Chapitre IV : Les principales méthodes de multiplication Dr Manel BOUDOUAYA 2017/2018

Sommaire

I. Présentation des différentes techniques

I.1. Culture de méristèmes
Chapitre IV I.2. Micropropagation
Les principales méthodes de I.3. Cultures d'anthères, de grains de pollen et d'ovules
multiplication I.4. Cultures de protoplastes
II. Les différentes techniques
II.1. Cultures de méristèmes
II.2. Micropropagation
II.3. Cultures de grains de pollen et d'ovules
II.4. Cultures de protoplastes
III. Acclimatation
III.1. Climat
III.2. Substrat
III.3. Protection sanitaire

I. Présentation des différentes techniques

La manière de procéder et les buts recherchés étant très différents, les cultures in vitro
se présentent sous quatre aspects.
I.1. Culture de méristèmes1
Cette technique est la première à avoir débouchée sur des applications pratiques. Son
but principal est la régénération d'espèces atteintes de virus, Son champ d'application s'est
un peu étendu puisqu'elle sert également dans certains cas de point de départ pour une
micropropagation.
I.2. Micropropagation
Le but de la micropropagation est de reproduire en grande quantité des plantes
identiques au pied-mère. C'est donc une réelle technique de multiplication, utilisée pour de
nombreuses espèces.
La micropropagation n'ayant pas d'influence sur la qualité sanitaire de la plante
propagée, il est indispensable de posséder au départ un matériel sain ; sinon, on retrouvera
tous les inconvénients, sur le plan sanitaire, de la multiplication végétative.

1 Le terme de culture de méristèmes est parfois employé improprement pour désigner les cultures in vitro.

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I.3. Cultures d'anthères, de grains de pollen et d'ovules

Le but recherché dans ce cas n'est ni la régénération ni la multiplication. Cette
technique permet la production rapide de plantes haploïdes.
Ces haploïdes peuvent servir à l'obtention de plantes homozygotes2 après doublement
des chromosomes, à la recherche de mutants ou d'individus nouveaux, de matériel de
recherche sur les chromosomes.
I.4. Cultures de protoplastes
Un protoplaste est une cellule chlorophyllienne isolée et débarrassée de sa paroi
squelettique. Ces protoplastes sont des matériaux de base très intéressants pour la recherche
sur le fonctionnement cellulaire. Ils permettent également la réalisation d'hybrides
somatiques après fusion. Ils servent enfin de base à diverses manipulations génétiques ou
autres, ouvrant d'énormes perspectives pour les années à venir.
II. Les différentes techniques
II.1. Cultures de méristèmes
Cette découverte fut pressentie au début des années 1950 par deux chercheurs
d'INRAE (P. Limasset et P. Cornuet). Mise au point et confirmée en 1952 par les travaux de
deux autres chercheurs d'INRAE (G. Morel et C. Martin) qui aboutirent, après trois années de
travail, à la régénération d’une plante saine (un Dalhia) à partir de méristèmes d’une plante
contaminée par trois virus.
Cette technique est utilisée pour obtenir des plantes saines à partir des plantes
virosées. De ce fait, la culture du méristème3 est plus une technique de régénération (guérison
de plantes atteintes de virus) que de multiplication proprement dite. Elle découle
d'observations faites par plusieurs chercheurs qui firent les constatations suivantes :
1. Les méristèmes sont des zones de cellules à divisions intenses, situés au cœur des
bourgeons et des extrémités de racines et à l'origine des tiges feuillées ou du système
racinaire.

2 L’homozygote est un état dans lequel un gène particulier est présent sous la forme de deux allèles identiques, soit
récessifs, soit dominants. Chez un individu homozygote, les traits récessifs sont exprimés phénotypiquement car il n’y a
pas d’allèle dominant pour bloquer l’expression du gène, en supposant qu’il suive les règles mendéliennes.

3 Le terme de méristème désigne un ensemble de cellules indifférenciées qui ont une capacité de division très élevée. Ils
sont situés dans différents sites et sont responsables de la croissance en longueur des tiges et des racines (méristèmes
apicaux) ; d'autres assurent la croissance en épaisseur des tiges chez les plantes vasculaires (méristèmes secondaires ou
cambium). Dans le cas de la culture de méristème, seuls les méristèmes caulinaires (situés à l'extrémité des tiges) sont
utilisés.

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2. La plupart du temps, le méristème4 apical d'une plante est indemne de virus. On

évoque pour cette particularité l'hypothèse suivante : la vitesse de multiplication des
cellules méristématiques qui, en quelque sorte et en simplifiant, se multiplieraient plus
vite que les virus, laissant ainsi quelques cellules saines.
La culture de méristèmes a permis, dans les années 50, de guérir des plantes virosées,
en particulier chez les plantes qui sont multipliées végétativement : pomme de terre, fraisier,
tulipe, etc. (dans le cas de la pomme de terre, les maladies virales ont entraîné en 1956 la perte
de 15 % de la production mondiale, soit 30 millions de tonnes). Cette découverte
expérimentale a eu un retentissement considérable et est appliquée aujourd’hui dans le monde
entier. En particulier dans les zones tropicales particulièrement sensibles aux épidémies, la
culture de méristèmes est la seule technique qui permet de maintenir des productions saines
de canne à sucre, de manioc, d’igname ou de bananier.
II.1.1. Prélèvement
Les méristèmes sont formés de cellules non différenciées qui sont présentes dans les
bourgeons à l’extrémité des tiges et des racines et qui peuvent, en se multipliant, donner
naissance à tous les tissus de la plante. Leur culture permet d'obtenir une plante identique à la
plante initiale.
Après désinfection ou non (suivant les espèces) du rameau de départ (l'explant), le
prélèvement se fait sous loupe binoculaire5, sous hotte stérile ou sur paillasse désinfectée.
Le fragment de rameau est débarrassé de ses feuilles, puis les ébauches foliaires sont
éliminées.
Quand le méristème apparaît, on ôte délicatement les dernières ébauches foliaires, puis
l'on découpe un minuscule cube de l’ordre de 0,2 à 0,5 mm6, dont les faces sont tangentes au
méristème ; une dernière section transversale permet de le détacher. Il est aussitôt placé dans
un tube à hémolyse, sur milieu gélosé. Toutes ces opérations doivent être conduites
rapidement afin d'éviter le dessèchement du méristème et limiter les risques de
contamination. Les outils employés sont désinfectés à chaque prélèvement (Figure IV.1).

4 Les méristèmes sont des structures indemnes de virus, dont la culture in vitro permet d'obtenir des plantes saines.

5 L’isolement des méristèmes se fait sous loupe binoculaire avec lumière froide pour éviter la dessiccation (le
dessèchement).

6 En général plus le méristème prélevé est grand plus la probabilité de survie augmente et celle de l’assainissement
diminue.

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Figure IV.1. Schéma de principe pour prélèvement d'un méristème

Photo IV.1. Bourgeon issu d’un méristème de laitue

II.1.2. Conditions de croissance
Les méristèmes, minuscules parties de la plante, ont les mêmes besoins nutritifs que la
plante entière. Toutefois, ne recevant plus certaines substances fournies par d'autres parties du
végétal, ils ont des exigences particulières. Ces besoins seront satisfaits par le milieu des
cultures additionné de phytohormones.
II.1.2.1. Environnement

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1) La lumière
Elle n'est pas strictement indispensable pour une bonne croissance des méristèmes
mais sa présence donne de meilleurs résultats. Les intensités apportées sont comprises entre
1000 et 3000 lux. Un régime de 16 heures de jour, pour 8 heures de nuit, est souvent adopté
bien qu'un éclairage en continu soit possible.
2) L'humidité relative
Elle doit être proche de la saturation. Les tubes étant en général fermés pour des
raisons sanitaires. On arrive très facilement à ce résultat sans problème.
3) La température
Elle doit être impérativement contrôlée, d'où l'utilité d'une chambre de culture en
moyenne entre 22 et 25°C.
4) L'asepsie
L'asepsie conditionne la réussite, Il faut donc :
 stériliser le milieu,
 désinfecter très fréquemment le matériel de prélèvement,
 éviter au minimum les risques de contamination, en travaillant rapidement sur
paillasse désinfectée ou sous un dispositif particulier, "la hotte à flux laminaire
horizontal", qui propulse un air filtré.

Photo IV.2. Une chambre de culture

II.1.2.2. Taux de réussite
Il est très variable et le taux de régénération varie de 0 à 80%, les cause de cette
variation sont très diverses.
1) Facteurs techniques
Les méristèmes étant de très petites tailles (de l'ordre de 1/10 de mm), il arrive très
souvent que des tissus voisins soient prélevés en même temps.

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2) Facteurs physiologiques
Le stade d'évolution de la plante a une grande importance. En général, le taux de
réussite est supérieur pour les espèces herbacées. Les chances de régénération sont également
plus importantes quand le prélèvement se fait sur une plante en pleine croissance. Les ligneux
posent un problème plus délicat. Le méristème prélevé sur une plante en croissance a parfois
tendance à brunir et à se nécroser sur le milieu de culture. En revanche, les prélèvements de
méristèmes sur des bourgeons au repos, mais dormance levée, donnent de meilleurs résultats
en culture mais le taux de régénération est plus faible.
3) Facteurs pathologiques
Le taux de régénération est en relation directe avec le statut viral. Certains virus
s'éliminent facilement, d'autres plus difficilement. Dans le cas de réussite nulle, on peut
associer "la thermothérapie et la culture de méristème". On place la plante à régénérer à la
température d'élimination du virus pendant le temps voulu, puis on pratique un prélèvement
de méristème sur cette plante.
o Exemple- Dianthus caryophyllus (œillet), où l'élimination du Streak de l'œillet se
pratique par cette double méthode (Tableau IV.1).
Tableau IV.1. Sélection sanitaire sur l'œillet
1er test viral : Prélèvement de méristème
- sérologique
- biologique
(indicateurs herbacés) Plantule saine
Sous réserve de tests négatifs

Multiplication in vitro
par microbouturage

2ème test viral : Acclimatation, puis rempotage -Culture en serre insect-proof

- sérologique pour constituer le bloc de -Contrôle variétal
- biologique pied-mère S0 -Serre ordinaire
-Traitements phytosanitaires très suivis
Contrôles viraux visuels Bloc de pied-mère S1 -Contrôle variétal
-Serre ordinaire
-Traitements phytosanitaires très suivis
Contrôles viraux visuels Bloc de pied-mère S2 -Contrôle variétal

Boutures commercialisées

II.1.3. Contrôles
Comme le taux de régénération n'est pas garanti, il est impératif de vérifier l'état
sanitaire de la plante obtenue. La détection des virus peut se faire soit par des techniques

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d'indexage en greffant la plante supposée infectée sur des plantes indicatrices sensibles ou
par détection sérologique de type ELISA ou Dot-ELISA. Dans le cas d'indexage, il faut
pratiquer trois indexages pour avoir l'assurance d'une régénération totale. Il est également
important de vérifier la conformité génétique de la plante obtenue. Ce contrôle visuel doit
établir qu'aucune mutation n'a eu lieu.
Il est à remarquer que les premiers stades de croissance d'un méristème sont
semblables à ceux d'une plantule issue de semis, ce qui semble mettre en évidence le
phénomène de rajeunissement signalé précédemment (au premier chapitre).

Figure IV.2. Culture de méristèmes avec la thermothérapie et la détection des

virus par détection sérologique de type ELISA

II.1.4. Domaines d’application de la culture de méristème

De nombreuses variétés de diverses espèces ont été sauvegardées grâce à cette
technique : pomme de terre, dahlias, fraisiers, vigne, iris, framboisiers etc. Beaucoup de
plantes horticoles de grande diffusion sont produites à partir de pieds mères qui ont été
assainis par culture de méristèmes. Il en est de même pour des espèces maraîchères tel
l'artichaut ou encore le fraisier.
 Applications horticoles
Les cultures horticoles exigent souvent des investissements importants, d'où l'intérêt
d'une bonne rentabilité des cultures installées. Cette rentabilité dépend en partie de la qualité
des pieds-mères ou des jeunes plants.

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Les cultures de méristèmes ont permis la régénération d'un certain nombre d'espèces,
permettant ainsi de disposer de pieds-mères sains assurant la production de boutures sans
virus.
o Exemples : Dianthus caryophyllus, Chrysanthemum, Pelargonium x hortorum,
orchidées, Dahlia, Rubus idaeus, Solanum tuberosum, Ribes, Prunus, Fragaria.
Outre la régénération, la culture de méristèmes est parfois utilisée comme point de
départ pour la micropropagation pour quelques espèces ainsi pour la multiplication de
certaines espèces d'orchidées.
Les cultures de méristèmes et micropropagation ont nettement raccourci la durée de
culture et le temps de mise à fleur. Elles facilitent grandement la programmation des dates de
floraison.
Les cultures de méristèmes peuvent être à l'origine d'un retour à l'aptitude au
bouturage7. Il est fréquent sur les conifères en particulier que la faculté d'émettre des racines
pour une bouture disparaisse avec l'âge, interdisant ainsi la multiplication végétative de clones
intéressants.
Le prélèvement d'un méristème, puis sa mise en culture, permettent dans de nombreux
cas de régénérer un pied-mère qui retrouve alors son aptitude au bouturage. Ce phénomènes
est parfois dénommé "rejuvénilisation".
o Exemples : Sequoiadendron, Taxodium distichum.
II.1.5. Microgreffage in vitro
Cette opération, peu courante et délicate à mettre en œuvre, se réalise dans les
conditions aseptiques de la culture in vitro.
Le but recherché est la constitution de plants indemnes de virus dans le cas où la
culture de méristèmes présente de grosses difficultés, ce qui arrive parfois chez certains
ligneux.
On greffe en conditions aseptiques des apex de l'espèce à régénérer sur de jeunes
plantules (décapitées) âgées d'environ quinze jours, indemnes de virus et cultivées in vitro.
Quelques réussites sur Citrus, Prunus et Malus.
II.1.6. Avantages de la culture de méristème
1. La culture de méristèmes permet le sauvetage des variétés virosées menacées.
2. Elle concerne essentiellement les plantes à reproduction par voie végétative tels la
pomme de terre, le fraisier, …etc.

7 Le bouturage consiste à prélever sur un végétal appelé "pied-mère", un organe ou un fragment d'organe, l'aider à
subsister puis à se régénérer, c'est à-dire reformer les parties qui lui manquent afin de reconstituer une plante complète.

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3. Les plantes produites sont saines : sans virus, champignons et bactéries et répondent
aux normes phytosanitaires d'échanges internationaux de plus en plus draconiennes.
4. Les plantes assainies ont une vigueur accrue, et des qualités de floraison et de
fructification restaurées.
II.1.7. Limites de la culture de méristème
Les plantes obtenues sont indemnes de virus mais ne sont pas devenues résistantes aux
virus. Elles peuvent être recontaminées via des insectes.
II.2. Micropropagation
C'est la technique in vitro la plus répandue. Actuellement un certain nombre d'espèces
sont multipliées presque exclusivement par cette méthode. L'exemple le plus typique étant le
Gerbera.
Le but de la micropropagation est de produire en grande quantité des jeunes plantes
identiques au pied-mère. Si cette technique permet l'élimination de la bactérie et champignons
par le simple fait de leur expression en milieu de culture, les tubes contaminés sont alors
éliminés. La micropropagation n'offre aucune garantie contre les virus.
Il est donc indispensable, pour éviter de transmettre ces maladies, d'avoir au départ un
matériel végétal sain. Ces pieds-mères sains sont obtenus si nécessaire après indexage ou sont
issus de culture in vitro.
II.2.1. Différentes phases
La micropropagation peut se décomposer en cinq stades successives : (stade 0 :
conditionnement des plantes mères ; stade 1 : établissement ou initiation d'une culture
aseptique ; stade 2 : multiplication ; stade 3 : enracinement (ou rhizogénèse) ; stade 4 :
acclimatation ou sevrage des plantules) (Figure IV.3 ; Figure IV.4).

Stade I : Stade II : Stade III : Stade IV :

Établissement de la Multiplication Enracinement et développement de Acclimatation
culture aseptique la plantule

Stockage au froid Culture en serre

Stade III bis

Figure IV.3. Schéma de principe de la micropropagation

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Figure IV. 3. Les différentes étapes de la micropropagation

II.2.1.1. Conditionnement du plant mère

Ce stade 0 réfère au conditionnement du plant mère. En effet, le plant mère devrait

être dépourvu de carences minérales et en pleine turgescence donc sans stress hydrique
important. Au mieux et dans presque tous les cas, le plant devrait être en croissance active,
donc mis en culture en dehors de sa dormance. Ceci limite dans le calendrier de production,
les dates préférables de mise en culture pour le stade d'initiation. Aussi les plants mère choisis
le seront en fonction de leur état sanitaire.
Des plants infestés d'insectes peuvent apporter des problèmes à toute une chambre de
culture. À titre d'exemple, les œufs de thrips qui se logent dans les interstices des bourgeons
résisteront à la stérilisation de surface des apex. Par la suite, des conditions favorables
permettront leur éclosion. Les larves et les adultes particulièrement se déplaceront d'un tube à
l'autre en quête de nourriture. Ces insectes sont suffisamment petits pour se glisser sous les
bouchons et pénétrer dans les tubes. On peut soupçonner leur visite lorsque des moisissures
envahissent les contenants longtemps après la mise en culture.

II.2.1.2. Établissement de la culture aseptique (durée 6 à 8 semaines)

C'est l'étape de base de l'opération. Elle consiste à établir la mise en culture in vitro de
la plante que l'on désire multiplier. Cette implantation demande un minimum de réflexion car
les réponses sont différentes pour chaque espèce. Le choix dépend essentiellement :
1) de la qualité sanitaire du pied-mère ;
2) de son âge et de son état physiologique.
En fonction de ces critères on décide :

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a) de l'époque de prélèvement ;
b) de la nature de l'explant à prélever ;
c) de la composition du milieu de culture.
 Explants utilisés
L'explant est le fragment de végétal utilisé et mis en culture. Les explants peuvent être
des parties d'organes ou des organes entiers, (tige, feuille, racine, fleurs, etc.), des tissus,
des pièces florales, des graines ou des embryons, des bourgeons ou des apex ou des
méristèmes, des cellules somatiques ou sexuelles, des protoplastes. Le choix de l'explant sera
fonction de la technique utilisée, de l'objectif et de l'espèce travaillée.
De ce fait, Toutes les parties du végétal sont utilisables mais, en pratique et en
fonction des espèces, on obtient de meilleurs résultats avec certaines parties :
o Exemples :
- Fragments de tiges : Nicotiana.
- Fragments de pétioles : Saintpaulia.
- Fragments de racines : Ipomea.
- Fragments de limbes Physalis
- Fragments d'écailles de bulbes : Lilium.
- Fragments de rhizomes : Nephrolepis.
- Fragments de pédoncules : Phalaenopsis.
- Méristèmes : Dianthus
- Pièces florales jeunes (fragment de capitule) : Gerbera.

En fonction de la nature de l'explant et de la composition du milieu, on obtient :

1) Une plantule.
2) Un amas de bourgeons ou de microfeuilles.
3) Un protocorme8 chez les orchidées.
Ces organes sont le point de départ de la deuxième étape.
II.2.1.3. Multiplication proprement dite (durée 4 à 5 semaines)
Elle a pour but d'obtenir le nombre de plantules désirées. Suivant le matériel végétal
obtenu en "phase I", on procède à un microbouturage dans le cas de plantules ou microfeuilles
à une division pour les amas de bourgeons, à une fragmentation du protocorme pour les
orchidées. Ces fragments sont remis en culture puis à nouveau divisés, ceci autant de fois que
nécessaire jusqu'à l'obtention du nombre de plants désirés.

8 Protocorme : Stade entre l'embryon et la plantule.

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II.2.1.4. Enracinement et développement (durée 2 à 4 semaines)

Après avoir obtenu le nombre de plants désirés, ceux-ci sont individualisés ou
microbouturés une dernière fois. Le repiquage s'effectue alors en bocal ou en tube, sur milieu
différent afin de provoquer la croissance et l'enracinement. On profite parfois de cette étape
pour commencer à "durcir" les plants et les préparer ainsi au passage "in vivo".
Le milieu utilisé lors de cette 3ème phase diffère du précédent par l'équilibre des
régulateurs de croissance, auxines et cytokinines.
Cette 3ème phase n'est pas une étape obligatoire. Pour quelques espèces, l'enracinement
in vitro n'est pas nécessaire. Dans ce cas, le passage en acclimatation se fait directement à la
fin de la phase II.
On peut également, pour diminuer le coût de l'opération, stocker en chambre froide, 4
à 5°C et conserver ainsi les bocaux pendant plusieurs mois (Dianthus : 18 mois, Stachys
sieboldii : 8 mois). Cette technique évite ainsi de recommencer l'établissement de la culture
aseptique.
II.2.1.5. Acclimatation ou sevrage (durée 3 à 4 semaines)
Il s'agit de la dernière étape qui consiste à adapter progressivement les microplantules
aux conditions qui prévalent dans la serre ou à l'extérieur. Après avoir éliminé la gélose de la
base des plants, ils sont transférés dans un substrat horticole. Les parties aériennes sont
ensuite recouvertes de manière à les maintenir dans un environnement qui avoisine les 100%
d'humidité relative.
Les stomates de ces jeunes feuilles cultivées in vitro demeurent constamment ouverts
et laissent donc s'échapper l'eau de transpiration de manière continue. Les risques de
dessèchement sont très élevés. Aussi doit-on attendre la croissance de nouvelles feuilles
fonctionnelles avant d'enlever progressivement la pellicule de recouvrement.
La qualité finale d'un plant in vitro dépend en partie de son acclimatation. Il faut que
ce passage s'effectue dans les meilleures conditions possibles.
C'est une étape délicate ; les racines nées in vitro sont extrêmement fragiles et placées
au contact d'un substrat, elles meurent. Il faut donc attendre la formation et la croissance de
nouvelles racines pour que la plante s'alimente. Pendant cette phase, les jeunes plantules se
comportent comme des boutures. Il faut assurer les mêmes soins : hygrométrie élevée,
température aux environs de 20°C ombrage éventuel, surveillance très sérieuse des maladies.
Après cette phase délicate (2 à 3 semaines), les plantules sont progressivement habituées à
l'ambiance de la serre.

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Il faut rappeler enfin que la maîtrise de tous les facteurs du milieu (humidité relative,
température ambiante, luminosité, protection sanitaire,...) est indispensable. Une défaillance
sur l'un d'entre eux ruinerait tous les efforts accomplis sur les autres.
II.2.2. Exemples
Exemples de quelques genres pouvant se multiplier in vitro : Ananas, Caladium,
Dahlia, Dianthus, Eucalyptus, Freesia, Gerbera, Iris, Lavandula, Lilium, Prunus, Rosa,
Rhododendron, etc...

Figure IV.5. Les différentes étapes de la micropropagation chez la carotte

II.3. Cultures de grains de pollen et d'ovules

Cette technique n'a pas pour but la multiplication ou l'amélioration sanitaire, mais est
utilisée pour l'amélioration des plantes. Elle permet, en effet, l'obtention d'haploïdes ou la
recherche de mutants intéressants.
Elle est également un moyen de mieux connaitre le fonctionnement de la plante, sur le
plan génétique en particulier.
II.3.1. Principe
La technique de base est celle de la culture in vitro classique ; en revanche, l'explant
de départ est constitué, soit par une anthère (Photo IV.3), soit par un grain de pollen isolé.

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Le stade de prélèvement est important et doit se faire avant que le pollen n'ait réalisé sa
dernière division.
Un choc physiologique est souvent indispensable afin de perturber l'évolution normale
du grain de pollen. Ce choc physiologique est obtenu par :
1) Un passage à basse température.
2) Un traitement avec certains régulateurs de croissance.
3) Une centrifugation.
Les milieux de culture sont les mêmes que pour les méristèmes ou la
micropropagation ; on note simplement la présence de régulateurs et une teneur en sucre
beaucoup plus élevée (environ 100 g/l). Cette haute teneur en sucre serait défavorable à la
multiplication des tissus diploïdes.

Photo IV.3. Culture d’anthères d’aubergine

II.3.2. Évolution du grain de pollen
Après la mise en culture, la réussite est loin d'être assurée, car l'évolution du pollen
mis en culture n'aboutit pas forcément à la création d'une plantule. Il existe beaucoup de voies
sans issue. En cas de réussite, les plantules obtenues ne sont pas forcément homogènes. Il faut
vérifier le niveau de ploïdie, par comptage chromosomique. Ce ne qu'après cette vérification
que l'on a l'assurance d'avoir obtenu un haploïde. Les haploïdes obtenus sont stériles, sauf
quand ils sont obtenus à partir de plantes tétraploïdes, et sont multipliés par voie végétative. Il
est possible d'obtenir le dédoublement du stock chromosomique (avec des substances comme
la colchicine) et d'avoir ainsi une plante diploïde homozygote et fertile. Le taux de réussite est
très faible (1 à 5%) (Tableau IV.2).

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Tableau IV.2. Évolutions possibles d'un grain de pollen.

 On obtient une division des noyaux mais pas de

cloisonnement cellulaire. On a ainsi un pollen
Échecs
multinucléé.
Grain de pollen  Le grain de pollen évolue "normalement" et germe sur
le milieu.
 La division se produit mais reste au niveau d'une
caulogenèse permanente.

 Division qui aboutit à la naissance d'un embryon puis

d'une plantule. Après vérification du stock Réussite
chromosomique on obtiendra un haploïde.

II.3.3. Intérêts
1) Outre la production de plantes homozygotes, la recherche de mutants est également
une voie intéressante. Les gènes n'étant présents qu'à un seul exemplaire, les
phénomènes de dominance ne jouent plus et certains caractères masqués s'expriment.
On arrive par ce simple fait à découvrir de nouveaux cultivars (des exemples sur le riz
et l'orge).
2) La fixation d'une lignée pure homozygote est plus rapide que par la voie sexuée (gain
de trois à cinq ans).
3) L'analyse génétique et l'étude du fonctionnement cellulaire sont simplifiées, ce qui est
très intéressant pour les chercheurs.
4) Les recherches sur les connaissances, marquages 9 et transferts de gènes sont
également beaucoup plus aisées.
5) Cette technique permet la création de plantes n'existant pas à l'état naturel.
II.3.4. Cultures d'ovules
La culture d'ovaires ou d'ovules in vitro, technique récente (première réussite en
1976), permet d'arriver au même résultat que les cultures de grain de pollen dans l'obtention
d'haploïdes. Il semble même que cette technique délicate réussite là où d'autres ont échoué et
ouvre des perspectives intéressantes, notamment pour l'étude du cytoplasme.

9 Le marqueur génétique est un gène ou une séquence polymorphe d'ADN aisément détectable grâce à un emplacement
connu sur un chromosome. On peut l'utiliser en cartographie génétique pour « baliser » le génome et identifier des
individus ou des espèces.

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Photo IV.4. Schéma de la technique de culture in vitro chez les embryons du piment doux
(Capsicum annuum)
A) autopollinisation, B) ouverture des fruits immatures juste récoltés, C) stérilisation des fruits
et graines, D-E) excision des embryons, identification des stades et semis in vitro, F)
développement des embryons et germination, G) évaluation des plantules et H-I)
acclimatation.
II.4. Cultures de protoplastes
Un protoplaste est une cellule chlorophyllienne débarrassée de sa paroi squelettique.
II.4.1. Intérêt de cette culture
Elle pourrait être un moyen de multiplication végétative à très haut potentiel, mais les
autres méthodes de multiplication in vitro suffisent largement aux besoins. De plus, le risque
d'obtention de mutants est relativement élevé et la technique est délicate à mettre en œuvre.
L'intérêt est ailleurs. Les protoplastes permettent :
1) Des recherches approfondies sur le fonctionnement de la cellule.
2) Des traitements mutagènes sur cellule isolée.
3) L'obtention de "résistances naturelles" contre les bactéries, des champignons, des
herbicides et même contre certains ravageurs, (exemple : sur le tabac, des protoplastes
mis en contact avec une molécule analogue à une toxine bactérienne ont régénéré un
tabac résistant à la bactérie).
4) L'étude du comportement des ADN.
5) Des manipulations génétiques avec introduction ou substitution de gènes.
Le protoplaste est le matériel végétal le plus couramment utilisé pour réaliser les
manipulations génétiques. Les recherches dans cette voie sont nombreuses et des réussites ont
permis l'obtention de résistance à certaines maladies ou ravageurs.

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D'autres pistes sont également explorées : introduction des gènes responsables de la

fixation de l'azote atmosphérique ; recherches de nouvelles pigmentations, de nouvelles
formes, de résistance au froid, etc.
L'information dans le domaine des plantes transgéniques reste très confidentielle.
Cette discrétion est dictée par le souci de protection économique, mais surtout en raison du
problème éthique qui y est associé.
II.4.2 Obtention de protoplastes
La présence de la paroi pectocellulosique des cellules est une des barrières aux
échanges d'information génétique. On peut séparer les cellules d'un tissu végétal grâce à
l'action d'enzymes généralement extraites de champignons, qui dégradent la cellulose et les
matières pectiques de la paroi. Des agents stabilisants sont ajoutés au milieu pour empêcher
l'éclatement de la cellule. On obtient ainsi des "cellules déshabillées", qui deviennent
sphériques : les "protoplastes". Ces derniers peuvent être obtenus à partir de n'importe quel
tissu végétal, mais ce sont généralement les parenchymes des jeunes feuilles qui sont utilisés
pour leur préparation.
À partir de ces protoplastes, il est possible d'obtenir de nouvelles plantes. Si les
conditions de milieu sont favorables, la paroi végétale se reconstitue. Les organites cellulaires
se réarrangent et les cellules entrent en division. Elles donnent ainsi naissance à des
microcolonies, puis des cals, amas de cellules indifférenciées. Transférés sur un milieu de
régénération, les cals se développent en embryons somatiques qui donneront des plantules.
S'il est apparemment possible d'obtenir des protoplastes chez toutes les espèces
végétales, leur culture puis la régénération d'une plante entière à partir des protoplastes posent
encore de nombreuses difficultés et constituent une limite de cette technique. Il semble
notamment que les monocotylédones soient plus récalcitrantes vis-à-vis de la culture des
protoplastes que les dicotylédones.
Les protoplastes sont, en général, isolés à partir de fragments de limbe, mais ils
peuvent parfois être obtenus à partir d'autres organes.
Après scarification, le limbe est découpé en fines lamelles, puis plongé dans une
solution où deux opérations simultanées se déroulent : (Figure IV.6.a ; Figure IV.6.b ; Figure
IV.6.c ; Photo IV.5).

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1. Désinfection de la feuille 2. Elimination de l'épiderme inférieur

et dilacération des tissus

4. Après dégradation de la paroi

3. Plasmolyse et macération enzymatique pectocellulosique, libération des

protoplastes

Figure IV.6.a. Schéma de principe d’obtention des protoplastes

Parenchyme Digestion enzymatique de Suspension de

de jeunes feuilles la paroi protoplastes

Enzymes de lyse de la paroi

pectocellulosique

+
Ajouts d'éléments stabilisants

(sucres, sels minéraux)

Figure IV.6.b. Schéma de principe d’obtention des protoplastes

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Figure IV.6.c. Schéma de principe d’obtention de protoplastes

Photo IV.5. Un protoplaste10 isolé : on observe de nombreux chloroplastes

1) Plasmolyse

10 Un protoplaste, c’est une cellule végétale non sexuelle débarrassée de sa paroi pectocellulosique. En l'absence de paroi,
la cellule devient parfaitement sphérique.

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La cellule est soumise à une pression osmotique élevée par l'ajout de sucres à la
solution. Cette opération a essentiellement pour but d'éviter l'éclatement de la cellule après
disparition de sa paroi squelettique. Elle facilite également le détachement de la cellule de la
paroi squelettique en concentrant la cellule sur elle-même.
2) Dégradation de la paroi pectocellulosique
 Elle est obtenue par l'intermédiaire d'enzymes qui sont à déterminer pour chaque
espèce.
 Les conditions du milieu pour la réalisation de ces opérations sont : (la température :
22°C, le pH : 5,5, la lumière : 2000 à 4000 lux, la durée : 16 à 24h).
 Les protoplastes obtenus sont rincés plusieurs fois, puis centrifugés pour éliminer
tous les déchets végétaux.
 Après dilution, ils peuvent être repiqués en milieu liquide agité ou sur gélose.
 Le milieu est un milieu comprenant les éléments classiques de la culture in vitro,
avec une concentration en sucre élevée (10 à 12%).
 Après deux ou trois jours, ils reconstituent leur membrane cellulosique.
 Ils peuvent alors entrer en division et évoluer vers un cal 11 puis un embryon ou un
méristème.

Figure IV.7. Culture in vitro des protoplastes

11
Le cal est un tissu indifférencié issu de cellules parenchymateuses, il peut être obtenu à partir des différents
organes des différentes espèces. L’aptitude à la callogenèse est influencée par différents facteurs comme la nutrition
minérale les hormones de croissance et les facteurs environnementaux.

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II.4.3. Applications
1) L'hybridation somatique
La propriété la plus importante des protoplastes est leur capacité à fusionner entre eux
lorsqu'ils sont placés dans un milieu approprié. Cette technique permet de surmonter les
barrières liées à la reproduction sexuée et de créer de nouvelles combinaisons entre noyau et
cytoplasme.
2) La transformation génétique (la transgénique)
Du fait de l'absence de la paroi pectocellulosique, l'introduction directe de l'ADN dans
les cellules est facilitée.
3) Les agents stabilisants
Ordinairement, l'appel d'eau provoqué par le potentiel osmotique de la vacuole de la
cellule est contrebalancé par la paroi végétale.
La suppression de la paroi doit donc être compensée par l'adjonction dans le milieu
d'agents plasmolysants, qui abaissent le potentiel osmotique, tels que des sucres ou des sels
minéraux en concentrations déterminées.
II.4.4. Fusions cellulaires
Les protoplastes sont capables de fusionner entre eux grâce à l'action du PEG
(Polyéthylène Glycol de 15 à 30%). La fusion de deux cellules à 2 N chromosomes amène
théoriquement l'obtention d'une cellule à 4 N chromosomes. Les hybrides ainsi obtenus sont
des hybrides végétatifs (encore appelés hybrides somatiques).
o Exemples :
 En 1972, une fusion entre deux protoplastes de Nicotiana glauca et Nicotiana
langsdorfii a donné un hybride somatique tout à fait semblable à l'hybride sexué,
réalisé lui aussi avec ces mêmes espèces.
 Fusion somatique entre "pomme de terre" et "tomate", avec obtention de la
"pomate", hybride qui présente des caractères intermédiaires des deux parents.
Extraordinaire plante de laboratoire, mais qui n'est pas exploitable en pratique.
Toutefois, les réussites sont loin d'être très importantes et le taux d'échec est élevé car
la fusion des deux cellules somatiques peut donner des résultats très variés :
 Les noyaux et les cytoplasmes fusionnent mais des chromosomes disparaissent.
On obtient un hybride somatique aneuploïde stérile.
 Noyaux et cytoplasmes fusionnent sans perte de chromosomes : c'est l'hybride
somatique à 4 N chromosomes fertile.

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 Les cytoplasmes fusionnent mais pas les noyaux ; on obtient alors un hybride
somatique avec le noyau de l'un des parents et un cytoplasme hybride. On emploie
quelquefois le terme de "cybride" pour désigner cet hybride somatique.
 Toutes les solutions intermédiaires sont possibles avec des fusions partielles des
noyaux ou des cytoplasmes. Mêmes si les réussites horticoles sont encore très peu
nombreuses, cette technique ouvre des perspectives nouvelles et variées.

Figure IV.8.a. Schéma récapitulatif de différentes techniques de culture in vitro chez les
végétaux

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Figure IV.8.b. Schéma récapitulatif de différentes techniques de culture in vitro chez les
végétaux
III. Acclimatation
L'acclimatation12 des plants issus de vitroculture est la dernière étape de ce mode de
multiplication. Il est, en effet, important de bien "passer " ce stade, sous peine de voir annuler
les efforts précédents.
Pour cela, il faut maîtriser parfaitement trois éléments :
a) Le climat.
b) Le substrat.
c) La protection sanitaire.
III.1. Climat
Avant d'évoquer chaque paramètre du climat, il faut se souvenir que :
1) La plantule née in vitro vit en atmosphère saturée où les mouvements d'air sont nuls.
2) La température assurée est relativement élevée et très régulière.
3) La lumière est artificielle, la "plantule" ne connaît donc pas le soleil.
De ce fait, la plantule est extrêmement sensible et fragile à toutes les "agressions
climatiques", même minimes, qui sont le lot quotidien des plantes en serre traditionnelle. Il

12 Acclimatation : ou appelée encore sevrage, c'est l'adaptation à un nouveau climat et à un nouveau milieu.

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faudra donc, dans un premier temps, placer ces plants dans des conditions très proches de
celles qu'ils connaissent.
III.1.1. Hygrométrie
Venant d'une atmosphère saturée, la jeune plante doit croître dans des conditions
voisines. Pour cela deux techniques sont couramment utilisées :
1) Mise à l'étouffée
Réalisée avec des films plastiques, cette technique est comparable à ce que l'on connaît
pour le bouturage traditionnel. Après quelques jours, une aération très progressive habitue les
jeunes plants à l'atmosphère de la serre. Demandant peu d'investissement, cette méthode
donne des résultats très satisfaisants sur les espèces dont l'acclimatation n'est pas trop délicate.
2) Brouillard artificiel
Également utilisé en multiplication traditionnelle, particulièrement pour les végétaux
ligneux, cette technique met en suspension dans l'air de minuscules gouttelettes d'eau,
assurant ainsi une hygrométrie saturée sans pratiquement apporter d'eau au niveau des
substrats. La fréquence de la diffusion est graduellement réduite afin " d'endurcir" les
plantes. Ce système qui donne d'excellents résultats, est pratiquement indispensable pour
réaliser l'acclimatation des plantes délicates.
III.1.2. Lumière
Venant d'une chambre de culture où la lumière est artificielle, la jeune plante "ne
connaît pas les rayons du soleil" et elle y sera très sensible.
Il faut, dans un premier temps, assurer un ombrage correct, puis progressivement les
habituer à la lumière naturelle.
III.1.3. Température
Il faut assurer une température assez proche de celle de la chambre de culture, en
général aux environs de 20°C. Cette température assure également un départ de végétation
rapide.
Après plusieurs jours, elle peut être progressivement diminuée, pour assurer la
transition avec la température de culture.
III.2. Substrat
En dehors des qualités traditionnelles d'un substrat de multiplication léger et drainant,
il doit être irréprochable sur le plan sanitaire. Une désinfection est indispensable, sauf pour les

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substrats naturellement sains. Le plus souvent, on utilise de "la tourbe 13 blonde" ou des
mélanges "tourbe- perlite".
III.3. Protection sanitaire
Commencée avec le substrat, la protection sanitaire doit être rigoureuse, sévère et
suivie. Il faut particulièrement surveiller les attaques cryptogamiques et être attentif aux
pesticides utilisés quant à leur choix et leur dosage. Les risques de brûlure sur des plants très
fragiles sont grands.

13 La tourbe est une matière organique fossile, formée de débris végétaux. Elle forme la majeure partie des sols saturés en
eau comme les tourbières.

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