P et le Phnanthrne, et une augmentation
de la fluidit ainsi que des changements de compostion lipidiques de la membrane plasmique
(Tekpli et al. 2013). Ainsi, il a t dcrit un nouveau mcanisme de l'apoptose, dclenche par le
1-nitropyrne et le BaP, via l'accumulation de lipides, des modifications de microstructures de la
membrane plasmique, notamment la modulation de lechangeur Na+/H+, l'inhibition des jonction
gap communicatives, la modification de la composition des radeaux lipidiques, et le stress
oxydant. Ces rsultats intressants soulignent le lien possible entre les altrations de la
membrane plasmique et la mort cellulaire. Les impacts sur le remodelage de la membrane
plasmique pourraient fournir des explications mcanistiques supplmentaires sur la faon dont
certains produits chimiques exercent leur effet cancrogne (Tekpli et al. 2011).
I.5.5.iv) Rle de la taille des PM
En plus de la composition, la taille est aussi un caractre determinant dans la cytotoxicit
des PM. Le potentiel oxydant des particules F et UF est plus important que celui des particules G
du fait de leur plus grande surface et de leur composition souvent riche en HAP et mtaux
(Churg et al. 1997; Baulig et al. 2004; Rumelhard et al. 2007b; Pietrodangelo et al. 2013). Une fois
internalises les petites particules sont plus mme dinduire un stress oxydant intracellulaire
et des dommages, directs ou indirects, sur les membranes et les organites de la cellule. Des
particules UF ont notamment t retrouves dans les mitochondries (Li, N. et al. 2003b) et les

55

lysosomes (Yue et al. 2010). La toxicit des PM2.5 est lie aux proxydations lipidiques,
lalteration de lactivit des SOD et la dimition du taux de glutathion, conduisant la mort
cellulaire (Kouassi et al. 2010). De plus, lapoptose induite par les particules PM2.5, contrairement
aux PM10, a t associe aux dommages lADN, larret du cycle cellulaire et laltration
morphologique des mitochondries (Gualtieri et al. 2011). Les PM10 quant elles sont
principalement limines par la clairance alvolaire, nanmoins, elle peuvent induire des effets
pro-inflammatoires, pouvant aussi conduire lapoptose des cellules (voir I.4.1, Wegesser et al.
2008). Enfin, une tude rcente, ralise sur des mitochondrie isoles, a montre que les PM10
sont aussi capables daltrer la chaine respiratoire mitochondriale (Delgado-Buenrostro et al.
2013).

I.5.6) Effets cytoprotecteurs des PM et de leurs composants

Lors d'une exposition chronique des polluants atmosphriques, l'acquisition de la
rsistance lapoptose pourrait tre une tape importante des mcanismes molculaires
impliqus dans l'initiation et la promotion des tumeurs (voir I.4.4). Malheureusement, trop
peu dtudes sintressent ce phnomne de rsistance l'apoptose ventuellement induite
par les polluants atmosphriques et aux mcanismes molculaires sous-jacents.
Dans le but de comprendre les mcanismes conduisant aux cancers pulmonaires, induits
par lexposition aux fumes de cuisson, Hung et collaborateurs, ont montr que le 2,4-DDE
(aldehyde2,4-dcadinal, le principal composant de ce type de pollution) est capable dinduire la
survie et la prolifration de cellules alvolaires (A549) via lexpression des IAP-1 et -2, de la
Survivine, et de la Cyclin D1 conduisant la diminution des niveaux de XIAP, Caspase-3, et p21
(Hung et al. 2007). Plusieurs tudes ont rapport les effets cytoprotecteurs des PM et de leurs
composs organiques ou leurs mtabolites, tels que les HAP, la TCDD, les PCB, et les pDi. Les
mcanismes exacts de l'inhibition de l'apoptose ne sont pas entirement compris, mais des
tudes in vitro ont dmontr la ncessit de la synthse des protines, la rgulation de p53, et
l'activation du AhR (Ferecatu et al. 2010, Annexe 1). La ncessit de synthse protique et
dactivation du AhR pourrait tre lie sa fonction de facteur de transcription qui pourrait
induire ou inhiber lexpression des gnes anti- ou pro-apoptotiques. Ainsi, certaines tudes ont
montr quAhR active l'expression des gnes anti-apoptotiques tels que bcl-2, bcl-xL, mcl-1, ou
vdac2 ; et peut interagir directement avec E2F1 conduisant la rduction de lexpression des
gnes pro-apoptotiques normalement induits par E2F1 tel que Apaf-1 (Andreau et al. 2012).
Dautres voies de signalisation de ont t identifies comme impliques dans la
cytoprotection confre par les particules atmosphrique, en particulier les protines kinases
(telles que Akt, ERK, JNK, PKA), ou le facteur de transcription Nrf2. Les voies PI3K/Akt et AhR
semblent tre interconnectes, puisque la prsence dAhR est ncessaire pour la fonction
cytoprotectrice dAkt. Ainsi, l'effet anti-apoptotique des pDi et de BPDE (un mtabolite du BaP)
semble li la phosphorylation et l'activation dAkt. En outre, Akt favorise la phosphorylation et
la liaison la membrane mitochondriale externe de lHexokinase II (HK-II) menant la
stabilisation du complexe PTP en conformation ferme et l'inhibition de la sortie du Cyt c dans le
cytosol. Enfin, l'activation de NF-B et AP-1 par l'exposition aux PM ou la fume de cigarette
est bien documente et reconnue comme faisant partie de la rponse inflammatoire et

56

prolifrative, mais leur rle dans la modulation de la mort cellulaire par apoptose reste mal
connu.
I.5.6.ii) Rle des composs mtalliques des PM
Parmi tous les composs hydrosolubles des PM, un candidat probablement responsable
de l'effet cytoprotecteur est le zinc (Zn) puisquil est dj connu pour minimiser le stress
oxydant (par exemple la peroxydation lipidique) et inhiber l'apoptose. En effet, Zn peut protger
les cellules directement en stabilisant les lipides et les protines des membranes cellulaires et
des organites ; ou indirectement en maintenant les niveaux de glutathion, en rduisant la
fragmentation de l'ADN, en empchant lactivation de la procaspase-3 et/ou en activant des
voies de signalisations cytoprotectrices (dont Akt et ERK). En outre, certains mtaux de
transition divalents (Mg2+, Sr2+, Mn2+, ) peuvent inhiber de faon comptitive louverture du
PTP dpendante du calcium par un mcanisme encore inconnu, suggrant un possible effet de
protection par les composs mtalliques, directement au niveau des mitochondries.
I.5.6.iii) Rle de la voie de signalisation Nrf2 et des enzymes anti-oxydantes
Les polluants atmosphriques sont galement des inducteurs de Nrf2, qui rgule
l'expression des enzymes de phase II de dtoxification et des anti-oxydants (voir I.4.2vi). En
effet, de nombreuses tudes ont signal lactivation de Nfr2 aprs exposition aux PM et leurs
composs (notamment les pDi, HAP et particules UF) dans des cellules pithliales bronchiques
humaines ou des macrophages de souris. Parmi les protines cibles anti-apoptotiques de Nfr2,
deux enzymes anti-oxydantes ont un intrt particulier en raison de leur emplacement et de leur
action sur les mitochondries: l'hme oxygnase 1 (HO-1) et la glutathion-S-transfrase (GST)
(voir I.4.2.iii).
L'expression et l'activit de la HO-1 sont considrablement augmentes dans les
mitochondries des cellules alvolaires et pithliales humaines exposes la fume de cigarette.
Cette surexpression de la HO-1 inhibe la mort des cellules et maintient les taux d'ATP (Morse et
al. 2005). Le mcanisme cytoprotecteur de la HO-1 est li ses produits de raction
enzymatiques tels que la biliverdine, le monoxyde de carbone (CO) et le fer ferreux (voir
I.4.2.iii). Ainsi, en rponse la production de Fe2+, la stabilit de la ferritine est augmente et
peut protger les cellules contre l'oxydation et l'apoptose ; et le CO limite la translocation
mitochondriale des protines de la famille de Bcl-2 et la sortie du Cyt c. De plus, il a t dmontr
dans des mitochondries isoles que le CO protge du gonflement et de la dpolarisation des
membranes mitochondriales associs louverture du PTP (Queiroga et al. 2011)
Dautre part, les GST sont impliques dans la dtoxification des mtabolites endognes
toxiques, des radicaux superoxydes et des XB. Il a t dmontr que les GST cytosoliques et
mitochondriales (, , et ) sont rgules positivement par de nombreux xnobiotiques et
certains ligands du AhR (TCDD, -naphtoflavone). Cependant les mcanismes daction de la GST
mitochondriale sont encore controverss : dune part ces enzymes empchent l'oxydation de la
cardiolipine et la PMM, d'autre part, il a t dmontr que la liaison de la GST mitochondriale la
membrane est active par S-glutathionylation et contribue la libration du Cyt c via louverture
du PTP.

57

Les ERO sont ventuellement impliqus dans la progression tumorale, les mtastases, et
plusieurs voies de signalisation induites par les xnobiotiques atmosphriques. La corrlation de
loxydation intracellulaire due au BaP et ses drivs (BaP-1,6-dione, BaP-3,6-dione, BaP-4,5dihydrodiol et 2-hydroxy-BaP-1,6-dione) avec la protection contre l'apoptose induite par le
retrait de srum, a clairement suggr qu'une certaine dose de ERO augmente la prolifration
cellulaire et la survie (Teranishi et al. 2010). Dans les conditions physiologiques, la viabilit des
cellules dpend essentiellement de la maintenance des systmes anti-oxydants fonctionnels en
particulier dans les cellules pulmonaires qui sont rgulirement exposes aux polluants
atmosphriques.
Le GSH est l'un des anti-oxydants les plus abondants dans les fluides et les cellules
pithliales des voies respiratoires. Il a un rle primordial dans la rgulation de lapoptose
puisque la N-actylcystine (NAC, prcurseur de GSH) empche efficacement l'apoptose induite
par des polluants de l'air, et que l'exposition in vivo la dioxine augmente les niveaux de GSH
mitochondrial dans des souris normales, CYP1A1 -/- et CYP1A2 -/-, mais pas dans les souris AhR
-/-, dmontrant aussi le rle de la voie AhR (Senft et al. 2002).

58

I.6) OBJECTIFS DE LETUDE

Le but de cette thse a t de comprendre le rle des caractristiques physicochimiques des PM dans la modulation de lapoptose des cellules pithliales bronchiques
humaines, contribuant ainsi une meilleure comprhension des acteurs et mcanismes
molculaires impliqus dans la cancrogense et la cytotoxicit induite par la pollution
atmosphrique.
Afin davoir une approche raliste, nous avons utilis des doses auxquelles un individu
est susceptible dtre expos dans des conditions normales de pollution pouvant tre observes
dans des mgacits comme Paris. Ainsi, les concentrations utilises de 5 50 g/cm, peuvent
mimer une exposition de l'ordre de 3 30 jours une pollution de 79 g/m3 (en PM2.5),
considrant que le dpt de la masse de PM2.5 est 2,3 g/cm2/24h dans la rgion trachobronchique, pour un individu lgrement asthmatique (Li, N. et al. 2003a). La concentration de
rfrence de 10 g/cm, pouvant mimer une exposition de lordre de 5 jours cette pollution.
Le modle cellulaire utilis est la ligne 16HBE, cest une ligne de cellules pithliales
bronchiques normales, provenant dun enfant ayant subi une greffe, et immortalises par
lantigne T du virus SV40. Ces cellules gardent en culture des caractristiques pithliales: elles
sont adhrentes, elles possdent des microvillosits ainsi que des jonctions gap et adhrentes
fonctionnelles. De plus, lendocytose des nanoparticules ainsi que lactivation du cytochrome
P450 par les pDi et la raction inflammatoire a t prcdemment prouve dans ces cellules
(Bonvallot et al. 2001; Belade et al. 2012). Elles prsentent lavantage de pouvoir tre cultives
pendant plusieurs semaines (par des passages successifs) et donc de pouvoir raliser des
expriences provenant dune mme dconglation afin de conserver au mieux les mmes
caractristiques et rponses biologiques.

Deux grands axes de recherche ont t abords :

1) Rle de la composition physico-chimique des PM dans la modulation de lapoptose
Cet axe de recherche peut tre spar en deux volets :
Etude du rle de la taille des PM dans la modulation de lapoptose
Pour cela nous avons utilis des particules atmosphriques de diffrentes classes de
tailles et de diffrentes sources, provenant de deux campagnes de prlvements :

Une ralise en 2003 Paris et Vitry-sur-Seine, qui a permis de collecter 4 lots de

particules PM2.5.

Une ralise en 2009 et 2010 Paris et Ouagadougou (Burkina-Faso) dans le cadre du

projet MEGATOX, qui a permis de collecter des particules de trois classes de tailles :
grossires G (PM1,5-10m), fines F (PM0,25-2,5m), ultrafines UF (PM<0,25m).

59

 Identification des composs particulaires impliqus dans la rsistance lapoptose

Aprs avoir identifi des particules induisant une rsistance lapoptose, nous avons
ralis des tests de corrlation afin dtablir le lien possible entre les effets observs et la
composition des PM. Nous avons ensuite tudi, en cytomtrie en flux, leffet des extraits
organiques et aqueux de ces PM anti-apoptotiques, ainsi que, leffet de diffrents mtaux et HAP
la concentration contenue, soit dans les particules anti-apoptotiques, soit dans les particules
non anti-apoptotiques.
2) Identification des mcanismes molculaires impliqus dans la rsistance lapoptose
confre par les particules
Dans un premier temps, nous avions dmontr le rle de lactivation de lAhR par les
HAP dans leffet anti-apoptotique des particules. Dans un second temps nous nous sommes
intresss de plus prs aux mcanismes molculaires activs par les composs mtalliques.
Nous nous sommes principalement focaliss sur la voie de signalisation anti-oxydante,
mais nous avons galement ralis des expriences prliminaires afin de dterminer si dautres
voies seraient impliques.
Etude de la voie de signalisation anti-oxydante
Sachant que les mtaux sont de forts inducteurs de stress oxydant et que les ERO
peuvent tre des modulateurs de l'apoptose, nous nous sommes intresss particulirement la
rponse cellulaire anti-oxydante. En effet, bass sur ces connaissances et sur le modle de la
rponse hirarchique au stress oxydant (Li, N. et al. 2003a; Andreau et al. 2012), nous avons fait
l'hypothse quune rponse anti-oxydante de faible intensit pourrait tre implique dans le
processus anti-apoptotique.
Pour cela, nous avons premirement valu la capacit oxydante intrinsque des
particules et des composs mtalliques, en conditions abiotiques, en utilisant le test DTT. Nous
avons tudi, par cytomtrie en flux, leffet de certains anti-oxydants sur linhibition de
lapoptose par les PM2.5 et nous avons effectu un dosage du Glutathion total (GSH+GSSG) avant
et aprs traitement par les PM2.5.
Enfin, nous nous sommes intresss de plus prs la voie de signalisation Nrf2. En effet,
Nrf2 est un facteur de transcription de nombreux gnes impliqus dans la rponse anti-oxydante
et dans le mtabolisme des xnobiotiques (Rubio et al. 2010). Aprs avoir mis en vidence la
translocation nuclaire rapide de ce facteur de transcription, nous avons montr la
surexpression de certains de ces gnes cibles (HO1, NQO1 et GPx1) par RT-qPCR aprs un
traitement aux particules ou aux composs mtalliques.
Etude de la prolifration des cellules en milieu glifi
Sachant que la rsistance lapoptose est un caractre prcancreux, nous avons regard
si les cellules exposes aux PM et a leurs composs acquirent dautres caractristiques, telle
que la prolifration sans adhesion. Pour cela, les cellules 16HBE ont t exposes diffrents

60

composs particulaires avant dtre mis en culture en milieu DMEM glifi par la nitrocellulose.
Les cellules 16HBE tant adhrentes, elles ne peuvent pas pousser autrement que lorsquelles
adhrent une matrice de fibronectine et collagne, sauf si des mutations leurs ont permis
dobtenir cette proprit.
Etude de la voie de signalisation calcique
Les particules anti-apoptotiques conduisent une rsistance lapoptose induite par
certains inducteurs dont lA23187. LA23187 est un ionophore calcique qui induit lapoptose en
augmentant le taux calcium intracellulaire, nous avons donc regard si les particules pouvaient
empcher cette augmentation de calcium, en lien avec leur effet anti-apoptotique. Pour cela nous
avons utilis un fluorochrome marquant spcifiquement le calcium intracellulaire et mesur le
flux calcique intracellulaire en cintique, en prsence et en absence de particules.
Etude des modifications du cytosquelette
Sachant que laugmentation du Ca2+ intracellulaire peut induire des rarrangements du
cytosquelette, en particulier le rseau dactine (Saneyoshi et al. 2012), et que les vnements
prcoces de lapoptose saccompagnent dune stabilisation du rseau de microtubules (Aslan et
al. 2009), il nous a sembl intressant dinitier des expriences sur leffet des PM antiapoptotiques sur lorganisation des microtubules et des filaments fins dactine. Pour cela nous
avons marqu en fluorescence lactine et la tubuline aprs traitement par des inducteurs
dapoptose ou par des particules.

61

62

II. MATRIEL ET MTHODES

II.1) Mise en culture et traitement des cellules ............................................................................. 64
II.1.1) Culture cellulaire ..................................................................................................................... 64
II.1.2) Traitements des cellules ....................................................................................................... 64
II.2) Particules et composs mtalliques ......................................................................................... 66
II.2.1) Les mthodes de prlvement des PM ............................................................................ 66
II.2.2) Particules de Paris 2003 ....................................................................................................... 67
II.2.3) Particules de Paris et Ouagadougou 2009 ..................................................................... 68
II.2.4) Composs mtalliques ........................................................................................................... 70
II.2.5) Extraits organiques et aqueux des PM-AW .................................................................... 70
II.3) Evaluation de la cytotoxicit des particules par cytomtrie en flux............................. 71
II.4) Etude de la voie de signalisation anti-oxydante .................................................................. 73
II.4.1) Mesure de la production despces ractives de loxygne par les PM:
test DTT.................................................................................................................................................... 73
II.4.2) Etude de leffet des anti-oxydants par cytomtrie en flux ........................................ 73
II.4.3) Dosage du Glutathion ............................................................................................................. 74
II.4.4) Quantification des ARN messagers par PCR quantitative en temps rel (rtqPCR) ........................................................................................................................................................ 74
II.4.5) Immunomarquage de Nrf2................................................................................................... 76
II.5) Etude de la voie de signalisation calcique .............................................................................. 77
II.5.1) Mesure du calcium intracellulaire par FlexStation..................................................... 77
II.5.2) Mesure du calcium intracellulaire par cytomtrie en flux....................................... 78
II.6) Etude des altrations morphologiques ................................................................................... 78
II.6.1) Observation de lactine en Microscopie lectronique fluorescence .................. 78
II.6.2) Microscopie lectronique balayage (MEB) ................................................................. 78
II.6.3) Culture des cellules en milieu glifi (METHOCELTM) ................................................ 79
II.7) Analyse statistique.......................................................................................................................... 79

63

II.1) MISE EN CULTURE ET TRAITEMENT DES CELLULES

II.1.1) Culture cellulaire
Le modle cellulaire utilis a t la ligne de cellules pithliales bronchiques humaines
16HBE14o-, fournie par le Dr Gruenert (Colchester, Vermont University), et nomme par la suite
16HBE. Ces cellules proviennent dun garon dun an ayant subi une greffe cur-poumon, elles
ont t immortalises par transfection avec lantigne T du virus SV40. Les cellules 16HBE n'ont
pas d'inhibition de contact, ne produisent pas de cils en culture mais gardent des marqueurs
pithliaux tels que la prsence de microvillosits, de jonctions gap fonctionnelles et de
jonctions adhrentes (desmosomes et hmidesmosomes, avec des intgrines et des Ecadhrines). Lendocytose des nanoparticules par ces cellules pithliales a dj t prouve
(Belade et al. 2012). Par ailleurs lactivation du cytochrome P450 a t observe sur ce mme
modle par des particules Diesel, cette activation induisant une raction inflammatoire
(Bonvallot et al. 2001).
Les 16HBE sont des cellules adhrentes et afin de mimer au mieux leur environnement
naturel elles ont t cultives sur une matrice, contenant 2.9% de collagne type I bovin (Purecol
Natucan 0,5 mg/cm, DB Laboratories), 1% de fibronectine humaine (1mg/ml, Sigma) et 10%
de srum albumine bovin (BSA, Sigma) dilus dans du milieu LHC (Gibco). Le milieu de culture
utilis est le DMEM/F12 (Life Technologies, Gibco) supplment avec 2% dUltroser G (UG,
substitut de srum, Biosepta), 1% de GlutaMAXTM (Glx, Gibco), 1% de PnicillineStreptozotocine (PS, Gibco) et 0,5% de Fongizone (FZ, Sigma-Aldrich). Les cellules sont
cultives 37C en prsence de 5% de CO2 sous atmosphre humide et le milieu est chang tous
les 2 3 jours. La confluence est maintenue une densit infrieure 60 000 cellules/cm par
un entretien une fois par semaine. Pour cela, les cellules sont rinces au PBS 1X (Phosphate
Buffered Saline, Gibco) puis dcolles avec de la trypsine-EDTA (0,05%, Gibco) pendant 3 5
min 37C. Lactivit enzymatique de la trypsine est inhibe par lajout de 10% de SVF (Srum
Veau Ftal, Gibco). Elles sont ensuite centrifuges 4 min 12 000 rpm, et le culot de cellules
est repris dans du milieu complet. Le nombre de cellules vivantes est dtermin par comptage
sur une cellule de Mallassez, en prsence de bleu Trypan qui discrimine les cellules mortes.

II.1.2) Traitements des cellules

Les traitements raliss sont rsums dans les tableaux II.1 et II.2.
Pour ltude de lapoptose et de la cytotoxicit, les cellules 16HBE une confluence de 60
70%, sont exposes 24 heures aux diffrentes PM ou aux mtaux dans du milieu DMEM/F12
complet dpourvu dUG et de srum, afin deviter lagrgation des PM sur le srum ou lUG. Avant
chaque traitement, les particules sont soniques 3 fois 20 secondes (70 W) puis vortexes afin
dviter au maximum leur agrgation entre elles.
Pour ltude de leffet anti-apoptotique lexposition aux PM se fait par un prtraitement
de 4 heures ( la concentration de 10 g/cm) avant lajout de linducteur dapoptose pendant
20 h supplmentaires (soit une exposition de 24 h aux particules au total). De la mme faon,
afin dtudier le rle des composs mtalliques, un prtraitement a t ralis avec des mtaux

64

aux concentrations trouves dans 10 g/cm de PM, avec ou sans chlateurs de mtaux, puis
lapoptose est induite par lajout dA23187 pendant 20 h supplmentaires.
Pour ltude de la signalisation anti-oxydante, des anti-oxydants ont t ajouts au mme
moment que le traitement par les particules ou les mtaux.
Tableau II.1: Traitements des cellules 16HBE.

65

Tableau II.2: Protocole et modes dactions des traitements.

Compos

Mode daction

Traitement

Concentration

Inducteurs dapoptose
Ionophore calcique : Induit lentre de Ca2+
A23187
(ou Calcimycine)
Peroxyde dhydrogne
(H2O2)
Staurosporine (STS)
Ionomycine (Iono)

dans la cellule [1]

4h aprs les PM ou

Dcouple les phosphorylations oxydatives [1]

mtaux,

Inhibe lATPase mitochondriale [1]

ou
sur des cellules

Induit un stress oxydant

non traites aux

Inhibiteur des protines kinases Ca2+

dpendantes (PKC)

PM, pour 20h

maximum.

[2]

Ionophore calcique : Induit lentre de Ca2+

3 M

10 M 1 mM
1 M
1 M

dans la cellule [3]

Anti-oxydants
Bloque le proxynitrite (ONOO-) et lanion
MnTBAP

superoxyde (O2-) [4]

100 M

Mime la SOD
Peroxydase : Catalyse la transformation du
Catalase

oxygne (2H2O +

En mme temps

O2) [5]

Catalyse la transformation de nombreuses

Glutathion rduit (GSH)

1 000 U/ml

peroxyde dhydrogne (H2O2) en eau et

espces ractives de loxygne (ERO) parmi

que les PM ou
mtaux.

1 10 mM

lesquelles H2O2 et ONOOGlutathion oxyd (GSSG)

Forme du GSH grce la Glutathion Rductase

10 mM

Augmente la synthse des systmes antiD-Mannitol

50 mM

oxydants enzymatiques et non-enzymatiques

[6]

Chlateur
Dfroxamine (DFO)
[1]

En mme temps que

Chlateur du Fer

les PM ou mtaux.

200 M

daprs Reed et al. 1972, [2] daprs Okazaki et al. 1988, [3] daprs Liu, C. et al. 1978, [4] daprs Batinic-Haberle et al.

2009, [5] daprs Laser 1955, [6] daprs Teke et al. 2011, [7] daprs Teke et al. 2011.

II.2) PARTICULES ET COMPOSES METALLIQUES

II.2.1) Les mthodes de prlvement des PM
Les particules en suspension dans lair sont rcupres grce des prleveurs
filtration ou impaction qui sparent les particules en fonction de leur taille. Lair est aspir
grce une pompe, travers une tte de prlvement place lentre du prleveur et qui
permet dexclure (avec un rendement de 50%) les particules dont le diamtre arodynamique
est suprieur une valeur dfinie, cest le seuil de coupure granulomtrique, les plus rpandues
sont les ttes de 2,5 m et de 10 m.
Les prleveurs filtration permettent de collecter une fraction reprsentative de la
quantit particulaire de lair. Les particules sont aspires dans lappareil et se dposent sur un
filtre (en tflon, quartz, polycarbonate) de densit ou porosit connue. Associ une tte de

66

prlvement ce type de prleveur permet de rcuprer les particules dune fraction

granulomtrique donne (PM2.5ou PM10).
Les prleveurs impaction, ou impacteurs en cascade, permettent de collecter et de
sparer les particules en fonction de leur taille. Le principe repose sur une succession dtages
dimpaction possdant chacun une tuyre qui projette perpendiculairement le jet dair aspir sur
une surface plane. Sur la surface est pos un filtre o vont simpacter les particules qui
possdent une inertie suffisante pour se dgager du flux dair. Linertie tant fonction de
la masse du corps, les particules plus fines, ayant moins dinertie, sont entranes par le flux
dair, contournent la surface dimpaction, et parviennent jusqu ltage suivant (Figure II.1).
Ainsi, les particules sont spares en fonction de leur granulomtrie par les diffrents tages
dimpaction (Quisefit et al. 1998). De plus, suivant la taille (et donc la masse) des particules
prlever on utilise des impacteurs haut (de 30 60 m3/h) ou bas dbit (environ 1m3/h).
A

Figure II.1: Impacteur en cascade. A) Photographie dun impacteur 10 tages, B) Exemple dun
impacteur trois tages : schma explicatif. Dans cet exemple, lair entre une tte de prlvement de
10m et arrive au premier niveau dimpaction, les PM10-2,5 possdent assez dinertie pour sortir du flux
dair et simpactent ltage 1, tandis que les PM2,5-0,1 et les PM0,1 continuent leur route dans le flux dair ;
ltage 2, les PM2,5-0,1 sortent du flux dair grce leur inertie et se fixent sur le filtre, les PM 0,1 font de
mme ltage 3.

Les particules atmosphriques tudies pendant ma thse proviennent de deux

campagnes de prlvements :
- Une ralise en 2003 Paris et Vitry-sur-Seine, qui a permis de collecter 4 lots de
particules PM2.5 (PM-AW, PM-AS, PM-VW, PM-VS).
- Une ralise en 2009 et 2010 Paris et Ouagadougou (Burkina-Faso) dans le cadre du
projet MEGATOX, qui a permis de collecter des particules de trois classes de tailles :
grossires G (PM1,5-10m), fines F (PM0,25-2,5m), ultrafines UF (PM<0,25m).
Les descriptions des PM prleves sont rsumes dans le tableau II.3.

II.2.2) Particules de Paris 2003

Les PM2.5 de 2003 proviennent dune campagne de prlvement effectue en rgion
parisienne en 2003. Les deux lieux de prlvements ont t slectionns pour leurs types de
pollution :

67

Des particules correspondant la pollution lie au trafic routier ont t prleves

proximit du priphrique parisien proche de la Porte dAuteuil en t et en hiver 2003
et sont ainsi nommes :
PM-AW pour PM Auteuil Winter
PM-AS pour PM Auteuil Summer

Des particules correspondant la pollution urbaine de fond ont t prleves Vitrysur-Seine en rgion parisienne, en t et en hiver 2003 et sont ainsi nommes :
PM-VW pour PM Vitry Winter
PM-VS pour PM Vitry Summer
Les particules de 2003 ont t collectes sur des filtres de nitrocellulose de 150 mm de

diamtre (HAWP, Millipore, Saint-Quentin-en-Yvelines, France) avec un prleveur impaction

haut dbit (DA-80 Digitel, Suisse, flux: 30 m3/h). Elles ont ensuite t dtaches des filtres par
sonication dans de leau distille puis lyophilise et conserves -20C (Baulig et al. 2004). Pour
les expriences, les particules sont resuspendues dans du milieu DMEM/F12 supplment avec
1% de Glx, 1% de PS et 0,5% de FZ, une concentration de 2 mg/ml et conserves -20C.

II.2.3) Particules de Paris et Ouagadougou 2009

Ces particules proviennent de deux campagnes de prlvement effectues Paris et
Ouagadougou (Burkina Faso) en 2009 et 2010. Les prlvements ont t raliss sur le toitterrasse de btiments situs proximit du centre-ville
Les particules atmosphriques parisiennes ont t collectes en rgion parisienne sur
deux sites diffrents deux priodes distinctes :
-

des particules correspondant la pollution lie la biomasse et au chauffage au bois,

prleves sur le Site Instrumental de Recherche par Tldtection Atmosphrique
(SIRTA) Massy Palaiseau situ environ 15 km au sud de Paris, en priode hivernale et
nommes :
WB1 et WB3 pour Wood Burning

des particules correspondant au trafic parisien collectes sur le toit du Laboratoire

dHygine de la Ville de Paris (LHVP) dans le XIIIme arrondissement. Les prlvements
ont eu lieu durant des heures de trafic intense, en priode estivale afin dexclure tout
risque de contribution des PM issues du chauffage au bois. Les chantillons sont
nomms :
TR5, TR6 et TR7 avec TR pour Trafic .
Les particules atmosphriques de Ouagadougou ont t collectes dans une zone

rsidentielle sur le toit du btiment de mtorologie nationale 4 km au nord-est du centreville :

-

des particules ayant comme sources identifies les feux de cuisson et de brlage des
ordures ainsi que le trafic li principalement aux mobylettes ont t prleves, soit le
soir (OB3, nommes OB pour Ouagadougou Biomasse), soit le matin (OB4).

68

des prlvements ciblant les particules modifies par photochimie ont aussi t ralises
en pleine journe et sont nommes OP5 et OP6 pour Ouagadougou Photochimie .
La collecte des PM a t ralise avec deux impacteurs diffrents, chacun ddi la

collecte de fractions granulomtriques spcifiques :

-

Limpacteur High Volume Sierra-Andersen a permis de rcuprer les particules

grossires (PM1,5-10m) sur des filtres Nucleporede 0,2 m de porosit. Les 3 premiers
tages de limpacteur ont t utiliss pour reconstituer la fraction grossire (tage 1 : 107,2 m, tage 2 : 7,2-3 m, tage 3 : 3-1,5 m).

Limpacteur High Volume Particle Sampler (HVPS) a t utilis pour rcuprer :

o les PM F (PM0,25-2,5m) par impaction sur des filtres Nuclepore de 0,2 m de
porosit.
o les particules UF (PM<0,25m) par filtration sur un filtre Nuclepore porosit de 5 m.
Les particules ont t dtaches des filtres par sonication dans du milieu DMEM/F12

supplment avec 1% de Glx, 1% de PS et 0,5% de FZ, et conserves une concentration de 1

mg/ml, -20C. Avant le traitement des cellules, les particules sont dcongeles, soniques 3 fois
20 secondes 70W (sonicateur Vibracel, Bioblock Scientific) et vortexes afin dviter au
maximum leur agrgation.

Les descriptions des PM prleves sont rsumes dans le tableau II.3.

Tableau II.3: Prlvements des particules atmosphriques.
PM
PM-AW

Dates de prlvements
20/01 au 18/02/2003

PM-AS

24/07 au 20/08/2003

PM-VW

25/02 au 31/03/2003

PM-VS

18/06 au 23/07/2003

WB1

4 au 18/02/2010

WB3

4 au 17/03/2010

TR5

30/06 au 12/07/2010

TR6

12 - 29/07/2010

TR7

25/08 au 20/09/ 2010

OB3

19 au 20/11/2009

OB4

24 au 26/11/2009

OP5

27 au 30/11/2009

OP6

1 au 2/12/2009

Lieux

Heures

Paris
(porte dAuteuil)

Sources identifies
Trafic automobile

ND
Vitry-sur-Seine
(banlieue parisienne)

Pollution de fond urbain

Palaiseau - SIRTA
(banlieue parisienne)

21h - 3h

Paris
(toit du LHVP)

6h - 10h
et
17h 19h
17h - 22h

Centre-ville de
Ouagadougou
(Burkina-Faso)

6h - 9h
10h - 16h
10h - 16h

Pollution de fond urbain

Trafic automobiles
Biomasse (Chauffage au bois)
Pollution de fond urbain
Trafic automobile
Biomasse (Cuisson au bois)
Trafic mobylettes
Biomasse (Cuisson au bois et
brlage dordures)
Trafic mobylettes
Particules modifies par la
photochimie

ND : pas de donnes. SIRTA : Site Instrumental de Recherche par Tldtection Atmosphrique (. LVHP : Laboratoire
dHygine de la Ville de Paris (Paris 13).

69

II.2.4) Composs mtalliques

Ltude des composs mtalliques a t ralise en exposant les cellules 16HBE
diffrents mtaux dilus 10 mg/ml dans leau distille :
quatre mtaux de transition :
le cuivre Cu(II) sous forme de chlorure de cuivre CuCl2 ou de cuivre sulfate CuSO4
le fer Fe(II) sous forme de sel de Morh (NH4)2Fe(SO4)2, 6H2O et Fe(III) sous
forme de chlorure de fer FeCl3
le manganse Mn(II) sous forme de chlorure de manganse MnCl2
le zinc Zn(II) sous forme de chlorure de zinc ZnCl2

un mtal post-transition : laluminium Al(III) sous forme de chlorure daluminium AlCl3

deux mtaux alcalino-terreux (Ca et Mg),

le calcium Ca(II) sous forme de chlorure de calcium CaCl2
le magnsium Mg(II) sous forme chlorure de magnsium MgCl2

et un mtal lourd : le plomb Pb(II) sous forme chlorure de plomb PbCl2

Pour lexposition des cellules, ces mtaux sont dilus dans du milieu complet sans UG aux

concentrations retrouves dans 10 g/cm de PM2.5 (Tableau II.4) :

Tableau II.4: Composs mtalliques des PM de 2003 et doses utiliss dans les expriences.
Mtaux
PM-AW (mg/g)

Total

Cu

Fe

Mn

Zn

Al

Ca

Mg

Pb

67.36

0.86

13.20

0.16

1.50

3.40

19.50

1.60

0.25

43

660

75

170

975

80

12.5

1.23

26.3

0.37

1.7

10.5

36.2

3.6

0.42

61.5

1315

ND

85

525

ND

ND

ND

0.37

13.5

0.42

1.3

10.4

59.6

4.3

0.52

18.5

675

ND

65

520

ND

ND

ND

0.40

21.6

0.54

1.30

20.40

110.6

6.7

0.43

Dose utilise dans

les expriences
(ng/ml)b
PM-AS (mg/g)c

106.68

Dose utilise dans

les expriences
(ng/ml)b
PM-VW (mg/g)d

120.29

Dose utilise dans

les expriences
(ng/ml)b
PM-VS (mg/g)a

193.26

Dose utilise dans

les expriences
20
1080
27
65
1020
5530
335
(ng/ml)b
a Daprs Baulig et al. 2004 , b quivalent 10 g/cm ou 50g/ml de PM , c Daprs Rumelhard et al. 2007a,
d
Daprs Rumelhard et al. 2007b , ND: pas de donnes.

21.5

II.2.5) Extraits organique et aqueux des PM-AW

Extrait organique
Lextrait organique des PM-AW (Oex) a t obtenu aprs extraction par du

dichloromthane, puis schage et dissolution dans du dimthylsulfoxyde (DMSO, Sigma). LOex

a t utilis la concentration mesure sur les particules daprs la fraction organique soluble
(SOF) dtermine pour les PM-AW (10%) (Ferecatu et al. 2010).

70

Extrait aqueux et particules laves

Lextrait aqueux (Aex) des PM-AW a t obtenu par une premire centrifugation

10 000 g dune solution de particules 2 mg/ml, suivie dune centrifugation du surnageant puis
dune filtration du nouveau surnageant sur un filtre de 0,22 m (filtre Durapore de
polyvinylidine difluoride, Millex GV, Carrigtohill , Cork , Irlande). Le volume dAex utilis pour
le traitement des cellules est le mme que le volume de suspension de particules initial ( 2
mg/ml) utilis pour le traitement 10 g/cm.
Les particules centrifuges correspondent aux PM laves et contiennent donc peu de
composs aqueux (Ferecatu et al. 2010).

II.3) EVALUATION DE LA CYTOTOXICITE DES PARTICULES PAR CYTOMETRIE EN FLUX

Principe
La mort cellulaire a t value par cytomtrie en flux (grce au cytomtre analyseur

CyAn ADP LX, de la Plateforme ImagoSeine de lInstitut Jacques Monod, et au cytomtre

analyseur/trieur BD FACSAria II, de la Plateforme de lunit de Biologie Fonctionnelle et
Adaptative). Brivement, le cytomtre en flux permet la quantification et la qualification
individuelle de cellules en fonction de leur taille (la lumire diffuse aux petits angles), de leur
granulosit (la lumire diffuse perpendiculairement) et de leur fluorescence (lie aux
fluorochromes utiliss) en rponse une stimulation lumineuse par un laser (Figure II.2).

Figure II.2: Fonctionnement dun cytomtre en flux. Les cellules sont mises en suspension et soumises
une surpression qui les fait progresser au centre dune gaine liquide dentranement. Les cellules dfilent
et sont interceptes par le faisceau lumineux mis par le laser. Suite cette excitation, les cellules
mettent des signaux optiques qui sont spars par des miroirs dichroques, focaliss par des filtres
optiques, puis convertis en signaux lectriques par lintermdiaire des photomultiplicateurs (PMT). Les
signaux lectriques sont ensuite numriss puis analyss informatiquement. Modifi daprs le dessin de
Vincent FRAISIER, Spencer Brown ISV.

Mthode
Aprs traitement, le surnageant de culture (contenant les cellules dtaches) ainsi que

les cellules adhrentes (dcolles par la trypsine-EDTA) ont t rcuprs dans les tubes

71

cytomtrie qui ont t centrifugs 5 min 1 200 rpm, temprature ambiante. Les surnageants
sont limins par retournement, puis les culots cellulaires sont repris dans 500 l de milieu de
culture contenant les diffrents fluorochromes. Afin de discriminer les cellules en apoptose des
cellules vivantes, nous avons mesur diffrents paramtres par des doubles marquages
fluorescents (rouge et vert) (Tableau II.5):
La diminution de la taille et laugmentation de granulosit ont t mesures par diffusion
de la lumire.
La chute du potentiel transmembranaire mitochondrial (m), a t mesure grce au
fluorochrome DiOC6(3) (DiOC, Invitrogen) qui saccumule dans la matrice mitochondriale et
met une fluorescence verte dont lintensit est directement proportionnelle au m (la
faible fluorescence est note DiOC-).
Lexposition des phosphatidylsrines membranaire la surface cellulaire (consquence de
la dstructure des membranes et du flip flop de lapoptose) a t mis en vidence par un
marquage lAnnexine V-FITC (AnnV, Sigma) qui interagit avec les phosphatidylsrines et
fluoresce en vert (note AnnV+).
La permabilisation de la membrane plasmique a t discrimine avec liodure de
propidium (IP, Sigma), un agent intercalant de lADN qui fluoresce en rouge et pntre dans
les cellules uniquement si la membrane plasmique est permabilise (note IP+).
La production de stress oxydant a t quantifie par lhydrothidine (HE, Sigma) qui, en
prsence danion superoxyde O2- est oxyd en thidium qui migre ensuite dans le noyau o il
sintercale entre les bases ADN et fluoresce en rouge (not HE+).
Tableau II.5: Mesure de lapoptose par cytomtrie en flux.
Caractristique
Mthode de dtection
Diminution de la taille
Augmentation de la granulosit
Permabilisation de la
membrane plasmique
Chute du m

Stress oxydant (O2-)

Exposition des
phosphatidylsrines

Absorption de la lumire aux petits angles

(0)
Diffusion de la lumire aux grands angles
(90)
Fluorescence de liodure de propidium
(IP+, 10 g/ml)
Fluorescence du DiOC6(3)
(DiOC-, 2 nM final)
Fluorescence de lhydrothidine
(HE+, 2 M final)
Fluorescence de lAnnV-FITC
(AnnV+, 2 g/ml final)

excitation

mission

488 nm

620 nm

488 nm

520 nm

488 nm

620 nm

488 nm

520 nm

Lanalyse par cytomtrie en flux est ralise sur 10 000 cellules aprs une incubation
denviron 15 min 37C et les rsultats sont exprims en pourcentage de cellules en apoptose
(DiOC- et HE+ ou DiOC- et IP+), en pourcentage dapoptose spcifique (AS) induite par le
traitement, ou en pourcentage dinhibition dapoptose spcifique selon les formules :
% AS = 100 x (% traitement - % tmoin) / (100 - % tmoin)
% Inhibition AS = 100 ((100 x % AS traitement) / % AS induite par A23187)

72

II.4) ETUDE DE LA VOIE DE SIGNALISATION ANTI-OXYDANTE

II.4.1) Mesure de la production despces ractives de loxygne par les PM:
test DTT

Principe
La production inhrente despces ractives de loxygne par les particules et les mtaux

a t mesure par un test DTT. Le test DTT est un test colorimtrique, bas sur la capacit des
composs redox-actif transfrer des lectrons partir du dithiothritol non oxyd (DTT)
l'oxygne et produire de l'anion superoxyde et du DTT disulfure :
RedOx
+ 2O2

+ 2O2.-

(DTT)

(DTT disulfide)

Le thiol restant est ensuite mis ragir avec le DTNB, gnrant le disulfure mixte et de
l'acide 5-mercapto-2-nitrobenzoque qui est mesur par son absorption 405nm.
DTT

Mthode
Les chantillons de particules ou de mtaux ont t incubs 30 min 37 C avec 200 M

de DTT (Euromedex) dans des plaques 96 puits. Aprs incubation, les plaques ont t
centrifuges 3000 g (15 min, 4C) et le DTT non oxyd restant a t mesur par sa raction
avec 2,5 mM de DTNB (acide 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoque), Euromedex), formant l'acide-5mercaptobenzoque 2-nitro (TNB) qui a t quantifi en mesurant l'absorbance 405 nm avec
un lecteur de plaque.
Le milieu utilis pour lexprience est du DMEM/F12 sans rouge de phnol, pour eviter
les interfrences entre les colorations, et dont loxygne a t limin en utilisant une pompe
vide, afin de limiter loxydation spontane au DTT. Toutes les mesures ont t effectues une
exposition lumineuse rduite. Le taux d'activit d'oxydation du DTT a t calcul en utilisant une
rgression linaire de la dose de DTT oxyd en fonction de la dose de PM ou de mtaux, sur la
base de la moyenne de 5 expriences distinctes.

II.4.2) Etude de leffet des anti-oxydants par cytomtrie en flux

Leffet des anti-oxydants sur la modulation de lapoptose par les particules et les mtaux
a t mesur par cytomtrie en flux. Les cellules ont t exposes des anti-oxydants en mme

73

temps que les particules (10 g/cm) ou les mtaux (quivalent 10 g/cm de PM) pendant 4 h
avant lajout de linducteur dapoptose pendant 20 h supplmentaires (Tableaux II.1 et II.2) et
lapoptose a t mesure par cytomtrie en flux avec le DiOC et lHE (voir II.3.2 et Tableau
II.5).

II.4.3) Dosage du Glutathion

Principe
Afin dtudier la rponse anti-oxydante des cellules suite aux traitements par les

particules ou les mtaux, le glutathion total (GSH et GSSG) a t dos par un kit d'analyse de
glutathion (Sigma), suivant les recommandations du fabricant. Le glutathion est mesur par sa
raction avec le DTNB, produisant du TNB. Le GSSG ainsi form est recycl par la glutathion
rductase et du NADPH.

Mthode
Brivement, aprs exposition des cellules aux PM (10 g/cm) ou leurs composs

mtalliques (quivalent 10 g/cm de PM) pendant 4 heures, les cellules ont t recueillies et
remises en suspension dans du PBS 1X. Aprs centrifugation, le culot a t suspendu dans 5%
d'acide 5-sulfosalicyclique et le lysat cellulaire a t obtenu par conglation/dconglation
successives. Aprs une centrifugation 10 000 g, le glutathion se trouve dans le surnageant qui
est dos.
Le H2O2 (1 mM) a t utilis comme contrle positif connu pour induire l'oxydation du
GSH. En parallle, le comptage des cellules en bleu Trypan a permis d'exprimer les rsultats pour
106 cellules.

II.4.4) Quantification des ARN messagers par PCR quantitative en temps

rel (RT-qPCR)

Principe
La RT-qPCR est base sur la technique de PCR classique. Elle correspond une

amplification dun fragment spcifique dADN, dlimit par deux amorces spcifiques (sens et
anti-sens). Les amorces s'hybrident la squence cible en prsence d'un excs de nuclotides et
dune Taq polymrase (ADN polymrase thermostable) synthtisant le brin complmentaire. La
mesure et la visualisation de lamplification se font en temps rel.
Premirement, les ARN de l'chantillon sont extraits grce au TriReagentTM, puis reversetranscrit (RT) en ADN complmentaires (ADNc) grce une Reverse Transcriptase. La PCR

74

quantitative est alors ralise sur les ADNc avec des amorces shybridant de faon spcifique sur
une partie du gne tudi, en prsence dun agent intercalant fluorescent : le SYBR green. La
fluorescence du SYBR green augmente lorsquil est li lADN double brin et est proportionnelle
au nombre de transcrits cibles prsents au dbut de la raction.

Mthode
Aprs traitement des cellules par les particules ou les mtaux, l'ARN total des cellules a

t extrait en utilisant du TriReagentTM selon les instructions du fabricant. La concentration en

ARN et la qualit de l'extraction ont t values en mesurant l'absorbance 260 nm et 280 nm
en utilisant un Nanodrop (ND- 2000, Thermo Scientific). La reverse transcription de lARN en
ADN complmentaire a t ralise laide du kit M-MLV reverse transcriptase (Promega,
Charbonnieres, France), selon le protocole donn par le fournisseur. Brivement, 2 g de lARN
total a t mis en prsence de 500 U de M-MLV reverse-transcriptase, 20 pg/ml d'amorces oligodT (Roche Applied Sciences, Meylan, France), et 500 M de nuclotides (dNTP, Roche Applied
Sciences, Meylan, France), pendant 30 minutes 42C, les produits de RT (les ADNc) sont
ensuite conservs -20C.
Les ADNc ont t amplifis par PCR quantitative en temps rel haut dbit dans un
appareil Light Cycler 480 (Roche), avec le kit Master Mix Light Cycler 480SYBR Green I
(Roche), selon les recommandations du fournisseur. Pour chaque chantillon, lADNc a t mis
en prsence 0,5 M damorces sens et anti-sens (Tableau II.6), dilus dans 1X de Master Mix
Light Cycler 480SYBR Green I, contenant lADN polymrase (FastStart Taq DNA Polymerase) et
lagent fluorescent SYBR Green I, et ont t amplifis.
Tableau II.6: Squence des amorces utilises pour la RT-qPCR.
Gne

Amorce sens

Amorce anti-sens

Nrf2

5-GAGACAGGTGAATTTCTCCCAAT-3

5-GGGAATGTGGGCAACCTGGG-3

HO-1

5-CAGGCAGAGAATGCTGATTC-3

5-GCTCTTCTGGGAAGTAGACAGG-3

NQO1

5- AAGAAAGGATGGGAGGTGGT-3

5-GCTTCTTTTGTTCAGCCACA-3;

SOD2

5-TTGTCCAAATCAGGATCCAC-3

5- TGCAAGCCATGTATGATCTTTCAG-3

GSTP1

5-CGGGCAAGGATGACTATGT-3

5-TCCAGCAGGTTGTAGTCAGC-3

GPx

5-GCGGGGCAAGGTACTACTTA-3

5- CTCTTCGTTCTTGGCGTTCT-3

GAPDH

5- CCCCTTCATTGACCTCAACTA-3

5-GACAAGCTTCCCGTTCTCA-3;

B2M

5- GCTCGCGCTACTCTCTCTTT-3

5- GGATGAAACCCAGACACATA-3.

Lamplification se droule en deux tapes :

1- Une phase de dnaturation (Hot Start) 95C pendant 10 min, durant laquelle il y a
sparation des deux brins dADN et des amorces par rupture des liaisons hydrogne, et
activation de lenzyme Taq polymrase possdant un groupement thermolabile qui bloque
son activit temprature ambiante.
2- Une phase de 45 cycles damplification, chaque cycle comportant lui mme trois phases :

75

a) une phase de dnaturation permettant la sparation des deux brins dADN, de 10

secondes 90C ;
b) une phase dhybridation des amorces spcifiques (10 secondes 60C). Le SYBR green va
se lier au niveau des sites de fixations des amorces sur lADN et va alors mettre de la
fluorescence ;
c) une phase dlongation (10 secondes 72C). La polymrase permet llongation dun
nouveau brin dADN partir des amorces lies celui-ci, se traduisant par une
augmentation des sites de fixations du SYBR green et donc une augmentation de la
fluorescence mise.
Pour chaque gne, lanalyse de la fluorescence mise en temps rel pendant toute la
phase damplification conduit la dtermination du Crossing point ou Cp, c'est--dire le
nombre de cycles damplification ncessaire afin que la fluorescence acquise sorte du seuil de
dtection. Le Cp est dpendant de la quantit dADN prsent avant lamplification, plus il y a
dADNc, plus le Cp sera petit (Figure II.3).
Quantit
damorces

Crossing
point
Cp

8 4 2 1
21 22 23 24

Seuil de dtection
Cycles

Figure II.3: Le principe de quantification en RT-qPCR est bas sur le Crossing point Cp ou Cycle
threshold Ct qui correspond au nombre de cycles damplifications ncessaire ce que la fluorescence
soit dtecte, plus il y a dADN, plus le Ct sera petit.

Le calcul des Cp et de la quantit (relative) dADNc se fait par le logiciel LightCycler

(Roche Applied Science) grce une gamme talon qui consiste en une srie de dilutions du
produit de la RT qui contient lADNc cible. La normalisation des Ct se fait grce des gnes de
rfrence dont la quantit ne varie pas en fonction des traitements infligs aux cellules. Cela
permet de normaliser le rsultat pour le gne tudi en fonction du rendement de la RT, de
lintgrit et de la quantit des ARN, et des erreurs de pipetage et de dosage. Ce sont les gnes 2
microglobuline (B2M, [GenBank: 567]) et glycraldhyde-3-phosphate dshydrognase (GAPDH,
[GenBank: 2597]) qui ont servi de gnes de rfrence pour nos expriences.

II.4.5) Immunomarquage de Nrf2

Principe

76

La translocation nuclaire du facteur de transcription Nrf2 a t observe par

immunofluorescence, qui permet de cibler la protine grce un anticorps primaire qui sera
ensuite cibl par un anticorps secondaire coupl un fluorochrome.

Mthode
Les cellules 16HBE ont t cultives sur le systme Slide Lab-Tek Chamber (Thermo

Scientific) et exposes pendant 24h aux particules (10 g/cm) ou au Fe(II) (quivalent 10
g/cm de PM-AW). Aprs traitement, les cellules ont t fixes avec 4% de paraformaldhyde,
puis permabilises avec 0,05% de Tween20 dilu en PBS 1X.
La protine Nrf2 a t dtecte par un anticorps primaire de chvre anti-Nrf2 (dilu
1/100me), qui lui-mme a t cibl par un anticorps secondaire anti-IgG de lapin conjugu au
fluorochrome Alexa Fluor 488 (dilu 1/500me, Life Technologies). La coloration de l'actine a
t ralise en utilisant la rhodamine phallodine (0,8 U/ml, Life Technologies). Un marquage
des noyaux a t ralis avec du DAPI (4',6-Diamidino-phnyl-2indole, dichlorhydrate, Life
Technologies, 0,5 g/ml). Les montages entre lames et lamelles ont t raliss en utilisant du
milieu de DABCO (Sigma).
Limmunofluorescence a t value par l'observation des lames au microscope confocal
laser (Zeiss LSM 710, de la plateforme ImagoSeine de lInstitut Jaques Monod). Le microscope
confocal permet dobtenir des images de plusieurs profondeurs de champs et donc des coupes
diffrents niveaux de la cellule. Les images ont t compiles avec le logiciel Image J.

II.5) ETUDE DE LA VOIE DE SIGNALISATION CALCIQUE

II.5.1) Mesure du calcium intracellulaire par FlexStation

Principe
Le flux calcique des cellules a t mesur grce au kit FILPR Calcium 5 Assay (Molecular

Devices) par le lecteur de plaque/injecteur FlexStation 3 (Multi Detection Reader with

Integrated Fluid Transfer, Molecular Devices, Plateforme Mtabolisme de lunit de Biologie
Fonctionnelle et Adaptative). La FlexStation 3 est un lecteur de plaque avec un distributeur
intgr permettant dajouter des produits juste avant ou pendant la lecture (en absorbance ou
fluorescence). Le kit FILPR Calcium 5 Assay contient la sonde fluorescence Fluo4 qui entre dans
la cellule et fixe le calcium, ainsi quun quencher qui nentre pas dans la cellule et permet
ainsi de rduire le bruit de fond li au calcium extracellulaire contenu dans le milieu de culture.
Afin de mesurer tout le calcium intracellulaire et limiter la libration de calcium de la cellule
vers lextrieur, les canaux ioniques sont inhibs par la probncide (Molecular Devices).

Mthode
Les cellules ont t cultives dans des plaques 96 puits noires fond transparent

(Greiner) puis traites dans 100 l de milieu DMEM/F12 sans UG ni rouge de phnol avec les
particules pendant 4 h. Lexprience a ensuite t ralise suivant le protocole du fournisseur. La
sonde fluorescente Fluo4, ainsi que la probncide (2,5 mM) ont t ajoutes pendant 45 min
avant la lecture. Les inducteurs dapoptose ont t injects juste avant la lecture de la

77

fluorescence qui a lieu pendant 3 min. Lintensit de fluorescence de la sonde est

proportionnelle la concentration calcique, nous permettant de mesurer les concentrations de
calcium intracellulaire en temps rel. Les rsultats sont exprims selon la formule : (F/F0)-1
(avec F : Fluorescence, F0 : Fluorescence au temps 0) qui traduit la fluorescence spcifiquement
d au traitement subi.

II.5.2) Mesure du calcium intracellulaire par cytomtrie en flux

Le flux calcique des cellules a galement t analys par cytomtrie en flux grce la
sonde fluorescente Fluo4 du kit FILPR Calcium 5 Assay (Molecular Devices). Les cellules ont
t traites 24h par les particules et prpares pour la cytomtrie sans marquage. Le
fluorochrome et le quencher ont t ajouts aux tubes de cytomtrie (250 l/tube) et incubs
30 min 37C selon les recommandations du fabricant. La fluorescence a t quantifie de
manire cintique par cytomtrie en flux (CyAn ADP LX, de la Plateforme ImagoSeine de
lInstitut Jacques Monod) avant et juste aprs lajout des inducteurs dapoptose dans les tubes.

II.6) ETUDE DES ALTERATIONS MORPHOLOGIQUES

II.6.1) Observation de lactine en Microscopie lectronique fluorescence
Les altrations morphologiques ont pu tre observes en microscopie lectronique
transmission en fluorescence par un marquage de lactine et de la tubuline. Aprs traitement par
les inducteurs ou les PM, lactine a t marque la phallodine-rhodamine 123 (0,8 U/ml, Life
Technologies, fluoresce en rouge) et la tubuline a t immunomarque grce un anticorps
secondaire coupl au fluorochrome FITC (fluoresce en vert). Aprs traitement par les PM, le
marquage de lactine a t ralis selon la mme mthode.

II.6.2) Microscopie lectronique balayage (MEB)

Principe
Le microscope lectronique balayage permet de visualiser des objets en relief. Il utilise

un fin faisceau dlectrons qui se focalise sur lchantillon. Linteraction entre les lectrons et
lchantillon provoque la formation dlectrons secondaires de plus faible nergie qui sont
amplifis puis dtects et convertis en un signal lectrique. Ce processus est ralis en chaque
point de lchantillon par un balayage du microscope. Lensemble des signaux permet de
reconstruire la typographie de lchantillon et de fournir une image en relief.

Mthode
Aprs traitement des cellules par les particules (4 h) et les inducteurs dapoptose (1 h ou

3 h), elles ont t rinces au PBS 1X puis fixes par une solution de glutaraldhyde 25% dans
du tampon cacodylate (0,1 M), 1 h temprature ambiante. Aprs deux rinages au PBS 1X, les
cellules ont t colores par de losmium 1%, 1h temprature ambiante, afin daccentuer le
contraste en microscopie. Les chantillons ont ensuite t rincs leau distille puis

78

dshydrats par un gradient dalcool : 3 fois 10 min lalcool 50%, 3 fois 15 min lalcool 70%, 3
fois 15 min lalcool 100%, puis lobserves en MEB.

II.6.3) Culture des cellules en milieu glifi (METHOCELTM)

Le METHOCELTM est compos de polymres de cellulose qui forme un milieu visqueux. 3
grammes de METHOCELTM en poudre strile ont t dissous dans 100 ml de milieu DMEM/F12,
1% PS et 0,5% FZ, mais sans UG ni Glx, chauff 60C. Aprs 20 minutes dagitation, 100ml du
mme milieu a t ajout, puis mlang 1 h sous agitation, et laiss pour la nuit 4C. Le
lendemain le milieu est centrifug 15 000 g pendant 1 h pour faire retomber les cristaux de
METHOCELTM non dissous.
Les cellules sont dans un premier temps cultives et exposes aux composs
particulaires pendant 24 h (puis rinces au PBS 1X), de manire rpte une fois par semaine
pendant 5 semaines. Les cellules ont t maintenues une confluence infrieure 60 000
cellules/cm par dcollement la Trypsine-EDTA et rensemencement. Aprs les traitements,
les cellules sont dcolles grce la Trypsine-EDTA puis rensemences 150 000 cellules pour
2 ml de milieu glifi, les observations en microscopie optique ont ensuite t ralises 3 jours
aprs.

II.7) ANALYSE STATISTIQUE

Tous les rsultats sont prsents sous forme de moyenne SEM d'expriences
indpendantes. Les donnes ont t analyses l'aide dune analyse de la variance (ANOVA). En
cas de diffrence des variances, un test Bonferroni ad hoc de comparaisons multiples a t
ralis pour toutes les comparaisons par paires par rapport aux conditions contrles ou par
rapport aux diffrents traitements des cellules grce au logiciel Prism5 GraphPad. Les
diffrences ont t considres comme significatives si la valeur de p tait au moins infrieure
0,05.

79

80

III.

RSULTATS : RLE DE LA COMPOSITION

PHYSICO-CHIMIQUE DES PARTICULES DANS LA

RGULATION DE LAPOPTOSE

III.1) Introduction..................................................................................................................................... 82
III.1.1) Contexte de ltude ................................................................................................................ 82
III.1.2) Rappel sur les particules tudies................................................................................... 83
III.2) Rsultats ........................................................................................................................................... 84
III.2.1) Etude de linduction dapoptose ....................................................................................... 84
III.2.2) Etude de linhibition de lapoptose.................................................................................. 92
III.3) Conclusion ......................................................................................................................................102

81

III.1) INTRODUCTION
III.1.1) Contexte de ltude
Depuis les annes 1950 jusqu aujourdhui, de nombreuses tudes pidmiologiques, ont
dmontr les effets dltres de la pollution particulaire sur la sant humaine notamment au
niveau respiratoire tels que les cancers broncho-pulmonaires (CBP) (Greenburg et al. 1967;
Higgins, I.T. 1976; Yanagi et al. 2012). Le 17 octobre 2013, lIARC a class la pollution de lair
extrieur ainsi que les PM comme cancrogne certain pour lhomme (groupe 1, IARC 2013)
sur la base des nombreuses recherches scientifiques montrant un lien de cause effet entre la
pollution atmosphrique et les CBP.
La pollution particulaire tant un mlange complexe de composs en suspension qui
sadsorbent les uns aux autres et forment des particules de diffrentes tailles (nommes PM
pour Particulate Matter ), les recherches sintressent au rle de la taille et de la composition
des PM dans la cancrogense. Il a notamment t montr que les particules fines sont associes
la mortalit par cancer du poumon, et la contribution annuelle de la pollution de l'air ambiant
la mortalit par CBP a t estim plus de 60 000 dcs dans le monde (IARC 2013). Parmi les
constituants particulaires, les HAP, dont le benzo(a)pyrne (BaP), ainsi que les mtaux lourds
sont reconnus comme des initiateurs et promoteurs de cancrogense.
Lchappement la mort cellulaire programme, ou apoptose, est lune des premires
caractristiques obtenues par les cellules en voie de cancrisation (Hanahan et al. 2011). Dans le
but damliorer les connaissances sur les processus de cancrogense provoqus par les
particules nous nous sommes intresss la modulation de lapoptose par les PM et aux
mcanismes molculaires sous-jacents.
Ce chapitre prsente les rsultats obtenus quant au rle de la taille et des composs
particulaires sur la modulation de lapoptose.
Une partie de cette tude a t ralise grce limplication de notre laboratoire dans le
projet ANR MEGATOX ( MEGacity Aerosols chemical characterization and TOXicity ) qui a eu
pour but de caractriser la composition chimique et la toxicit de la pollution particulaire dans
deux villes contrastes (en Europe et Afrique). Ce projet a permis de prlever les PM, de
caractriser leur composition chimique et les sources de pollution, et dtudier les effets
biologiques des PM de diffrentes tailles court terme et long terme sur les cellules
pithliales et endothliales respiratoires humaines.
Jai donc eu accs travers ce projet des PM des 3 classes de taille (grossires G ; fines F
et ultrafines UF) issues de sources contrastes et jai tudi leurs impacts sur linduction ou
linhibition de lapoptose des cellules pithliales bronchiques humaines. La concentration
maximale de 10 g/cm utilise mime une exposition de 5 jours une pollution de 79 g/m3 (en
PM2.5), laquelle nous pouvons tre exposs, notamment dans des zones urbaines ou des
mgacits comme Paris (considrant que le dpt de la masse de PM2.5 est 2,3 g/cm2/24h dans
la rgion tracho-bronchique, pour un individu lgrement asthmatique, Li, N. et al. 2003a).

82

III.1.2) Rappel sur les particules tudies

Les PM tudies proviennent de deux campagnes de prlvements :
Une campagne ralise en 2003 Paris (priphrique porte dAuteuil) et Vitry-sur-Seine,
qui a permis de collecter 4 lots de PM2.5 (PM-AW, PM-AS, PM-VW, PM-VS), pour lesquels
nous avons tudi leur cytotoxicit et leur effet anti-apoptotique.
Une ralise en 2009 et 2010 Paris et Ouagadougou (Burkina-Faso) dans le cadre du
projet MEGATOX, qui a permis de collecter des particules de trois classes de tailles :
grossires G (PM1,5-10m), fines F (PM0,25-2,5m), ultrafines UF (PM<0,25m) et pour
lesquelles a t tudie leur cytotoxicit.
Pour une meilleure visibilit, la description des particules, leurs noms, et les dtails des
prlvements sont rsums dans le tableau ci-dessous (copie du Tableau II.3) :
Pour rappel : Tableau II.3: Prlvements des particules atmosphriques.
PM
PM-AW

Dates de prlvements
20/01 au 18/02/2003

PM-AS

24/07 au 20/08/2003

PM-VW

25/02 au 31/03/2003

PM-VS

18/06 au 23/07/2003

WB1

4 au 18/02/2010

WB3

4 au 17/03/2010

TR5

30/06 au 12/07/2010

TR6

12 - 29/07/2010

TR7

25/08 au 20/09/ 2010

OB3

19 au 20/11/2009

OB4

24 au 26/11/2009

OP5

Lieux

Heures

Paris
(porte dAuteuil)

Sources identifies
Trafic automobile

ND
Vitry-sur-Seine
(banlieue parisienne)

Pollution de fond urbain

Palaiseau - SIRTA
(banlieue parisienne)

21h - 3h

Paris
(toit du LHVP)

6h - 10h
et
17h 19h
17h - 22h

Centre-ville de
Ouagadougou
(Burkina-Faso)

6h - 9h

Pollution de fond urbain

Trafic automobiles
Biomasse (Chauffage au bois)
Pollution de fond urbain
Trafic automobile
Biomasse (Cuisson au bois)
Trafic mobylettes
Biomasse (Cuisson au bois et
brlage dordures)
Trafic mobylettes

27 au 30/11/2009
10h - 16h Particules modifies par la
photochimie
OP6
1 au 2/12/2009
10h - 16h
ND : pas de donnes. SIRTA : Site Instrumental de Recherche par Tldtection Atmosphrique (. LVHP : Laboratoire
dHygine de la Ville de Paris (Paris 13).

83

III.2) RESULTATS
III.2.1) Etude de linduction dapoptose
III.2.1.i) Les PM2.5 parisiennes de2003
Les premires tudes auxquelles jai particip pendant mon stage de Master 2 au
laboratoire ont port sur les particules PM2.5 prleves en 2003 de deux lieux et sources
diffrents : les PM-AW et AS prleves proximit dun axe routier (priphrique de Paris,
porte dAuteuil) ainsi que les PM-VW et VS ciblant la pollution de fond urbain ( Vitry-surSeine), prleves en hiver (-W) et en t (-S) 2003 (dcrites dans le II.2.1 et le Tableau II.3).
Cette tude a fait lobjet dune publication dans Particle and Fibre Toxicology en 2010
(Annexe 1), intitule :
Polycyclic aromatic hydrocarbon components contribute to the mitochondriaantiapoptotic effect of fine particulate matter on human bronchial epithelial cells via the
aryl hydrocarbon receptor .
Ioana Ferecatu, Marie-Caroline Borot, Camille Bossard, Melanie Leroux, Nicole Boggetto,
Francelyne Marano, Armelle Baeza-Squiban, Karine Andreau.

Ainsi, nous avons tout dabord montr que les quatre lots de PM2.5 prlevs en 2003
ninduisent pas lapoptose de trois lignes de cellules pithliales bronchiques humaines :
16HBE, NCI-H292 et BEAS-2B, ainsi que des cellules primaires bronchiques humaines NHBE
(Ferecatu et al. 2010, Figure III.1 A). Cette inocuit des PM2.5-AW a t mise en vidence vis-vis de quatre paramtres apoptotiques mesurs par cytomtrie en flux : la chute du potentiel
transmembranaire mitochondrial determine par le DiOC6(3), la production danion superoxyde
quantifie par le HE, lexposition des phosphatidylsrines mesure par lAnnV, et la
permabilisation de la membrane plasmique grce lIP (Figure III.1 B). Ainsi, labsence de
cytotoxicit des PM-AW t observe pour des concentrations allant de 1 50g/cm (Figure
III.1 C) et pour des temps dexposition de 24h, 48h et 72h (Figure III.1 B et C).
Ces rsultats montrent donc que les PM2.5 parisiennes de 2003 ninduisent pas lapoptose
des cellules pithliales bronchiques humaines.

84

Figure III.1: Effet de l'exposition des PM2.5 prleves en 2003 sur les cellules pithliales
bronchiques humaines. A) Les cellules pithliales bronchiques humaines 16HBE, NCI-H292, BEAS-2B
ou NHBE ont t exposes 24 heures 10 g/cm2 de diffrents lots de PM2.5: Auteuil-hiver (AW), Auteuilt (AS), Vitry-hiver (VW) ou Vitry-t (VS) ; le H2O2 a t utilis 500M comme contrle positif
dapoptose. Les cellules ont t analyses par cytomtrie en flux et le pourcentage dapoptose a t
dtermin par des marquages du potentiel transmembranaire mitochondrial (m) avec le DiOC6(3) et
de la permabilisation de la membrane plasmique avec lIP. (*traits vs contrle, p<0,05, n=3). B) Effet
dose des PM2.5-AW dans les cellules 16HBE. Les cellules 16HBE ont t exposes 24h aux PM 2.5-AW de 1
50 g/cm2 ou au H2O2 (500M, pour contrle positif), et quatre critres de lapoptose ont t mesurs en
cytomtrie en flux par diffrents fluorochromes: le DiOC6(3) pour mesurer la chute du m,
lhydrothidine (HE) pour la mesure de lanion superoxyde, l'Annexine V-FITC pour marquer l'exposition
de phosphatidylsrine, et l'iodure de propidium (IP ou PI) a t utilis comme un indicateur de la
permabilisation de la membrane plasmique. C) Etude cintique de l'effet PM2.5-AW sur l'apoptose dans
les cellules 16HBE. Les cellules ont t exposes aux PM 2.5-AW (de 1 50 g/cm2) ou H2O2 (500 M)
pendant 48 h ou 72h avant l'analyse par cytomtrie en flux. Les rsultats sont reprsentatifs de trois
expriences indpendantes. Daprs Ferecatu et al. 2010 (Annexe 1).

III.2.1.ii) Les particules parisiennes Trafic (TR) G, F et UF de 2010

Les rsultats prcdents montrent que des PM2.5 parisiennes ne sont pas cytotoxiques
pour les cellules pithliales bronchiques humaines. Cela est-il li une taille des particules ?
Des particules plus grosses ou plus petites induiraient-elles lapoptose ?

85

Afin dapprhender le paramtre de taille des PM, nous avons analys les particules TR5,
TR6 et TR7 de 2010 pour les trois classes de taille (G, F et UF). Parmi ces 3 chantillons, il sest
avr que TR6 avait un impact diffrent des particules TR5 et TR7. Nous avons donc fait la
moyenne des rsultats obtenus pour TR5 et TR7, et les rsultats de TR6 ont t analyss
sparment (Figure III.2). Aprs 24h dexposition, les particules TR5 et TR7 des 3 classes de
taille ninduisent pas daugmentation de lapoptose des cellules 16HBE. Cependant, une
augmentation modre de lapoptose semble apparatre lorsque les cellules sont exposes aux
TR6 G et UF pour les doses de 5 et 1 g/cm, respectivement.
Ainsi, les particules TR5 et TR7 de 2010 ne semblent pas cytotoxiques pour les cellules
16HBE quelle que soit leur taille, alors que le lot TR6 pourrait induire lapoptose en
relation avec la taille et la dose des particules.

Figure III.2 : Effet de l'exposition aux particules TR sur les cellules 16HBE. Les cellules 16HBE ont t
exposes 24h aux PM grossires (G), fines (G) et ultrafines (UF) aux concentrations de 1, 5 et 10 g/cm
avant la quantification de lapoptose par cytomtrie en flux des cellules prsentant simultanment une
dpolarisation mitochondriale (DiOC(6)3 low) et une permabilisation de la membrane plasmique (PI
high). Le H2O2 (1mM) a t utilis comme control positif. (*traits vs contrle, p<0.001, n=4 pour TR5-7
et n=2 pour TR6 sans test statistique).

III.2.1.iii) Les particules parisiennes Biomasse (WB) G, F et UF de 2010

Afin de comprendre si la composition chimique des particules tait un paramtre
impliqu dans la cytotoxicit des PM, nous avons tudi les particules parisiennes WB dont les
sources identifies sont le chauffage au bois en plus du trafic automobile et de la pollution de
fond.
Du fait des quantits trs limites en particules qui ont t prleves (PG=1.8 g/m 3,
PF=14.4 g/m3 et PUF=1.8 g/m3 en moyenne pour WB1 et WB3), nous navons pu faire que 2
rplicats pour chaque source et donc choisi de prsenter ici la moyenne des rsultats obtenus
pour WB1 et WB3 (note WB). Comme illustr sur la figure III.3, les diffrentes classes de
particules provenant du site biomasse WB ninduisent pas lapoptose des cellules 16HBE jusqu
une concentration de 10 g/cm. Ceci est en accord avec les rsultats prcdents.

86

En consquence, les particules WB de 2010 ne semblent pas cytotoxiques pour les cellules
16HBE quelle que soit leur taille.

Figure III.3: Effet de l'exposition aux particules WB. Les cellules 16HBE ont t exposes 24h aux PM
grossires (G), fines (G) et ultrafines (UF) aux concentrations de 1, 5 et 10 g/cm avant la quantification
de lapoptose par cytomtrie en flux des cellules prsentant simultanment une dpolarisation
mitochondriale (DiOC(6)3 low) et une permabilisation de la membrane plasmique (PI high). Le H 2O2
(750 M) a t utilis comme control positif. (*traits vs contrle, p<0.001, n=4).

III.2.1.iv) Les particules Biomasse G, F et UF de Ouagadougou (OB)

La divergence des rsultats prcdents obtenus avec des particules ayant des sources
identifies proches (TR6 vs. les autres lots de PM parisiennes) interroge sur le rle exact de la
composition chimique des PM dans leurs effets sur lapoptose. Afin de mieux apprhender le rle
des composs particulaires, nous avons tir avantage de laccs aux PM africaines prleves
Ouagadougou et donc issues de sources trs contrastes par rapport aux PM parisiennes de
2003 et 2010. En effet, lintrt dtudier cette ville africaine sub-saharienne rside dans des
concentrations en particules trs fortes (prs de 10 fois les niveaux parisiens) avec une
multitude de sources potentiellement toxiques (cuisson au bois, trafic de deux roues et parc
automobile ancien, brlage des dchets, remise en suspension des routes non goudronnes,
proximit du dsert, etc.).
Les rsultats montrent que les particules Biomasse de Ouagadougou, prleves le soir
(OB3, Figure III.4) naltrent pas lapoptose spontane des cellules 16HBE quel que soit la taille
des PM. A linverse, les particules prleves au mme endroit mais le matin (OB4) induisent une
augmentation du taux apoptotique des cellules 16HBE de manire dose-dpendante pour les
particules grossires et 1 et 5g/cm pour les fines. Ceci pourrait sexpliquer par le brlage des
ordures qui intervient spcifiquement le matin et diffrencie donc les lots OB3 et OB4.
En plus de la taille et de la concentration, la temporalit des prlvements et donc la
composition chimique des PM semble tre un paramtre rgulant linduction de
lapoptose des cellules bronchiques humaines.

87

Figure III.4 : Effet de l'exposition aux particules OB. Les cellules 16HBE ont t exposes 24h aux PM
grossires (G), fines (G) et ultrafines (UF) aux concentrations de 1, 5 et 10 g/cm avant la quantification
de lapoptose par cytomtrie en flux des cellules prsentant simultanment une dpolarisation
mitochondriale (DiOC(6)3 low) et une permabilisation de la membrane plasmique (PI high). Le H2O2
(750 M) a t utilis comme control positif. (*traits vs contrle, p<0.05, n=4).

III.2.1.v) Les particules Photochimie G, F et UF de Ouagadougou (OP)

La pollution photochimique ou pollution photo-oxydante, rsulte de la transformation de
polluants primaires par les rayonnements ultra-violets solaires. Cette pollution atmosphrique
est riche en composs oxyds et espces oxydantes (voir Figure I.20) tels que lozone et lanion
superoxyde (CITEPA 2013). Il est donc particulirement intressant dtudier les proprits des
particules issues de la photochimie.
Ltude par cytomtrie en flux montre que les particules UF OP5 semblent induire une
faible augmentation de lapoptose 10 g/cm (Figure III.5). Tandis que les particules OP6
augmenteraient modrment lapoptose des cellules 16HBE pour des concentrations plus faibles
(1 et 5 g/cm) et pour des particules plus grosses (G).
Comme prcdemment, la temporalit des prlvements et donc la composition chimique
des PM semble tre un paramtre rgulant linduction de lapoptose.

88

Apoptose (% )

100
80
60
40

Co
1 g/cm
5 g/cm
10 g/cm

30
20
10
0

OP5 G

OP5 F OP5 UF OP6 G

OP6 F OP6 UF H2O2

Figure III.5 : Effet de l'exposition aux particules OP. Les cellules 16HBE ont t exposes 24h aux PM
grossires (G), fines (G) et ultrafines (UF) aux concentrations de 1, 5 et 10 g/cm avant la quantification
de lapoptose par cytomtrie en flux des cellules prsentant simultanment une dpolarisation
mitochondriale (DiOC(6)3 low) et une permabilisation de la membrane plasmique (PI high). Le H 2O2
(750 M) a t utilis comme control positif. (*traits vs contrle, p<0.001, n=3 pour H2O2 et n=2 pour
OP5 et OP6).

III.2.1.vi) Rsultats complmentaires & Discussion

Cette partie de ltude nous a permis de dmontrer que les particules PM2.5 prleves en
2003 ninduisent pas lapoptose des cellules 16HBE (Figure III.1). Ltude des particules de
diffrentes classes de tailles na pas perms dtablir de lien entre la taille des particules et leur
cytotoxicit modre (Figure III.2, III.4 et III.5), qui serait plutt en relation avec les lieux et la
temporalit des prlvements (Figures III.4 et III.5) et donc avec la composition chimique des
PM. En effet, des particules de mme classe de taille, prleves soit Paris soit Ouagadougou
ont des effets diffrents sur lapoptose des cellules 16HBE : TR6 vs TR5-7, OB4 vs OB3, OP5 vs
OP6.
Cependant, les rsultats obtenus avec les particules de Ouagadougou sont interprter
avec prudence du fait des nombreux problmes qui ont surgi avec ces PM aussi bien pour leur
analyse chimique que biologique. En effet, lors des prlvements, une quantit importante de
poussires crustales sont venues contaminer les tages des impacteurs et ont enrichi de manire
artfactuelle les fractions F et UF. Ceci sest traduit visuellement par une coloration diffrente
des arosols suivant leur classe de taille (Figure III.6):
En rsum, la taille, la dose et la composition chimique des PM constituent des
paramtres qui conditionnent possiblement linduction de lapoptose.

89

Figure III.6 : Composition chimique des particules OB3. A) Coloration diffrente

des arosols suivant leur classe de taille : une couleur brune dans le mode G
(PM10) pour la dominance de la resuspension locale des PM (routes), une couleur
orangetre dans le mode F (PM1) pour le transport longue distance de
poussires sahariennes et , et une couleur gristre pour le mode UF (PM0.2) pour
larosol de combustion produit par lagglomration. B) Analyse chimique.

Afin davoir une meilleure interprtation des rsultats obtenus, il est ncessaire de les
comparer avec les autres expriences ralises lors du projet MEGATOX.

Autres tests de cytotoxicit

En parallle, le laboratoire de toxicologie de lInstitut Pasteur de Lille (IPL) a ralis

dautres tests de viabilit sur le mme type cellulaire : un test au bleu Trypan, un colorant qui est
exclu activement des cellules vivantes et permet donc de les discriminer des cellules mortes ou
mourantes ; un test des halos qui utilise un gradient de solvant et une coloration au bromure
dthidium permetant de distinguer les cellules vivantes, ncrotiques, ou apoptotiques ; ainsi
quun un test des comtes (ou Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) permettant de dtecter et
quantifier des lsions primaires de lADN, par lectrophorse.
Les rsultats du test comte nont pas montr deffets gnotoxiques des particules
prleves Paris et Ouagadougou en 2009-2010, de mme que le test au bleu Trypan et le test
des halos nont montr aucune cytotoxicit pour ces particules, except des phnomnes de
ncrose causs par les particules OB3 UF et OB4 G 10 g/cm. Ces rsultats sont concordants
avec nos rsultats obtenus par cytomtrie en flux sur les paramtres de chute du potentiel
transmembranaire mitochondrial et de permabilisation de la membrane plasmique (Figure
III.4 A).

Etude de lexpression des gnes pro-inflammatoires

L'absence ou linduction modre dapoptose dans les cellules 16HBE ne signifie pas que

les particules tudies ici ne modifient pas l'tat des cellules bronchiques, comme lexpression
des cytokines pro-inflammatoires. Depuis de nombreuses annes, notre laboratoire sintresse
lexpression des gnes de linflammation et du mtabolisme des xnobiotiques et il a t montr
prcdemment que les PM-AW, -AS, -VW et VS induisent notamment la scrtion de
lAmphirguline (AR) et du GM-CSF ( Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor )
aprs 24 heures dexposition (Figure III.7).

90

Induction of secretion

5
4
3
2
1

Co.
AW
AS
VW
VS

*
*

* *

*
*

AR 4h
AR 24h
GM-CSF 4h GM-CSF 24h
Figure III.7: Potentiel pro-inflammatoire de diffrents lots de PM2,5 (AW, AS, VW et VS). Aprs 4 ou
24 heures dexposition 10 g/cm2 de particules, la scrtion de lAmphirguline (AR) et du GM-CSF a t
value par ELISA. (*traits vs contrle, p<0.001, n=3). Daprs Ferecatu et al. 2010 (Annexe 1).

Concernant les PM de 2010, une tude approfondie de lAR, du GM-CSF, de lIL-6

(Interleukine 6), du CYP1A1 (cytochrome P450 1A1), de NQO-1 (NADPH Quinone
Oxydorductase 1) et HO1 (Hme Oxygnase 1) a t ralise par le Dr Laura Boublil via RTqPCR (Figure III.8). Aprs une exposition des cellules 16HBE avec 10g/cm de particules
pendant 24h, les ARNm des gnes de linflammation et du mtabolisme des xnobiotiques ont
t quantifis. Les reprsentations en radars confirment que la fraction grossire est celle ayant
le moins deffets sur lexpression gntique quel que soit le biomarqueur considr
comparativement aux PM F et UF. Par ailleurs, les fractions fines TR7 et WB1 semble tre trs
ractives et induire une surexpression de quatre gnes tudis (IL-6, NQO1, CYP1A et AR,). Pour
la fraction UF, ce sont les PM WB3, TR6 et TR7 qui semblent les plus ractives avec une
surexpression des gnes de lIL-6, NQO-1, AR, et GM-CSF (Figure III.7 A).

Figure III.8: Reprsentation, en radars, des effets des PM sur lexpression des gnes de
linflammation. Les cellules 16HBE ont t traites pendant 24h avec 10g/cm de PM prleves Paris
en 2009-2010. Lexpression des ARNm des gnes du GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony
Stimulating Factor), de lIL-6 (Interleukine 6), du CYP1A1 (cytochrome P450 1A1), de lAR
(Amphirguline), de NQO-1 (NADPH Quinone Oxydorductase 1) et de HO1 (Hme Oxygnase 1) ont t
mesur par RT-qPCR et normaliss en affectant 1 la plus forte induction.

Ces modifications de lexpression gntique concordent avec les rsultats trouvs dans la
littrature. En effet, il a t largement dmontr que les particules atmosphriques induisent

91

laugmentation de lexpression des gnes du mtabolisme des xnobiotiques et du stress

oxydant tels que le CYP 1A1, HO1 et NQO1, ainsi que les gnes de linflammation tels que lAR, le
GM-CSF et lIL-6 (Abbas et al. 2009; Baulig et al. 2009; Aung et al. 2011; Danielsen et al. 2011;
Diabate et al. 2011; Dergham et al. 2012). Lexpression de ces gnes traduit de la mise en place
dun mcanisme de dfense physiologique et cellulaire contre ces toxiques, mais nest pas
obligatoirement li une cytotoxicit conduisant laltration ou la mort des cellules. Ainsi, ces
rsultats ne sont pas en dsaccord mais sont complmentaires de ceux obtenus sur lapoptose.

III.2.2) Etude de linhibition de lapoptose

III.2.2.i) Rle de la taille
L'absence de cytotoxicit des PM2.5 de 2003 ne veut pas dire que ces particules ne
modifient pas l'tat des cellules bronchiques, par exemple leur facult mourir par apoptose.
Nous avons donc tudi la capacit des PM rduire lapoptose induite par diverses molcules.
Pour cela, les cellules ont t exposes pendant 4h aux PM seules, puis 20h additionnelles en
prsence dun inducteur dapoptose tel que lionophore calcique A23187 (A23). Ainsi, les PM2.5AW semblent avoir un effet anti-apoptotique sur les cellules pithliales bronchiques humaines
alors que les PM2.5-VS restent sans effet (Figure III.9).
Concernant les particules prleves en 2009-2010, leffet anti-apoptotique na pu tre
tudi que pour les PM TR5 et OB3 et uniquement pour les fractions G et F par manque de
particules collectes. Nanmoins, la figure III.9 montre que les particules parisiennes (TR5) et
africaines (OB3), grossires et fines, nont pas leffet anti-apoptotique dmontr pour les PM2.5AW (Figure III.9) bien que lon puisse noter une lgre diminution dans le cas de TR5 F. Sachant
que les PM2.5 comprnent toutes les particules prleves inferieures 2,5 m et que les
particules fines (F) sont comprisent entre 2,5 et 0,25 m (voir II.2.3), ils serait necessaire
deffectuer dautres prlvments afin de statuer sur le rle de la taille dans leffet anti-apoptique
des PM.
Figure III.9 : Effet anti-apoptotique de
particules de diffrentes tailles. Les
cellules 16HBE ont t exposes 4h aux
diffrentes PM avant lajout de linducteur
dapoptose A23187(A23) pendant 20h
supplmentaires. Le pourcentage de cellules
apoptotiques a t dtermin en cytomtrie
en flux par un double marquage au DiOC6(3)
et IP) mesurant respectivement la chute du
m et la permabilisation de la membrane
plasmique. Les rsultats sont la moyenne de
trois expriences distinctes (pour les PM-AW
et VS et les tmoins (Co) ou de deux rpliquas
(pour les PM TR5 et OB3). * trait vs. control
(p<0,05, n=3). Daprs Ferecatu et al. 2010.

92

III.2.2.ii) Rle de la composition chimique

Afin de dterminer le rle de la composition chimique des particules dans leur effet antiapoptotique, les cellules 16HBE ont t exposes 4 heures aux quatre lots de particules de 2003
(PM-AW, -AS, -VW et -VS), ainsi quaux extraits organiques (Oex) ou aqueux (Aex) des PM-AW,
aux PM-AW laves (wash, dpourvues des composs hydrosolubles), ou des particules de noir
de carbone (CB, mimant le cur carbon, voir Figure I.6 ). Lapoptose a ensuite t induite
pendant 20h supplmentaires avec lA23187 puis quantifie par cytomtrie en flux aux regards
des paramtres de chute du m (DiOC(6)3 low) et de production de lanion superoxyde (HE->
Eth high). La Figure III.10 montre que parmi les quatre lots prlevs en 2003, les PM-AW, -AS et
-VW rduisent denviron 40% lapoptose induite par lA23187 (A23). A linverse, les PM-VS
restent sans effet, suggrant que la composition chimique des particules, qui varie entre ces
diffrents lots, pourrait tre un paramtre dterminant.
Les rsultats montrent que lextrait organique, comme lextrait aqueux et les PM-AW
laves, miment partiellement leffet anti-apoptotique des PM-AW entires (Figure III.10) ; au
contraire du CB qui na aucun effet anti-apoptotique.
Ainsi, la composition chimique semble tre un paramtre cl impliqu dans leffet antiapoptotique des particules, en particulier les composs organiques et hydrosolubles.

Figure III.10: Effet anti-apoptotique des diffrents composs particulaires. Les cellules 16HBE ont
t prtraites 4h par 10g/cm de PM2.5 (-AW, -AS, -VW, -VS), ou la concentration quivalente dextrait
organique (Oex, 4,27mg/ml) ou aqueux (Aex) des PM-AW, ou aux particules PM-AW laves (wash,
10g/cm), ou au noir de carbone (CB, 10g/cm), avant une exposition de 20h supplmentaires
linducteur dapoptose A23187 (3M). Le pourcentage de cellules apoptotiques a t dtermin en
cytomtrie en flux par un double marquage au DiOC6(3) et HE. Co : Contrle. * trait vs. control (p<0,05,
n=3). Daprs Ferecatu et al. 2010, (Annexe 1).

III.2.2.iii) Rle des composs organiques

Puisque les composs organiques des PM semblent impliqus dans leur effet antiapoptotique, nous nous sommes particulirement intresss aux hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAP) (Tableau III.1). Lanalyse chimique des PM montre que les particules antiapoptotiques (cest--dire PM-AW, -AS et-VW) possdent une quantit totale de HAP trs

93

suprieure aux particules non anti-apoptotiques (PM-VS), laissant supposer que les HAP
pourraient participer leffet anti-apoptotique. Un constat identique peut-tre fait concernant
les HAP de plus de 3 cycles benzniques mais pas propos des HAP de 2 et 3 cycles.
Tableau III.1: Composition en HAP des PM de 2003. Daprs Baulig et al. 2004.
HAP (g/g)
PM-AW
PM-AS
PM-VW
PM-VS
Total
210.2
84.7
88.3
34.7
HAP lgers (2-3 cycles)

32.8

9.4

11.6

10.1

Phnanthrne

7.8

5.4

2.5

3.0

Fluoranthne

16.9

8.9

4.8

3.6

HAP lourds (> 3 cycles)

177.4

75.3

76.7

24.6

Benzo(b)fluoranthrne

21.4

13.4

14.6

3.4

Benzo(k)fluoranthrne

7.8

2.7

5.4

1.1

Benzo(a)pyrne

17.0

3.5

5.3

1.1

Dibenzo(a,h)anthracne

2.4

1.9

11.9

0.4

Benzo(g,h,i)prylne

30.6

11.4

13.3

3.8

Benzo(g,h,i)prylne

30.6

11.4

13.3

3.8

Indno-pyrne

15.0

4.0

7.3

2.1

Afin de vrifier cette supposition, des essais dassociation linaire entre linhibition de
lapoptose (dau moins 40%) et la composition en HAP des diffrents lots de particules ont t
raliss

(Figure III.11). Les

reprsentations graphiques

obtenues

confirment

que,

contrairement aux HAP lgers, les HAP lourds (ayant plus de 3 cycles benzniques) semblent
impliqus dans leffet anti-apoptotiques des PM. De plus, cette tude, bien que quelque peu
spculative, suggre que linhibition de lapoptose pourrait requrir une concentration minimale
en HAP totaux dau moins 52 g/g de particules.

94

B
80

VW

60

AS

VS

20

52
0

100

Inhibition of specific
apoptosis (% )

AW

40

R=0.3425

50

100

Inhibition of specific
apoptosis (% )

Inhibition of specific
apoptosis (% )

100

250

AS

60

VW
AW

40
20
0

100
150
200
Total PAH (g/g)

R=0.09719

80

VS
0

10
20
30
2-3 cycles PAH (g/g)

40

R=0.3890

80
VW

60

AS

AW

40
20
0

VS
0

46
50
100
150
>3 cycles PAH (g/g)

200

Figure III.11 : Corrlation entre la composition des PM en HAP totaux (A), lgers (B) ou lourds (C), et
linhibition de lapoptose. La concentration minimale en HAP pour obtenir une inhibition de lapoptose
dau moins 40% a t dtermine (en rouge) daprs la droite de rgression linaire.

Afin de valider limplication des HAP lourds dans leffet cytoprotecteur des PM, les
cellules 16HBE ont t exposes pendant 4h diffrents HAP (Tableau III.2). En accord avec les
rsultats prcdents, nous avons montr que seuls les HAP particulaires (de cinq cycles
benzniques ou plus) ont des proprits anti-apoptotiques (Ferecatu et al. 2010, Annexe 1). En
particulier, le Benzo(a)pyrne (BaP) est celui qui permet la plus grande inhibition de lapoptose
induite par A23187, avec un effet proche de celui observ avec les PM-AW entires (Andreau et
al. 2012).
Les HAP particulaires plus de 5 noyaux benzniques participent leffet antiapoptotique des PM, en particulier le BaP, et une concentration minimale semble requise.

95

Tableau III.2: Leffet anti-apoptotique des diffrents des PM-AW est li aux HAP ayant cinq cycles
benzniques ou plus. Les cellules 16HBE ont t prtraites pendant 4h avec diffrents HAP aux
concentrations quivalentes 10 g/cm (50 g/ml) de PM-AW avant l'induction de l'apoptose par
A23187 (3 M) pendant 20h supplmentaires. Les rsultats sont la moyenne SD (n=6). La significativit
a t calcule par le test de Dunnett (*trait vs solvant cyclohexane 1%, p <0,01). A noter que lapoptose
induite par A23 seul provoque une chute du m (DiOC -) et une permabilisation de la membrane
plasmique (PI +) de 93.00 3.31% et 96,97 7,18%, respectivement. En outre, lexposition aux PM-AW
(10 g/cm) induit en moyenne une diminution de lapoptose induite par A23 de 64.33 9.89 % (DiOC
low) et de 39.45 8.50 % (PI high). Daprs Andreau et al. 2012(Annexe 2).

HAP

Structure

Apoptose induite par A23

(% du contrle)
DiOC PI +

Phnanthrne

88.96 5.00

94.43 6.33

Fluoranthne

86.22 7.13

87.37 10.79

Benzo[b]fluoranthrne

91.17 3.62

99.17 8.41

Benzo[k]fluoranthrne

96.41 6.56

104.09 11.45

Benzo[a]pyrne

70.27 5.60*

34.55 3.68*

Dibenzo[a,h]anthracne

80.69 1.26*

80.10 5.37*

Benzo[g,h,i]prylne

75.49 2.94*

75.91 3.31*

Indno[1,2,3-cd]pyrne

79.38 4.43*

80.24 10.38*

III.2.2.iv) Rle des composs mtalliques

Cette tude constitue la premire partie dune publication soumise (voir Chapitre IV) et
ne seront rappels ici que les principaux rsultats prsents dans larticle :
Urban fine PM and their metallic compounds protect human bronchial epithelial cells from
apoptosis: Role of Nrf2
Melanie Lovera-Leroux, Belinda Crobeddu, Nadim Kassis, Armelle Baeza-Squiban
and Karine Andreau

96

En plus des composs organiques tels que les HAP particulaires, les rsultats prcdents
semblent galement impliquer les composs hydrosolubles dans leffet anti-apoptotique des PM
(voir Figure III.10). Parmi les composs hydrosolubles, nous nous sommes intresss au rle
des composs mtalliques. De manire prliminaire, des essais dassociation linaire entre
linhibition de lapoptose (dau moins 40%) et la composition mtallique des diffrents lots de
particules ont t raliss (Figure III.12). Les reprsentations graphiques obtenues suggrent
quune concentration maximale en mtaux (<147 mg/g de PM) serait ncessaire
ltablissement de leffet anti-apoptotique et ceci en lien avec les mtaux de transition (< 21.5
mg/g), alcalins et alcalino-terreux (< 123 mg/g), mais indpendamment des mtaux lourds.

80

AW

AS

40
20

100

Inhibition of specific
apoptosis (% )

VW

60

147
0

50

VS

100
150
200
Total metals (mg/g)

250

D
VW
AW AS

40
20
0

123

R=0.9174

80

VW

60

VS

AW

20

100

21.5

60

VS

20
25
Transition metals (mg/g)

30

R=0.08116

80

VW

AS

AW

40
20
0
0.4

0
50
100
150
200
Alkali and Alkaline Earth metals (mg/g)

AS

40

0
15

R=0.7112

80
60

100

R=0.7377

Inhibition of specific
apoptosis (% )

Inhibition of specific
apoptosis (% )

100

Inhibition of specific
apoptosis (% )

VS
0.5
0.6
0.7
0.8
Heavy metals (mg/g)

0.9

Figure III.12: Corrlation entre la composition des PM en mtaux totaux (A), de transition (B),
alcalino-terreux (C), et lourds (D), et linhibition de lapoptose. La concentration maximale en metaux
pour obtenir une inhibition de lapoptose dau moins 40% a t dtermine (en rouge) daprs la droite de
rgression linaire.

Afin didentifier les mtaux de transition ou alcalino-terreux qui seraient impliquer dans
leffet cytoprotecteur des PM, les cellules 16HBE ont t exposes 4h diffrents mtaux sous
forme ionique, la concentration quivalente 10 g/cm de PM-AW ou de PM-VS (pour rappel
Tableau II.4, ci-dessous), puis lapoptose a t induite avec lA23187 pendant 20h
supplmentaires. Les huit mtaux tests sont : quatre mtaux de transition (Cu, Fe, Mn et Zn), un
mtal post-transition (Al), deux mtaux alcalino-terreux (Ca et Mg), et un mtal lourd (Pb).

97

Pour rappel : Tableau II.4 : Composs mtalliques des PM de 2003 et doses utiliss dans les
expriences.
Mtaux
PM-AW (mg/g)

Total

Cu

Fe

Mn

Zn

Al

Ca

Mg

Pb

67.36

0.86

13.20

0.16

1.50

3.40

19.50

1.60

0.25

43

660

75

170

975

80

12.5

1.23

26.3

0.37

1.7

10.5

36.2

3.6

0.42

61.5

1315

ND

85

525

ND

ND

ND

0.37

13.5

0.42

1.3

10.4

59.6

4.3

0.52

18.5

675

ND

65

520

ND

ND

ND

0.40

21.6

0.54

1.30

20.40

110.6

6.7

0.43

Dose utilise dans

les expriences
(ng/ml)b
PM-AS (mg/g)c

106.68

Dose utilise dans

les expriences
(ng/ml)b
PM-VW (mg/g)d

120.29

Dose utilise dans

les expriences
(ng/ml)b
PM-VS (mg/g)a

193.26

Dose utilise dans

les expriences
20
1080
27
65
1020
5530
335
(ng/ml)b
a Daprs Baulig et al. 2004 , b quivalent 10 g/cm ou 50 g/ml de PM , c Daprs Rumelhard et al. 2007a,
d
Daprs Rumelhard et al. 2007b , ND: pas de donnes.

21.5

Brivement, les rsultats montrent que sept des huit mtaux tests (Cu, Fe, Mn, Al, Ca, Mg
et Pb) ont un effet protecteur contre lapoptose induite par A23187 lorsquils sont utiliss la
concentration trouve dans 10 g/cm des particules anti-apoptotiques PM-AW (Figure III.13).
Inversement, ces mmes mtaux nont pas deffet protecteur lorsquils sont utiliss la
concentration trouve dans 10 g/cm des particules non-anti-apoptotiques PM-VS, except
dans le cas du Mg(II) et du Pb(II). Contrairement aux mtaux cits prcdemment, le Zn(II) na
pas deffet protecteur la concentration trouve dans 10 g/cm de PM-AW, ceci en relation
avec la quantit similaire retrouve adsorbe sur les PM-AW et les PM-VS (voir Tableau II.4 cidessus). La concentration en mtaux semble donc jouer un rle primordial dans leffet antiapoptotique des PM.

98

Specific apoptosis (% )

100
80

PM-AW
PM-VS

60
40

*
*

20

*
* *

0
Medium PM

Cu(II) Fe(II) Fe(III) Mn(II) Zn(II) Al(III) Ca(II) Mg(II) Pb(II) H2 O2

A23187

Figure III.13: Effet anti-apoptotique des composs mtalliques des PM. Les cellules 16HBE ont t
exposes pendant 4h aux mtaux Al(III), Cu(II), Fe(II), Fe(III), Zn(II), Ca(II), Mg(II), Mn(II) et Pb(II) aux
concentrations trouves dans 10 g/cm (soit 50 g/ml) des particules PM-AW (anti-apoptotiques) ou
PM-VS (non anti-apoptotiques), puis lapoptose a t induite par le A23 (3 M) pendant 20h
supplmentaires. Linhibition spcifique de lapoptose induite par A23 a t dtermine par cytomtrie en
flux grce un double marquage : au DiOC6(3) pour la chute du potentiel transmembranaire
mitochondrial et au HE pour la production danion superoxyde. Les rsultats sont la moyenne SEM de
quatre expriences distinctes. * trait vs. control A23 seul (p<0.05), $ mtaux vs. PM (p<0.001).

Limplication du fer a t analyse grce lutilisation du chlateur de fer, dfroxamine

(DFO, 200 M). Bien que ce compos augmente lapoptose induite par A23187 denviron 23%, il
prvient leffet anti-apoptotique confr par les PM-AW entires ou par Fe(II) (Figure III.14 A).
Ces rsultats suggrent que les composs ferreux contribuent activement leffet antiapoptotique des PM.
Par la suite, nous avons concentr nos recherches sur le fer, pour lequel la diffrence de
concentration entre les lots PM-AW et PM-VS est suffisamment importante (Tableau II.4). Nous
avons ralis un effet-dose du Fe(II) sur l'inhibition de l'apoptose induite par A23187 afin de
dterminer la quantit de Fe(II) capable de mimer l'effet anti-apoptotique des particules
entires (Figure III.14 B). Ainsi, le fer inhibe significativement lapoptose induite par A23187
pour des concentrations comprises entre 500 et 750 ng/ml, avec un effet maximal observ pour
la concentration en Fe(II) quivalente 10 g/ml de PM-AW. A contrario, la concentration en
Fe(II) quivalente 10 g/ml de PM-VS na aucun effet protecteur ce qui confirme notre
hypothse concernant le rle prpondrant de la concentration en composs mtalliques dans
leffet anti-apoptotique des PM.
Les composs mtalliques (dont le fer) sont impliqus dans leffet anti-apoptotique des
PM; et une concentration maximale semble requise.

99

Figure III.14 : Effet antiapoptotique

des
composs
None
ferreux des PM. (A) Effet de la
DFO
dfroxamine. Les cellules 16HBE
80
*
*#
ont t incubes en prsence ou en
absence de dfroxamine (DFO,
60

200 M) pendant 4 heures en

40
mme temps que lexposition aux
*
*
PM-AW (10 g/cm) ou Fe(II) (660
20
ng/ml, qsp 10 g/cm de PM-AW)
suivie par l'induction de l'apoptose
0
par A23187 (3 M) pendant 20
Medium
PM-AW
Fe(II)
heures
supplmentaires.
A23187
L'apoptose spcifique a t
B
dtermine par cytomtrie en flux
100
pour les paramtres de la chute
dum (DiOC6(3)) et de la
80
permabilisation de la membrane
plasmique (IP). Les rsultats sont
60
PM-AW
des moyennes SEM (n = 4). *
**
p<0.05 vs A23187 seul, p<0.01 vs
40
*
A23187+DFO et # p<0.5 vs A23187
PM-VS
*
+ PM-AW+DFO. B) tude effet-dose
20
de l'effet anti-apoptotique de Fe
(II). Les cellules 16HBE ont t
0
0
250
500
750
1000
1250
exposes 4 heures au Fe (II)
Fe(II) (ng/ml)
diffrentes doses (0 1250 ng/ml)
avant l'induction de l'apoptose par
A23187 (3M). Les concentrations de Fe (II) absorbes sur 10 g/cm de PM-AW (anti-apoptotique) et
PM-VS (non-anti-apoptotique) sont mises en vidence par des flches. L'inhibition de l'apoptose
spcifique a t mesure par cytomtrie en flux par un double marquage au DiOC6(3) et lIP. Les
donnes sont la moyenne SEM de 3 expriences diffrentes * trait vs. A23187 seul, p <0.01. (voir
Article chapitre IV)

Inhibition of specific apoptosis (%)

Specific apoptosis (%)

100

III.2.2.v) Discussion
Bien que le rle du paramtre de taille des PM doit encore tre approfondit, nous avons
montr que la composition des PM joue un rle primordial dans leur leffet anti-apoptotique,
plus spcifiquement les HAP particulaires (Tableau III.2) et certains mtaux, tels que des
mtaux de transition (Cu, Fe, Mn, Fe) ou post-transition (Al), des mtaux alcalino-terreux (Ca et
Mg) ou un mtal lourd (Pb) (Figure III.13).
Des tests de corrlations entre la composition chimique et linhibition de lapoptose par
les diffrentes PM, ont permis de faire lhypothse que leffet anti-apoptotique des PM pourrait
tre conditionn par une concentration minimale en HAP lourds adsorbs sur les PM (46 g/g,
Figure III.11 C) mais galement par une concentration maximale en mtaux de transition (21.5
mg/g, Figure III.12 B) et alcalins/alcalino-terreux (123 mg/g, Figure III.12 C). En accord avec
ces analyses de corrlation, nous avons montr que 3 mtaux de transition (Cu, Fe et Mn), un
mtal post-transition (Al) et un mtal alcalino-terreux (Ca) prsentent un effet cytoprotecteur en
lien avec leur concentration spcifique dans les PM-AW anti-apoptotiques (Figure III.13).

100

Jusqu aujourdhui, de nombreuses tudes ont mis en vidence la toxicit des particules
atmosphriques via linduction de la mort cellulaire, dun stress oxydant, et dune rponse proinflammatoire (Upadhyay et al. 2003; Agopyan et al. 2004; Dagher et al. 2006; Zhang et al. 2007;
Chuang et al. 2013). Nanmoins, plusieurs tudes ont rapport les effets cytoprotecteurs des
composs organiques de PM comme les HAP (Teranishi et al. 2010) ou de leur mtabolites
(Burdick et al. 2006; Hung et al. 2007; Teranishi et al. 2010), la 2,3,7,8-ttrachlorodibenzo-pdioxine (TCDD) (Chopra et al. 2009), des PCB non-dioxine (Al-Anati et al. 2010), ou les particules
Diesel (Bayram et al. 2006). Les mcanismes exacts ne sont pas entirement compris, mais des
tudes in vitro ont montr la ncessit des synthses protiques (Chopra et al. 2010) dont
laugmentation des protines IAP1, IAP2 et Survivine associe la diminution de XIAP et
Caspase-3 (Hung et al. 2007), la modulation de la protine p53 (Al-Anati et al. 2010; Mukherjee et
al. 2011), et l'activation du rcepteur Ah (Ferecatu et al. 2010). De plus, nos rsultats montrent
que le BaP mime le plus efficacement leffet anti-apoptotique des PM-AW en accord avec les
travaux montrant que son mtabolite BPDE (anti-7,8-dihydrodiol-9,10-poxy-benzo[a] pyrne)
est galement capable de supprimer l'apoptose des cellules pithliales mammaires (Burdick et
al. 2006).
De mme, bien que les mtaux et les HAP sont connus pour tre des composs chimiques
cytotoxiques (Manzl et al. 2004; van Grevenynghe et al. 2004; Gobe et al. 2010; Orrenius et al.
2011), quelques tudes suggraient que certains mtaux tels que le lithium (Luo 2010), le fer, le
cuivre (Wang, Q. et al. 2007; Yu, J.W. et al. 2010) et le zinc pouvaient avoir un effet
cytoprotecteur. Parmi les composs particulaires hydrosolubles, Zn est dj connu pour inhiber
l'apoptose et minimiser le stress oxydant (par exemple la peroxydation lipidique, Carter et al.
2002; Truong-Tran et al. 2001) par un processus qui stabilise directement les lipides et les
protines membranaires ou indirectement par le maintien des niveaux de glutathion (SzusterCiesielska et al. 2008). L'effet protecteur de Zn a galement t li linhibition de lactivation des
caspases -8, -9 et -3 (Hao et al. 2013). Cependant dans notre tude, Zn est le seul mtal dnu
d'effet anti-apoptotique, en opposition avec les publications montrant une protection contre
l'apoptose provoque par de nombreux inducteurs, probablement en raison de la faible
concentration utilise ici: environ 0,55 M tandis que l'effet cytoprotecteur du zinc a t signale
au-del de 10 M (An et al. 2005; Kontargiris et al. 2012).

101

III.3) CONCLUSION
Dans le cadre du projet MEGATOX, cette tude nous a permis, de montrer que la
cytotoxicit de certaines particules atmosphriques (TR6, OB4, OP5, OP6) pourrait tre lie la
taille mais galement la concentration des PM. Il ressort que les particules fines et ultrafines
sont plus ractives concernant linduction des cytokines pro-inflammatoires. Enfin, les rsultats
tant trs contrasts au sein des prlvements de mmes lieux, il est possible que la cytotoxicit
soit lie la composition des PM, mais, ce jour, les analyses chimiques des diffrents lots de
particules ne nous permettent pas dtablir un lien entre la composition de ces PM et leurs effets
cytotoxiques.
Dautre part, nous avons montr que les particules PM2.5 de 2003 ne sont pas
cytotoxiques mais au contraire ont un effet anti-apoptotique dans les cellules pithliales
bronchiques humaines. La composition chimique des particules semble tre un caractre
dterminant de leur effet anti-apoptotique puisquune concentration minimale en HAP lourds
ainsi quune concentration maximale en mtaux de transition et alcalins/alcalino-terreux
semblent requises.
A notre connaissance, ce travail est la premire tude prsentant des preuves que de
faibles concentrations de PM (10 g/cm) ont un effet anti-apoptotique sur les cellules
pithliales bronchiques humaines en lien avec leurs composants mtalliques et organiques
adsorbs en concentrations prcises.

102

IV. RSULTATS : MCANISMES MOLCULAIRES

IMPLIQUS DANS LEFFET ANTI-APOPTOTIQUE
DES PARTICULES

IV.1) Contexte de ltude ...................................................................................................................... 104

IV.2) Rle de la voie anti-oxydante Nrf2 dans le mcanisme anti-apoptotique induit par
les composs particulaires mtalliques ......................................................................................... 105
IV.2.1) Rsum ....................................................................................................................................105
IV.2.3) Article soumis........................................................................................................................ 106
IV.2.3) Rsultat supplmentaire & Discussion ........................................................................153
IV.3) Rsultats supplmentaires .......................................................................................................159
IV.2.1) Rle du calcium dans leffet anti-apoptotique ........................................................... 159
IV.2.2) Interaction particules / cytosquelette .........................................................................161
IV.2.2) Discussion ............................................................................................................................... 167
IV.4) Conclusion ......................................................................................................................................169

103

IV.1) CONTEXTE DE LETUDE

Les rsultats prcdents ont dmontr que les particules fines atmosphriques
parisiennes de 2003 ont un effet anti-apoptotique sur les cellules pithliales bronchiques
humaines. Cet effet cytoprotecteur est associ la composition chimique des PM, et en
particulier aux HAP particulaires de plus de 5 cycles benzniques ainsi quaux composs
mtalliques, notamment les mtaux de transition (voir Chapitre III).
Nous savons que certains HAP sont considrs comme des carcinognes certains (par
exemple le benzo(a)pyrne), carcinognes probables (comme le dibenzo(a,h)anthracne) ou
carcinognes possibles (tel que le benzo(k)Fluoranthne) pour lHomme. Pour mieux
comprendre le rle des HAP et des mtaux dans leffet anti-apoptotique, nous avons cherch les
mcanismes impliqus dans lacquisition de la rsistance lapoptose provoque par ces
composs. Dans une premire tude ralise au laboratoire, nous avions dmontr que les HAP
agissent via leur rcepteur spcifique le AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) pour induire leffet
anti-apoptotique, probablement en rgulant lexpression de certains gnes de rgulation de
lapoptose (Ferecatu et al. 2010, Annexe 1).
De plus, les nombreux mtaux absorbs sur les PM peuvent affecter la sant humaine,
notamment lorsquils entrent en comptition avec les lments essentiels de nombreux
processus cellulaires (comme les processus enzymatiques). Ce sont galement des inducteurs
puissants de stress oxydant cellulaire et certains sont considrs comme carcinognes (ex : As,
Cd, Cr, Ni, pour revue voir I.4.2, Andreau et al. 2012).
Dans ce chapitre, nous avons cherch dcrypter les mcanismes molculaires antiapoptotiques induits par les mtaux, dans les cellules 16HBE, dans la perspective que leur
comprhension puisse fournir des indices expliquant le dveloppement des cancers du poumon
au cours d'expositions long terme de faibles concentrations en particules.
Cette tude fait lobjet dun article soumis :
Urban fine PM and their metallic compounds protect human bronchial epithelial cells from
apoptosis: Role of Nrf2
Melanie Lovera-Leroux, Belinda Crobeddu, Nadim Kassis, Armelle Baeza-Squiban
and Karine Andreau

104

IV.2) ROLE DE LA VOIE ANTI-OXYDANTE NRF2 DANS LE MECANISME ANTIAPOPTOTIQUE INDUIT PAR LES COMPOSES PARTICULAIRES METALLIQUES

IV.2.1) Rsum
Cet article est structur en trois parties :
1- Tout dabord nous avons dmontr le rle des composs mtalliques dans l'effet antiapoptotique des PM2.5 (Article: Figures 1, 2, S1 et S3, partie rsume dans le Chapitre III de
ce manuscrit).
2- Sachant que les mtaux sont de forts inducteurs de stress oxydant dans la cellule (Manzl
et al. 2004; Rana 2008; Gobe et al. 2010), et que les espces ractives de l'oxygne (ROS) peuvent
tre des rgulateurs de l'apoptose (Orrenius et al. 2011; Sinha et al. 2013), nous nous sommes
intresss la rponse adaptative anti-oxydante des cellules. En se basant sur ces connaissances
et sur le modle de la rponse hirarchique au stress oxydant (Li, N. et al. 2003a; Andreau et al.
2012), nous avons fait l'hypothse que des quantits prcises de mtaux, peuvent induire
une rponse anti-oxydante de faible intensit, qui pourrait tre implique dans le processus
anti-apoptotique.
Nous avons dmontr, par la mthode du test DTT, que les particules PM2.5 ainsi que les
mtaux ont une capacit oxydante intrinsque, en accord avec donnes de la littrature (Li, N. et
al. 2003b; Cho et al. 2005; Koike et al. 2006; Biswas et al. 2009; Charrier et al. 2012). Ensuite, par
cytomtrie en flux et dosage du glutathion, nous avons montr quune augmentation du contenu
cellulaire en glutathion est implique dans leffet anti-apoptotique induit par les PM2.5 et par le
Fe(II) (Article : Figure 4 et 5). Ces rsultats sont en accord avec les donnes scientifiques
dmontrant que les PM ainsi que leurs composs peuvent dclencher une production de H2O2
(DiStefano et al. 2009; Shen et al. 2012) et une augmentation du contenu cellulaire en GSH
(Garcon et al. 2001; Michael et al. 2013). Nous avons donc suppos que les PM peuvent induire
la production dERO, impliqus dans une signalisation redox conduisant une rponse
anti-oxydante caractrise par laugmentation de la synthse du glutathion.
3- Enfin, nous nous sommes intresss de plus prs la voie de signalisation Nrf2 qui est
connue pour tre implique dans la transcription de nombreux gnes anti-oxydants et du
mtabolisme des xnobiotiques tels que Nrf2 lui-mme, GPx ( Glutathion peroxydase ), HO-1
( Heme oxygenase 1 ), GST ( Glutathion S-transferase ), NQO1 ( NADPH Quinone
Oxidoreductase 1 ), MRP ( Multidrug Resistance-associated Protein ), etc. (Rubio et al. 2010).
Par immunofluorescence, nous avons dmontr la translocation nuclaire de Nrf2
induite par les particules PM-AW et le Fe(II), ainsi que la transcription de ses gnes cibles
GPx, HO- 1 et NQO1, dmontre par RT-qPCR (Article : Figure 6). Ces rsultats sont en accord
avec les publications, montrant une surexpression de HO-1 et NQO1 aprs des expositions
similaires dans la ligne cellulaire alvolaire A549 (Deng et al. 2013) et dans les cellules
pithliales bronchiques humaines immortalises BEAS-2B (Diabate et al. 2011).

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IV.2.3) Article soumis

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IV.2.3) Rsultat supplmentaire & Discussion

Cette tude nous permet de proposer un modle , pour les mcanismes de l'effet antiapoptotique des particules atmosphriques, impliquant : dune part les HAP, via la translocation
nuclaire du facteur de transcription AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) et la transcription des
gne cibles possdant l'lment de rponse aux xnobiotiques (XRE) (Ferecatu et al. 2010) ;
dautre part les mtaux, via linduction dune rponse adaptative anti-oxydante et lactivation
subsquente du facteur de transcription Nrf2 qui conduit la surexpression des gnes HO1,
NQO1 et GPx1. De plus, plusieurs tudes ont dmontr quil existe une interaction entre les
voies de signalisation du AhR et de Nrf2. En effet, ces deux facteurs de transcription ont des
gnes cibles en commun (Surh 2003) tels que Nrf2 (Miao et al. 2005; Hayes et al. 2008), GST
(Hayes et al. 1995) et NQO1 (Begleiter et al. 2002). Enfin, il semblerait que Nrf2 et AhR peuvent
interagir physiquement en tant que cofacteurs (Wang, L. et al. 2013), ou bien que le AhR peut
aussi fixer lARE (Niestroy et al. 2011). Par ailleurs, il a t dmontr que le benzo(a)pyrne peut
rguler ngativement la transcription de Keap1 et donc participer l'activation de Nrf2 (Nguyen
et al. 2010).
Cette rponse adaptative peut conduire la survie cellulaire et la cancrogense. En
effet, l'implication de la production dERO, ainsi que l'activation de Nrf2 dans l'initiation de la
cancrogense, ont largement t dmontres, en particulier dans les cancers du poumon (Sporn
et al. 2012; Bauer et al. 2013; Ganan-Gomez et al. 2013). Ainsi, nous avons fait lhypothse que les
composs mtalliques des PM auraient la capacit de transformer les cellules pithliales
bronchiques normales en cellules prcancreuses, de par leur acquisition de caractristiques
spcifiques comme la rsistance lapoptose. Afin de conforter cette hypothse, nous avons
cultiv les cellules dans un milieu de nitrocellulose glifi (METHOCELTM), aprs des traitements
successifs aux composs particulaires. Des observations au microscope nous ont permis
danalyser les rsultats de manire qualitative. Les cellules 16HBE tant des cellules adhrentes,
en conditions normales elles ne peuvent pas pousser en suspension sauf si elles subissent des
mutations leur confrant la capacit de prolifrer. Hors, la perte de ladhrence, et le potentiel
rplicatif dsordonn sont des caractristiques des cellules en voie de cancrisation (voir
I.4.4). Les rsultats montrent que le Fe(II), le Cu(II) et le BaP, mais pas le Fe(III) ont permis aux
cellules de prolifrer dans le milieu de nitrocellulose et de former des colonies (Figure IV.7).

157

Figure IV.1 : Effet des PM et de leurs composs mtalliques et organiques sur la prolifration des
cellules 16HBE en milieu semi-solide. Aprs cinq expositions rptes aux composs particulaires
(pendant 24 h, 1 fois/semaine), 150 000 cellules ont t resuspendues dans 2 ml de milieu de
nitrocellulose glifi (METHOCELTM). Les colonies cellulaires ont t observes au microscope trois jours
plus tard. Grossissement X100.

En plus de protger de la mort cellulaire, les composs particulaires semblent donc

induire des modifications cellulaires telles que les cellules acquirent la capacit de
prolifrer en absence dadhrence.
Pour conclure, notre tude permet de mettre en lumire leffet dltre des mlanges et
des faibles doses de toxique, surtout dans la cancrogense. Une interaction possible entre AhR
et Nrf2 suggre un effet additif des composants organiques et mtalliques, sur la rponse
adaptative anti-oxydante, pouvant conduire la survie cellulaire et linitiation de la
cancrogense.

158

IV.3) RESULTATS SUPPLEMENTAIRES

Sachant que les particules inhibent lapoptose induite par le ionophore calcique A23187
et que linternalisation des PM, notamment des nanoparticules, a t montre dans les cellules
pithliales pulmonaires humaines par macropinocytose (Vranic et al. 2013), nous nous sommes
aussi intresss au rle de la voie de signalisation calcique et des interactions ventuelles entre
le cytosquelette et les particules.

IV.2.1) Rle du calcium dans leffet anti-apoptotique

Les PM-AW (10 g/cm) inhibent spcifiquement lapoptose induite par A23187 mais
pas celle dclenche par la ionomycine (Ferecatu et al. 2010), nous avons donc cherch savoir
quel tait leffet des particules anti-apoptotiques (PM-AW, PM-AS et PM-VW) et non-antiapoptotiques (PM-VS) sur laugmentation du calcium intracellulaire induite par lA23187
(Figure IV.2). Pour cela, les cellules ont t prtraites 4h avec 10 et 50 g/cm de particules,
avant la mesure du taux de calcium intracellulaire des cellules 16HBE (grce au fluorochrome
Fluo-4) et lajout dA23187 (5 M). La fluorescence est lue immdiatement aprs linjection
grce la FlexStation3 (voir II.5.1).
LA23187 dclenche lapoptose en induisant une augmentation importante et immdiate
du

Ca2+

intracellulaire qui se stabilise au bout de quelques minutes. Cette augmentation du Ca 2+

est significativement diminue par les PM-AW la concentration de 10g/cm et par les 4 lots
de PM 50g/cm (Figure IV.2).

Figure IV.2 : Effet des PM2.5 sur le pic de calcium induit par A23, dans les cellules 16HBE. Les
cellules 16HBE ont t exposes pendant 4h aux particules 10 g/cm (A) ou 50 g/cm (B), avant
lajout du fluorochrome Fluo4, marquant le calcium intracellulaire, puis linducteur dapoptose A23187
(5M) a t ajout juste avant la lecture de la fluorescence en cintique. Les rsultats sont prsents
comme la fluorescence relative par rapport au tmoin. * trait vs A23187 seul, n=24, p<0,05.

Laugmentation du Ca2+ intracellulaire a galement t retrouve avec un autre

ionophore calcique : lionomycine (1 M), mais pas avec la staurosporine (STS, 1 M) qui est un
inducteur dapoptose inhibant les protines kinases calcium dpendantes (Figure IV.3 A). De

159

manire intressante, les PM-AW semblent rduire laugmentation de Ca2+ provoque par
lionomycine (Figure IV.3 B) alors quelles ne protgent pas contre lapoptose induite par cet
inducteur (Ferecatu et al. 2010, Annexe 1). A linverse, les PM-AW protgent de lapoptose
induite par STS, qui ninduit pas daugmentation calcique (Ferecatu et al. 2010, Annexe 1 et
Figure IV.3 A).
Ces rsultats contradictoires posent la question dune interaction entre les PM non
internalises dans les cellules 16HBE et le fluorochrome Fluo-4 qui provoquerait lextinction de
sa fluorescence. Afin de tester cette hypothse, des mesures de Ca2+ intracellulaire ont t
ralises par cytomtrie en flux. Pour cela, les cellules 16HBE ont t exposes au PM-AW (de 10
50 g/cm) pendant 4h, avant lajout du Fluo-4 et lintensit de sa fluorescence a t mesure
par cytomtrie en flux avant et aprs ajout des inducteurs dapoptose (A23187, STS, et Iono)
(Figure IV.3 C).
A

Figure IV.3 : Effet des PM-AW sur le calcium intracellulaire. A) La fluorescence des cellules 16HBE,
marques au Fluo4, a t mesure par FlexStation 3 ds lajout des inducteurs dapoptose suivants :
A23187 (2,5M), staurosporine (STS, 1M), ou ionomycine (Iono, 1M). B) Aprs un prtraitement de 4h
aux PM-AW, la Ionomycine a t ajoute (Iono, 1M) et le calcium intracellulaire a t mesur par la
fluorescence du Fluo4 ( la FlexStation 3). Les rsultats sont prsents en unit relative de fluorescence
(RFU). C) Les cellules 16HBE ont t exposes au PM-AW (de 10 50g/cm) pendant 4h, avant lajout du
fluorchrome Fluo4 et la fluorescence a t mesur par cytomtrie en flux avant et aprs ajout dA23.
Lintensit moyenne de fluorescence, ainsi que les dviations standards ont t calcules par le logiciel du
cytomtre en flux.

Les rsultats confirment que les deux ionophores calciques (A23 et Iono) augmentent le
taux de Ca2+ intracellulaire qui est diminu par les PM-AW (Figure IV.3 C). Comme la technique
de cytomtrie en flux quantifie lintensit de fluorescence du Fluo-4 spcifiquement mise par

160

les cellules, ceci suggre que les PM-AW peuvent contrecarrer lgrement laugmentation de de
Ca2+ intracellulaire de manire dose-dpendante.
Les PM2.5 semblent donc capables de rguler le flux calcique intracellulaire de manire
dose-dpendante.

IV.2.2) Interaction particules / cytosquelette

Sachant que laugmentation du Ca2+ intracellulaire peut induire des rarrangements du
cytosquelette, en particulier sur le rseau dactine (Saneyoshi et al. 2012) et que les vnements
prcoces de lapoptose saccompagnent dune stabilisation du rseau de microtubules (Aslan et
al. 2009), il nous a sembl intressant dinitier des expriences sur leffet des PM-AW antiapoptotiques sur lorganisation des microtubules et des filaments fins dactine.
Nous avons tout dabord examin limpact des inducteurs dapoptose A23187 et STS sur
les rseaux dactine et tubuline (Figure IV.4). Aprs 1h dexposition lA23187, les cellules
commencent prsenter des foci de polymrisation intense des microtubules, ce phnomne
saccentuant jusqu 4 heures. Paralllement, lA23187 semble augmenter la fluorescence de
lactine corticale et des fibres de stress. Dans le cas de lapoptose induite par la STS, les cellules
16HBE prsentent une morphologie trs altre aprs 1 heure de traitement, des microtubules
et un rseau dactine dsorganis (Figure IV.4).
A linverse, lexposition des cellules 16HBE aux PM-AW (10 g/cm) pendant 1 ou 4
heures ne semble pas impacter la structure du rseau dactine (Figure IV.5).

161

Figure IV.4 : Effet des inducteurs dapoptose sur lactine et la tubuline des cellules 16HBE. Les
cellules 16HBE ont t exposes pendant 1h ou 4h aux inducteurs dapoptose A23 (3M) ou STS (1M)
puis fixes et marques avec la phallodine-rhodamine pour lactine et avec un anticorps secondaire
coupl au fluorochrome FITC pour la tubuline, avant dtre observes en microscopie lectronique
fluorescence.

162

Figure IV.5 : Effet des PM-AW sur lactine des cellules 16HBE. Les cellules 16HBE ont t exposes
pendant 1h ou 4h aux PM-AW (10g/cm), puis fixes et marques avec la phallodine-rhodamine 132,
avant dtre observes en microscopie lectronique fluorescence.

Ltude des consquences dune exposition aux PM-AW (10g/cm) sur la morphologie
des cellules 16HBE dans le cadre de leur effet anti-apoptotique a t ralise par leur
observation par microscopie lectronique balayage (MEB, Figure IV.6 et IV.7). Les
observations en MEB confirment que les cellules 16HBE possdent des microvillosits (flches
vertes, Figure IV.6 A). On peut observer quaprs 4h dexposition aux PM-AW (10g/cm), les
microvillosits ont une forte interaction avec les particules, qui se fixent aux cellules et forment
des agrgats (flches bleues, Figure IV.6 B), mais les cellules gardent leur intgrit
morphologique.
Ds 1h dexposition au A23187, les cellules commencent prsenter des modifications
morphologiques visibles, caractristiques de lapoptose, notamment la formation de bourgeons
membranaires ( blebbing , flches rouges) et la perte des microvillosits (Figure IV.6 C). Ces
deux phnomnes tendent diminuer lors du prtraitement par les PM-AW (10g/cm pendant
4h, Figure IV.6 D).
Aprs 4h de traitement, lA23187 induit clairement une mort apoptotique (Figure IV.6
E), caractrise par le dtachement des cellules (elles sont rondes, flches oranges), la formation
de bourgeons ( blebbing , flches rouges), et la perte de leurs microvillosits (flches vertes).
Le prtraitement des cellules par les PM-AW (4h 10g/cm) a visiblement permis de diminuer
lapoptose des cellules et de maintenir leur intgrit morphologique (Figure IV.6 F).
Concernant lapoptose induite par la STS, ds 1h des modifications morphologiques
importantes au niveau des microvillosits apparaissent (Figure IV.7 C), celles-ci sont beaucoup
moins nombreuses et trs allonges (flches vertes). Le prtraitement aux PM-AW montre que
les microvillosits allonges ont une trs forte interaction avec les particules (Figure IV.7 D).
Aprs 4h de traitement par la STS, les cellules 16HBE meurent en prenant une
morphologie trs dendritique (Figure IV.7 E, flches rouges) comme observes en
immunofluorescence (voir Figure IV.4) et perdent leurs microvillosits la surface de la
membrane plasmique (flche verte). Comme pour lA23187, le prtraitement aux PM-AW a

163

clairement protg des cellules des altrations morphologiques induites par le STS (Figure IV.7
F).
Ainsi, les PM-AW protgent les cellules des altrations du cytosquelette et
morphologiques provoques par les inducteurs dapoptose.

164

Figure IV.6 : Effet des PM-AW et de lA23 sur le cytosquelette des cellules 16HBE. Les cellules 16HBE
ont t exposes pendant 1h (C) ou 3h (E) lA23 (3M) ou pendant 4h aux PM-AW (B), puis 1h ou 3h
supplmentaires avec linducteur dapoptose A23 (3M, Det F), avant dtre fixes et traites pour tre
observes en microscopie lectronique balayage (MEB).

165

Figure IV.7 : Effet des PM-AW et du STS sur le cytosquelette des cellules 16HBE. Les cellules 16HBE
ont t exposes pendant 1h (C) ou 3h (E) au STS (1M) ou pendant 4h aux PM-AW (B), puis 1h ou 3h
supplmentaires avec linducteur dapoptose STS (1M, Det F), avant dtre fixes et traites pour tre
observes en microscopie lectronique balayage (MEB).

166

IV.2.2) Discussion
Pour rsumer, nous avons montr que les particules, notamment les PM-AW, sont
capables de rduire laugmentation de Ca2+ intracellulaire cause par les ionophores calciques
A23187 et ionomycine (Figures IV.3 et IV.4). Cependant, nous ne pouvons dterminer si cette
rduction du taux de Ca2+ intracellulaire participe leffet anti-apoptotique des PM car (voir
Tableau IV.1):
i) les particules anti-apoptotiques (PM-AW, -AS et -VW) mais galement les PM non-antiapoptotiques (-VS) rduisent laugmentation de Ca2+ ;
ii) les PM-AW semblent rduire laugmentation de Ca2+ provoque par lionomycine alors
quelles ne protgent pas contre lapoptose induite par cet inducteur ;
iii) les PM-AW protgent de lapoptose induite par STS, qui ninduit pas daugmentation calcique.
Tableau IV.1: Rcapitulatif des effets des inducteurs sur le calcium. Les PM-AW protgent de
lapoptose et rduisent le pic de calcium induits par lA23187, mais elles protgent aussi de lapoptose
induite par STS, qui ninduit pas daugmentation calcique. A linverse, les PM-AW ne protgent pas de
lapoptose induite par lionomycine, mais rduisent le pic de calcium induit par ce ionophore.
inducteur
Effet antiDiminution
apoptotique des
du Ca2+
PM-AW
intracellulaire
A23187
oui
oui
STS

oui

non

Ionomycine

non

oui

LA23187 tant un ionophore calcique, il induit lapoptose suite une importante

augmentation du calcium intracellulaire (Reed et al. 1972). Cependant, les mcanismes
molculaires impliqus dans cette induction sont encore mconnus et dpendent du type
cellulaire tudi. En effet, plusieurs tudes ont montr une activation des caspases par lA23187
dans diffrents types cellulaires (musculaires, lymphoblastiques, neuronales, , Menconi et al.
2004), bien que les caspases ne jouent pas ncessairement un rle effecteur dans le mcanisme
apoptotique (D'Mello et al. 2000). A linverse, dautres publications dcrivent une induction
dapoptose par A23187 indpendante des caspases (Cummings et al. 2004).
Par ailleurs, des tudes ralises au laboratoire (par le Dr Ioana Ferecatu, le Dr Ada
Bouharrour, Camille Bossard et Blinda Crobeddu) ont montr que linduction dapoptose par
A23187 dans les cellules 16HBE semble dpendre de lactivation des calpanes mais tre
indpendante de lactivation des caspases (rsultats non illustrs). En effet, il est connu que le
processus apoptotique peut tre excut indpendamment des caspases, via lactivation dautres
protases telles que les calpanes (Lu et al. 2002), qui sont composes dune sous-unit
rgulatrice o se fixe le calcium et dune sous-unit catalytique cystine-protinase (Sorimachi et
al. 1997; Lopatniuk et al. 2011). La fonction ionophore calcique du A23187 est concordante avec
lactivation des calpanes et linduction dapoptose dpendante des calpanes (Ray et al. 2000;

167

Menconi et al. 2004; Kar et al. 2009). Il sera ncessaire de poursuivre les recherches dans ce
domaine afin de confirmer lactivation des calpanes par lA23187 dans les cellules 16HBE et
dterminer si elles sont impliques dans leffet anti-apoptotique des PM.
Enfin, labsence deffet anti-apoptotique des PM-AW vis--vis de lapoptose induite par
lionomycine pourrait contredire lhypothse dun effet de ces particules sur la signalisation
calcique puisque l'ionomycine et lA23187 sont tous deux des ionophores monocarboxyliques
qui favorisent une augmentation slective du Ca2+ cytosolique (Liu, C. et al. 1978). Il faut
cependant citer une publication montrant que, contrairement lA23187, lionomycine ne
permet pas une surcharge en calcium mitochondrial dans les cellules pimastigotes de
Trypanosoma cruzi (Irigoin et al. 2009). La mesure des taux de Ca2+ cytosolique et mitochondrial
en rponse lA23187 et lionomycine pourrait nous permettre de comprendre pourquoi
l'apoptose induite par lA23187 est slectivement inhibe par les PM.
Les tudes prliminaires du cytosquelette ont montres dune part que les inducteurs
dapoptose A23187 et STS altrent les rseaux dactine et de tubuline, tandis que les PM-AW ne
semblent pas altrer les microfilaments dactine. Ces expriences mritent dtre approfondies
par une tude des microtubules aprs traitement par les PM ainsi quun marquage de lactine et
de la tubuline aprs un prtraitement par les PM suivi dun traitement par les inducteurs afin de
voir si les PM sont capables dempcher lapparition des fibres de stress et des foci de
polymrisation des microtubules. Dautre part, lA23187 et la STS induisent prcocement ( 1 h
et 3 h de traitement) des modifications morphologiques, dont la perte des microvillosits
membranaires et un dbut de dtachement de la matrice, qui sont contrecarrs par le
prtraitement aux PM-AW (10 g/cm).
Le caractre innovant de ces rsultats rsulte dans la capacit des PM, faible dose,
protger des altration morphologiques causes par dautres agents, puisquau contraire,
dautres tudes ont montr que les PM, mais des doses plus fortes provoquent des altrations
du cytosquelette, notamment dans les rseaux dactine et tubuline et dans les jonctions serres,
en lien avec linduction dun stress oxydant (Wang, T. et al. 2010; Mutlu et al. 2011) ou une
modulation du calcium intracellulaire (Moller et al. 2005).
Par ailleurs, lactivation des calpanes par des PM10 a t dmontre dans des cellules
pithliales bronchiques humaines (BEAS-2, Watterson et al. 2009) montrant que les particules
sont capables de moduler lactivation de ces protines kinases. De manire intressante, lquipe
de G. N. Garcia a montr, in vivo (dans des modles de souris et in vitro (dans des cellules
endothliales respiratoires humaines) que lactivation des calpanes par des PM2.5 tait lie
linduction dun stress oxydant et laltration du cytosquelette. Ils suggrent que les ERO gnrs
par les PM conduisent des modifications de lhomostasie calcique, induisant lactivation des
calpanes et laltration des jonctions serres via le clivage de la protine ZO-1 (Wang, T. et al.
2012), refltant le lien troit qui existe entre lhomostasie calcique, le statut redox
intracellulaire, et le cytosquelette.

168

IV.4) CONCLUSION
Tout dabord, cette tude nous a permis de confirmer que les composs particulaires
mtalliques ont un effet anti-apoptotique en lien avec leur concentration, et que les particules
PM2.5 de 2003, ainsi que les mtaux, ont une capacit oxydante intrinsque lie linduction
dune rponse cellulaire anti-oxydante. Cette rponse anti-oxydante, caractrise par
laugmentation du GSH total dans la cellule, est corrle leffet anti-apoptotique des PM. La
gnration de H2O2 intracellulaire par les PM pourrait expliquer cette rponse anti-oxydante,
puisque, comme les PM, de faibles doses de H2O2 ont t capables de protger les cellules de
lapoptose. Il serait donc ncessaire deffectuer un dosage du H2O2 intracellulaire afin de vrifier
cette hypothse.
Nous avons dmontr que la voie de signalisation Nrf2 est implique, dans la rponse
anti-oxydante et leffet anti-apoptotique induit par les PM2.5-AW, via sa translocation nuclaire
et la transcription de ses gnes cibles HO1, NQO1 et GPX1. Nos rsultats sont en accord avec les
publications, montrant une surexpression de HO-1 et NQO1 aprs des expositions similaires
dans la ligne cellulaire alvolaire A549 (Deng et al. 2013) et dans les cellules pithliales
bronchiques humaines immortalises BEAS-2B (Diabate et al. 2011). Cependant, nous navons
pas mis en vidence de surexpression des gnes de SOD2 et de GST aprs 4h de traitement, mais
il est possible que ces expressions ncessitent un temps plus long, comme cela a dj t montr
dans dautre types cellulaires (Tanaka et al. 2000; Saint-Georges et al. 2008).
Cette tude nous a permis de proposer un modle pour les mcanismes de l'effet antiapoptotique des particules atmosphriques, impliquant dune part les HAP, via la translocation
nuclaire du facteur de transcription AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) et la transcription des
gne cibles possdant l'lment de rponse aux xnobiotiques (XRE) (Ferecatu et al. 2010),
dautre part les mtaux, via linduction dune rponse adaptative anti-oxydante et la subsquente
translocation du facteur de transcription Nrf2 activant ces gnes cibles, possdant llment de
rponse anti-oxydante (ARE) (Article : Figure 9).
Cette rponse adaptative peut conduire la survie cellulaire et la cancrogense. En
effet, l'implication de la production de ROS ainsi que l'activation de Nrf2, dans l'initiation de la
cancrogense, a dj t dmontre, en particulier dans les cancers du poumon (Sporn et al.
2012; Bauer et al. 2013; Ganan-Gomez et al. 2013). Des tudes complmentaires prliminaires
ont montr que lexposition rpte des cellules aux composs particulaires des PM-AW leur
permet dacqurir la capacit de prolifrer en absence dadhrence, soutenant lhypothse que
lexposition aux particules atmosphriques faible dose peut conduire la transformation
prcancreuse des cellules.
Ltude du calcium intracellulaire a montr que les PM sont capables de moduler
lhomostasie calcique, mais aucun lien entre cette rgulation et leffet anti-apoptotique nas put
tre tabli.
Enfin, ltude morphologique de linteraction entre la membrane cellulaire et les PM
montr que les PM ne modifient pas les microfilaments, contrairement deux inducteurs

169

dapoptose (A23187 et STS) qui altrent les rseaux dactine et de tubuline. Il serait ncessaire
deffectuer des marquages de lactine et de la tubuline aprs prtraitement par les PM, suivit des
inducteurs dapoptose, afin de voir si les PM protgent des altrations causes sur ces deux
protines du cytosquelette. Il serait galement judicieux deffectuer les mmes expriences avec
des agents dtruisant spcifiquement lactine, comme la Cytochalasin D, ou la tubuline comme la
Colchicine, afin de voir si les PM protgent aussi des altrations causs par ces produits.

170

V. CONCLUSIONS GENERALES & PERSPECTIVES

171

Grce aux nombreuses tudes pidmiologiques ralises depuis la rvolution

industrielle, la pollution atmosphrique a t depuis longtemps associe une augmentation de
tous types de cancers. La composante particulaire est particulirement incrimine, notamment
dans les cancers broncho-pulmonaires (CBP). Cependant les mcanismes molculaires associs
sont trs peu connus. La rcente classification de la pollution atmosphrique, et en particulier
des particules fines PM2.5, en tant que cancrigne certain pour lhomme par lIARC, montre
quil est indispensable de poursuivre et approfondir les recherches sur les mcanismes
impliqus dans linitiation des CBP par les particules atmosphriques. Sachant que la rsistance
lapoptose est lune des premires caractristiques acquises par les cellules cancreuses
(Hanahan et al. 2000; Hanahan et al. 2011), notre quipe sest focalise sur la capacit de
diffrentes particules moduler lapoptose des cellules pithliales bronchiques humaines.

Dans ce contexte, mes travaux de thse avaient pour objectifs :

i) de comprendre le rle de la taille et de la composition chimique des PM dans leur
effet sur lapoptose (aussi bien son induction que son inhibition) ;
ii) didentifier les composs impliqus dans linhibition de lapoptose observe avec
certaines PM ;
iii) de dcrypter les mcanismes molculaires mis en uvre dans la rsistance
lapoptose confre par les composs identifis.

Le modle cellulaire que nous avons utilis dans lensemble de mon travail a t la ligne
16HBE, de cellules pithliales bronchiques non transformes provenant dun enfant ayant subi
une greffe, immortalises par lantigne T du virus SV40. Lintrt de cette ligne est quelle
conserve lors de sa culture in vitro, un certain nombre de caractristiques des cellules
pithliales bronchiques humaines : ce sont des cellules adhrentes, elles possdent des
microvillosits ainsi que des jonctions gap et adhrentes fonctionnelles bien quelles ne
prsentent pas d'inhibition de contact et ne produisent pas de cils. De plus, lendocytose des
nanoparticules ainsi que lactivation du cytochrome P450 par les pDi et la raction
inflammatoire a t prcdemment prouve dans ces cellules (Belade et al. 2012 ; Bonvallot et al.
2001). Les cellules 16HBE sont des cellules non cancreuses capables de se transformer lors
dexpositions rptes au BaP et dinduire ainsi lapparition de tumeurs pulmonaires chez la
souris nude (Zhao, P. et al. 2012). Les cellules 16HBE sont donc un modle cellulaire adquat
pour ltude des cellules pithliales bronchiques humaines et les processus de
cancrognicit en lien avec lacquisition dune rsistance lapoptose.

Les rsultats acquis au cours de cette thse ont clairement mis en vidence que :

172

i) La taille et la composition chimique des particules conditionnent leur capacit

moduler lapoptose des cellules pithliales bronchiques humaines
Dans une premire tude, lutilisation de diffrents lots de particules issues de sources
contrastes et/ou de diffrentes classes de taille a permis de dterminer que la taille, la dose et
la composition chimique des PM constituent des paramtres qui conditionnent possiblement
linduction de lapoptose. Afin davoir une approche raliste, nous avons utilis des doses
auxquelles un individu est susceptible dtre expos dans des conditions normales de pollution.
Ainsi, nous avons expos les cellules 16HBE a une concentration maximale de 10
g/cm, correspond une exposition 5 jours une pollution de zones urbaines telles que
celles observes dans des mgacits comme Paris (Li, N. et al. 2003a).
Ltude de des diffrents lots de particules a montr quaussi bien la taille que la
composition chimique des particules peuvent conditionner linduction dapoptose des
cellules 16HBE. Cependant, la composition chimique des PM semble tre un paramtre plus
dterminant dans la modulation de lapoptose puisque des particules de mme classe de taille,
prleves un mme endroit ont eu des effets diffrents. Ces diffrences entre les
prlvements ont galement t observes pour linduction de lexpression des gnes de
linflammation et des EMX. Ainsi, les variations dans les effets provoqus par les PM
pourraient rsulter des sources et donc des compositions chimiques diffrentes. Cependant,
les analyses chimiques des PM prleves en 2009-2010, ayant t ralises sur des sries de
prlvements de mme caractristiques spatio-temporelles (soit : WB, TR, OB, et OP), nous
navons pu identifier les composs particulaires impliqus dans linduction de lapoptose des
cellules pithliales bronchiques 16HBE.
Concernant la rsistance lapoptose confre par les PM, letude du rle la taille
doit tre approfondie. Linhibition de lapoptose induite par des inducteurs spcifique a t
observe avec trois des quatre lots de PM2.5 prleves en 2003 (PM-AW, -AS et -VW), mais pas
avec des particules fines et grossires prleves en 2009-2010. Cependant, parmi tous les lots
notre disposition, seuls quelque uns ont pu tre tudis quant leffet anti-apoptotique (TR5 et
OB3) ; ce qui limite la conclusion que nous pouvons apporter sur le rle de la taille dans
linhibition de lapoptose. Il sera donc ncessaire dtudier dautres particules de diffrents
classes de tailles, notamment dautres PM2.5 et des particules ultrafines, afin de conclure sur
ce point dautant plus les particules fines issues du trafic prleves en 2010 ont lgrement
rduit lapoptose de manire non significative (TR5 F, Figure III.9).
Les rsultats que nous avons obtenus ont clairement dmontr que la composition
chimique des particules fines urbaines de 2003 est un paramtre cl impliqu dans leur
effet anti-apoptotique ; en particulier les composs organiques et mtalliques. En effet,
lanalyse chimique ces PM2.5 a montr que celles ayant un effet anti-apoptotique (PM-AW, -AS et
-VW) ont une composition trs diffrente des particules non-anti-apoptotiques (PM-VS). Elles
ont notamment plus de HAP et moins de mtaux (Tableaux III.1 et II.4).

173

ii) Les HAP particulaires plus de 5 noyaux benzniques et les composs mtalliques
participent leffet anti-apoptotique des PM
Les rsultats obtenus dans la premire tude ont orients nos recherches sur leffet de
ces composs organiques et mtalliques sur linhibition de lapoptose, en lien avec leurs
concentrations. Ainsi, nous avons dmontr quaussi bien les composs organiques que les
composs hydrosolubles participent aux proprits anti-apoptotiques des PM, et une tude de
corrlation entre la composition et leffet anti-apoptotique des PM nous a permis de dterminer
quune concentration de HAP lourds suprieure 46 g/g, ainsi quune concentration
infrieure 147 mg/g en mtaux seraient ncessaire pour rduire dau moins 40%
lapoptose induite par lA23187.
Plus prcisment, les HAP lgers ne semblent pas impliqus dans leffet anti-apoptotique
tandis que les HAP lourds sont ncessaires ( une concentration suprieure 46 g/g).
Lutilisation de diffrents HAP a permis de discriminer ceux ayant plus de 5 noyaux
benzniques comme ncessaires leffet anti-apoptotique des PM-AW (Tableau III.2).
Parmi les composs mtalliques, ce sont principalement les mtaux alcalino-terreux (
une concentration infrieure 123 mg/g) et les mtaux de transition ( une concentration
infrieure 21,5 mg/g) qui semblent participer leffet anti-apoptotique des PM. La capacit
anti-apoptotique du Fe(II) et Fe(III), de lAl(III), du Cu(II), du Ca(II), du Mg(II), du Mn(II) et
du Pb(II) a notamment t vrifie en cytomtrie en flux et nous avons montr que celle-ci
dpend bien de sa concentration (Figures III.13 et III.14).
Dans le contexte actuel, la population est expose une multitude de polluants
environnementaux, et plusieurs tudes sintressant lexposition de mlanges de toxiques ont
montr quils pouvaient tre plus nfastes de faibles doses, que les polluants seuls. Or, la
pollution atmosphrique particulaire constitue un mlange complexe de composs toxiques
(organiques, mtalliques et biologiques, voir I.1.1.iii). Afin de poursuivre ce travail, il serait
donc intressant dexposer les cellules pithliales bronchiques humaines un nombre restreint
de composs, organiques et mtalliques (par exemple, BaP, Fe et Cu), en mlange, afin de
reconstituer un modle de composs particulaires cytoprotecteur, mais sans la contrainte de
la nature particulaire des PM. En effet, celle-ci peut poser quelques interfrences avec les
techniques biologiques utilisant des fluorochromes, du fait du cur carbon des PM, comme nos
rsultats de dosage du calcium intracellulaire peuvent le suggrer.

iii) Les mcanismes molculaires de la rponse adaptative anti-oxydante sont

impliqus dans leffet anti-apoptotique des PM
Afin de comprendre les mcanismes molculaires associs leffet anti-apoptotique
observ avec les composs particulaires, nous avons premirement identifi la voie AhR
comme implique dans leffet anti-apoptotique induit par les HAP particulaires, lors dune
tude ralise par le Dr Ioana Ferecatu, laquelle jai particip (Ferecatu et al. 2010, Annexe 1).

174

En complment, mon travail de thse sest concentr sur les composs mtalliques et les
mcanismes molculaires quils activent lors de ltablissement dune rsistance lapoptose.
En se basant sur la connaissance de linduction dun stress oxydant par les PM et les
mtaux (Baulig et al. 2003; Manzl et al. 2004; Cho et al. 2005; Rana 2008; Gobe et al. 2010) ainsi
que sur le modle hirarchique de rponse au stress tabli par N. Li et ses collaborateurs (Li,
N. et al. 2003a), nous avons cherch savoir si nos PM et leur composs mtalliques
induisaient un stress oxydant pouvant tre impliqu dans la rsistance lapoptose. Ainsi,
de manire concordante dautres tudes ralises prcdemment (Baulig et al. 2009; DiStefano
et al. 2009; Shen et al. 2012), nous avons dmontr que les PM prleves en 2003 ainsi que
leurs composs mtalliques ont une activit pro-oxydante intrinsque lie linduction dune
rponse cellulaire anti-oxydante (voir III-Article soumis). Cependant, il serait tout fait
souhaitable de quantifier in cellulo la quantit de mtaux de transition, notamment le fer, ainsi
que la production de diverses ERO, notamment le proxyde dhydrogne suite une exposition
aux PM anti-apoptotiques par une technique de rsonance paramagntique lectronique (RPE).
La rponse anti-oxydante induite par les particules et les composs mtalliques
semble lie au glutathion (GSH) puisque, contrairement aux autres anti-oxydants tudis,
lajout de GSH a augment, de manire dose-dpendante, leffet anti-apoptotique des PM-AW. De
plus, le prtraitement avec les particules anti-apoptotiques PM-AW (10 g/cm), de mme
quavec le Fe(II) ( la concentration contenue dans 10 g/cm de PM-AW) ont permis de
contrecarrer la dpltion de GSH provoque par linducteur dapoptose A23187. Enfin, de faibles
doses de H2O2 ont aussi t capables de protger les cellules 16HBE contre lapoptose induite
par lA23187 (voir III-Article soumis). Ces rsultats sont concordants avec ceux obtenus
prcdemment par A. Baulig et collaborateurs qui avaient dmontr que la N-actylcystine
(NAC, un prcurseur de GSH), mais pas le D-mannitol, rduit la production dHO par les PM2.5
(Baulig et al. 2009). Ainsi, lensemble de ces rsultats suggrent que les PM-AW, via leurs
composs mtalliques, provoquent un faible stress oxydant induisant une rponse
adaptative anti-oxydante, spcifiquement lie au GSH intracellulaire. La mesure de lactivit
de la glutamate cystine ligase (GCL), qui catalyse la synthse du GSH, nous permettrait de
confirmer la synthse de GSH induite par les PM et ses composs, et des dosages individuels du
glutathion rduit (GSH) et oxyd (GSSG) nous permettrait de faire un ratio GSH/GSSG.
Pour aller plus loin dans notre analyse mcanistique de la rponse adaptative antioxydante, nous nous sommes intresss la voie de signalisation Nrf2 et nous avons montr
quelle est implique dans la rsistance lapoptose. En effet, nous avons clairement montr
lactivation rapide dNrf2 et sa translocation nuclaire aprs traitement par les PM-AW antiapoptotiques ( 10g/cm) et le Fe(II) (qsp 10g/cm de PM-AW), mais pas par les PM-VS, nonanti-apoptotiques. Nrf2 induit ensuite la transcription de ces gnes cibles, possdant llment
de rponse anti-oxydante ARE notamment Nrf2 lui-mme, HO-1, NQO1 et GPx (voir III-Article
soumis). Lactivation de Nrf2 par les PM a plusieurs fois t dmontre (Baulig et al. 2003;
Diabate et al. 2011; Deng et al. 2013), mais notre tude apporte un claircissement sur le rle de
lactivation de Nrf2 par les composs mtalliques, dans leffet anti-apoptotique confr par les
particules fines. Ainsi, les composs mtalliques des PM2.5 induiraient un lger stress

175

oxydant, conduisant une rponse adaptative anti-oxydante, via lactivation la voie Nrf2
(Figure V.1). Afin de vrifier cette hypothse, des expriences dextinction du gne Nrf2 (siRNA)
sont en cours de ralisation. Il serait galement intressant dinvalider lexpression de lenzyme
HO1 qui est la plus fortement induite par les PM-AW. De plus, notre tude de lexpression des
gnes cibles dNrf2 pourrait tre complte par lanalyse des gnes impliqus spcifiquement
dans la synthse du GSH, tels que la glutamate-cysteine ligase (GCL) dont on sait quelle
restore le taux de GSH et protge contre le stress oxydant induit par la fume de cigarette (Kode
et al. 2008).
Mon tude des composs mtalliques a permis de complter notre modle des
mcanismes molculaires et cellulaires induisant la rsistance lapoptose par les PM 2.5 (Figure
V.1). Ainsi selon notre modle, les PM2.5 peuvent tre internalises, puis, in cellulo, les composs
particulaires se dsorbent ; les HAP activent le rcepteur Aryl hydrocarbon (AhR) tandis que
les mtaux induisent un faible stress oxydant qui active Nrf2. Ces deux facteurs de transcription
sont transloqus dans le noyau o ils vont se fixer respectivement sur les lments ARE et XRE
et activer la transcription des gnes de la rponse anti-oxydante et des gnes du mtabolisme
des xnobiotiques. Ces deux voies de signalisation peuvent tre interconnectes bien que les
mcanismes impliqus dans ce dialogue ne sont pas encore compltement lucids. Ainsi Nrf2 et
AhR peuvent interagir physiquement pour fonctionner comme des cofacteurs pour les gnes
ARE et XRE, le AhR pourrait aussi activer la transcription des gnes ARE ; enfin, certains gnes
possdent la fois llment ARE et llment XRE comme le gne codant pour Nrf2 lui-mme
(Miao et al. 2005; Niestroy et al. 2011; Wang, L. et al. 2013).

iv) Les PM induisent dautres modifications cellulaires et molculaire pouvant tre

impliqus dans lacquisition de la rsistance lapoptose
En plus de lactivation de la voie Nrf2, la rgulation du calcium intracellulaire semble
tre implique dans leffet anti-apoptotique des PM (Figure V.1). En effet, les PM semblent
capables de diminuer le pic de calcium provoqu par les ionophores calciques (A23 et
Ionomycine) inducteurs de lapoptose des cellules 16HBE. Ces rsultats restent cependant
confirmer notamment par lutilisation de chlateurs de Ca2+ de manire concomitante aux PM.
Cependant, des travaux raliss dans notre quipe ont montr que, dans les cellules 16HBE,
lapoptose induite par A23187 semble dpendre de lactivation des calpanes (protases
actives par de fortes doses de calcium) en non pas des caspases comme cela a dj t montr
(D'Mello et al. 2000; Cummings et al. 2004). La rgulation de lactivation des calpanes serait une
piste explorer afin de dcrypter leffet cytoprotecteur des PM contre lapoptose spcifiquement
induite par A23187.
Des tudes morphologiques prliminaires nous ont permis de montrer que les
inducteurs dapoptose A23187 et STS altrent fortement le cytosquelette (rseaux dactine et de
tubuline), ainsi que la morphologie cellulaire (microvillosits), et que les PM-AW semblent
protger les cellules de ces altrations morphologiques (Figure V.1). Ces rsultats apportent
un nouveau regard sur linteraction PM/membrane cellulaire et il serait intressant de

176

poursuivre les recherches afin de dterminer si linternalisation des PM est une condition sine
qua none leur effet protecteur ou si seule linteraction PM/membrane suffit. Il serait galement
justifi de dterminer le lien existant entre les altrations de lhomostasie calcique et celles du
cytosquelette, puisque le calcium est connu pour modifier la polymrisation de lactine via
notamment la gelsoline.

Figure V.1 : Modle hypothtique du mcanisme de l'effet anti-apoptotique de PM2.5. Lexposition

des cellules pithliales bronchiques aux PM2.5 conduit leur endocytose, puis la dsorption des HAP et
la solubilisation des composs mtalliques. Les HAP activent leur rcepteur spcifique AhR (Aryl
hydrocarbon receptor, Ferecatu et al. 2010) qui peut transloquer au noyau, se fixer llment de rponse
aux xnobiotiques (XRE) et activer la transcription de ses gnes cibles. Les faibles niveaux de mtaux
produisent certainement de faibles quantits dERO (Espces Ractives de lOxygne) qui peuvent activer
Nrf2, qui transloque au noyau puis se lie llment de rponse anti-oxydante (ARE). Cette activation de
Nrf2 permet une rgulation positive de lui-mme, ainsi que la transcription des anti-oxydants
enzymatiques (HO1, NQO1 et GPx1) et non enzymatiques (GSH) pouvant contrer la permabilisation de la
membrane mitochondriale (PMM) et l'apoptose subsquente. De rcentes tudes ont aussi montr que
AhR et Nrf2 peuvent interagir (Miao et al. 2005; Niestroy et al. 2011; Wang, L. et al. 2013). De plus, les
PM2.5 sont aussi capables de rduire le pic de calcium cytosolique et les altrations morphologiques
provoqus par certains inducteurs dapoptose dont le A23187. Illustration ralise grce Servier Medical
Art.

177

Enfin, nous avons montr quen plus de confrer une rsistance lapoptose les
composs particulaires semblent permettre la survie voire la prolifration des cellules
pithliales bronchiques 16HBE en condition non adhrente, en lien avec la composition des
PM. En effet, les traitements rpts avec les particules ainsi que certains composs (Cu(II),
Fe(II), et BaP) ont permis aux cellules de pousser dans un milieu semi-solide METHOCELTM
contrairement aux cellules non traites (Figure IV.1). Cette exprience prliminaire mrite
dtre reconduite de manire plus rigoureuse par un test de formation de colonies en milieu
Agar afin de pouvoir apprhender les effets des PM anti-apoptotiques ainsi que leurs composs
organiques et mtalliques sur les processus de cancrogense. En effet, depuis quelques annes,
des tudes suggrent que les PM (Hung et al. 2007; Rubio et al. 2010), les HAP (notamment le
BaP, Teranishi et al. 2010) et les mtaux (dont laluminium, le fer et le cuivre, Wang, Q. et al.
2007; Yu, J.W. et al. 2010) peuvent avoir un effet cytoprotecteur conduisant la cancrisation
des cellules pulmonaires, notamment via lactivation de la voie de survie Nrf2.
Le paradoxe de la voie Nrf2 rsulte dans son implication dans la cancrogense aussi
bien comme possible suppresseur de tumeurs que comme oncogne (pour revue voir Sporn et
al. 2012). En effet, des tudes in vivo ont montr le dveloppement de multiples cancers dans des
souris Nrf2-/- (Becks et al. 2010; Ohkoshi et al. 2013; Cheung et al. 2014), alors que ltude de
carcinomes des voies ariennes a mis en vidence des mutations activatrices dNrf2 ou
inhibitrices de Keap1, conduisant lactivation constitutive de Nrf2 (pour revue voir Sporn et al.
2012). Lensemble de ces donnes, laissent donc supposer que le classement dNrf2 en tant
quoncogne ou en tant que suppresseur de tumeurs dpend du type de cancer, de ltape de
dveloppement du cancer, et du degr dactivation de Nrf2. La mise en perspective de nos
rsultats dans un contexte dexpositions rptes de faibles doses de particules
atmosphriques laisse supposer quune suractivation, ou lactivation rpte, de la voie antioxydante Nrf2 pourrait induire une rponse adaptative conduisant ltablissement dune
rsistance lapoptose, la survie de cellules endommages et lacquisition de
caractristiques prcancreuses. Ce type de mcanisme dadaptation pouvant conduire la
cancrogense a dj t suggr prcdemment pour la voie Nrf2 et pour la voie AhR (pour
revue voir Barouki 2010; Sporn et al. 2012).
En conclusion, ce travail de thse met en exergue, linfluence de la composition chimique
des particules sur leurs effets toxiques, ainsi que, leurs impacts cellulaires et molculaires sur
ltablissement dune rsistance la mort cellulaire apoptotique, et peut fournir des indices
mcanistiques permettant dexpliquer le dveloppement des cancers du poumon lors
d'expositions long terme.

178

VI. ANNEXES

ANNEXE 1: .................................................................................................................................................. 181

Polycyclic aromatic hydrocarbon components contribute to the mitochondria-antiapoptotic
effect of fine particulate matter on human bronchial epithelial cells via the aryl hydrocarbon
receptor .
Ioana Ferecatu, Marie-Caroline Borot, Camille Bossard, Melanie Leroux, Nicole Boggetto,
Francelyne Marano, Armelle Baeza-Squiban, Karine Andreau.
Particle and Fibre Toxicology 2010, 7:18
ANNEXE 2 : ................................................................................................................................................. 199
Health and cellular impacts of air pollutants: from cytoprotection to cytotoxicity.
Karine Andreau, Melanie Leroux and Ada Bouharrour
Biochemistry Research International 2012, 493894

179

180

Annexe 1:

Polycyclic aromatic hydrocarbon components contribute to the

mitochondria-antiapoptotic effect of fine particulate matter
on human bronchial epithelial cells via the aryl hydrocarbon receptor .

Ioana Ferecatu, Marie-Caroline Borot, Camille Bossard,

Melanie Leroux, Nicole Boggetto, Francelyne Marano,
Armelle Baeza-Squiban, Karine Andreau.

Particle and Fibre Toxicology 2010, 7:18

181

182

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194

195

196

197

198

Annexe 2 :

Health and cellular impacts of air pollutants:

from cytoprotection to cytotoxicity.

Karine Andreau, Melanie Leroux and Ada Bouharrour

Biochemistry Research International 2012, 493894

199

200

201

202

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211

212

213

214

215

216

217

218

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233

Etude des mcanismes de rgulation de la mort cellulaire apoptotique

par les particules atmosphriques et leurs composs mtalliques
Les effets dltres des particules atmosphriques (PM) sur la sant humaine ont t associs un
risque accru de la mortalit et de la morbidit d'origine cardio-respiratoire ainsi que lapparition ou
lexacerbation des cancers pulmonaires et sont principalement lis aux particules les plus petites
pouvant atteindre les cellules du poumon profond et s'y accumuler. Les PM sont un mlange
complexe de suies sur lesquelles sadsorbent des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et
des mtaux, connus pour leurs effets cancrognes. La cancrogense est un processus multi-tapes
o les cellules acquirent des proprits remarquables, telle que la rsistance la mort cellulaire par
apoptose. Dans ce contexte, les objectifs de cette thse ont t de : i) comprendre le rle de la taille et
de la composition chimique des PM dans la modulation de lapoptose, ii) identifier les composs
impliqus dans la rsistance lapoptose confre par les particules fines, iii) dcrypter les
mcanismes molculaires mis en uvre. Nous avons tudi la rponse des cellules pithliales
bronchiques humaines 16HBE exposes des PM de taille (grossire, fine et ultrafine) et de sources
varies (issues de Paris et Ouagadougou) quant leur rponse sur linduction ou linhibition de
lapoptose et montr que la taille, la dose et la composition chimique des PM constituent des
paramtres pouvant conditionner linduction de lapoptose. De plus, leffet anti-apoptotique
dmontr pour des PM fines parisiennes ne semble pas li la taille de ces PM mais leur teneur
spcifique en HAP et en composs mtalliques, notamment en mtaux de transition (Fer et Cuivre).
Ltude mcanistique de la rsistance lapoptose (induite par le ionophore calcique A23187)
confre par les PM fines parisiennes a mis en vidence : i) limplication de la voie du rcepteur Ah
("Aryl hydrocarbon") activ par les HAP ; ii) lactivation de la voie anti-oxydante Nrf2 en rponse aux
composs mtalliques des PM ; iii) ainsi que la rgulation possible de lhomostasie calcique. Ces
recherches ont mis en vidence, le rle dterminant des composs mtalliques, qui en agissant
conjointement avec la fraction organique, peuvent conduire ltablissement dune rsistance
lapoptose, tape initiale de la cancrogense broncho-pulmonaire.

Mechanisms of apoptotic cell death regulation by atmospheric particles

and their metallic compounds
The deleterious impacts of atmospheric particulate matter (PM) on human health have been
highlighted by an increased mortality and morbidity of cardiopulmonary origin and the onset or
exacerbation of lung cancers and are mainly associated with smallest PM that can reach the deep
lung and be retained. PM are a complex mixture composed mainly of soots and several components
adsorbed, including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and metals, all both known for their
carcinogenic effects. Carcinogenesis is a multi-step where cells acquire unique properties, such as
resistance to apoptotic cell death. In this context , the objectives of this thesis were to : i) understand
the role of the size and chemical composition of PM in the modulation of apoptosis, ii) identify the
compounds involved in the resistance to apoptosis conferred by fine particles , iii) decipher the
molecular mechanisms involved . We studied the response of 16HBE human bronchial epithelial cells
exposed to PM with different size (coarse, fine and ultrafine) and from various sources (Paris and
Ouagadougou) regarding either induction or inhibition of apoptosis and we showed that the size, the
dose and the chemical composition of PM may be parameters that regulate apoptosis induction. In
addition, the antiapoptotic effect demonstrated for fine Parisian PM does not seem related to their
size but rather to their specific content in PAH and metallic compounds, especially transition metals
(iron and copper). The mechanistic study of resistance to apoptosis (triggered by calcium ionophore
A23187) conferred by Parisian fine PM demonstrated: i) the involvement of the Ah receptor pathway
(Aryl hydrocarbon) activated by PAHs ii) activation of the antioxidant adaptive pathway Nrf2 in
response to metallic compounds of PM; iii) as well as potential regulation of calcium homeostasis.
These studies have highlighted the key role of the metal compounds, which by acting jointly with the
organic fraction, may lead to the development of a resistance to apoptosis, the initial step of
bronchopulmonary carcinogenesis.