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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Centre Universitaire d’El Tarf


Institut des Sciences Vétérinaires

THESE DOCTORALE

en Sciences Vétérinaires Option : Microbiologie

THEME

"ETUDE DE PREVALENCE ET ANALYSE DU RISQUE


DE LISTERIA MONOCYTOGENES DANS LES LAITS
CRUS DANS LA REGION CENTRE "

Présentée par : EL HADJ AHMED LEBRES

Devant le jury

Pr R. OUZROUT : Président
Pr D. GUETARNI : Directeur de Thèse
Pr N. DEKKAR : Examinateur
Pr A. SOUKEHAL : Examinateur
Pr M. BELKAID : Invité

Le 05 Mars 2006

1
Je remercie vivement…
Le Professeur Miloud BELKAID, Directeur Général
de l’Institut Pasteur d’Algérie, pour avoir guidé et
encouragé mes timides avancées vers la voie Doctorale et
pour avoir soutenu l’ensemble de ce travail par des moyens
matériels.
Le Professeur Rachid OUZROUT, Recteur du Centre
Universitaire d’El-Tarf pour avoir accepté de m’inscrire en
Thèse Doctorale et pour avoir accepté de présider le jury.
Le Professeur Djamal GUETARNI, enseignant à
l’institut de Biologie, Université de Blida, pour avoir
accepté de diriger ce travail, pour ses judicieux conseils, ses
chaleureux encouragements et plus particulièrement pour
sa patience durant ces trois années.
Le Professeur Nourreddine DEKKAR, Chef du
Service Epidémiologie au CHU BEO – Alger et Officier de
liaison de l’OMS en Algérie, pour avoir accepté de juger ce
travail.
Le Professeur Abdelkrim SOUKEHAL, Chef de Service
d’Epidémiologie au CHU – Béni Messous – Alger, pour
avoir accepté de juger ce travail.
Que chacun d’entre vous soit ici vivement remercié de
m’avoir fait l’honneur d’accepter de participer à ce jury et
le plaisir d’assister à ma soutenance, ainsi que pour
l’attention et l’intérêt particuliers que vous avez apporté à
ce travail.
2
Je remercie également…
Le Docteur Jocelyne ROCOURT, Responsable du
Laboratoire National de Référence des Listeria à l’Institut
Pasteur de Paris, Chef du Programme Food Safety OMS-
Genève puis Directrice de l’institut Pasteur de Yaoundé –
Cameroun, pour ses précieux conseils et ses multiples
orientations tout au long de ce travail.

L’ensemble du personnel de mon laboratoire à l’institut


Pasteur d’Algérie avec à leur tête Mme Fawzia Mouffok,
Akila, Chafika, Samia, Radia, Djaouida, Malika, Farida,
Halima, Yacine, Djamal, Badreddine, Brahim, Mohamed,
Karim, Hakim, Souâad, Farida et Houria.
Un travail scientifique ne saurait se réduire à une réalisation
isolée. Que chacun d’entre vous soit ici très sincèrement
remercié d’avoir contribué à l’aboutissement de ce travail.

L’ensemble du personnel de la Direction des Affaires


Internationales de l’Institut Pasteur de Paris et à leur tête
Michèle Boccoz, pour m’avoir intégré dans une sphère
universitaire internationale, qui m’a été d’une aide très
précieuse durant ces dernières années.

Enfin, je souhaite tout particulièrement adresser mes


chaleureux encouragements à toutes celles et à tous ceux qui
s’engagent cette année, dans une aventure Doctorale, Amina,
Naima, Seddik, Smain, Mustapha, et Saïd, sans oublier notre
inoubliable informaticien Rédha.

3
Je dédie cette thèse…
Avec une attention particulière à la mémoire de mon
Père et à celle de mon Frère Smain, Que Dieu le tout
puissant les accueille en son vaste paradis.
A ma Mère, pour sa gentillesse, son affection, sa
douceur, sa tendresse, ses encouragements éternels et qui
sans elle rien n’aurait été possible.
A ma Femme, pour son attachement, ses chaleureux
encouragements, sa vive compassion à ma réussite et
surtout pour sa compréhension et sa patience.
A mes Adorables Enfants, Nassiba et Lamine, à qui je
souhaite pleins succès.
A mon Frère Farouk, qui a toujours représenté à nos
yeux, l’image d’un père attentif et respectueux, un exemple
à suivre.
A mon Frère Rachid, pour sa gentillesse et sa
disponibilité.
A mes Sœurs.
A mes Beaux Parents.
A mes Amis.
A tous les Miens.
Enfin, à tous ceux qui de près ou de loin, ont collaboré
à la réalisation de ce travail, en guise de reconnaissance.
4
TABLE DES MATIERES
RESUME 1

PARTIE I : GENERALITES. 2

Chapitre I : Introduction. 3
Chapitre II : Historique. 5
Chapitre III : Taxonomie 8
Chapitre IV : Clinique de la listériose. 9
IV.1.En médecine vétérinaire : 9
IV.1.1.L’avortement, 10
IV.1.2.L’encéphalite à Listeria. 11
IV.2.En médecine humaine : 14
IV.2.1.Formes foeto-maternelles et du nouveau-né. 14
IV.2.2.Formes de l'adulte. 15
IV.3.Immunité. 17
IV.4.Portage. 17
IV.5.Durée d'incubation. 17
Chapitre V : Epidémiologie de la listériose. 18
V.1.En médecine vétérinaire, 18
V.2.En médecine humaine. 19
Chapitre VI : Mode de transmission. 22
V.1.En médecine vétérinaire, 22
V.2.En médecine humaine. 23
Chapitre VII : Dose infectante. 24
Chapitre VIII : Ecologie des Listeria. 26
VIII.1.Le lait cru, 28
VIII.2.Le troupeau laitier, 28
VIII.3.L’ensilage, 29
VIII.4.La terre et le sol, 32
VIII.5.les autres alimentations animales. 32

Chapitre IX : Bactériologie. 33
IX.1.Structure et morphologie. 33
IX.2.Culture et croissance. 35
IX.3.Caractères biochimiques. 36
IX.4.Evolution des techniques de recherche des Listeria : 39
IX.4.1.Méthodes bactériologiques. 40

5
IX.4.2.Méthodes immunochimiques. 44
IX.4.3.Méthodes immunophysiques. 45
IX.4.4.Méthodes physiques. 46
IX.4.5.Méthodes de biologie moléculaire. 47
IX.5.Sérotypie. 49
IX.6. Conservation des souches 51
Chapitre X : Pouvoir pathogène des Listeria. 52
X.1.L’infection par Listeria monocytogenes : 52
X.1.1.Pouvoir pathogène expérimental : in vivo. 52
X.1.2.Physiopathologie de la listériose. 52
X.1.3.Description du cycle infectieux au niveau cellulaire
in vitro, 55
X.2.Les déterminants génétiques et moléculaires du pouvoir
pathogène de Listeria monocytogenes. 57
X.2.1.Entrée dans les cellules. 57
X.2.2.Le mouvement intracellulaire de Listeria monocytogenes
et le passage de cellule à cellule. 59
Chapitre XI : Traitement de la listériose. 60
XI.1.En médecine vétérinaire, 60
XI.2.En médecine humaine. 61
Chapitre XII : Sensibilité des Listeria aux antibiotiques. 62
Chapitre XIII : Prophylaxie et recommandations. 63
XIII.1.Prophylaxie dans les élevages, 63
XIII.2.Prophylaxie dans les industries, 64
XIII.4.Prophylaxie chez l'homme. 65

PARTIE II : MATERIEL ET METHODES. 67


Chapitre I : Prélèvements. 68
Chapitre II : Méthodes d’analyses 70
II.1. Méthode qualitative : ISO 11290-1. 70
II.2. Méthode quantitative : ISO 11290-2. 86
II.3. Approche des risques. 92

6
PARTIE III : RESULTATS. 93
Chapitre I : Résultats 94
Chapitre II : Analyse qualitative 97
Chapitre III : Analyse quantitative. 99

PARTIE IV : DISCUSSION 106


Chapitre I : Discussion 107
Chapitre II : Analyse du risque 111
II.1. Evaluation du risque 112
II.1.1. Identification des dangers 113
II.1.2. Caractérisation des dangers 115
II.1.3. Evaluation de l’exposition au risque 117
II.1.4. Caractérisation des risques 124
II.2. Gestion du risque 125
II.3. Communication sur les risques 127

PARTIE V : CONCLUSION 128

PARTIE VI : RECOMMANDATIONS. 130

PARTIE VII : REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 134

ANNEXES 151

7
Liste des Abréviations

ADN : Acide Désoxyribo Nucleïque


AFNOR : Association Française de Normalisation
AFSSA : Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments
API : Analytic Prophylactic Index
ARN : Acide Ribo Nucleïque
CAMP : Christie, Atkins , Munch , Petersen
CCFH : Comité du Codex sur l’Hygiène Alimentaire
CDC : Centers for Disease Control and Prevention (USA)
DLC : Date Limite de Consommation
DLUO : Date Limite d'Utilisation Optimale
DMI : Dose Minimale Infectieuse
FDA : Food and Drugs Administration
FAO : Food and agriculture organization
FIL : Fédération Internationale de Laiterie
GC : Guanine Cytosine
HACCP : Hasard Analysis Critical Control Point
ISO : International for Standardisation Organisation
MTA : Maladie à Transmission Alimentaire
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
PCR : Polymerase Chain Reaction
PNDA : Programme National de Développement Agricole
RM : Rouge de Méthyl
TSAYE : Tryptone Soja Agar Yeast Estract
UFC : Unité Formant Colonie
USDA : United States Drug Administration
VP : Voges Proskauer
WHO : World Health Organisation

8
RESUME

L’incidence croissante des maladies provoquées par les microorganismes


transmis principalement par les aliments tels que Listeria monocytogenes,
Salmonella enteritidis, Campylobacter jejunii a été signalée dans de nombreux
pays, au cours de ces dernières décennies. Des menaces graves sont alors
apparues telles que : Escherichia coli O 157 : H7, la dioxine, le prion
responsable de l’encéphalopathie spongiforme bovine et récemment encore le
virus de la grippe aviaire.

Les maladies d’origine alimentaire ont un impact direct non seulement sur la
santé du consommateur mais aussi sur le développement. Par conséquent, le
renforcement des capacités en matière de sécurité sanitaire des aliments est
indispensable dans la plupart des pays, notamment dans les pays en
développement.

En Algérie, la production nationale en lait cru et le développement des industries


laitières sont en nette croissance. Notre inquiétude est grande face à Listeria
monocytogenes, bactérie pathogène, ubiquiste, résistante, principalement
véhiculée par le lait cru et agent causal de la listériose considérée comme la
maladie des pays industrialisés.

Nos résultats ont confirmé la présence de Listeria monocytogenes au taux de


1,90 %, loin d'être négligeable mais similaire à ceux rapportés par la littérature,
qui prouve qu'on n'est pas à l'abri d'une éventuelle épidémie. Le dénombrement
de Listeria monocytogenes nous a permis de classer les laits en trois catégories
dont 12 à la limite de l’acceptabilité, 5 présentant un danger potentiel et 2
présentant un risque réel de listériose. L’analyse du risque a montré que parmi
les populations susceptibles, certaines personnes continuent de consommer des
aliments (lait cru ou caillé) pour lesquels, le potentiel de croissance de Listeria
monocytogenes, la durée de conservation et l’intégrité de la chaîne de froid ainsi
que la fréquence et la taille des portions journalières ingérées, constituent en
somme, des facteurs augmentant à un niveau alarmant, le risque d’épidémie. Il
est donc temps, de redoubler de vigilance en mettant en place dès à présent, une
réglementation adéquate suivie et contrôlée ainsi qu’une bonne communication
sur les risques en vue de sensibiliser au mieux la population.

Mots clés : Lait, Listeria, Listériose, Dénombrement, UFC, Danger, Risque,


Analyse du risque.

9
10
Chapitre I Introduction

Chapitre I : Introduction.

La sécurité sanitaire des aliments a été au centre des préoccupations de


l’humanité, dès les premières civilisations. La fermentation, une méthode
primitive de préservation des aliments, encore employée de nos jours, était alors
connue des civilisations égyptiennes et chinoises.
Lors des dernières décennies, la découverte des microorganismes, les progrès
réalisés dans l’industrie alimentaire et l’expansion rapide du commerce mondial
des produits alimentaires, ont rendu nécessaire l’adoption de diverses mesures
de sécurité sanitaire des aliments (79, 149,155).
Le système des Nations Unies a, dès lors, reconnu le rôle crucial de cette
dernière et ses conséquences aussi bien sur le plan sanitaire que sur le plan
économique. Ainsi, en 1963, fut crée le Codex Alimentarius dans le but de
protéger la santé des consommateurs et pour assurer des pratiques loyales dans
le commerce international. Des déclarations et des accords internationaux ont
été formulés. Des stratégies de prévention innovatrices ont été mises au point
pour assurer la sécurité des approvisionnements alimentaires. L’une des plus
importantes et des plus récentes est l’analyse du risque et le système HACCP
pour l’analyse des dangers et la maîtrise des points critiques (79).
En dépit des ces efforts, on estime que dans les pays développés un tiers de la
population est victime chaque année de maladies d’origine alimentaire. La
situation est encore plus grave dans les pays en développement où les cas
signalés ne représentent que la pointe de l’iceberg.
Aujourd’hui encore, la découverte des microorganismes émergents ou ré
émergents semble prendre le pas et les maladies diarrhéiques d’origine hydrique
et alimentaire tuent chaque année trois millions de personnes dans le monde. Les
enjeux actuels sont donc très diversifiés (79, 84).
Listeria monocytogenes, microorganisme émergent et principal vecteur de la
listériose a elle été, au centre de notre travail.
La listériose, maladie d’origine alimentaire certaine, quasiment inconnue des
médecins, des vétérinaires et des microbiologistes jusqu'en 1960. Actuellement,
elle intéresse désormais à la fois les cliniciens (médecins et vétérinaires), les
épidémiologistes et les microbiologistes (médicaux et alimentaires), les
généticiens ainsi que les autorités administratives. A cela s’ajoutent
périodiquement les médias, notamment lors des épidémies qui jalonnent
l’histoire de cette infection depuis plus d’une dizaine d’années.
A ce stade, il est important de rappeler que la listériose est une zoonose
essentiellement animale et accidentellement humaine.

11
Chapitre I Introduction

Chez l’animal, de nombreuses observations ont été faites et font état de cas
sporadiques, de foyers endémiques et/ou de portages asymptomatiques observés
sur diverses espèces animales (194).
Chez l’homme, la listériose invasive est une maladie qui atteint
préférentiellement la femme enceinte et l’enfant qu’elle porte, les
immunodéprimés et les personnes âgées. Elle se manifeste principalement sous
formes de cas sporadiques ou d’épidémies engendrant des méningites, des
méningo-encéphalites, des septicémies ou des avortements prématurés (164,
165, 166). Mais pour peu, qu’un de ces sujets soit en contact direct avec les
animaux d’élevage, qu’on n’est plus à l’abri d’une transmission directe ou
indirecte.
En industrie laitière, les Listeria peuvent contaminer directement ou
indirectement les produits et l’environnement par le biais des laits crus
contaminés, entraînant ainsi d'énormes pertes aussi bien sur le plan de la santé
publique que sur le plan économique.
De nos jours, le recours moderne passe nécessairement par l’analyse du risque
qui suppose l’existence d’une solide base scientifique, chargée d’une étude
profonde sur l’évaluation des risques et dont les résultats seront exploités par les
gestionnaires du risque dans le but d’asseoir de nouvelles dispositions
réglementaires adaptées. Les consommateurs seront quant à eux, sensibilisés par
un processus d’information appelé "communication sur les risques". Les coûts et
les avantages des réglementations en matière de sécurité sanitaire des aliments
sont souvent intangibles et difficiles à traduire en quantité monétaire. Il est
souvent difficile de confronter les risques, qui pourraient être exprimés en
termes subjectifs, aux avantages susceptibles d’être exprimés en termes
économiques (79). Autrement dit, comment pouvons-nous quantifier la qualité
de vie ou pire encore le coût d’une vie humaine ?
Enfin, quelque soit la politique adoptée en matière de sécurité sanitaire des
aliments, la difficulté est de la mettre en œuvre et de faire respecter les lois et
règlements y afférents. Il est donc nécessaire de combler le fossé entre la
politique et la pratique, ou mieux encore entre la théorie et la réalité avec
comme mot clé, la traçabilité, elle-même conçue sur des preuves tangibles.

12
Chapitre II Historique

Chapitre II : Historique.

La listériose est due à Listeria monocytogenes, espèce type du genre, qui


est une bactérie à Gram positif, ubiquiste contaminant le sol, les végétaux, les
ensilages, les murs des étables et par conséquent l'homme.
Listeria monocytogenes, doit son nom en grande partie à la mémoire du Docteur
John Lister. Elle est caractérisée par une élévation anormale du taux de
monocytes d’où son nom de monocytogenes.
Décrite pour la première fois en 1926 par Murray -–Webb et Swann, lors d’une
épizootie chez des lapins et des cobayes qui présentaient une mononucléose
sanguine et des lésions de nécrose au niveau du foie . Ils lui donnèrent alors le
nom de Bactérium monocytogenes. Mais en réalité, l’histoire de Listeria
monocytogenes commença bien avant (14, 49).
Hulphers , vétérinaire Suédois, fut le premier auteur à avoir décrit cette infection
chez un lapin atteint de méningite en 1911.
Dumon et Cotoni, isolèrent la même souche à partir d’un liquide
céphalorachidien (LCR) chez homme et cette souche demeure toujours
conservée au niveau de l’Institut Pasteur de Paris depuis 1921 (43, 49).
D’autres chercheurs isolèrent la même bactérie dans des circonstances
différentes à partir de 1926, parmi lesquels :
- Pirie, chez la gerbille en Afrique, décrite sous le nom de Listerella
hepatolytica en 1927.
- Nyfeld , chez l’homme lors d’un syndrome mononucléosique , décrite sous le
nom de Bacterium monocytogenes hominis en 1929.
- Burn , démontre le rôle de la bactérie dans l’infection périnatale en 1933.
- Sohier et coll , ont mis en évidence, à partir d’un sang de bœuf cuit, une seule
souche de Listeria qui se différencie de Listeria monocytogenes par la
réduction des nitrates et l’ont décritent sous le nom de Listeria denitrificans
en 1948. Toutefois, cette dernière a été définitivement exclue du genre
Listeria lors de la récente révision de la taxonomie. Cette bactérie
corynéforme a été transférée dans le nouveau genre Jonesia dont elle
constitue l’unique espèce.
- Reiss , Potel et Krebs (Allemands) décrivirent la forme septicémique du
nouveau – né , et les travaux de Seeliger ont montré que Listeria
monocytogenes joue un rôle assez important aussi bien en pathologie
humaine qu'en pathologie animale à partir de 1951.

13
Chapitre II Historique

Par ailleurs, ce n'est qu'en 1960 que les infections humaines à Listeria ont été
diagnostiquées, et qu'en 1981 qu'on a observé les premières flambées de
Listériose et démontré que la bactérie responsable de la maladie pouvait être
transmise par certains aliments, en plus des modes habituels de transmission. Le
CDC estime à 1850 cas d'infection causés annuellement aux USA, dont 425 cas
mortels soit 23 % (164, 178).

Depuis, on a enregistré dans le monde :


 En 1981, au Canada 41 cas dont 17 morts parmi lesquels 83 % étaient des
cas périnataux, ayant pour origine une salade de choux conservée à +4C et
vendue dans un supermarché ; les choux provenaient d'un champ fertilisé
avec des crôtins de moutons contaminés.
 En 1983 à Boston, 49 personnes dont 14 morts parmi lesquels 14 %
étaient des cas périnataux, ayant pour origine un lait pasteurisé sans aucune
confirmation.
 Entre 1983 et 1987 en Suisse, 122 cas, dont 34 morts, ayant pour origine,
un fromage à pâte molle (Vacherin Mont-d'Or) contaminé par Listeria
monocytogenes
 En 1984/85, en Californie du Sud, 142 cas dont 48 morts parmi lesquels
85 % étaient des cas périnataux, ayant pour origine des fromages frais de
type Mexicain, fabriqués aux USA à partir de lait américain provenant d'un
troupeau infecté.
 En 1987 à Philadelphie, 32 cas dont 11 morts. La cause ne fut jamais
identifiée.
 En 1988 aux Massachusetts, 56 cas et une quarantaine de cas en 1983
ayant pour origine probable un lait pasteurisé.
 En 1992, en France, 279 cas de listériose dont 63 décès ayant pour origine
la langue de porc en gelée.
 En 1993, 39 cas ont encore été recensés en France suite à la contamination
par des rillettes.
 En 1995, en France, 20 cas dont 4 décès. ayant pour origine un fromage
appelé "Le Brie de Meaux".
 En 1997, en France, 15 cas dont 2 morts, lors d’un avortement et un
enfant mort à la naissance, ayant pour origine des fromages à pâte molle.
 En 1998, aux Etats-Unis d’Amérique, 100 cas d'infection dont 20 mortels
comprenant 2 avortements, ont été recensés dans 11 Etats (notamment en
Ohio, à New York, au Tennessee, au Massachusetts, en Virginie-Occidentale,
au Michigan, au Connecticut, en Oregon, Vermont et en Georgie). Des
saucisses de type hot-dog étaient la source de l'infection. Le 22 décembre, le
fabricant, Bil Mar Foods, a volontairement rappelé des lots de production
particuliers de saucisses (15 millions de livres) et d'autres produits de viande
pouvant être contaminés.

14
Chapitre II Historique

 En 2000 et le 06 Mai le Président Clinton, a prononcé devant le congrès


américain à la maison blanche (Washington), un discours relatif à la stratégie
globale de prévention et de lutte contre Listeria monocytogenes
particulièrement dans les hot dogs et ce suite au rapport du CDC.

En Algérie, ont été décrit :


 Le premier cas clinique de listériose humaine par Benallègue et coll en
1967 (46).
 Bellouni R (1989) :
 11 souches de Listeria, réparties comme suit : 2 Listeria
monocytogenes, 1 Listeria welshimeri, 2 Listeria seeligeri et 6 Listeria
innocua. à partir de 87 placentas de bovins.
 1 souche de Listeria innocua à partir de 16 fromages analysés (43).
 Ramdani N (1999), 5 cas humains (146, 147).
 Naim M (Hôpital Central de l’Armée – 2000), 1 cas humain (121, 146).
 Lebres E (2000) :
10 souches de Listeria dont 7 Listeria monocytogenes et 3 Listeria
innocua à partir de 419 échantillons de denrées alimentaires autres que le
lait (110).
 Lebres E & Guetarni D (2004) :
28 souches de Listeria dont 10 Listeria monocytogenes et 17 Listeria
innocua et 1 Listeria ivanovii à partir de 1432 échantillons de laits crus
(110, 111).

15
Chapitre III Taxonomie

Chapitre III : Taxonomie.


En raison de sa morphologie, petit bacille à Gram positif, Listeria a
longtemps été considérée comme une bactérie corynéforme; il est actuellement
admis que les bactéries de ce genre appartiennent à la branche phylogénétique
des Clostridium, voisin des genres Brochothrix, Lactobacillus, Staphylococcus,
Streptococcus et Bacillus (37, 174).

Dés 1966, la recherche de plus en plus fréquente de Listeria dans des niches
écologiques variées a conduit à l’isolement de souches atypiques dont l’étude
taxonomique a montré qu’il s’agit bien de nouvelles espèces.

En 1988, et compte tenu des travaux de J. Rocourt (174), dans le but de réviser
la nomenclature des Listeria, on admet aujourd'hui, que le genre Listeria se
définit sur le plan de la taxonomie par :
- un G + C % DNA compris entre 36 et 46 %,
- un peptidoglycane branché en variation A1 Gamma associé à un type d’acide
teichoïque ( polyribitol – phosphate ),
- la présence d’acides lipoteichoïques,
- l’absence d’acide mycolique et MK7, comme principal isoprenoid quinone.
(37, 62).
Actuellement 6 espèces sont donc reconnues dans ce genre, en plus de Listeria
monocytogenes, il s’agit de :

 Listeria grayi qui a été découverte en 1966 par Larsen et Seeliger à partir
d’une coproculture chez un chinchilla ; cette souche se caractérise par la
fermentation du mannitol (49, 172, 174).

 Listeria murrayi qui a été découverte en 1971 par Welshimer et Meredith à


partir d’une végétation ; une fois encore cette souche se caractérise par la
fermentation du mannitol et la réduction des nitrates (172, 174).

 Listeria ivanovii qui a été découverte en 1984 par le microbiologiste bulgare


Ivanov lors d’avortements chez des brebis dans une ferme ; cette souche
s’est caractérisée par une forte hémolyse, donc pathogène (49).

 Listeria innocua qui a été découverte en 1981 par Seeliger à partir de


l’environnement et de l’intestin de l’homme et des animaux ; cette souche est
par contre non hémolytique donc non pathogène (174).

 Listeria seeligeri et Listeria welshimeri qui ont été mises en évidence en


1982, lors des hybridations ADN / ADN (174).

16
Chapitre IV Clinique de la listériose

Chapitre IV : Clinique de la listériose.


IV.1.En médecine vétérinaire.
En médecine vétérinaire, la listériose est une des affections qui s'estompe
progressivement dans l'esprit du clinicien parce qu'elle n'est que rarement
diagnostiquée.
Bien qu’elle affecte différentes espèces animales (cf. tableau I), elle peut évoluer
sous des formes cliniques de façon sporadique ou endémique. Elle peut être
également retrouvée en portage asymptomatique.
Tableau I : Espèces animales affectées par la listériose (194).

Espèces Expression maladies Fréquence / Apparition


Bovins Formes cliniques Maladie sporadique ou
Ovins Formes cliniques endémique possible, rares
Caprins Formes cliniques plus enzooties dans les troupeaux
Ruminants sauvages : Chevreuils rares
Lamas , Buffles
Equins Formes cliniques plus Rares cas dans les élevages
Baudet rares
Porcins Formes cliniques plus Rares cas dans les élevages
rares,
Porteurs sains surtout
Carnivores : Chiens , Chats Formes cliniques très
Carnivores sauvages : Renard , Raton rares,
laveur , Furet , Vison , Martre , Léopard Porteurs sains
Coyotte
Lagomorphes : Lièvres, Lapins Formes cliniques Cas sporadiques dans les
élevages.
Rongeurs : Rat , Souris , Cobaye , Formes cliniques et Formes endémiques ou
Chinchilla , Gerbille , Lemming , Porteurs sains enzootiques
Ecureuil , Campagnol.
Oiseaux Formes cliniques Cas sporadiques dans les
élevages.
Volailles : Poule, Dindon, Pintade,
Canard, Oie.
Pigeon, Merle, Moineau, Mouette, Formes cliniques très Cas individuels
Freux, Corbeau rares,
Gibier à plumes : Faisan, Perdrix. Porteurs sains
Perroquet, Canari, Hibou des neiges,
Poissons : Carpe, Tanche, Truite, Silure Formes cliniques Cas sporadiques dans les
étangs.
Batraciens : Grenouille, Crapaud, / Porteurs sains
Salamandre
Reptiles ophidiens : Serpents / Porteurs sains
Reptiles chéloniens : Tortues / Porteurs sains

17
Chapitre IV Clinique de la listériose

Chez les bovins, la listériose n'est généralement pas très bien connue et un
diagnostic étiologique précis n'est pas dénué de difficultés. Elle se présente
habituellement et essentiellement sous deux formes cliniques:
- l'avortement,
- l'encéphalite ou méningo-encéphalite.

Cependant, on peut aussi observer des formes septicémiques chez le jeune veau
ou des mammites à Listeria chez la vache, mais celles ci sont
proportionnellement plus rares.

IV.1.1.L'avortement.
L'utérus paraît être l'organe de loin le plus sensible au point que c'est cette
localisation qu'on trouve chaque fois que l'infection s'installe chez un animal
gravide. La listériose affecte en premier lieu les enveloppes fœtales et se
transmet au veau par voie sanguine, secondairement les liquides amniotiques
suite à une élimination bacillaire par voie urinaire (55, 85).

La source habituelle d'infection est l'ensilage et l'avortement se situe le plus


souvent entre le quatrième et le septième mois et quelque fois entre le sixième et
le huitième mois. La mort du fœtus est de règle ; il peut être emphysémateux ou
momifié.

Si le veau reste encore vivant au moment de l'avortement, il meurt rapidement.


On peut observer un écoulement vaginal purulent chez la mère avant l'expulsion
du fœtus. Il y a rétention des enveloppes dans les deux tiers des cas.

La fécondation reste ultérieurement possible et il est rare que la mère avorte une
seconde fois.

Dans les quelques cas mortels, la vache sombre dans un état comateux, suite à
l'extension de la listériose au cerveau.

L'affection apparaît surtout en hiver avec un maximum en janvier et février.


Occasionnellement de décembre à avril (113, 184, 187).

Dans 80 % des cas étudiés par Djikstra, les animaux étaient nourris aux
ensilages et l'avortement a lieu le plus souvent quatre semaines après l'ouverture
du silo, ce qui tend à faire croire que c'est là, la durée de l'incubation de
l'infection (50).

18
Chapitre IV Clinique de la listériose

IV.1.2.L'encéphalite à Listeria.
C’est la forme habituelle de listériose des bovins non gravides, et sans doute,
aujourd'hui la cause la plus fréquente d'encéphalite dans cette espèce. L'infection
cérébrale est généralement localisée aux régions de la base, aux pédoncules
cérébraux et au cervelet. Les lésions ne sont pas abondantes, il n'y a pas
d'atteinte des cellules nerveuses et les bacilles sont peu nombreux.

On trouve à l'endroit de l'infection, une réaction à dominance lymphocytaire,


sans caractère pyogène et sans grosse réaction vasculo-sanguine. Ceci est
essentiel pour comprendre le succès thérapeutique.

Du point de vue symptomatologie, il existe une entité clinique caractéristique


qui, à elle seule, tient lieu de diagnostic. Il s'agit de l'encéphalite qui
s'accompagne d'une atteinte du nerf facial trijumeau (50).

L'animal, présente simultanément :


- des troubles nerveux centraux des plus divers : ataxie, mouvements
impulsifs, tremblements locaux ou généralisés.
- de la paralysie unilatérale de l'oreille, de la paupière, de la lèvre ou celle de la
mâchoire inférieure,
- souvent aussi, une conjonctivite du côté de la paralysie et une panophtalmie.
Cette paralysie, surajoutée, intéresse parfois la langue et le larynx rendant la
déglutination impossible. Ce syndrome est également suspect mais il est
moins pathognomonique. En l'absence de ces paralysies, spécialement celle
unilatérale du facial ou celle du trijumeau, le diagnostic devient plus difficile.

Deux caractères particuliers sont néanmoins suffisamment caractéristiques et


constants pour être des éléments de présomption (186, 195).

 le premier caractère est le signe d'une atteinte cérébrale assez localisée. Il y a


régulièrement dominance des symptômes d'un seul côté : anomalie du port
de la tête, symptôme assez particulier, en ce sens qu'il s'agit d'une déviation
latérale du cou ou ataxie d'un seul bipède latéral, mouvement impulsif latéral
(tournis ).

 le second caractère est l'intensité de l'atteinte psychique et la tendance


précoce à une sorte de somnolence.

Même si le vétérinaire intervient tardivement, le caractère unilatéral et cette


somnolence restent des éléments qui ont frappés le propriétaire et qu'on peut
ainsi retrouver après une bonne anamnèse.

19
Chapitre IV Clinique de la listériose

Chez les bovins, l'évolution de l'affection est généralement assez longue,


contrairement à ce qui se passe chez le mouton où la mort intervient en 3 à 4
jours. Les bovins eux, survivent pendant 8 à 15 jours et on voit cette somnolence
se muer progressivement en un véritable coma qui conduit l'animal au décubitus,
reproduisant à ce moment, un tableau très comparable à celui d'une fièvre de lait
du type comateux.

Le délai d'incubation de l'encéphalite paraît plus long que celui de l'avortement.


En conséquence, les accidents d'encéphalite se situent plus tard dans l'année que
les avortements, donc après des périodes d'avortements et le vétérinaire clinicien
doit garder un œil attentif pendant longtemps.

Les principaux symptômes et la fréquence de l'encéphalite bovine à Listéria ont


été rapporté par Dijkstra (50).

- Tremblements musculaires ……………………………… 21


- Tournis à gauche ………………………………………... 23
- Tournis à droite …………………………………………. 22
- Ataxie …………………………………………………… 20
- Mouvements impulsifs …………………………………. 21
- Impossibilité de déglutition ……………………………... 23
- Salivation ………………………………………………… 20
- Paralysie de la langue ……………………………………. 14
- Paralysie faciale unilatérale ……………………………… 8
- Paralysie faciale bilatérale ………………………………. 6
- Larmoiements …………………………………………… 13
- Phénomènes d'excitation ………………………………… 10
- Cécité ……………………………………………………. 29
- Somnolence …………………………………………….. 10
- Paralysie des membres ………………………………….. 18

Les principales manifestations cliniques de la listériose chez les différentes


espèces animales figurent dans le tableau II ci après.

20
Chapitre IV Clinique de la listériose

Tableau II : Manifestations cliniques de la listériose animale (194).

Espèces Manifestations cliniques Fréquence


Bovins , Ovins , Formes abortives Les plus fréquentes
Caprins Formes nerveuses Néonatale le plus souvent
Formes septicémiques Peuvent être associés ou non à d'autres
Formes oculaires : affections
(conjonctivite , kératite , uvéite ) Plus rares , portage le + souvent
Formes mammaires Décrites mais pas systématiques
Formes digestives
Equins Plus rares mais décrites Existent mais très rares
Formes nerveuses 1 % des avortements
Formes abortives décrites chez le poulain
Formes septicémiques
Formes oculaires
Formes digestives
Porcins Rares mais décrites Chez les jeunes animaux mais peuvent
Formes nerveuses guérir spontanément
Souvent porteurs sains
Carnivores Très rares Chez les jeunes animaux , associés à
Formes nerveuses d'autres affections .
Formes septicémiques Très rares mais décrites
Formes cutanées
Animaux porteurs sains
Lagomorphes Formes abortives Fait suite aux deux précédentes , néonatale
Formes nerveuses le plus souvent sur tous les petits d'une
Formes septicémiques portée .
Formes mammaires
Formes respiratoires
Formes cutanées
Formes conjonctivales
Rongeurs Formes septicémiques Le plus souvent maladie endémique dans
Formes conjonctivales et les élevages ou les colonies d'animaux
respiratoires sauvages
Porteurs sains importants
Oiseaux Formes septicémiques le plus Cas sporadiques en élevage, mais certaines
souvent exploitations peuvent être touchées jusqu'à
Formes digestives 40% de mortalité et plus : enzootie
Formes nerveuses et/ou
septicémiques
Poissons Formes septicémiques Cas sporadiques en pisciculture d'étangs
Formes cutanées pouvant être associés ou non à d'autres
pathologies et entraîner une forte mortalité
Associées ou non aux formes septicémiques
Batraciens Porteurs sains /
Reptiles Porteurs sains /

21
Chapitre IV Clinique de la listériose

On remarque qu’il y a prédominance des formes nerveuses et abortives par


rapport aux formes septicémiques et encore plus aux formes localisées
(conjonctivales, oculaires, pulmonaires, digestives et cutanées).
IV.2.En médecine humaine.
En médecine humaine, il y a lieu de distinguer entre :
 la listériose invasive qui peut elle-même, être schématiquement divisée en
deux grands groupes d’infection ; celles du nouveau – né et de la femme
enceinte par opposition à celles de l’adulte et qui se manifeste par l’atteinte du
système nerveux central allant jusqu’à la septicémie. Ces deux cas représentent
les principales formes cliniques (48, 104, 164).
 la listériose non invasive encore appelée "gastroentérite fébrile à Listeria"
qui a été observée principalement durant un certain nombre de poussées où la
majorité des cas ont affiché des symptômes de gastroentérite, tels que diarrhée,
fièvre, céphalées et myalgie, après une brève période d’incubation (Dalton 1997;
Salamina, 1996; Riedo, 1994; Aureli, 2000). Ces poussées ont généralement
comporté l’ingestion de fortes doses de Listeria monocytogenes par des
individus par ailleurs en bonne santé.
Dans la listériose invasive, les organes le plus souvent infectés sont l’utérus chez
la femme enceinte, le système nerveux central et le sang.
IV.2.1.Formes foeto-maternelles et du nouveau –né.
Le premier cas de listériose foeto-maternelle humaine est apparu en 1935 et ce
n’est qu’en 1955 que la relation entre la listériose de la mère et celle de l’enfant
est mise en évidence et comprise du point de vue transmission hématogène
transplacentaire. L’analyse anatomopathologique a permis de décrire les quatre
voies de contamination suivantes (164) :
- La voie hématogène transplacentaire :
Suite à une infection, voire à une septicémie dans le mois qui précède
l’accouchement, les germes traversent le placenta, s’y multiplient en provoquant
des lésions nodulaires disséminées (granulomes) dans toute la masse et
atteignent le fœtus par voie sanguine. Celui ci élimine ensuite les Listeria dans
l’urine contaminant ainsi le liquide amniotique, puis se surinfecte en aspirant en
ingérant ce liquide amniotique riche en germes.
A l’autopsie de l’avorton, les mêmes lésions nodulaires parsèment les différents
viscères particulièrement le foie, la rate et les surrénales.
- La voie ascendante transmembranaire :
La rupture prématurée des membranes est rare et Listeria monocytogenes est
rarement isolée à partir de prélèvement cervico-vaginal, de ce fait, cette voie est
relativement peu fréquente.

22
Chapitre IV Clinique de la listériose

Le point de départ de cette contamination est cervico-vaginal et les Listeria


pénètrent dans la cavité amniotique quel que soit l’état des membranes, rompues
ou non. Si cette contamination est précoce, les germes se multiplient dans le
liquide amniotique, l’enfant s’infecte par ingestion et/ou par aspiration de ce
liquide et souffrira d’une méningite à la naissance.
- La voie endométriale:
Dans cette voie, il s’agit le plus souvent d’un foyer endométrial quiescent et
réveillé lors de la grossesse. Les abcès volumineux, au centre nécrosé,
caséimorphes, peuvent rester localisés, n’entraînant aucun symptôme chez la
mère et l’enfant naît sain ; néanmoins, Listeria monocytogenes peut être
retrouvée dans le méconium.
Toutefois, ces abcès peuvent se compliquer secondairement d’une placentite
miliaire, infecter ainsi l’amnios et le cordon, entraînant alors une infection
endométriale grave du fœtus.
L’origine endométriale de la contamination du fœtus représente le mécanisme le
plus fréquent (164, 166).
- La contamination pendant l’accouchement :
Ce mode de contamination se caractérise par l’absence de lésions du placenta et
des annexes, associé au faible nombre de germes retrouvés chez l’enfant.
La listériose maternelle se traduit par un syndrome pseudo grippal, voire une
discrète pneumopathie associée à des douleurs lombaires, une infection urinaire
ou encore des leucorrhées. Ces symptômes surviennent le plus souvent vers le
cinquième ou le sixième mois, et très souvent l’évolution de l’infection
listérienne conduit la mère à une interruption de la grossesse. Il convient donc de
rechercher ce germe devant toute symptomatologie infectieuse chez la femme
enceinte (104, 117, 164, 166).
La listériose du nouveau - né, se manifeste soit précocement (avant le
quatrième jour après la naissance), soit tardivement, après une période muette de
7 à 21 jours et dans les deux cas, il souffre d’un syndrome méningé, de meilleur
pronostic s’il est traité tôt (164).
IV.2.2.Formes de l’adulte.
Sur le plan clinique, aucune symptomatologie particulière ne permet de
distinguer une méningite à Listeria monocytogenes d’une autre inflammation
méningée d’origine bactérienne. Ces formes s’expriment généralement par des
méningites ou des méningo-encéphalites qui se traduisent tout d’abord par un
état grippal ou par une simple rhinite, mais le plus souvent des signes
annonciateurs et évocateurs s’installent. Les malades souffrent de violentes
céphalées accompagnées d’une somnolence, voire d’un syndrome confusionnel,
dans un état fébrile (164, 166).

23
Chapitre IV Clinique de la listériose

Dans les cas de méningo-encéphalites, l’atteinte de l’encéphale se traduit par des


paralysies diverses souvent accompagnées de manifestations bronchiques. La
recherche du germe à l’examen direct du LCR peut être négative, mais la culture
sera positive (166). Ces formes surviennent essentiellement chez des patients
souffrant d’une affection sous-jacente immunodéprimante.

Enfin, un résumé de 782 cas de listériose déclarés par vingt pays a montré que
43 % étaient des infections liées à la grossesse, et 57 % n’étaient pas liées à la
grossesse. Ces derniers ont été classées à leur tour en catégories: 29 % de
septicémies, 24 % d’infections du système nerveux central et 4 % de formes
atypiques (Rocourt, 1996).
Outre la gravité inhabituelle des signes cliniques, la listériose invasive est
caractérisée par un taux élevé de létalité estimé entre 20 à 30 % (Mead, 1999).
La listériose invasive peut laisser des séquelles (Mc Lauchlin, 1997), mais leur
incidence est rarement estimée ; jusqu’à 11 % des nouveaux-nés et 30 % de ceux
qui survivent à une infection du système nerveux central souffrent de
symptômes résiduels, parfois de séquelles psychiatriques (Rocourt, 1996).
La caractéristique épidémiologique courante de la listériose invasive est une
manifestation assez fréquente de cas sporadiques et la reconnaissance
occasionnelle de poussées épidémiques. La majorité des cas de listériose semble
être sporadique, mais une partie de ces cas sporadiques peuvent être des groupes
d’origine commune non reconnue.
Une étude assez récente a indiqué que 95 % de ces cas sporadiques sont
d’origine alimentaire (Mead, 1999).
Plusieurs poussées épidémiques d’origine alimentaire ont été décrites depuis
1981 et certaines ont touché un grand nombre de patients sur une longue
période : 122 patients en Suisse entre 1985-1987, environ 300 patients au
Royaume-Uni en 1987-1989 et 279 patients en France en 1992 (Rocourt et
Cossart 1997).

24
Chapitre IV Clinique de la listériose

IV.3. Immunité.
Après l’infection, Listeria monocytogenes déclenche une réponse immunitaire à
médiation cellulaire qui, sous l'effet de cytokines, provoque l'afflux de
macrophages vers les sites infectieux constituant des granulomes inflammatoires
où les bactéries sont détruites. Les lymphocytes T mémoire perpétuent un état de
résistance à l'infection. Autrement dit, les convalescents gardent une résistance
acquise de longue durée due à la présence de cellules T-mémoires (47, 105, 106,
107, 114, 166).
Chez la souris, il est démontré qu’après la phase de croissance initiale des
bactéries, apparaissent des lymphocytes T spécifiques. Ces derniers activent les
monocytes sanguins d’origine médullaire dans les foyers infectieux. L’afflux de
macrophages dans les tissus infectés, aboutit à la constitution de granulomes
inflammatoires où les bactéries sont détruites (166).

IV.4.Portage
L’homme tout comme l’animal reste fréquemment porteur sain pendant de longs
mois, même après traitement. Il s’agit d’un portage transitoire et sans
signification clinique, seulement tous les deux peuvent aisément véhiculer ce
germe (170).

Des animaux (bovins, ovins et poulets) ont également été trouvé porteurs sains
au niveau des sécrétions nasales et des matières fécales (185).

Chez l’homme, des travaux similaires, notamment ceux de Seeliger (1961) et


ceux de Gray et Killinger (1966) ont montré la présence de Listeria
monocytogenes dans les matières fécales, la gorge et le pharynx d’individus
sains. Ce portage varie de 0,6 % à 44 % des sujets examinés. Ces variations sont
fonction des individus, de leur profession (éleveurs et vétérinaires) mais aussi
des pays où sont effectuées les enquêtes (61, 104).

IV.5.Durée d’incubation.
La durée d’incubation de la maladie reste actuellement mal connue aussi bien
chez l’homme que l’animal ; néanmoins, elle est estimée entre 3 à 4 jours voire
3 à 4 semaines (77, 164, 168).

25
Chapitre V Epidémiologie de la listériose

Chapitre V. Epidémiologie de la listériose.


Sur le plan épidémiologique, il est important de rappeler qu’avant tout, la
Listériose est une maladie essentiellement animale et accidentellement humaine.
V.1. En Médecine Vétérinaire
Dès les années 1940 et, surtout, depuis les années 1960, le rôle des ensilages
dans la contamination des ruminants a été mise en évidence, c'est pourquoi, elle
reçue le nom de "maladie de l'ensilage". En effet, lors de leur préparation, les
ensilages peuvent être contaminés par un faible nombre de bactéries. En surface
et dans les premiers centimètres de l'ensilage, les conditions d'aérobiose
permettent la multiplication des Listeria et la faible acidification des couches
superficielles de l'ensilage (pH en surface et sur les premiers centimètres
supérieur ou égal à 5) associée à la température du milieu extérieur (un ensilage
de maïs préparé en automne va passer l'hiver à l'extérieur) permettent un
véritable enrichissement sélectif. Compte tenu du fait qu'il s'écoule au minimum
3 semaines et souvent plusieurs mois entre la fabrication d'un ensilage et sa
distribution aux animaux, le nombre de bactéries peut être très important au
7
moment de la consommation (plus de 10 UFC par kg). Lorsque l'ensilage est
mal conservé et/ou mal préparé (notamment un tassement insuffisant),
l'acidification à cœur est insuffisante (pH supérieur ou égal à 5) et l'anaérobiose
n'est pas totale ce qui permet une prolifération des Listeria. Les ensilages ne sont
pas seuls en cause et la pratique de l'enrubannage est également impliquée. Dans
un enrubannage (balle d'herbe semi-séchée et enveloppée sous plastique, la
conservation est assurée par l'action conjointe de la fermentation et de la
dessiccation. Le pH d'un enrubannage (de l'ordre de 5,5 à 6) et le taux
d'humidité (de l'ordre de 40 %) facilitent la croissance de Listeria
monocytogenes (47, 54, 55, 92, 113, 194).
En élevage intensif, chez les animaux nourris avec des ensilages, les listérioses
se présentent le plus souvent sous forme de cas sporadiques et quelques fois
même endémiques.
Chez les bovins, les formes abortives sont plus fréquentes ; par contre, les
formes méningo-encéphalitiques sont plus fréquentes chez les ovins et les
caprins (50, 55).
En fonction des techniques d'élevage, la maladie évolue le plus souvent en hiver
et au printemps chez les bovins laitiers. Il en est de même, pour tous les
herbivores qui reçoivent en hiver et au printemps des ensilages ou des foins mal
conservés. Toutefois, l'affection peut évoluer également toute l'année chez les
animaux en stabulation qui reçoivent des ensilages, des pulpes ou des tourteaux
en continu.

26
Chapitre V Epidémiologie de la listériose

A cela, s’ajoutent plusieurs paramètres, à savoir, le climat, la pluviométrie, la


région géographique, les méthodes d'élevage (traditionnelles ou modernes), mais
aussi et surtout la qualité des aliments distribués et l'environnement immédiat
des animaux.
La distribution de foin ramassé et compacté en rouleaux mécaniquement,
contenant des mottes de terre, favorisera généralement l'apparition de cas
endémiques.
L’affection sévit également dans les exploitations, mal protégées ou mal
contrôlées sur le plan hygiénique, où des rats ou des oiseaux circulent librement
et particulièrement la nuit (50, 55).
V.2. En médecine humaine.
Chez l'homme, les premiers cas de listériose ont été réellement décrits dans les
années 1960 mais il fallut atteindre les années 1979-1980 pour observer les
premières épidémies et mettre en évidence le rôle des aliments. Ces épidémies
se traduisent par de petites bouffées de moins de 20 cas ou par d'importantes
épidémies pouvant regrouper plusieurs centaines de cas, évoluant sur des
périodes prolongées (4 ans par exemple, dans l'anadémie suisse) et responsables
d'un important taux de mortalité (20 à 30 %). Outre les épidémies, la
transmission alimentaire est bien documentée pour un certain nombre de cas
sporadiques dont on estime qu'environ 80 % ont une origine alimentaire. Les
infections nosocomiales étant très rares (164, 165, 166).
La Listériose humaine invasive se présente sous l’une des trois formes
suivantes : (54, 96, 99, 164).
 les cas sporadiques,
 les infections nosocomiales, rares, essentiellement caractérisées par des
infections croisées entre nouveaux - nés,
 les épidémies.
Dans les cas sporadiques, elle est souvent considérée comme un problème
spécifique des pays industrialisés de par la grande variété de denrées
alimentaires mises à la disposition des consommateurs, mais elle n’épargne en
aucun cas les pays en développement.
Les infections nosocomiales, c’est-à-dire les infections transmissibles lors
d’actes thérapeutiques en milieu hospitalier, particulièrement dans les services
de maternités où thermomètres, sondes d'aspiration, incubateurs sont très
souvent incriminés.
Les épidémies, d'origine alimentaire sont incontestablement les plus fréquentes
et se soldent généralement par 20 à 30% de mortalité.

27
Chapitre V Epidémiologie de la listériose

Depuis quelques années, dans tous les pays développés, l'incidence des
listérioses humaines diminue. Cette baisse est due à un meilleur contrôle des
denrées alimentaires et à l'information des populations à risque.
En France, selon les chiffres du Centre National de Référence des Listeria :
 801 cas de listériose ont été recensés en 1986,
 301 cas ont été décrits en 1995,
 alors que, pour les années 1996,1997 et 1998, le nombre de cas de listériose
est compris entre 220 et 230.
 En 1998, seuls des cas sporadiques (20 % de formes périnatales et 80 % de
formes non périnatales) ont été notés. L'incidence de la listériose humaine
invasive a été de 3,8 cas par million d'habitants, variant, selon la région, de 1,4 à
8,4 cas par million d'habitants.
Selon Les Professeurs S. Robin et S. Roche du CHU de Lyon – France (2002),
la maladie humaine est observée à tous les âges avec cependant 3 pics :
 avant 1 an : listériose néo-natale,
 entre 20 et 40 ans : cas maternels d'infection materno-fœtale,
 entre 60 et 80 ans : rôle du terrain.
Enfin, de nombreux problèmes subsistent en ce qui concerne la présence des
Listeria dans les aliments ; 70 à 90 % des souches isolées d'aliments
appartiennent au sérogroupe 1/2 a, alors que la majorité des souches isolées des
cas sporadiques appartiennent au sérogroupe 4b. L'analyse fine des souches
isolées d'une part, des entreprises de transformation et d'autre part des aliments,
suggère que certaines souches s'adaptent à l'environnement des entreprises, sont
capables d'y persister et sont fréquemment responsables de la contamination des
denrées. L'identification de l'aliment responsable d'infections est souvent
délicate car la période d'incubation, généralement comprise entre 3 et 4
semaines, peut parfois atteindre 70 jours. De plus, les aliments sont
fréquemment contaminés par différentes souches, les contaminations croisées
sont possibles chez les détaillants ou chez les consommateurs, un même lot de
produits peut être distribué sous des dénominations commerciales différentes
(79, 148).
Un aliment, même contaminé, n'est pas toujours dangereux. En effet, les
résultats des dénombrements dans les aliments montrent que les cas de listériose
humaine sont généralement dus à un aliment contaminé avec plus de 100
Listeria monocytogenes par gramme ou par millilitre. Ce fait suggère que seules
les denrées fortement contaminées présentent un risque réel. Toutefois, lors
d'une épidémie décrite en 1999 en Finlande, 12 des 13 échantillons de l'aliment
contaminé (beurre pasteurisé) contenaient moins de 100 Listeria monocytogenes
par gramme. Cette épidémie présentait également deux autres originalités : 1) la
souche appartenait au sérovar 3a qui n'avait encore jamais été impliqué dans des

28
Chapitre V Epidémiologie de la listériose

infections alimentaires collectives et 2) l'aliment contaminé était du beurre,


denrée alimentaire très rarement impliquée(152).
Les produits les plus sensibles sont ceux qui peuvent favoriser la croissance des
Listeria, qui ont une longue durée de vie et qui peuvent être consommés sans
être chauffés (lait cru, produits laitiers, charcuteries et produits de la pêche).
Selon une enquête de la Direction Générale de la Concurrence de la
Consommation et de la Répression des Fraudes en France, environ 10 % des
aliments sensibles sont contaminés au moment de leur distribution. En revanche,
les produits stérilisés et notamment les conserves (par exemple, les charcuteries
en conserve) sont totalement indemnes de Listeria avant ouverture (150).
La contamination peut intervenir à tous les stades de la fabrication et de la
distribution mais, elle peut aussi se produire chez le consommateur. La
prévalence de l'infection est faible (5 à 10 cas par million d'habitants en France)
mais le taux de mortalité atteint 20 à 30 %.
La listériose de l'homme est présente dans les pays industrialisés mais il semble
qu’elle est quasiment absente des pays en développement. Outre les différences
existant dans les moyens de diagnostic et de surveillance sanitaire, cette
répartition géographique s'expliquerait par une meilleure hygiène et par la
généralisation de la chaîne du froid dans les pays développés. En effet, de
manière paradoxale, il semble que ce soit la bonne hygiène des procédés de
fabrication et le développement de la chaîne du froid qui soient à l'origine d'une
augmentation des cas de listériose observée depuis une quarantaine d'années
(79).
L'amélioration des conditions sanitaires sur les lieux de transformation des
denrées alimentaires a pour conséquence une réduction de la contamination par
des flores d'altération et/ou de putréfaction. De ce fait, associée à une
réfrigération systématique, la date limite de consommation des aliments
augmente. Si l'aliment contenait au départ quelques Listeria monocytogenes,
celles-ci ont le temps de se multiplier d'autant plus que leur multiplication n'est
pas entravée par d'autres proliférations microbiennes. L'aliment devient
fortement contaminé et il est d'autant plus dangereux qu'il ne présente aucun
signe d'altération visible. Bien sûr, un mauvais respect de la chaîne du froid ou
de mauvaises conditions de stockage (peu de réfrigérateurs domestiques ont une
température, en tous points, inférieure à + 4 °C !) accroissent les risques.

29
Chapitre VI Mode de transmission

Chapitre VI : Mode de transmission.

Aujourd'hui, il est clairement reconnu que la consommation d'aliments


contaminés constitue le principal mode de transmission de Listeria
monocytogenes, aussi bien en médecine humaine qu'en médecine vétérinaire.

VI.1.En médecine vétérinaire.


De nombreux travaux ont montré la multiplication active des Listeria dans les
ensilages mal préparés (pH trop élevé, broyage trop grossier des végétaux,
aérobiose, présence de terre, stockage en semi enterré dans les sols, lessivages
par des pluies, mauvaise protection par des bâches abîmées ou récupérées (55,
197, 198). Certains auteurs n'hésitent pas à rapporter que l'utilisation d'ensilage
multiplie le risque de 20 à 40 fois d'avoir la listériose pour un troupeau (198).
Seulement, deux situations peuvent se présenter :
 D'une part, les animaux dont l'état physiologique est bon pourront ingérer
des quantités importantes de Listeria sans manifester de signes cliniques.
Cependant, ils excréteront de façon plus ou moins importante les germes,
entre autres dans les fèces et le lait. Ainsi, les végétaux, entrant dans la
composition des ensilages, pourront être contaminés par des épandages
d'excréments. L'animal porteur sain devient alors un dangereux
multiplicateur de germes, enrichissant donc le milieu extérieur. La
contamination de l'environnement sera telle, que la transmission à d'autres
animaux sera imminente (55, 105, 106, 107).
 D'autre part, et pour des raisons diverses : gestation, maladies intercurrentes,
stress, alimentation déséquilibrée, carences, accidents et autres, l'équilibre
physiologique peut être rompu. Les animaux vont alors présenter une
baisse de l'immunité et l'ingestion de quantités importantes de Listeria va
faire apparaître des signes cliniques.

La maladie pourra être sporadique dans un troupeau, mais lors de contamination


massive, l'affection peut devenir enzootique et un grand nombre d'animaux
pourront présenter diverses formes cliniques de listérioses à savoir :
avortements, méningo-encéphalites, septicémies, conjonctivites.

Pour les animaux producteurs de lait; les litières, les trayons, les manchons
trayeurs et par conséquent le lait seront aisément contaminés (55, 77).

30
Chapitre VI Mode de transmission

VI.2.En médecine humaine.


L'homme se contamine le plus souvent par l'ingestion de laits crus contaminés
ou de fromages faits à base de laits crus contaminés. Néanmoins, d'autres
denrées alimentaires ont été incriminées dans la transmission de la maladie
causant ainsi des épidémies dont la majorité est répertoriée dans le tableau III ci
- après.

Tableau III : Principales épidémies de Listérioses humaines répertoriées dans le


monde en fonction de leur localisation, des denrées en cause, des années et du
nombre de cas (105).
Localisation Année Nb de cas Origine
Halle (Allemagne) 1949-1957 100 Lait cru , Lait acide , crème
Iéna (Allemagne) 1954 26 Lait cru
Union soviétique 1956 19 Porc , souris
Brème (Allemagne) 1960-1961 81
Halle (Allemagne) 1956 279
Auckland (Nlle-Zéland) 1969 13
Anjou ( France) 1975-1976 162
Johannesburg 1977-1978 14
Australie 1978-1979 12 Végétaux crus
Massachussets (USA) 1979 20 Végétaux crus , lait cru
Auckland 1979-1980 10
Auckland 1980 22 Poisson cru , crustacé
Angleterre 1981 11 Crème
Slovaquie 1981 49
Canada 1981 41 Salade de choux
Christchurch (NleZéland) 1981-1982 18
Houston (Texas ) 1983 10
Allemagne de l’Ouest) 1983 25
Massachussets (USA) 1983 49 Lait pasteurisé
Vaud (Suisse) 1983-1987 122 Vacherin Mont d’or
Los Angeles 1985 142 Fromage mexicain
Danemark 1985-1987 35
Linz (Autriche) 1986 20 Lait cru , végétaux
Los Angeles 1986-1987 37 Œuf cru
Los Angeles 1987 11 Beurre
Angleterre 1987 23
France 1999-2000 47et plus Fromages, Rillettes de porc

Ce tableau illustre bien le fait qu’il s’agit de denrées alimentaires diverses d’une
part, et ne concerne que les pays industrialisés d’autre part. La question de
savoir si de telles épidémies sont passées inaperçues dans d’autres pays
(particulièrement dans les pays en développement), associée à un défaut de
diagnostic clair, reste toujours posée.

31
Chapitre VII Dose Infectante

Chapitre VII : Dose infectante.


La dose minimale d’infection est une des façons d’évaluer la capacité
d’infection d’un micro-organisme. Elle exprime la quantité minimum de germes
nécessaire à la création d’une infection dans des circonstances déterminées.
Ce terme suppose que chaque organisme possède un potentiel infectieux ; il
repose sur la dose effective nécessaire, la virulence de l’agent et la réponse des
individus.
Pour certaines bactéries pathogènes, la dose minimale infectieuse est bien
déterminée, mais on ne peut encore avancer aucun chiffre avec certitude
concernant Listeria monocytogenes malgré les travaux de recherche entrepris
depuis 1985.
De nombreuses études, réalisées dans plusieurs pays, indiquent que Listeria
monocytogenes est présente dans grand nombre d’aliments, mais normalement
en très petites quantités, c’est-à-dire moins d’une unité formant colonie (UFC)
par gramme d’aliment. Ceci implique que de nombreuses personnes sont
exposées quotidiennement à Listeria monocytogenes à très bas niveau (79).
Autrement dit, que ce soit pour l’homme ou pour l’animal, la dose minimale
infectieuse demeure à nos jours une grande inconnue. Elle est très difficile à
définir car encore une fois, elle est tributaire non seulement du statut
immunitaire des consommateurs (population susceptible par rapport à la
population non susceptible), mais également de la virulence de la souche. Cette
dernière étant intimement liée à son caractère hémolytique, à sa capacité de
pénétrer les cellules, de s’y multiplier à basse température et de se transmettre de
cellule en cellule. Ainsi donc, la teneur maximale de Listeria monocytogenes
pouvant être à l'origine de la maladie chez des individus adultes et sains, n'est
pas forcément la même pour les sujets immunodéprimés (54, 77, 145).
Par ailleurs, si on essaie d'être de plus en plus vigilant en ce qui concerne
l'absence de Listeria monocytogenes dans les aliments consommés par l'homme,
l'animal, en revanche, l'herbivore en particulier, est directement au contact des
bactéries environnementales par l'herbe qu'il ingère.
En outre, en qualité de bactérie ubiquiste, Listeria monocytogenes; contamine la
terre, l'herbe, le sol, les murs et les plafonds des étables et des usines agro-
alimentaires, les chambres froides et les parois de nos réfrigérateurs.
En bref, comment éliminer de nos aliments, une bactérie aussi présente et aussi
résistante dans notre environnement ? Plus en aval, dans la chaîne alimentaire,
l'accent a été très souvent mis sur la propreté des manipulations tout au long de
la chaîne alimentaire, de la ferme au produit fini.
De ce fait, il semble aujourd'hui, illusoire de vouloir éradiquer complètement les
Listeria et donc les listérioses (40).

32
Chapitre VII Dose Infectante

De plus, la plupart des cas de contamination résultent de l'ingestion d'aliments


fortement contaminés et les aliments incriminés contiennent généralement plus
3
de 10 Listeria monocytogenes dans 25 gr ou 25 ml et dans la majorité des cas
6
ils en renferment plus de 10 .
Expérimentalement, la dose minimale infectieuse par voie orale, est de l'ordre de
108 cellules pour la souris normale et de 109 cellules pour des singes (2, 79).
En somme, la question de la teneur minimale de Listeria monocytogenes admise
dans nos aliments, autrement dit, la dose minimale infectieuse (DMI) est restée
longtemps posée.
Actuellement, certains organismes internationaux ont apporté des solutions par
le biais de l’instauration de critères microbiologiques stricts ; seulement ces
derniers demeurent désormais toujours contestés dans certains pays par certains
industriels (41, 68).

Aux USA, la FDA et le Département Américain de l'Agriculture ont adopté


un critère zéro de tolérance de la bactérie dans les aliments vendus prêts à la
consommation (2, 79).
En France, le Conseil Supérieur de l'Hygiène Publique de France et
l’AFSSA ont d’abord exigé l’absence de Listeria monocytogenes dans 25 ml
ou gr dans le cas des laits crus et des fromages au lait cru. Plus tard, ils ont
finis par accepter une tolérance en fin de DLUO, et non pas sortie usine, si et
seulement si l'industriel est capable de prouver qu'à la DLC (ou la DLUO), le
seuil est inférieur ou égal à 100 Listeria monocytogenes par gramme de
produit, tout en sensibilisant les consommateurs et notamment les personnes
susceptibles sur le fait qu’elles peuvent être sensibles à quelques unités
infectieuses (77, 102).
En Algérie, l'Arrêté interministériel n°35 du 27 Mai 1998, fixant les critères
microbiologiques de certaines denrées alimentaires et notamment des laits
crus, n'en parle pas du tout. Cependant, compte tenu de la situation
épidémiologique mondiale, il a été proposé et retenu pour le prochain arrêté,
l'absence de Listeria monocytogenes dans 25 millilitre de lait cru. Cette
norme a même été étendue à un grand nombre de produits alimentaires prêts
à consommer (produits laitiers frais, produits carnés) ainsi qu'aux produits de
la pêche, fumés(134).

Comme on le voit, le problème de la listériose, associé à la médiatisation des


accidents humains par le biais du lait cru de vache, n'est pas facile à gérer.

33
Chapitre VIII Ecologie des Listeria

Chapitre VIII : Ecologie des Listeria.


Listeria monocytogenes est une bactérie mésophile ubiquitaire que l’on
retrouve aussi bien chez les porteurs sains, qu'au niveau du milieu extérieur : sol,
plantes, terre, végétation, ensilages, eaux.

Listeria monocytogenes est également un contaminant du lait cru, c’est


pourquoi, la maîtrise de ce risque sanitaire nécessite une bonne connaissance des
différentes sources de contamination dans l’exploitation laitière.

Origines de la contamination du lait cru

La filière laitière est particulièrement vigilante dans la production d’un lait cru
indemne de bactéries et plus particulièrement de Listeria monocytogenes.

De nombreux travaux ont permis d’étudier le mode de transmission : de la


bactérie pathogène au lait cru (185).

La détermination du cycle de contamination de Listeria monocytogenes dans


l’exploitation laitière est obligatoire pour les deux raisons suivantes :
 d'une part, maîtriser l’hygiène de la production laitière,
 d’autre part, définir les moyens de lutte.

34
Chapitre VIII Ecologie des Listeria

Le cycle de contamination du lait cru par Listeria monocytogenes, inclut les


étapes qui figurent dans le schéma°1 ci - après.

LAIT CONTAMINE

Matériel de traite
Urines, Litières Air
Excréments à travers le trayon
Indirect Direct

Porteurs Sains
Excréteurs

Malades

Infections

Vaches
Stressées

Ensilage Contaminé

Amplificateur

Excrétions
Animaux
Rongeurs
Oiseaux
Sol
Eau
Végétaux

Schéma n°1 : Cycle de contamination du lait (185).

35
Chapitre VIII Ecologie des Listeria

VIII.1.Le lait cru.


La contamination du lait cru peut avoir lieu par :

 une contamination interne et directe : dans ce cas, la bactérie peut traverser le


tractus intestinal de l’animal, passer dans la circulation sanguine et
contaminer le lait au moment de son excrétion, comme tout autre micro-
organisme. Ce cas rare, est difficile à mettre en évidence car le protocole est
lourd et onéreux, car il nécessite une investigation minutieuse vache par
vache.

 une contamination externe et indirecte : celle ci, viendra de l’environnement


contaminé en Listeria à savoir le paillage, les matières fécales, les trayons
souillés de la vache, le matériel de traite mal nettoyé et mal désinfecté et ce,
pendant la traite ou juste après. Cette voie externe semble la principale
source de contamination du lait cru à la ferme.
Des études effectuées aux USA sur 650 échantillons de lait cru et au Canada
sur 315 échantillons de lait cru, ont montré que respectivement 1,3 et 5,4 %
des tank à lait étaient contaminés par Listeria monocytogenes (185).

VIII.2.Le troupeau laitier.

Les animaux ingérant des aliments contaminés deviendront des porteurs de


germes.
A ce moment, deux éventualités se présentent :

 l’hôte est résistant et les souches de Listeria ne manifestent aucun pouvoir


pathogène ; l’animal est alors « un porteur sain » : Listeria se développe
dans l’organisme sans qu’il en souffre. Les bactéries seront éliminées dans
les excréments et vont enrichir l'environnement immédiat (les litières, le sol).

 la résistance de l’hôte n’est pas suffisante et l’animal va présenter les


symptômes cliniques de la maladie.

L’infection sévit chez les animaux de tous les âges, mais elle est plus grave pour
les nouveaux - nés et les jeunes animaux.

Le troupeau laitier atteint de listériose contamine l’étable par les matières


fécales, les urines, l’avorton et l’écoulement utérin.

36
Chapitre VIII Ecologie des Listeria

Les animaux sont plus particulièrement sensibles à la contamination à la fin de


l’hiver et au printemps, les principales raisons sont les suivantes :
 une alimentation trop riche en ensilage peut à la fois augmenter la sensibilité
de l’hôte mais également peut lui proposer un contact fréquent avec Listeria.
Des études ont démontré la corrélation entre le lait cru, contaminé par
Listeria et la consommation préalable d’ensilage contaminé (185). La
présence de Listeria dans l’ensilage, et donc dans les matières fécales,
multiplie le risque de la contamination du lait cru à la récolte,
 les changements d’habitat et d’alimentation ; en automne et en hiver les
animaux sont nourris par l’ensilage dans l’étable, alors qu’au printemps les
animaux, dans certaines régions au moins, sortent au pâturage,
 la concentration d’animaux en gestation qui, de ce fait, sont affaiblis. De
plus, l’accumulation de délivrances dans les étables constitue une source
majeure de contamination,
 le manque d’espace,
 la mauvaise aération,
 le manque d’hygiène et de nettoyage,
 le manque d’eau,
 et le manque de soins vétérinaires.

Le rôle de l’animal contaminé dans les infections humaines n’est pas à négliger :
des éleveurs et des vétérinaires ont contracté la listériose à l’occasion de
contacts directs avec des animaux, lorsque les mesures d’hygiène traditionnelles
n’avaient pas été respectées. Cette forme de la maladie se traduit le plus souvent
par une dermatose au niveau des bras et des avants bras (164, 170).

VIII.3.L’ensilage.
Les fourrages destinés aux vaches laitières sous forme d’ensilage, dans lesquels
la terre a été entraînée lors de la récolte, peuvent contaminer les silos en Listeria.
L’ensilage constitue donc, un milieu propice à la multiplication de la bactérie
pathogène, notamment dans les zones du silo où le pH est supérieur à 5. En
dessous de cette valeur, Listeria ne se multipliera plus aisément mais arrivera à
survivre pendant plus d’une année.

Une étude menée par Aerial (185) en 1990 – 1991, a mis en évidence une
importante contamination de l’ensilage de maïs par des bactéries du genre
2
Listeria. En effet, le nombre de Listeria présent dans les silos variait entre 10
6
UFC/g et 10 UFC/g.

37
Chapitre VIII Ecologie des Listeria

Son étude a donc fourni les résultats suivants :


 lors de la première période d’ensilage en 1990, 41% des prélèvements
effectués sur 203 échantillons au total, étaient contaminés par l’une des
espèces du genre Listeria.
 durant la deuxième période, en 1991, seulement 30% des prélèvements
effectués sur les 203 échantillons au total, étaient contaminés par l’une des
espèces du genre Listeria.
La présence de Listeria monocytogenes était respectivement de 17% et de 7%.
Listeria innocua, d’écologie proche de l’espèce pathogène, représentait 24%
pour la première période et 11% pour la seconde.
L’ensilage d’herbe a été indemne de Listeria au cours des deux années de
travail.
Ce résultat est surprenant, car selon la littérature, le risque de contamination est
similaire pour les deux types d’ensilage.

Les sites sensibles dans les silos d’ensilage de maïs ont été identifiés et sont
indiqués sur le schéma n°2 ci - après.
B
C

D A

Schéma n°2 : Sites sensibles à la contamination par Listeria monocytogenes


d’un silo.
Légende : A : côté du silo au sommet, B : centre du silo 30 à 150 cm de
profondeur, C : centre au sommet, D : côté à 30 cm de profondeur.
Les zones A et D sont les principaux sites à risques en Listeria.
Les zones B et C sont moins souvent impliqués.

38
Chapitre VIII Ecologie des Listeria

Le schéma n°3 nous indique la répartition de la contamination en Listeria (dont


Listeria monocytogenes) dans les quatre sites sensibles des silos étudiés en 1990.

Zone : D 31% 34% Zone : A

Zone : C 16% 19% Zone : B

Schéma n°3 : Répartition de la contamination en Listeria monocytogenes dans


les quatre sites sensibles (185).
La conservation de l’ensilage dans les sites A et D est plus délicate.
Le tassement insuffisant ou la présence d’oxygène due à un manque d’étanchéité
du silo sont fréquents. Les conditions d’anaérobiose sont alors imparfaites et les
germes aérobies indésirables se développent, entravant l’acidification souhaitée
du milieu par les flores lactiques. L’augmentation du pH de l’ensilage dans ces
zones est plus exactement dû à la consommation de l’acide lactique et à la
production d’ammoniac par les bactéries aérobies. Ces pH élevés, pouvant
dépasser la valeur de 6,00, sont propices au développement de Listeria.
A ce niveau de pH, d’autres facteurs inhibant Listeria et produits par les flores
lactiques tels que les acides, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines sont
également in opérationnels.
Par ailleurs, une relation étroite entre le pH de l’ensilage de maïs et la présence
ou l’absence de Listeria a pu être déterminée. il a été constaté une augmentation
progressive du nombre d’échantillons contaminés en Listeria lorsque le pH
s’accroît.
Pour exemple, lors de la première année d’étude, la répartition a été la suivante :
 17 % des échantillons prélevés à pH inférieur à 4,00 présentent le genre
Listeria,
 52 % des échantillons prélevés à pH compris entre 4,00 et 4,99 sont
contaminés par Listeria,
 54 % des échantillons prélevés à pH compris entre 5,00 et 5,99 sont
contaminés par Listeria,
 72 % des échantillons prélevés à pH supérieur à 6,00 sont contaminés.

39
Chapitre VIII Ecologie des Listeria

Ces résultats sont conformes à l’écologie de Listeria, à savoir un développement


de la bactérie à un pH compris entre 5,00 et 7,50 avec un maximum à pH 7,00 à
7,50.
Les ensilages bien conservés suite à une acidification correcte ont un pH
compris entre 3,50 et 4,00 ; ce dernier devient alors inhibiteur de Listeria.
Dans ce cas, la bactérie pathogène ne survit généralement pas plus d’une ou de
deux semaines.
VIII.4.La terre et le sol.
Dés 1960, Gray a isolé des Listeria à partir d’ensilage de maïs, ces travaux ont
été confirmés par des isolements à partir de plantes, de fourrage, de terre, de
boues, de poussières, d’ensilages d’herbes et à partir d’eaux de rivière (35, 36).
La fréquence élevée avec laquelle on isole ce germe du sol et des plantes, la
capacité des Listeria de se multiplier à basse température, la possibilité de
survivre pendant de longues périodes dans le sol, impliquent une existence
saprophytique certaine (39, 185).
L’environnement plante – sol constitue donc véritablement un réservoir. De ce
fait, on admet que les végétaux peuvent contaminer les animaux.
VIII.5.Les autres alimentations animales.
D’autres vecteurs de Listeria tels que la paille, le foin, les pulpes de betteraves
et l’eau peuvent être cités.
Cependant, lors de l’étude menée par Aerial, le genre Listeria n’a jamais été
isolé dans les prélèvements effectués dans les milieux énumérés précédemment.

40
Chapitre IX Bactériologie

Chapitre IX : Bactériologie.
IX.1.Structure et Morphologie.
Listeria monocytogenes est un petit bacille à Gram positif de 0,5 µm à 2 µm de
long sur 0,4 à 0,5 µm aux extrémités arrondies, asporulé et non capsulé.

Photo n° 1 : Aspect de Listeria monocytogenes au Gram.

Peu ou pas mobile à 37°C, Listeria monocytogenes est toujours mobile à 22-
25°C.

Photo n° 2 : Aspect de Listeria monocytogenes sur gélose mobilité à 22 °C.

Cette particularité est un caractère important dans le diagnostic bactériologique


de ce germe. Cette mobilité est due à la présence de 1 à 4 flagelles
d’implantation péritriche (22, 35, 122, 164, 168).

41
Chapitre IX Bactériologie

Pour l'étude de la mobilité, deux bouillons nutritifs sont ensemencés et incubés


l'un à 20-25°C, l'autre à 35-37°C pendant environ 4 heures. A 25°C Listeria
monocytogenes présente une mobilité caractéristique (la bactérie donne
l'impression de tourner sur elle-même) alors qu'elle est immobile à 37°C. Ce test
simple doit être effectué devant toute suspicion de listériose (cf. schéma n°4 ci-
après).
Par ailleurs, en gélose mobilité incubée à 22°C, Listeria donne une image
typique de sapin renversé (cf. figure 2), témoignant de son caractère micro
aérophile.

Gélose Mobilité en tubes,


à ensemencer par piqûre centrale, puis à incuber à :
22°C 37°C

pendant 24 à 48 h

Culture en forme de sapin Pas de culture


Schéma n°4 : Aspect de Listeria monocytogenes sur gélose mobilité.

Cette mobilité à 22°C permet également de différencier Listeria des bactéries


immobiles comme Erysipelothrix et la plupart des Corynébactéries.
Ces bactéries se regroupent parfois en amas, en palissades et pourront évoquer
des bactéries du genre Corynebactérium.

42
Chapitre IX Bactériologie

IX.2.Culture et croissance.
C'est un germe aéro- anaérobie facultatif qui pousse bien sur les milieux usuels.
L'adjonction de glucose au milieu à 0,5 % ou l'utilisation de milieux à base de
tryptose favorisent cette culture (34, 62, 114, 168).
Sur gélose nutritive, de petites colonies, moins de 1 mm de diamètre, lisses à
bords réguliers et transparents, apparaissent en 24 heures à 37°C.
Examinées en transillumination oblique selon la technique d'Henry, elles ont une
coloration bleu-vert très caractéristique (166, 168, 171).
Dans les vieilles cultures, les colonies s'élargissent et s'opacifient. Les colonies
"R" sont plus larges, plates et ternes.
En bouillon glucosé, un trouble intense et homogène apparaît en 18 heures.
Sur gélose au sang de cheval ou de mouton, on observe, après 24 h d'incubation
à 37°C, une zone étroite et diffuse d'hémolyse de type ß, comme le montre la
photo n° 3 ci-après.
Listeria monocytogenes est également hémolytique pour les globules rouges de
lapin et d'homme, ce caractère est intimement lié à la pathogénicité des souches
(77, 164, 168, 171).

Photo n°3 : Aspect de Listeria monocytogenes sur gélose au sang.


La mise en évidence de ce caractère est importante car elle permet :
- d'une part, de faire la différence entre les espèces,
- d'autre part, de faire la distinction avec les souches non hémolytiques,
donc non virulentes.

43
Chapitre IX Bactériologie

Dans d'autres cas litigieux parfois, on aura recours au Camp-test, qui permet de
confirmer ou d'infirmer l'hémolyse.
Listeria monocytogenes cultive bien à un pH neutre ou légèrement alcalin
(optimum : 7,2 - 7,6) comme on vient de le voir dans la partie écologie.
La croissance à +4°C est une particularité exceptionnelle de Listeria
monocytogenes, elle était d'ailleurs utilisée autrefois, comme procédé
d'enrichissement.
La résistance de Listeria monocytogenes aux agents physiques et chimiques est
étonnante pour un germe non sporulé : les cultures restent viables plusieurs mois
à la température du laboratoire, et plusieurs années à +4°C (36, 77, 168).
Elles résistent à un chauffage de 55°C pendant 30 minutes, survivent à l'action
des milieux hostiles contenant 10% de Na Cl, 40% de bile, 0,5% de Téllurite de
potassium (36, 77, 168).
IX.3.Caractères biochimiques.
Les principaux caractères biochimiques communs au genre Listeria sont
consignés dans le tableau IV, ci-après :
Tableau IV : Principaux caractères biochimiques du genre Listeria
(61, 105, 106, 107.

Réactions positives Réactions négatives


Catalase Oxydase
Glucose Gaz en Glucose
VP , RM Uréase
Esculine Indole
Type respiratoire : aéro-anaérobie Gélatinase
Réduction du Lait tournesolé H2S

Les principaux caractères biochimiques correspondants aux différentes espèces


de Listeria et Jonesia denitrificans figurent dans le tableau V (105).

44
Chapitre IX Bactériologie

Tableau V : Caractères biochimiques différentiels des espèces de Listeria(105).

L. monocytogenes

L.welshimeri

denitrificans
L. seeligeri

L. ivanovii

L. murrayi
L. innocua

L. grayi

Jonesia
Caractéristiques
Bâtonntes irréguliers - - - - - - - +
ß-hémolyse + - + - - - - -
Camp-test
- Staphylococcus aureus + - + - - - - -
- Rhodococcus equi - - - - + - - -
Production d'acide à partir de :
Glucose + + + + + + + +
Listeria-arabinose - - - - - +
Dextrine ± - - + + +
Galactose ± - ± + + +
Gluconate - - - - - + +
Glycogène - - - - - +
Lactose ± + + + + +
D-Lyxose - - - + +
Mannitol - - - - - + + -
Mélézitose ± ± ± - - -
Mélibiose - - ± - - -
&-Méthyl-D-glucoside + + + + + -
&-Méthyl-D-mannoside + + - + -
Listeria-Rhamnose + ± - ± - - ± -
Sorbitol ± - - - - -
Amidon soluble - - - + +
Saccharose - ± ± - - +
D-xylose - - + + + - - +
Maltose + + + + + + + +
D-tagatose ± ± ± ± - - -
D-turanose ± ± ± ± ± - +
Voges-Proskauer + + + + + + + -
Hydrolyse de :
Urée - - - - - - - -
Cellulose - - - - - +
Hippurate + + + - - -
Amidon ± ± - - - +
Esculine + + + + + + + +
Lécithinase ± ± + - - -
Phosphatase acide ( APIZym ) + + + + + - - -
Phosphoamidase ( APIZym ) + + + + + - -
Réduction de NO3 en NO2 - - - - + +
Pathogénicité pour la souris + - - - + - - +
G + C ( % mol ) 37-39 36-38 36 36 37-38 41-42 41-42 56-58

45
Chapitre IX Bactériologie

Le diagnostic biochimique différentiel entre les espèces de Listeria peut être


également facilité par l’utilisation de la clé dichotomique suivante.

Schéma n°5: Clé dichotomique (164, 168).

Les caractères différentiels entre Listeria et les bactéries proches, figurent dans
le tableau VI .
Tableau VI : Caractères différentiels entre Listeria et les bactéries proches (104,
168).

Listeria Erysipelothrix Corynebacterium Streptococcus


Mobilité à 25°C + (a) - - - (+)
Catalase + - + -
Esculine + (b) - - +
H2S - + - -
Lait tournesolé
- coagulation - - - +
- réduction + - - +
Corpuscules - - + -
métachromatiques
a) immobile ou peu à 37°C
b) réaction positive en 2 heures

46
Chapitre IX Bactériologie

Les caractères des sept genres composant le groupe des bacilles à Gram positif,
proches de Listeria figurent dans le tableau VII.
Tableau VII : caractères des sept genres composant le groupe des bacilles à
Gram positif, proches de Listeria (105, 106, 107).
Morphologie Genre Catalas Type Mobilit Habitat
e respiratoir é
e
Bacilles droits Lactobacillus - AAF* - Produits fermentés
Non pathogènes
Bacilles fins, souvent en Erysipelothrix - AAF* - Rouget de Porc :
filaments pathogène
Bacilles fins , souvent en Brochothrix + AAF* - Produits carnés :
filaments non pathogènes
Bacilles courts, souvent Listeria + AAF* + Saprophytes :
en courtes chaînettes et 20-25°C pathogènes chez
filaments l'homme et
l'animal
Bacilles en chaînettes , Kurthia + AS** + Intestin des
coccoïdes dans les animaux de la
cellules âgées ferme
Bacilles courts en Caryophanon + AS** + Intestin de la
chaînettes vache
Non pathogènes
Bacilles courts , souvent Renibacterium + AS** - Pathogènes du
par paires poisson.
* AAF : Aéro - anaérobie facultatif.
** AS : Aérobie strict.

IX.4.Evolution des techniques de recherche des Listeria.


Depuis le début des années 1980, le rôle des aliments et particulièrement du lait
de vache a été mis en évidence dans la contamination de l’industrie laitière et
par conséquent dans la contamination humaine lors de flambées épidémiques de
listériose.
A cet effet, plusieurs méthodes de détection ont été proposées et développées de
façon à isoler le plus rapidement possible le groupe génomique monocytogenes,
responsable des principaux cas de listériose.
En somme, il s'agit de méthodes bactériologiques, immunochimiques,
immunophysiques, physiques et des méthodes de biologie moléculaire (9, 22,
51, 53, 61, 105, 106, 107).

47
Chapitre IX Bactériologie

IX.4.1.Méthodes bactériologiques.
En médecine humaine
La culture et l’isolement de Listeria monocytogenes se fera soit à partir du LCR
(Liquide Céphalo-rachidien) y compris les LCR clairs trompeurs soit à partir du
sang au lit du malade et au moment du pic thermique dans les cas de méningite,
méningo-encéphalite ou septicémie, soit encore à partir des avortons ou du
liquide amniotique dans les cas des avortements. L’isolement est pratiqué sur
gélose au sang frais (lecture utile de l'hémolyse) ou gélose chocolat enrichie,
même si la bactérie cultive sur gélose ordinaire ou sur des milieux hostiles (bile
esculine, hypersalé). Une gélose type Columbia au sang additionnée d’acide
nalidixique est le milieu préconisé par Bio Mérieux. Listeria peut, curieusement,
cultiver sur le milieu BEA (Bile Esculine Agar). La sérologie étant très peu
significative n’est généralement jamais demandée (45, 121, 146, 147).
En bactériologie alimentaire.
En effet, dès 1966, la première méthode bactériologique proposée, reposait sur
le caractère psychrophile des Listeria et supposait donc, un enrichissement
sélectif de trois à quatre semaines à + 4°C. Cette étape a été jugée très longue,
car elle ne répondait pas aux exigences des délais de réponse, déjà posés.
Depuis, beaucoup de progrès ont été réalisés de façon à optimiser la sélectivité
de la culture et le temps nécessaire à la détection de Listeria monocytogenes est
passé de trois à quatre semaines à 4 voire 7 jours. De plus, la connaissance de la
résistance de Listeria à de nombreux inhibiteurs a permis d'évoluer vers des
techniques d'enrichissement plus rapides de l'ordre de 2 à 3 jours à 30 et/ou
37°C.
Par contre, il faudrait signaler que la recherche de Listeria est relativement
simple lorsque celles ci sont abondantes dans le prélèvement à analyser. Or,
dans la majorité des cas, le problème ne se pose pas de la même façon : les
Listeria sont en général en petit nombre et elles sont accompagnées d'une flore
associée abondante : c'est le cas des laits crus.
C'est ainsi qu'en Décembre 1993, l'AFNOR a proposé une méthode
expérimentale portant la référence NF V 08-055, qu'elle a ensuite fait
homologuée et référencée en Août 1997 (133).
En 1998, l'ISO a proposé également une méthode de référence portant la
référence ISO 11290-1, homologuée et validée (131). Cette dernière repose sur
les mêmes principes que la méthode AFNOR.
Plus tard, en juin 1998, les Laboratoires Sanofi Diagnostic Pasteur font part
d'une nouvelle méthode bactériologique appelée : RapidL'mono. Cette méthode
a également été homologuée et validée par l'AFNOR comme méthode
alternative et est inscrite aujourd'hui sous le numéro SDP-07/04-09/98 (63, 106,
107).

48
Chapitre IX Bactériologie

Le principe du milieu RapidL'mono repose sur la détection spécifique d'une


phospholipase de Listeria monocytogenes et sur l'aptitude de cette espèce à
métaboliser le xylose (63, 106, 107).
Après 24 à 48 h d'incubation, Listeria monocytogenes forme des colonies
caractéristiques bleu franc sans halo jaune. Les colonies formées par les autres
espèces de Listeria sont blanches avec ou sans halo jaune (cf. schéma n°6 ci-
après).
Il faut alors noter la particularité de l'espèce Listeria ivanovii qui se présente
sous forme de colonies bleu-vert avec un halo jaune due à son caractère xylose
positif. Le supplément sélectif contenu dans le milieu RapidL'mono, permet
l'inhibition plus ou moins totale de la majorité des flores interférentes.
Ainsi, par ses performances, RapidL'mono est le premier milieu de culture
chromogène qui permet une identification rapide et directe de Listeria
monocytogenes, en 24 à 48 heures, après préparation des échantillons
conformément à la norme AFNOR, à savoir enrichissement en bouillon Fraser
au demi, pendant 24 h puis en bouillon Fraser 1, pendant 48 heures(63, 106,
107).
A côté, de ces trois méthodes bactériologiques, et devant la crainte de voir surgir
encore de nouvelles épidémies tant en élevage bovin qu'en industrie laitière, se
sont développées plusieurs techniques bactériologiques, traduisant ainsi une
concurrence entre les différentes firmes. Cependant les phases d'enrichissement,
d'isolement et d'identification biochimique, restent incontournables.
Le tableau VIII ci - après résume les principales méthodes proposées par les
principales firmes.
Tableau VIII : Principales méthodes bactériologiques (105, 106, 107).

Méthodes NF V08-055 / FIL FDA USDA


ISO 11290-1
Applications Tous les Laits et Laits et Viandes
aliments Produits produits et produits
laitiers laitiers carnés
Enrichisseme Fraser LEB LEB UVM
nt primaire 24h , 30°C 48 h , 30°C 24 à 48 h , 24 h , 30°C
30°C
Enrichisseme Fraser 1/2 - - Fraser
nt secondaire 24 à 48h , 24 h , 30°C
37°C
Isolement Palcam ou Oxford MMA Oxford modifié
Oxford 48 h , 37°C 48 h , 30°C 24 h , 30°C
24 à 48h ,
37°C
Rapidité 2 à 5 jours 4 jours 2 à 4 jours 3 à 4 jours

49
Chapitre IX Bactériologie

FIL : Fédération Internationale Laitière; FDA : Food and Drug Administration;


USDA : United States Drug Administration; LEB : Listeria Enrichissement
Broth; UVM : Milieu proposé par l'Université du Vermont; MMA : Milieu
Modifié de Mac Bride.
En conclusion, les méthodes bactériologiques requièrent, selon la contamination
initiale des échantillons de laits d'une part, et l'état physiologique des Listeria,
d'autre part, au minimum 4 à 7 jours pour obtenir un résultat positif confirmé
avec identification de l'espèce.
La sensibilité de ces méthodes est de 1 à 10 bactéries dans 25 ml de lait.
La récupération des cellules de Listeria ayant subi un stress dépend de la qualité
du premier bouillon d'enrichissement, puisque aucune étape de pré
enrichissement n'est réalisée dans les protocoles les plus courants.
En ce qui concerne la spécificité, les différents éléments sélectifs présents dans
les milieux d'enrichissement et d'isolement ne permettent pas d'inhiber la totalité
de la flore compétitive, une confirmation biochimique est quelque fois
obligatoire. Cependant l'aspect très caractéristique des colonies de Listeria sur la
gélose Palcam ou Oxford, utilisé dans la méthode ISO ou AFNOR, pallient ce
problème.
En ce qui concerne le dénombrement des Listeria, deux méthodes
bactériologiques sont de nos jours proposées et recommandées, à savoir :

 La méthode ISO 11290 partie 2, par étalement direct de 0,1 ml sur gélose
Palcam ou Oxford, après la période de pré enrichissement (132).

 La méthode FDA avec la technique en tubes multiples en tenant compte


du nombre le plus probable (NPP) (106, 107).

La méthode ISO 11290-1 relative à la recherche qualitative des Listeria et la


méthode ISO 11290-2 relative à la recherche quantitative de Listeria
monocytogenes, seront largement développées dans le chapitre matériel et
méthodes.

50
Chapitre IX Bactériologie

Méthode RapidL'mono

Lait 25 ml 2,25 ml

Supplément

Enrichissement primaire
225 ml

Bouillon Fraser 1/2

30°C , 24 h

Enrichissement secondaire Isolement sur RapidL'mono

0,1 ml Bouillon Fraser RapidL'mono

37°C , 24 h 37°C , 24 à 48 h

RapidL'mono Identification directe sur


RapidL'mono

37°C , 24 à 48 h

Listeria monocytogenes :
Colonies bleues sans halo

Schéma n°6. Méthode RapidL’mono

51
Chapitre IX Bactériologie

IX.4.2.Méthodes immunochimiques.
Ces méthodes de détection sont fondées sur la reconnaissance d'antigènes de
Listeria à l'aide d'anticorps spécifiques de l'espèce ou plus récemment du groupe
génomique Listeria monocytogenes (9, 51, 53, 106, 107).

Le complexe antigène - anticorps est mis en évidence à l'aide d'une réaction


chimique avec un substrat chromogène ou fluorogène.

Parmi ces techniques, on peut citer :


 la méthode ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Asay),
 le système VIDAS.

La sensibilité générale de ces techniques est comparable à celle des méthodes


bactériologiques c'est à dire 1 à 10 Listeria par millilitre de lait.

Cependant, il faut signaler que ces techniques peuvent induire des faux négatifs
liés aux bactéries stressées.

De plus, certains auteurs préconisent la confirmation des échantillons présumés


positifs par des méthodes bactériologiques.

52
Chapitre IX Bactériologie

IX.4.3.Méthodes immunophysiques.
Ces méthodes sont basées sur la formation d'un complexe antigène / anticorps
révélé à l'aide d'une technique physique (9, 53).

Parmi ces techniques, on peut citer :


 Test immuno-latex,
 La cytomètrie de flux,
 L'immunocapture.

Les principaux caractères de ces techniques figurent dans le tableau IX ci après :


Tableau IX : Tableau récapitulatif des principaux caractères des techniques
immuno-physiques (53).

Méthodes Cytomètrie
De flux Immuno-latex Immunocapture

Détection Quantitative Quantitative Quantitative Qualitative


(Listeria Rapid Test) (Lister Test) (Lister Sreen )
Spécificité Listeria spp Listeria spp Listeria spp Listeria spp

Sensibilité 106 à 107 104 à 105 1 1

Enrichissement 24 h 42 h Aucun 18 h

Rapidité 26 h 43 h 27 h 42 à 66 h

Système de Fluorescence Immobilisation Etalement Etalement


détection complexe sur gélose sue gélose
Ag/Ac-latex dot blot Palcam
bleu
Validation AFNOR Non 1995 Non 1995

53
Chapitre IX Bactériologie

IX.4.4.Méthodes Physiques.
Une méthode physique a été utilisée pour la détection des Listeria : il s'agit de
l'impédancemétrie (53).
Cette technique permet de mesurer les variations électriques d'un milieu de
culture causées par le métabolisme microbien. Deux électrodes plongées dans le
bouillon de culture vont mesurer l'accroissement de la conductance ou de la
capacitance lors de la croissance bactérienne.
L'impédancemétrie peut être utilisée pour le dénombrement de micro-
organismes puisque le temps de détection dépend de la contamination initiale en
micro-organismes.
L'impédancemétrie offre plusieurs avantages tels que :
 la rapidité de la détection, 24 heures environ,
 l'automatisation,
 la standardisation,
 l'économie de milieux de culture.
Cependant, le développement d'un tel système de détection pour les Listeria,
souvent présentes en faible quantité dans un milieu poly contaminé, se heurte à
certaines difficultés.
Le milieu de culture utilisé doit être très sélectif et doit avoir une formulation
permettant de fortes variations de conductivité lors du métabolisme des Listeria.
Les difficultés concernant la spécificité du milieu de culture expliquent que
l'impédancemétrie est peu utilisée en routine pour détecter les Listeria.

54
Chapitre IX Bactériologie

IX.4.5.Méthodes de biologie moléculaire.


Les méthodes de biologie moléculaire permettent de détecter spécifiquement
Listeria monocytogenes ou Listeria spp à l'aide d'une sonde nucléique dont la
cible se trouve sur l'ADN ou l'ARN (9, 51, 53).

Ces techniques génétiques présentent comme principal avantage leur spécificité,


ce qui permet en particulier la détection de souches atypiques.

Après utilisation de sondes naturelles constituées par exemple d'un fragment du


gène de la lystériolysine, un certain nombre d'oligonucléotides ont été
synthétisés de façon à détecter les Listeria :
 soit par hybridation avec une sonde nucléique,
 soit par la technique PCR avec des amorces.
Les tests d'hybridation d'acides nucléiques sont basés sur la capacité des brins
complémentaires d'ARN ou d'ADN à s'associer spécifiquement de façon à
former des complexes stables à double brin. Deux sondes spécifiques de l'ARN
ribosomal 16 S sont actuellement commercialisés, mais quelque soit la sonde
utilisée, cette méthode nécessite un enrichissement de façon à atteindre le seuil
de détection même en cas de faible taux de contamination.
La technique d'amplification de gène ou PCR, met en évidence un gène (ou une
portion de gène) spécifique d'un genre, d'une espèce ou d'une souche d'un
organisme. Des oligonucléotides amorces judicieusement choisies vont
permettre l'amplification du fragment délimité par les amorces à l'aide d'une
polymérase thermorésistante. Après de multiples cycles, le fragment amplifié est
mis en évidence.
La technique PCR présente de multiples avantages, parmi lesquels :
- spécificité,
- sensibilité,
- rapidité,
- possibilité d'automatisation.
Cependant, cette technique n'est pas directement utilisable sur les échantillons
de laits et même autres que le lait, car certains constituants inhibent la réaction
d'amplification génique. Il faut en outre distinguer les bactéries mortes des
bactéries vivantes, et détecter les Listeria lorsqu'elles sont en petit nombre, or la
prise d'essai utilisée pour la PCR est très faible.

55
Chapitre IX Bactériologie

En conclusion, une grande variété de méthodes, ont été développées pour la


détection des Listeria à partir du lait ainsi que d'autres denrées alimentaires.
Le choix d'une méthode dépend des exigences des utilisateurs, qui seront en face
de différents critères d'appréciation tels que la rapidité, la sensibilité, la
spécificité, le coût, les possibilités ou les exigences de dénombrement et
l'automatisation surtout en industrie laitière.
Par ailleurs, malgré l'évolution des méthodes de détection, aucun test utilisable
en routine ne détecte spécifiquement les souches réellement pathogènes. La mise
au point de techniques de détection des facteurs de virulence de Listeria
monocytogenes est un des objectifs à atteindre. Dans ce sens, la PCR sera sans
doute, l'une des méthodes qui pourra assurer cette spécificité.
Enfin, le tableau X ci-après, apporte une récapitulation de toutes ces techniques
et peut orienter tel ou tel laboratoire vers l'utilisation de telle ou telle technique
en fonction de ses moyens et de ses objectifs.
Tableau X : Critères de choix d’une technique (51).

Sensibilité Spécificité Coût Dénombrement Automatisation Rapidité

Méthodes + Listeria + Oui Oui +


Bactériologiques
Méthodes + Listeria ++ Non Oui Etape de
ELISA révélation
rapide
Immunocapture ++ Listeria +++ Oui Oui Enrichisse
ment
rapide
Hybridation avec + Listeria et +++ Non Semi- Etape de
Sonde L.monocyt Automatisé révélation
ogenes rapide
PCR ++ Listeria et +++ Non Semi- Etape de
L.monocyt Automatisé révélation
ogenes rapide
Immunolatex + Listeria ++ Non Semi- Etape de
Automatisé révélation
rapide
Impédancemétrie + Listeria ++ Oui Oui Etape de
révélation
rapide
Système VIDAS + Listeria et +++ Non Oui Etape de
L.monocyt révélation
ogenes rapide

56
Chapitre IX Bactériologie

IX.5.Sérotypie
Dans le genre Listeria on distingue :
 15 antigènes somatiques (I à XV),
 05 antigènes flagellaires (A à E).
La combinaison de ces différents facteurs dans une même bactérie permet de
reconnaître actuellement 17 sérovars (62, 105, 106, 107, 164, 168).
En France, l'utilisation de la sérotypie est d'intérêt limité puisque plus de 95 %
des souches isolées des infections cliniques appartiennent au sérovar 1/2a, 1/2b
ou 4b. Il n'y a pas de rapport entre un sérovar particulier et son origine
géographique et animale (77, 99, 105, 106, 107, 164, 168).
Actuellement, il est bien connu que le sérovar 4b de Listeria monocytogenes est
le plus impliqué dans les cas de listériose animale et humaine (99, 105, 106,
107).
Listeria monocytogenes sérovar 5, nommée depuis 1984 Listeria ivanovii, n'est
jamais isolée des aliments et elle est peu retrouvée en pathologie humaine, par
contre elle est surtout rencontrée chez les ruminants et plus particulièrement
chez le mouton (Broadent, 1972).
Le diagnostic sérologique par agglutination, fixation du complément ou
immunoprécipitation est peu sensible et peu spécifique.
La détection des anticorps anti-listériolysine O est plus prometteuse. Un test de
type Dotblot, utilisant comme antigène de la listériolysine O purifiée, nécessite
un traitement préalable des sérums pour éviter les réactions faussement positives
dues à la présence d'anticorps anti-streptolysine O. Un test de Western-Blot,
faisant appel à un polypeptide produit par des techniques de biologie
moléculaire et correspondant aux 411 premiers acides aminés de la listériolysine
O est beaucoup plus spécifique mais des réactions faussement positives sont
observées lors d'encéphalites herpétiques. La sensibilité de ces tests est toutefois
médiocre et n'est globalement que de 50 à 60 % (77).
Selon l'Institut de Veille Sanitaire, l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des
Aliments et le Centre National de Référence des Listeria, la sérologie est soit
trop peu sensible soit trop peu spécifique pour apporter à l'heure actuelle une
aide au diagnostic.

Les différents caractères antigéniques des sérovars de Listeria sont consignés


dans le tableau IV ci-après (62, 105, 106, 107, 168).

57
Chapitre IX Bactériologie

Tableau XI : Caractères antigéniques des sérovars de Listeria (105, 106, 107).

Espèces Sérovar Antigènes Somatiques Antigènes


s Flagellaire
s
1/2a I II (III) AB
1/2b I II (III) ABC
1/2c I II (III) B D
3a II (III) IV AB
3b II (III) IV (XII XIII) ABC
Listeria 3c II (III) IV (XII XIII) B D
monocytogenes 4a (III) (V) VIII IX ABC
4ab (III) V VI VIII IX X ABC
4b (III) V VI ABC
4c (III) V VII ABC
4d (III) (V) VI VIII ABC
4c (III) V VI (VIII) IX ABC
7 (III) XII XIII ABC
Listeria ivanovii 5 (III) (V) VI (VIII) X ABC
6a (III) V (VI) (VII) (IX) A B C
Listeria innocua 6b XV ABC
4ab (III) (V) (VI) (VII) IX X XI A B C
(III) V VI VII IX X
1/2b I II (III) ABC
Listeria welshimeri 4c (III) V VII
6a (III) V (VI) (VII) (IX)
6b XV
(III) (VII) IX X
XI
1/2a I II (III) AB
1/2b I II (III) ABC
Listeria 1/2c I II (III) B D
Seeligeri 4b (III) V VI ABC
4c (III) V VII ABC
4d (III) (V) VI VIII ABC
6b (III) (V) (VI) (VII) IX X A B C
XI
Listeria grayi subsp. (III) XII
grayi XIV E
Listeria grayi subsp. (III) XII
murrayi XIV E

58
Chapitre IX Bactériologie

IX.6. Conservation des souches.

Les souches de Listeria peuvent être conservées dans un tube de gélose nutritive
profonde maintenu à 15°C. Elles pourront survivre tant que la gélose ne sera pas
desséchée, mais un repiquage trimestriel est recommandé en vue d’une
meilleure conservation (62, 77, 105, 106, 107, 164).

59
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria

Chapitre X : Pouvoir pathogène des Listeria.


Parmi les sept espèces que regroupe le genre Listeria, seules Listeria
monocytogenes et Listeria ivanovii sont naturellement et expérimentalement
pathogènes.
Listeria ivanovii est responsable essentiellement des avortements chez les
bovins, ovins et caprins.
Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène opportuniste, à
multiplication intracellulaire facultative.
Son pouvoir pathogène est très large. Elle entraîne en effet des infections chez
plus de soixante espèces animales, incluant l'homme, 37 espèces de
mammifères, 17 espèces d'oiseaux, des poissons, des crustacés et même des
insectes (cf. tableau I).
Une des caractéristiques très remarquable de ces infections est la fréquence des
infections neuro-ménningée aussi bien chez l'homme que chez l'animal.
La listériose est présente dans les pays industrialisés, sans qu'il en soit possible
de dire si elle est vraiment absente des pays en développement ou présente et
non diagnostiquée.
X.1.L'infection par Listeria monocytogenes.
X.1.1.Pouvoir pathogène expérimental : In vivo.
De nombreuses espèces animales, en particulier les lapins, souris et cobayes,
sont sensibles à l'infection expérimentale.
L'animal de laboratoire le plus utilisé est la souris. En effet, la listériose murine
est comparable à la listériose humaine en de nombreux points : toutes les
souches de Listeria monocytogenes isolées à partir de cas cliniques se sont
révélées virulentes chez la souris ; des complications similaires à celles
rencontrées chez la femme enceinte infectée sont retrouvées dans le cas d'une
infection chez la souris gravide et les observations immuno-pathologiques sont
similaires (48, 62, 67, 168, 179, 187).
X.1.2.Physiopathologie de la listériose.
Les données anatomopathologiques et celles provenant des modèles
expérimentaux chez l'animal, ainsi que l'origine alimentaire de la contamination,
indiquent que la porte d'entrée de Listeria dans son hôte est très probablement
localisée au niveau du tube digestif.

En 1972, dans une étude pionnière en microscopie électronique, P. Racz a


montré que Listeria monocytogenes est capable de pénétrer dans les cellules
épithéliales de l'intestin (après inoculation per-os d'une dose sub-létale de
Listeria monocytogenes) chez les cobayes.

60
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria

Quelques années, plus tard, deux études réalisées chez la souris (179) montraient
que Listeria monocytogenes est surtout retrouvée dans les plaques de Peyer et
non dans les cellules intestinales absorbantes, comme cela a été observé par
Racz. La contradiction apparente de ces travaux reflète :
 d'une part, des conditions expérimentales très différentes,
 d'autre part, l'existence de plusieurs sites d'entrée dans l'organisme,
 d'autre part, encore, la difficulté de produire une infection expérimentale par
cette voie.
En effet, après la traversée de la barrière intestinale, les bactéries sont
phagocytées par les macrophages résidents de la lamina pro pria et circulent,
libres ou dans des macrophages via la lymphe, vers les ganglions mésentériques.
Elles sont ensuite véhiculées dans les canaux lymphatiques efférents qui se
déversent dans la circulation sanguine. Les bactéries se retrouvent alors dans le
foie et la rate, principaux organes filtres du système sanguin. Elles sont alors très
rapidement ingérées et détruites par les cellules phagocytaires du système
réticulo-endothélial et en particulier par les macrophages résidents du foie, les
cellules de Küpffer (179). Les bactéries survivantes peuvent se multiplier dans
les macrophages et/ou envahir les hépatocytes adjacents qui représentent un site
privilégié de multiplication intracellulaire bactérienne.
Au début de l'infection, les hépatocytes infectés sont lysés par les neutrophiles.
Les bactéries se retrouvent alors à l'extérieur des cellules et deviennent
accessibles à l'ingestion par les macrophages listéricides.
Si la multiplication bactérienne dans ces foyers infectieux n'est pas rapidement
contrôlée par le système immunitaire de l'hôte, les bactéries sont à nouveau
disséminées dans le courant sanguin et se dirigent vers le système nerveux et
l'unité foeto-placentaire.

61
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria

Les foyers hépatiques et spléniques peuvent devenir coalescents et atteindre des


proportions importantes, en particulier chez le nouveau-né (granulomatis
infantiseptica).

Schéma n°7 : Représentation schématique des différentes étapes de l'infection


par Listeria monocytogenes au niveau de l'organisme hôte (49, 67, 179).

Ce schéma physiologique souligne l'importance d'un mécanisme clé dans la


virulence de Listeria monocytogenes, sa capacité à pénétrer et à se multiplier
dans de nombreuses cellules animales et à échapper ainsi à certains mécanismes
de défense de l'organisme.

Il faut souligner également la capacité de Listeria à passer directement d'une


cellule à l'autre et de se disséminer ainsi à l'intérieur des tissus ; ceci est alors
une autre stratégie très importante.

62
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria

X.1.3.Description du cycle infectieux au niveau cellulaire : In vitro.


Le développement des modèles in vitro d'infection cellulaire par Listeria
monocytogenes, au cours de ces dernières années, a permis de décrire les
principales étapes de l'invasion des cellules eucaryotes.
Les cellules utilisées sont d'origine diverse, soit des cellules phagocytaires
professionnelles de type macrophagique (macrophages primaires d'origine
péritonéale ou médullaire), ou cellules de la lignée.
Les cellules sont cultivées en monocouche sur des supports variés et infectées
par les bactéries à des multiplicités d'infection comprises entre 1 et 100 bactéries
par cellule. L'entrée des Listeria et leur croissance intracellulaire peuvent être
étudiées quantitativement par le dénombrement de bactéries restées viables en
présence de gentamicine, un antibiotique qui, utilisé à une concentration
approprié, ne pénètre pas à l'intérieur des cellules vivantes et détruit
sélectivement les bactéries extracellulaires (48, 49, 179).
L'ensemble du processus infectieux a été visualisé grâce à la microscopie
électronique (179).
L'utilisation de la microscopie à fluorescence et le marquage spécifique de
certaines molécules comme l'actine ont permis de visualiser l'interaction des
Listeria avec les constituants du cytosquelette cellulaire.
En dehors de la phase d'entrée, les mêmes mécanismes semblent être mis en jeu
dans les cellules phagocytaires professionnelles et non professionnelles. Listeria
monocytogenes est phagocytée par les cellules phagocytaires, ou induit sa propre
phagocytose dans les cellules non phagocytaires.
Le mécanisme d'entrée dans les cellules épithéliales est apparenté à la
phagocytose, car il fait intervenir le système des micro filaments d'actine de la
cellule hôte. En effet, les cellules prétraitées avec des drogues qui inhibent la
polymérisation de l'actine telles que les cytochalasines, sont incompétentes pour
l'infection par Listeria monocytogenes.
Peu après son internalisation, la bactérie est présente dans un phagolysosome
qu'elle lyse très rapidement (en moins de trente minutes). Elle gagne ensuite le
cytoplasme où non seulement, elle se multiplie, mais où elle induit un
phénomène décrit également pour Shigella flexneri, la polymérisation de l'actine
cellulaire. Cette actine filamenteuse recouvre tout d'abord la bactérie puis se
réorganise pour former une comète qui se situe du côté opposé à la direction
prise par la bactérie.

63
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria

Environ 3 heures après l'infection, quand Listeria monocytogenes atteint la


membrane de la cellule hôte, elle la déforme, créant une protrusion cellulaire qui
peut atteindre des dizaines de fois la longueur de la bactérie.
Si cette protrusion entre en contact avec une autre cellule, elle est alors
endocytée et la bactérie se retrouve dans une vacuole à deux membranes qu'elle
peut lyser et ainsi recommencer un nouveau cycle de multiplication.
Les différentes étapes de ce cycle sont schématisées sur le schéma n°8 ci
dessous.

Schéma n°8 : Mouvement intracellulaire de Listeria monocytogenes et le


passage de cellule à cellule (179).
Le passage direct de cellule à cellule permet à Listeria monocytogenes
d'échapper à certaines défenses immunitaires de l'hôte telles que les anticorps
circulants ou le système du complément.

64
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria

X.2.Les déterminants génétiques et moléculaires du pouvoir pathogène de


Listeria monocytogenes.
Les principaux facteurs de virulence seront décrits en suivant la chronologie des
différentes étapes du cycle infectieux au niveau cellulaire.
X.2.1.Entrée dans les cellules.
L'adhésion est la première étape de l'invasion des cellules hôtes par les bactéries.
Cette étape pourrait faire intervenir des interactions de type lectine-substrat.
D'une part, le sucre alpha D-galactose présent à la surface d'une souche virulente
de Listeria monocytogenes, est responsable de la fixation de certaines lectines et
également récepteur du galactose présent sur certaines cellules eucaryotes non
phagocytaires. Deux souches non virulentes n'auraient pas ces résidus alpha D-
galactose présent à leur surface (Cossart et al 1990).
D'autre part, des composés de type lectines, capables de fixer certains sucres, ont
été identifiés à la surface de Listeria monocytogenes.
Ces composés seraient de nature protéique, mais leur rôle dans l'adhésion n'a pas
été élucidé (Cottin et al 1990).
Il a également été rapporté que Listeria monocytogenes est capable de se lier à
une molécule de la matrice extracellulaire, la virionectine. Cependant, son rôle
dans la virulence semble peu probable puisque des souches non pathogènes de
Listeria fixent aussi cette molécule (179).
En revanche, la fibronectine dont le rôle dans l'adhésion a été établi pour
d'autres bactéries à Gram positif telles que les Streptocoques et les
Staphylocoques, ne se fixe pas sur Listeria.
A l'heure actuelle, il est encore difficile de faire une distinction très précise, chez
Listeria monocytogenes entre les :
 facteurs d'adhésion,
 facteurs d'invasion.
Le mécanisme d'entrée de Listeria monocytogenes dans les cellules
phagocytaires professionnelles est un processus de phagocytose stricto sensu
impliquant plusieurs récepteurs cellulaires.
Une corrélation intéressante a été établie entre la nature moléculaire du
récepteur utilisé et le pouvoir bactéricide des macrophages.
En effet, dans les macrophages listéricides, le récepteur de type 3 du
complément (CR 3) est le récepteur majeur, qui reconnaît spécifiquement les
molécules C3b du complément déposées à la surface des bactéries.

65
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria

Dans les macrophages non listéricides, des récepteurs différents du CR3 sont
utilisés. Leur nature moléculaire n'est pas encore établie (179).
L'entrée de Listeria monocytogenes dans les cellules non phagocytaires telles
que les cellules épithéliales et fibroblastiques fait intervenir un processus
apparenté à la phagocytose. Cette propriété à induire sa propre phagocytose au
niveau des cellules hôtes est spécifique des espèces pathogènes du genre
Listeria.
A ce jour, deux facteurs bactériens ont été impliqués dans l'invasion des cellules
non phagocytaires :
 la protéine p60,
 l'internaline.
La protéine p 60.
Elle a d'abord été décrite comme étant une protéine majeure de 60 KDa, sécrétée
par Listeria monocytogenes et nécessaire pour l'invasion in vitro des cellules
fibroblastiques de la lignée 3T6.
En réalité, le rôle de cette protéine dans l'invasion reste difficile à interpréter. Il
faut d'ailleurs noter que la plupart des espèces du genre Listeria, pathogènes ou
non, produisent des protéines immunologiquement apparentées à la p60 et
possèdent, au sein de leur chromosome, des séquences homologues au gène iap
(invasion associated protein ).(48, 67, 179).
L'internaline.
Cette protéine a d'abord été identifiée en étudiant des mutants non invasifs pour
les cellules épithéliales d'origine intestinale.
La nature du récepteur cellulaire reconnu par l'internaline n'est pas encore
établie (48, 67, 179).

66
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria

X.2.2.Le mouvement intracellulaire de Listeria monocytogenes et le passage de


cellule en cellule. (cf. schéma n°8 ci avant).
La capacité de Listeria monocytogenes à se mouvoir à l'intérieur des cellules en
piratant le cytosquelette de l'hôte et ainsi à passer directement de cellule en
cellule, est un déterminant essentiel de la virulence.
La motilité intracellulaire de Listeria monocytogenes qui est strictement corrélée
à la polymérisation de l'actine cellulaire est en fait, un modèle simple de
mouvement lié à l'assemblage de l'actine, et pour cette raison très convoitée par
les biologistes cellulaires qui s'intéressent à la nucléation de l'actine (179). Cette
motilité intracellulaire est très différente de la motilité propre de Listeria
monocytogenes dans le milieu extracellulaire. En effet, cultivée entre 20 et 25°C,
Listeria monocytogenes est mobile grâce à la production d'un à quatre flagelles
péritriches, à 37°C les flagelles sont absents (114, 179).
Le passage direct de cellule en cellule peut être visualisé in vitro en utilisant le
test de formation de plages décrit pour la première fois par Havell en 1986. Ce
test consiste à infecter une monocouche de cellules fibroblastiques par Listeria
monocytogenes à une faible multiplicité d'infection et à recouvrir cette
monocouche d'une surcouche d'agarose contenant de la gentamicine qui
empêche la reinfection des cellules par les bactéries extracellulaires.
L'apparition de plages de lyse permet alors, de visualiser le passage des bactéries
dans les cellules voisines des cellules infectées.
Ainsi, des mutants incapables de former des plages de lyse ont pu être isolés et
l'analyse de ces mutants montre que leur virulence est fortement atténuée chez la
souris, bien qu'ils soient capables d'envahir les cellules et de se multiplier dans
le cytoplasme.

67
Chapitre XI Traitement de la listériose

Chapitre XI : Traitement de la listériose.


XI.1.En médecine vétérinaire.
En médecine vétérinaire, la mise en place et le choix du traitement dépendent à
la fois du stade et de la forme de la maladie, mais aussi de l'âge des animaux tout
en tenant compte du fait que certains malades restent porteurs sains pendant de
longues périodes, donc entretiennent bien le foyer infectieux : (55, 77, 193, 196,
198).

Tout d'abord en ce qui concerne les animaux atteints d'encéphalites ou de


méningo-encéphalites à Listeria, ainsi que les veaux nés après avortement, ils
finiront par mourir comme on l'a déjà vu dans la partie clinique, il n'y a donc pas
lieu d'instaurer un traitement (55, 196, 198).

En ce qui concerne les animaux jeunes atteints d'une forme clinique aiguë,
l'injection intraveineuse de Chlortétracycline à raison de 12 mg par kg de poids
vif et par jour pendant 5 jours est assez efficace contre la méningo -encéphalite
bovine, mais moins chez le mouton (55).
Le taux de guérison dépend étroitement de la précocité du traitement. Si des
signes graves sont déjà visibles, la mort s'ensuit malgré la mise en place d'un
traitement.
Habituellement dans une enzootie, le premier sujet meurt, les cas subséquents
sont alors dépistés assez tôt pour que le traitement empêche la mortalité.

Le chloramphénicol et une synergie de pénicilline et de streptomycine à raison


de 0,25 g et 300 000 UI, ont été employés avec succès dans la forme
septicémique (55, 77).

En ce qui concerne, les vaches ayant avortées, et dans le but de minimiser au


maximum les foyers infectieux, il est vivement conseiller aujourd'hui de les
abattre, car elles restent excrétrices de Listeria pendant très longtemps, jusqu'à 6
mois et plus.

68
Chapitre XI Traitement de la listériose

XI.2.En médecine humaine.


L’Ampicilline est préconisée depuis longtemps et reste l’antibiotique de choix
dans le traitement des listérioses (77, 170, 171).
L’association de cette molécule avec un aminoside comme la gentamicine à
raison de 3 mg/kg/jour, permet d’obtenir un effet bactéricide plus rapide.
Un relais oral (ampicilline 4 g/jour) peut être institué après 15 jours de
traitement intraveineux. La durée du traitement est habituellement de 4 à 6
semaines, un minimum de 2 semaines étant requis dans tous les cas.
En raison de leur faible diffusion méningée, une injection intra-thécale
d’aminosides est quelque fois préconisée bien que l’efficacité réelle de cette
administration soit contestée par certains auteurs.
Du fait de leur caractère toxique sur le rein et l’oreille interne, un dosage
sanguin des aminosides devra être effectué régulièrement pendant la durée du
traitement.
En cas d’allergie aux -lactamines, l’alternative est représentée par l’association
Trimétoprime – Sulfaméthoxazole. Cette association aurait une efficacité
équivalente à l’association classique ampicilline – gentamicine et de plus, elle
présente une bonne pénétration de la barrière hémoméningée et une activité
intéressante sur les bactéries intracellulaires (77, 120, 164).
La Vancomycine peut également être considérée pour les bactériémies
primaires.
Par contre, il est important de rappeler que les céphalosporines de troisième
génération, utilisées très fréquemment dans le traitement d’attaque des
méningites et les Quinolones récentes, ayant l’avantage d’une bonne pénétration
cellulaire, sont le plus souvent inefficaces dans le traitement des listérioses (77).
Le succès du traitement dépend donc, tout particulièrement de sa précocité,
notamment dans les infections du système nerveux central.

69
Chapitre XII Sensibilité des Listeria aux antibiotiques

Chapitre XII : Sensibilité des Listeria aux antibiotiques.


La sensibilité de Listeria monocytogenes aux agents antimicrobiens est
assez stable depuis plusieurs années.
In vitro, Listeria monocytogenes et les autres Listeria sont généralement
sensibles à de nombreux antibiotiques parmi lesquels :
Pénicilline G, Ampicilline, Amoxicilline, Azlocilline, Imipénème, Gentamicine,
Sisomicine, Nétilmicine, Amikacine, Kanamycine, Streptomycine,
Erythromycine, Clarithromycine, Roxithromycine, Tyrothricine, Vancomycine,
Teicoplanine, Daptomycine, Triméthoprime-sulfaméthoxazole, Rifampicine,
Tétracyclines.
Une résistance naturelle est notée vis-à-vis des :
Céphalosporines (notamment vis-à-vis des céphalosporines de troisième
génération à large spectre comme la Céfotaxime ou la Céfépime), Aztréonam,
Acide nalidixique, Ofloxacine, Fluoroquinolones récentes, Fosfomycine.
La sensibilité est intermédiaire pour la Céfalotine, Ciprofloxacine,
Chloramphénicol, Clindamycine
Quelques rares souches sont capables d'acquérir une résistance à la
streptomycine, à la Kanamycine, à la Gentamicine, au Triméthoprime, aux
Tétracyclines ou à la Rifampicine.
L'émergence des souches résistantes résulte généralement de l'acquisition de
plasmides.
Ainsi, en 1988, une souche multirésistante a été isolée en France. Cette souche
résistait à l'Erythromycine, à la Streptomycine, au Chloramphénicol, à la
Tétracycline et à la Minocycline. L'ensemble de ces caractères est porté par un
plasmide de 37 kb (le plasmide p IP 811) également présent chez des souches de
Enterococcus sp et de Streptococcus sp.
In vitro, les plasmides de résistance aux antibiotiques des entérocoques se
transfèrent facilement à des souches de Listeria sp. Il est donc probable que ce
transfert soit possible in vivo notamment lorsque des souches de Listeria sont
hébergées dans le tube digestif.
Par ailleurs, l'utilisation anarchique des antibiotiques aussi bien en médecine
humaine que vétérinaire, pourrait dans un proche avenir faire émerger de
nombreuses souches de Listeria multi résistantes.
La résistance à la Tétracycline est la résistance acquise la plus fréquemment
observée chez Listeria monocytogenes aussi bien chez des souches isolées de
prélèvements cliniques que chez des souches isolées des aliments et de
l'environnement (77).
En revanche, aucune souche résistante aux Pénicillines n'a été isolée.

70
Chapitre XIII Prophylaxie et recommandations

Chapitre XIII : Prophylaxie et recommandations.


Actuellement, on évolue progressivement vers la mise en place de
systèmes HACCP en entreprises, et vers un nouveau concept appelé "Analyse
du risque". Les systèmes HACCP sont des procédures relatives à la mise en
place d’une démarche "Assurance Qualité", fondée sur l’analyse des dangers et
la maîtrise des points critiques, soit la maîtrise de tout danger ou risque de porter
atteinte à la fois à la santé humaine, à la santé animale ou à l’industrie agro-
alimentaire de façon générale. De plus, ces systèmes s'étalent de la fourche
(élevage) à la fourchette (consommateur), autrement dit, ils permettent non
seulement de chercher, de découvrir et de mesurer la valeur des points critiques,
mais aussi d’y apporter des mesures correctives. C’est donc, dans ce sens et sur
la base de ce nouveau concept, que sera mise en place, la prophylaxie de la
listériose au niveau des élevages, en industrie, mais aussi chez l’homme.
Par ailleurs, et compte tenu du fait que, Listeria monocytogenes, est une bactérie
ubiquiste et résistante, il serait donc, illusoire de penser à son éradication totale.
Néanmoins, il ne faut pas non plus, négliger une quelconque étape dans la mise
en place de ces systèmes. D’ailleurs, la moindre erreur, permettra d’entretenir
une souche et par conséquent, de maintenir et d'enrichir un foyer infectieux
d’une part, et d’affaiblir toutes les démarches entreprises d’autre part (77, 96,
139, 145).

XIII.1.Prophylaxie dans les élevages.


Dans les élevages, plusieurs points forts sont à maîtriser :
 D’abord l’animal lui-même : dans ce cas, la prophylaxie passe
nécessairement par le dépistage systématique en vue de détecter les vaches
excrétrices. Cette recherche doit s'effectuer avec un rythme annuel ou
semestriel et devra être réalisée à l'échelon individuel ou collectif. La
réforme des femelles excrétrices est une nécessité (77).
 L’alimentation : compte tenu du fait que les ensilages constituent les
principaux foyers d’entretien et de multiplication des Listeria, ils doivent être
correctement préparés et conservés. Un soin particulier doit être apporté au
tassement et à l'absence de mottes de terre. Certains auteurs préconisent
l'ensemencement des ensilages avec des souches de Lactococcus lactis ou de
Lactobacillus plantarum qui inhibent la croissance des Listeria. L'utilisation
de ce procédé apparaît prometteur (77).
 L'hygiène des locaux et en particulier l’hygiène de la salle et du matériel de
traite. Les désinfectants classiques (détergent acide anionique, ammonium
quaternaire, iode, hypochlorite) sont actifs sur Listeria monocytogenes (77,
145).

71
Chapitre XIII Prophylaxie et recommandations

XIII.2.Prophylaxie dans les industries.


Dans les industries, plusieurs points forts sont également à maîtriser :
 Les Listeria sont introduites dans les locaux de transformation par les
matières premières contaminées, par les équipements de manutention
contaminés, par les chaussures et les vêtements du personnel, par les
individus porteurs sains. Leur croissance et leur survie est favorisée par
l'humidité et par la présence de nutriments. En effet, Listeria monocytogenes
est capable d'adhérer à de nombreuses surfaces (y compris le verre ou l'acier
inoxydable), elle survit dans l'environnement des entreprises de
transformation, elle peut être retrouvée sur les mains du personnel même
après lavage et elle survit dans les aérosols. L'utilisation de conditionnement
sous vide ou sous atmosphère modifiée n'a aucun effet significatif sur la
croissance de Listeria monocytogenes (77, 138, 139). Par conséquent, la
prophylaxie de la listériose sera fondée sur :
 la sélection rigoureuse des matières premières,
 le strict respect des plans de nettoyage et de désinfection,
 le strict respect des bonnes pratiques de fabrication (BPF).
A titre d’exemple, en France, 2 à 4% des prélèvements de laits crus sont
reconnus contaminés, par Listeria. Cette contamination présente un risque
majeur pour les produits fabriqués à base de lait cru ; c’est le cas de certains
fromages, d’ailleurs, environ 10% d’entre eux, sont contaminés (77).

 L’hygiène de l'abattage est également cruciale car les carcasses des animaux
de boucherie sont essentiellement contaminées en surface et, à l'abattoir, le
poste de dépouillage est un point critique de contamination. Ultérieurement,
les phases de découpe et de conditionnement accroissent les risques. Il est
donc nécessaire de veiller au strict respect des normes d'hygiène pour chacun
de ces postes à risque (145).

 Respect de la chaîne du froid et réduction des dates limites de consommation.


Listeria monocytogenes peut se multiplier à basse température mais le temps
de génération est beaucoup plus long qu'à température ambiante. Le respect
de la chaîne du froid est donc primordial pour éviter une multiplication
excessive. Si les industriels et les commerçants ont les capacités techniques
d'assurer une bonne conservation des aliments, il n'en est pas toujours de
même pour les consommateurs. Un produit présentant très peu de bactéries
au moment de la vente peut devenir fortement contaminé lorsqu'il est
conservé plusieurs jours voire même plusieurs semaines dans un réfrigérateur
domestique dont la température est généralement supérieure à +4°C. Dans
ces conditions, une diminution des dates limites de conservation peut
constituer une bonne alternative (77, 139, 145).

72
Chapitre XIII Prophylaxie et recommandations

XIII.3.Prophylaxie chez l’homme.


La prophylaxie de la listériose humaine est avant tout, une prophylaxie sanitaire
fondée sur une éducation sanitaire exemplaire et irréprochable.
L’hygiène corporelle et vestimentaire, individuelle et collective, des
manipulateurs doit être rigoureuse. La formation et la sensibilisation du
personnel sont particulièrement importantes.
La médecine du travail préconise dans ce sens, en plus de la visite médicale
d’embauche, deux contrôles annuels avec dépistage systématique des porteurs
sains et insiste beaucoup sur la formation et l’éducation sanitaire (138, 139).
Par ailleurs, la vaccination et/ou antibioprophylaxie n'est pas utilisée et, selon
un avis du Conseil Supérieur d'Hygiène Publique de France (approuvé le 29 juin
1999), il n’y a pas lieu de recommander une antibioprophylaxie systématique en
cas de consommation d’un aliment contaminé par Listeria monocytogenes (77).
En conclusion, la prophylaxie de la listériose humaine est basée essentiellement
sur l’information des populations à risque et sur l’éducation sanitaire.
Les meilleurs conseils que l'on puisse donner aux consommateurs, sont ceux
dictés par le Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire (N° 4 du 25 janvier 2000)
à savoir :
 Eviter la consommation de lait cru et de produits à base de lait cru,
 Cuire soigneusement les aliments crus d'origine animale,
 Laver soigneusement les légumes crus et les herbes aromatiques,
 Dans le cas de repas qui ne sont pas pris en collectivité, les restes
alimentaires et les plats cuisinés doivent être réchauffés soigneusement avant
consommation immédiate,
 Conserver les aliments crus, séparément des aliments cuits ou prêts à être
consommés,
 Se laver les mains, nettoyer les ustensiles de cuisine après la manipulation
d'aliments non cuits,
 Nettoyer fréquemment et désinfecter ensuite avec de l'eau de Javel son
réfrigérateur,
 S’assurer que la température du réfrigérateur est suffisamment basse : 4°C,
 Respecter les dates limites de consommation,
 Eviter les croûtes des fromages.

Les recommandations du CDC d'Atlanta sont comparables à celles édictées par


la Direction Générale de la Santé de France et reposent sur les mêmes règles
citées précédemment.

73
Notre synthèse bibliographique, à partir des plus récents travaux, montre
que Listeria monocytogenes est une bactérie ubiquiste et pathogène. Elle est
dépourvue de capsule, ne sporule pas mais résistante à de nombreux agents
physiques, chimiques, biologiques ainsi que dans le milieu extérieur. Elle est
responsable de la Listériose qui est considérée comme une maladie des pays
industrialisés, essentiellement animale et accidentellement humaine. La dose
minimale infectieuse n’est pas connue avec certitude jusqu’à ce jour car
tributaire des groupes à risque. La durée d’incubation reste improbable et est
estimée entre 3 à 4 jours, voire 3 à 4 semaines et parfois même un peu plus. Le
mode de transmission se fait essentiellement par le biais des ensilages chez
l’animal et surtout par les laits crus et les fromages à base de laits crus, chez
l’homme.

Sur le plan bactériologique, la méthode de recherche quantitative de Listeria


monocytogenes, homologuée et validée par l’ISO est préconisée. Actuellement,
la sérotypie a peu d’intérêt car elle n’apporte pas d’informations capitales. La
lysotypie quant à elle, ne trouve sa valeur que lors d’épidémies dans les enquêtes
cas témoins. La sérologie, particulièrement chez la femme enceinte n’est pas du
tout significative, car après l’infection Listeria monocytogenes provoque une
réaction immunitaire à médiation cellulaire.

Sur le plan clinique, la Listériose invasive se manifeste sous forme de méningite,


méningo-encéphalite allant jusqu’à la septicémie et avortement aussi bien, chez
l’homme que chez l’animal. Les séquelles sont de nature psychiatrique et la
mortalité peut atteindre des taux de 25 à 30 %, chez l’homme.
L'antibiothérapie est efficace en cas d'infection, si le diagnostic est porté
rapidement.

Sur le plan épidémiologique, la Listériose se manifeste le plus souvent sous


forme de cas sporadiques, rarement sous forme d’épidémies dans les deux cas, et
plus rarement encore sous forme d’infection nosocomiale notamment dans les
services de maternités.

En Algérie, face à l’augmentation croissante de la production de lait cru,


au net développement des industries agro-alimentaires, particulièrement les
industries laitières ; notre inquiétude est grande face à cette bactérie. Partant de
l’hypothèse que les Listeria sont principalement véhiculées par le lait cru, nous
nous sommes fixés les objectifs suivants :

1. Recherche :
o qualitative des Listeria à partir du lait cru.
o quantitative de Listeria monocytogenes à partir du lait cru.
2. Analyse du risque Listeria monocytogenes, dans le lait cru.

74
75
Chapitre I Prélèvements

Chapitre I. Prélèvements.
Notre travail s’est effectué dans la région centre (Alger, Blida, Ain Defla,
Tipaza et Boumerdes) durant la période allant de Février 1998 à Août 2005.
La première période s’étend du mois de Février de l’année 1998 au mois de
décembre de l’année 2003. La seconde période s’étend du mois de Janvier 2004
au mois d’août de l’année 2005.
Entre 1998 et 2002, le travail s’est effectué au "Laboratoire de Bactériologie
Alimentaire" à l’institut Pasteur d’Algérie puis entre 2003 et 2005, la suite du
travail s’est effectuée au "Laboratoire National des Listeria" toujours à l’IPA.
Les prélèvements de laits crus de vache ont été effectués selon les règles des
bonnes pratiques d’échantillonnage et de transport au niveau des points de vente,
exceptés ceux de l’année 2000 et 783 laits sur 974 de l’année 2001.
La répartition des échantillons de laits crus par année, ainsi que leur nombre
total et leur pourcentage, figurent dans le tableau suivant.
Tableau XII : Distribution des échantillons de lait par année.
Première période Seconde
période
Années 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Nombre 79 102 649* 974** 533 121 286 251
Pourcentage 2,64 3,40 21,67 32,52 17,80 4,04 9,55 8,38
Total 2995
* : tous ces laits sont destinés au circuit de transformation. ** : Sur les 974
prélèvements, 783 laits sont destinés au circuit de transformation et 191 sont
destinés au circuit de vente directe.
Au total, nous avons réalisé 2995 échantillons de laits crus de vaches répartis
comme suit :
 Première période :
 79 échantillons de lait cru en 1998, soit 2,64 %,
 102 échantillons de lait cru en 1999, soit 3,40 %,
 649 échantillons de lait cru en 2000, soit 21,67 %,
 974 échantillons de lait cru en 2001, soit 32,52 %,
 533 échantillons de lait cru en 2002, soit 17,80 %,
 121 échantillons de lait cru en 2003, soit 4,04 %,
 Seconde période :
 286 échantillons de lait cru en 2004, soit 9,55 %,
 251 échantillons de lait cru en 2005, soit 8,38 %.

76
Chapitre I Prélèvements

La distribution des échantillons de laits par année est représentée de façon


graphique dans la figure suivante.

1200

1050
974
900
Nbre de prélèvements

750
649
600
533
450

300 286 251


150 121
79 102
0
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Années

Figure n° 1. Courbe d’échantillonnage.


En 1998, après la mise en place de la méthode de recherche qualitative des
Listeria dans les laits crus de vaches, nous avons traité 79 prélèvements et 102
prélèvements en 1999.
Dès l’année 2000, nous avons constaté une augmentation sensible du nombre de
prélèvements avec un pic de 974 prélèvements en 2001. Ceci peut s’expliquer
par une motivation et une sensibilisation accrues, dues aux épidémies survenues
dans le monde et particulièrement dans les pays voisins, endémiques (2).
Le nombre d’échantillons diminue sensiblement dès 2003, pour se maintenir à
des niveaux de prélèvements de l’ordre de 250 par année, ce qui se traduit par
une surveillance microbiologique constante.
En 2003, l’avancée réalisée dans les travaux de recherche sur les Listeria nous a
permis d’axer notre travail sur une nouvelle méthode quantitative.

77
Chapitre II Méthodes d’analyse

Chapitre II : Méthodes d’analyse.


II. 1. Analyse qualitative :
Méthode ISO 11290-1. Recherche des Listeria à partir des denrées
alimentaires.
II.1.a. Objet et domaine d’application..
Cette méthode consiste en la recherche des Listeria dans toutes les catégories de
laits et produits laitiers.
II. I. b. Référentiels.
L’application correcte de cette méthode nécessite au préalable, l’utilisation de
certains référentiels parmi lesquels nous citerons :
 Norme ISO 11290-1 : Recherche des Listeria dans les denrées alimentaires.
 Norme AFNOR. NF V 08-055 : Recherche des Listeria dans les denrées
alimentaires.
 Norme NF V 08-010 : Règles générales pour la préparation des dilutions en
vue de l’examen microbiologique.
 Norme NF EN ISO 6887-1 : Suspension mère et dilutions décimales ; 1.
règles générales.
 Norme NF V 08-057-2 : Microbiologie alimentaire – Directives générales
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique.
 Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et
l’expression des résultats.
 Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
 Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence
des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
III .I . c. Mode opératoire.
Par cette méthode, la recherche des Listeria se fait en quatre étapes
successives selon le protocole suivant :
Jour 1 : Enrichissement primaire.
Prélever 25 millilitres de lait cru à analyser dans 1 sachet stérile de type
Stomatcher 400, contenant 225 ml de bouillon Fraser au Demi additionné de ses
suppléments et antibiotiques.
Broyer cette suspension dans un broyeur de type Stomatcher, puis la transposer
dans un flacon stérile qu’on incube à 30°C pendant 18 à 24 heures.
Jour 2 : Enrichissement secondaire et premier isolement.
A partir du bouillon d’enrichissement primaire, procéder comme suit :
 d’une part, à l’enrichissement secondaire sur milieu sélectif de Fraser en tube
à raison de 0,1 ml, à incuber à 37°C pendant 24 heures,
 d’autre part, à l’isolement sur gélose Palcam (P1) ou Oxford (O1), à incuber
à 37°C pendant 24 à 48 heures, comme l’indique le logigramme n°1 ci-après.

78
Chapitre II Méthodes d’analyse

Jour 3 : lecture et isolement.


 A partir du bouillon d’enrichissement secondaire, procéder au deuxième
isolement sur gélose Palcam (P2) ou Oxford (O2), à incuber à 37°C pendant
24 à 48 heures.
 Faire la lecture des plaques P1 ou O1, en recherchant les colonies
caractéristiques.
 Dans les cas de forte suspicion, procéder à une purification sur gélose
TSAYE.
 Dans le cas contraire, ré incuber les boites à 37°C pendant 24 heures
supplémentaires.
Jour 4 : Lecture et identification biochimique.
Les colonies caractéristiques ayant poussé sur gélose Palcam, Oxford ou
TSAYE feront l’objet d’une identification biochimique basée sur :
 Identification du genre Listeria, elle-même basée sur :
 Coloration de Gram (petits BGP),
 Test Catalase (positif),
 Identification des espèces du genre Listeria, basée elle-même sur :
 Mobilité (Etat Frais ou mieux en gélose mobilité à 22 - 25°C),
 Hémolyse de type β, ou Camp-test sur gélose TSA au sang,
 Aéro-anaérobie facultatif,
 VP (+) et RM (+),
 Oxydase (–),
 Nitrate réductase (–),
 Glucose (+), Gaz (–) et H2S (–),
 Esculine (+),
 Urée (–), Indole (–) et TDA (–),
 ou mieux encore une galerie biochimique miniaturisée de type
API – Listeria.
Remarques importantes.
1. Certains auteurs préconisent l'utilisation d'une souche témoin de Listeria
monocytogenes en même temps que l'analyse elle même et dans les mêmes
conditions opératoires, ceci a pour but de contrôler toutes les étapes
analytiques y compris le contrôle des étuves ainsi qu’un contrôle de fertilité
des milieux de cultures utilisés.
2. D'autres auteurs préconisent le maintient du bouillon d'enrichissement
primaire pendant 7 à 8 jours à 30°C, puis d'en faire un isolement sur gélose
Palcam ou Oxford, ceci a pour but d'augmenter les chances de retrouver
surtout les Listeria et particulièrement les Listeria stressées.

79
Chapitre II Méthodes d’analyse

LOGIGRAMME n°1 : METHODE ISO 11290 – 1

Jour 1

25 ml dans
225 ml de
Fraser ½

Enrichissement primaire
30°C, 18 à 24 h

Jour : 2

0,1 ml

Isolement

P(1)
ou Fraser
O(1)

Enrichissement
Secondaire

37°C, 24 h

Jour : 3
P(2)
ou
O(2)

3 à 5 Colonies 37°C , 24 h
Jour : 4
Purification Purification
TSAYE TSAYE

Identification du genre d’abord puis de l’espèce après.

80
Chapitre II Méthodes d’analyse

Identification du genre Listeria.


Aspect de Listeria monocytogenes sur Palcam
La photo suivante montre l’aspect typique de Listeria monocytogenes sur gélose
Palcam.

Photo n°4. Aspect de Listeria monocytogenes sur Palcam

La photo suivante montre l’aspect typique de Listeria monocytogenes sur gélose


Oxford.

Photo n°5. Aspect de Listeria monocytogenes sur Oxford

81
Chapitre II Méthodes d’analyse

Coloration de Gram.
Cette dernière donne des petits bacilles à Gram positifs, en forme de « V » ou de
« L », comme le montre la figure suivante.

Photo n°6. Aspect de Listeria monocytogenes au Gram

Réaction Catalase.
Placer séparément deux gouttes d’une solution de peroxyde d’hydrogène à 20
volumes sur une lame de microscope. Prélever une colonie avec une tige de
verre (pipette Pasteur) ou en plastique (surtout pas de fil métallique) et
l’émulsionner doucement dans une des deux gouttes.
Observer immédiatement et après 5 minutes s’il y a apparition (catalase
positive) ou absence (catalase négative) de bulles d’oxygène. Dans le cas où il y
a doute, recouvrir chacune des gouttes avec lamelle de microscope et comparer
l’apparition des bulles sous les deux lamelles. Les observations peuvent se faire
macroscopiquement ou à l’aide d’un microscope à faible grossissement.
Les Listeria sont catalase positive.

Photo n°7. Aspect de la réaction Catalase.

82
Chapitre II Méthodes d’analyse

Identification des espèces du genre Listeria.


Mobilité.
La mobilité peut être observée soit à l’état frais entre lame et lamelle, auquel cas
on verra de petits bacilles mobiles par une ciliature péritriche, ou mieux encore
sur gélose mobilité en culture, auquel cas, il faudrait ensemencer deux tubes par
piqûre centrale ;
 le premier tube sera incubé à 25°C, pendant 24 à 48 heures,
 le second tube sera incubé à 37°C, pendant 24 à 48 heures.
A 25°C, Listeria monocytogenes donne une image typique de sapin renversé,
témoignant de son caractère micro aérophile, comme le montre la photo
suivante.

Photo n°8. Aspect de Listeria monocytogenes sur gélose mobilité.

Cette mobilité à 22 - 25 °C permet également de différencier Listeria des


bactéries immobiles comme Erysipelothrix et la plupart des Corynébactéries.

Oxydase.
Cette réaction est aussi simple qu’instantanée. Il suffit de prendre une colonie
caractéristique puis la déposer sur un disque d’oxydase préalablement imbibé à
l’aide d’une goutte d’eau distillée stérile. Le virage spontané au violet indique
une réaction positive. En fait, les derniers stades de la respiration cellulaire font
intervenir une chaîne de métalloprotéines : les cytochromes dont le dernier
maillon, le cytochrome oxydase, réagit directement et instantanément avec
l’oxygène.

83
Chapitre II Méthodes d’analyse

Hémolyse.
L’hémolyse est normalement visible sur gélose au sang de mouton après
isolement à partir d'une colonie ayant poussé sur gélose TSAYE, qu'on incube à
37°C, pendant une nuit. Cette réaction nous permettra de voir si la souche testée
est hémolytique ou non. L'hémolyse se traduit par la formation d'une zone
étroite et claire autour des colonies, on parle alors d'hémolyse de type ß, comme
le montre la photo suivante.

Photo n°9. Aspect de Listeria monocytogenes sur gélose au sang.

Dans le cas où l’hémolyse n’est pas bien visible sur gélose au sang, ou encore
dans les cas litigieux, on peut avoir recours au Camp Test (Christie-Atkins-
Munch-Peterson-Test). Ce dernier a été proposé pour une meilleure distinction
entre souche hémolytique et non hémolytique, il s’effectue à l’aide de deux
souches de référence de la façon suivante.
- un Camp-test avec une souche de Staphylococcus aureus, réf : ATCC 25923,
- un Camp-test avec une souche de Rhodococcus equi, réf : ATCC 6939.
Le Camp-test est réalisé sur gélose TSA additionnée de 5 % de globules rouges
de mouton lavés et remis en suspension dans un volume de tampon PBS égal au
volume initial de sang (62, 77, 164, 168).
On réalise d'abord, une première strie à l'aide de souche de Staphylococcus
aureus sur la gélose TSA, puis une seconde strie parallèle à la première à l'aide
de la souche de Rhodococcus equi , puis une troisième strie à l'aide d'une souche
de Listeria monocytogenes réf : ATCC 19118 (témoin) perpendiculairement aux
deux premières, puis une quatrième à l’aide de la souche à tester, en veillant à ce
que les stries ne se touchent pas entre elles et restent donc distantes d’au moins 2
millimètres, comme l'indique le schéma n°9 ci-après.

84
Chapitre II Méthodes d’analyse

Listeria monocytogenes

Staphylococcus Rhodococcus
aureus equi

Souche à tester
Schéma n° 9: Camp-test avant incubation.
Après une période d'incubation de 36 à 48 heures à 37°C, on observe
l'accentuation de l'hémolyse autour de la zone adjacente perpendiculairement à
la strie de Staphylococcus aureus, sous forme d'une pelle ou d'une brèche,
comme l'indique le schéma n°10 ci-après.
L'identification de Listeria ivanovii peut également être confirmée par la mise en
évidence de l'hémolyse accentuée autour de la zone adjacente
perpendiculairement à la strie de Rhodococcus equi.

Zone d'hémolyse Listeria monocytogenes

Staphylococcus Rhodococcu
aureus equi

Listeria ivanovii Zone d'hémolyse


Schéma n° 10 : Camp-test après incubation.

85
Chapitre II Méthodes d’analyse

La photo suivante montre un Cam test positif d’une souche de Listeria


monocytogenes avec une souche de Staphylococcus aureus.

Photo n°10. Aspect d’un Camp test positif.

Réactions VP et RM.
La mise en évidence des voies fermentaires est de grande utilité pour le
diagnostic des micro-organismes. Beaucoup de bactéries et particulièrement les
Listeria empruntent la voie dite des acides mixtes, abaissant ainsi le pH vers 4,5
à 5 et certaines bactéries VP(+) empruntent surtout la voie dite du butylène
glycol. Au cours de la fermentation butylène glucolique, avant de parvenir au
stade butylène–glycol, l’acide pyruvique est transformé en acéthyl-méthyl-
carbinol ou acetoïne. La formation d’acétoïne est favorisée par la présence
d’acétate. L’acétoïne est donc mise en évidence par une coloration rose obtenue
en milieu alcalin par action de la créatine sur le diacétyl formé par oxydation :
c’est la réaction de Voges Proskauer.
Deux réactifs sont ajoutés au milieu : d’abord la créatine ou (VP I), puis l’alpha-
naphtol ou (VP II).
Une culture sur milieu Clark et Lubs servira à la détermination des réactions de
Voges Proskauer (VP) et Rouge de Méthyl (RM). Ensemencer un tube contenant
le milieu Clark et Lubs à l'aide d'une colonie ayant poussé sur gélose TSAYE,
puis l'incuber à 37°C pendant une nuit. Le lendemain, verser la moitié du tube
dans un autre tube stérile :
 l'un servira à la recherche de la réaction VP, après adjonction des réactifs VP
I, puis VP II, attendre environ 3 minutes puis noter la couleur ; si elle vire au
rouge orangé, il s'agit d'une réaction positive,
 l'autre servira à la recherche de la réaction RM, après adjonction du réactif
RM ; s'il y a virage de la couleur au rouge, il s'agit d'une réaction positive.

86
Chapitre II Méthodes d’analyse

Les Listeria sont VP (+) et RM (+).

Photo n°11. Aspect d’une réaction Photo n°12. Aspect d’une réaction
VP positive RM positive

Réduction des Nitrates.


Réaliser une culture dense sur bouillon Nitrate à partir de la gélose TSAYE,
qu'on incube à 37°C pendant une nuit. Le lendemain ajouter à peu près 3 gouttes
du réactif Nitrate I puis 3 gouttes du réactif Nitrate II, puis observer :
 S’il y a apparition d’une coloration rouge ou rose : il y a eu réduction des
nitrates ; dans ce cas les bactéries utilisent les glucides en anaérobiose, en
présence d’un accepteur d’hydrogène qui peut être l’ion NH3-. Elles
possèdent alors l’enzyme Nitrate Réductase et les nitrites sont alors mis en
évidence par la réaction de diazotation de Griess Ilosway.
 Si le milieu reste incolore : ajouter un peu de poudre de zinc (réducteur de
nitrates), agiter un peu puis déposer le tube ouvert sur la paillasse en position
inclinée. La lecture se fera après 5 minutes ; dans ce cas, les autres bactéries
réduisent les nitrites en hydroxylamine, ammoniac et azote qui se dégage. La
mise en évidence des nitrates se fait alors en ajoutant un peu de poudre de
zinc. En effet, en présence des nitrates, il y a réduction de ceux-ci en nitrites
puis en azote, qui n’entraîne pas de changement de couleur du milieu, se
traduisant par une réaction positive.
 S’il y a apparition d’une coloration rouge ou rose : cela signifie qu’il
restait dans le tube des nitrates qui n’avaient pas été réduits, donc la
réaction est négative.
 Si par contre, le milieu reste incolore, cela signifie qu’il ne restait plus de
nitrates dans le tube, et que les bactéries les avaient réduits au delà du
stade nitrites, donc la réaction est positive.
Les Listeria ne possèdent pas l’enzyme nitrate réductase.

87
Chapitre II Méthodes d’analyse

Esculine.
La réaction à l’esculine est normalement visible sous forme d’une auréole noire
autour des colonies sur gélose Palcam. Dans le cas contraire, ensemencer par
piqûre centrale, un tube effilé de gélose esculine puis l’incuber à 37°C pendant
une nuit. L’hydrolyse de l’esculine se traduit par une coloration noirâtre tout au
long du tube.

Galerie Biochimique : API Listeria.


API Listeria est un système d'identification des Listeria utilisant des tests
standardisés et miniaturisés, ainsi qu'une base de données spécifiques.
Il permet la caractérisation du genre Listeria par élimination des espèces
n'appartenant pas au genre Listeria.
Principe :
La galerie API Listeria comporte 10 micro tubes ou cupules contenant des
substrats sous forme déshydratée, qui permettent la réalisation des tests
enzymatiques et qui sont disposés de la façon dont l'indique la photo n°13 ci-
après.

Photo n°13. Présentation de la Galerie API Listeria.


La dénomination des substrats contenus dans les cupules, est la suivante :
DIM : Différentiation entre Listeria innocua et Listeria monocytogenes; ESC:
Esculine ; &MAN : & Mannosidase ; DARL : D-Arabitol ; XYL : D-Xylose ;
RHA : Rhamnose ; MDG : &-Méthyl-D-Glucoside ; RIB : Ribose ; G1P :
Glucose - 1 - Phosphate ; TAG : D-Tagatose . ß HEM : Hémolyse.
Dans le coffret, on y trouve :
- 10 galeries API Listeria,
- 10 ampoules de suspension Medium, 2 ml,
- 1 ampoule de réactif ZYM. B,
- 10 boites d'incubation,
- 10 fiches de résultats.

88
Chapitre II Méthodes d’analyse

Les réactions produites durant la période d'incubation à savoir l'acidification des


sucres et l'hydrolyse de l'esculine, se traduisent par des changements de
coloration spontanés ou révélés par l'addition d'un réactif.
 Le test DIM est fondé sur l'hydrolyse d'un substrat naphtylamide par une
arylamidase. La réaction est la suivante :
E = arylamidase

R-naphtylamidase ------------------- > naphtylamide + R


R = radicale acide aminé ; E = arylamidase
Dans la réaction, on détecte la naphtylamide , par le réactif ZYM B qui est un
sel de diazonium, pour former un composé azoïque coloré en orange, et seul
Listeria innocua possède l'arylamidase.

 Le test à l'Esculine est basé sur l'hydrolyse de l'Esculine par la


glucosidase. La réaction est la suivante :
glucosidase

Esculine ---------------- > D glucose + esculétine


La détection de l'esculine positif se fait par la formation d'un complexe
marron foncé à noir. Toutes les Listeria sont esculine positif.

 Le test Mannosidase est un test chromogénique fondé sur l'hydrolyse du


paranitrophényl D mannopyranoside par l'enzyme mannosidase.
La réaction est la suivante :
mannosidase

paranitrophényl D mannopyranoside -------- > D mannose + para nitrophénol


Le D mannose + para nitrophénol confère une coloration jaune au test
dans les cas positifs, sinon le test reste incolore.

89
Chapitre II Méthodes d’analyse

 Les sept substrats glucidiques restants sont testés en fermentation : la


fermentation se déroule en anaérobiose et fait varier l'indicateur de pH
(rouge de phénol) du rouge au jaune voire au jaune orangé.
Après incubation de 18 à 24 heures à 35 - 37°C, la lecture des réactions
est réalisée visuellement et interprétée en fonction du tableau XIV de
lecture et d'identification, proposé par API système.
Mode Opératoire :
Les cultures bactériennes à étudier doivent être considérés comme
potentiellement dangereuses et doivent être manipulées de façon appropriée par
un personnel compétent et averti.
Avant d'ensemencer une galerie, il faudrait tout d'abord s'assurer de la
purification de la souche et de son appartenance au genre Listeria (courts
bacilles à Gram positif, mobiles à 25°C mais pas à 37°C, catalase positive et
oxydase négative) à l'aide d'une subculture réalisée sur gélose au sang à partir
d'une colonie bien isolée.
Réunir ensuite fond et couvercle d'une boite d'incubation et répartir environ 5 ml
d'eau distillée stérile dans les alvéoles du fond pour créer une atmosphère
humide. Inscrire la référence de la souche à étudier sur la languette latérale de la
boite.
Sortir la galerie de son emballage d'origine et individuel et la placer dans la boite
d'incubation puis se débarrasser du sachet déshydratant.
Ouvrir ensuite une ampoule de suspension Médium, puis prélever à l'aide d'une
pipette, quelques colonies isolées pour réaliser une suspension d'une opacité
égale à 0,5 Mac Farland.
Observer le type d'hémolyse et le noter sur la fiche de résultats, ce caractère
constituant un test additionnel.
Répartir la suspension bactérienne précédente dans les cupules ou micro tubes
en évitant d’introduire des bulles d’air, pour cela incliner la boite d'incubation
vers l'avant et placer la pipette sur le côté de la cupule formant un angle
d'environ 45°.
En ce qui concerne le test DIM, remplir environ 100 µl soit 2 gouttes de pipette
Pasteur en veillant à ne pas créer un ménisque convexe.
En ce qui concerne les autres tests, remplir uniquement la partie basse des
cupules des tests ESC à TAG, soit environ 50 µl ou 1 goutte de pipette Pasteur.
Refermer la boite d'incubation et l'incuber à 35 - 37 °C, pendant 18 à 24 Heures
en aérobiose.

90
Chapitre II Méthodes d’analyse

Lecture de la galerie.
Tout d'abord, ajouter 1 goutte de réactif ZYM B au test DYM, laisser agir
pendant 3 minutes, puis lire ; ce test sert de base essentielle pour la
différenciation entre Listeria monocytogenes pour laquelle il est négatif et
Listeria innocua pour laquelle il est au contraire positif.
Noter ensuite toutes les réactions positives par le signe (+) et les réactions
négatives par le signe (-) sur la fiche de résultats en se référant au tableau n°XII,
relatif à la liste des profil numériques.
Coder par la suite les réactions obtenues en un profil numérique, les tests sont
séparés par groupes de trois et une valeur de 1, 2 ou 4 est indiquée pour chacun
comme l'indique la photo 13 en page 80.
En additionnant à l'intérieur de chaque groupe les valeurs correspondant à des
réactions positives, un profil de 4 chiffres est obtenu, exemple : 6510.
L'identification est obtenue en recherchant le profil numérique dans la liste des
profils qui figure ci après.
Tableau XII : Lecture et Interprétation des caractères portés sur la galerie API
Listeria.
Tests Réactions Résultats
Négatifs Positifs
DIM Différenciation Orange pâle
Listeria innocua / Listeria Rose beige Orange
monocytogenes Gris bleu
ESC Esculine ( hydrolyse ) Jaune pâle Noir
& MAN & MANnosidase Incolore Jaune
DARL D-Arabitol ( Acidification )
XYL D-XYlose ( Acidification )
RHA RHAmnose ( Acidification ) Rouge , Jaune ,
MDG &Méthyl-D-Glucoside (Acidification) Rouge - Jaune -
RIB RIBose (Acidification) Orangé Orangé
G1P Glucose - 1 - Phosphate (Acidification)
TAG D-TAGatose

91
Chapitre II Méthodes d’analyse

La photo suivante montre l’aspect de Listeria monocytogenes sur API Listeria.

Photo n° 14. Aspect de Listeria monocytogenes sur API Listeria.

92
Chapitre II Méthodes d’analyse

LISTE DES PROFILS NUMERIQUES DES LISTERIA SUR


GALERIE API

2150 Listeria ivanovii 3750 Listeria ivanovii


2170 Listeria ivanovii 3770 Listeria ivanovii
2250 Listeria ivanovii 6010 Listeria monocytogenes
2310 Listeria seeligeri / ivanovii 6110 Listeria monocytogenes / innocua
2311 Listeria welshimeri 6120 Listeria grayi
2330 Listeria ivanovii 6130 Listeria grayi
2340 Listeria ivanovii 6150 Listeria monocytogenes
2350 Listeria ivanovii 6310 Listeria seeligeri / welshimeri
2370 Listeria ivanovii 6311 Listeria welshimeri
2410 Listeria monocytogenes 6410 Listeria monocytogenes
2510 Listeria monocytogenes 6450 Listeria monocytogenes
2550 Listeria monocytogenes /ivanovii 6510 Listeria monocytogenes
2711 Listeria welshimeri 6520 Listeria grayi
2750 Listeria ivanovii 6550 Listeria monocytogenes
2770 Listeria ivanovii 6701 Listeria welshimeri
3110 Listeria seeligeri/innocua/ivanovii 6711 Listeria welshimeri
3120 Listeria grayi 7110 Listeria innocua
3130 Listeria grayi / ivanovii 7111 Listeria welshimeri
3150 Listeria ivanovii 7120 Listeria grayi
3170 Listeria ivanovii 7130 Listeria grayi
3210 Listeria seeligeri / ivanovii 7301 Listeria welshimeri
3250 Listeria ivanovii 7310 Listeria seeligeri/welshimeri/innocua
3270 Listeria ivanovii 7311 Listeria welshimeri
3300 Listeria seeligeri / ivanovii 7320 Listeria grayi
3310 Listeria seeligeri 7330 Listeria grayi
3311 Listeria welshimeri 7500 Listeria innocua
3330 Listeria ivanovii 7510 Listeria innocua
3340 Listeria ivanovii 7511 Listeria welshimeri
3350 Listeria ivanovii 7520 Listeria grayi
3360 Listeria ivanovii 7530 Listeria grayi
3370 Listeria ivanovii 7701 Listeria welshimeri
3520 Listeria grayi 7710 Listeria welshimeri / innocua
3711 Listeria welshimeri 7711 Listeria welshimeri
3730 Listeria ivanovii 7720 Listeria grayi

93
Chapitre II Méthodes d’analyse

III. 2. Analyse quantitative :


Méthode ISO 11290-2. Dénombrement de Listeria monocytogenes à partir
des denrées alimentaires.
III. 2. a. Objet et domaine d’application.
Cette méthode consiste en la recherche et le dénombrement de Listeria
monocytogenes dans toutes les catégories de denrées alimentaires.
III. 2. b. Définition de Listeria monocytogenes.
Microorganismes formant des colonies typiques sur milieu sélectif décrit et
possédant les caractéristiques biochimiques, morphologiques et physiologiques
décrites lorsque l’essai est effectué conformément à la présente norme.
III. 2. c. Dénombrement de Listeria monocytogenes.
Détermination du nombre d’unités formant colonies (UFC) de Listeria
monocytogenes dans une quantité déterminée de produit, lorsque l’analyse est
effectuée conformément à la présente norme.
III. 2. d. Principe.
Le dénombrement de Listeria monocytogenes nécessite six étapes successives :
 Préparation de la suspension mère dans un diluant.
 Revivification pendant une heure à 20°C.
 Ensemencement en surface du milieu sélectif solide coulé dans deux boites
de Pétri, à raison de 0,1 ml par plaque.
 Incubation des boites à 35 ou 37°C et examen après 24 à 48 heures.
 Confirmation des colonies présumées de Listeria monocytogenes.
 Calculer le nombre de Listeria monocytogenes à partir du nombre de colonies
confirmées par gramme ou par millilitre.
III. 2. e. Référentiels.
L’application correcte de cette méthode nécessite au préalable, l’utilisation de
certains référentiels parmi lesquels nous citerons :
 Norme ISO 11290 – 1 : Recherche des Listeria dans les denrées alimentaires.
 Norme ISO 11290 – 2 : Dénombrement de Listeria monocytogenes dans les
denrées alimentaires.
 Norme AFNOR. NF V 08-055 : Recherche des Listeria dans les denrées
alimentaires.
 Norme NF V 08-010 : Règles générales pour la préparation des dilutions en
vue de l’examen microbiologique.
 Norme NF EN ISO 6887-1 : Suspension mère et dilutions décimales ; 1.
règles générales.

94
Chapitre II Méthodes d’analyse

 Norme NF V 08-057-2 : Microbiologie alimentaire – Directives générales


pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique.
 Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et
l’expression des résultats.
 Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
 Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence
des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
III. 2. f. Mode opératoire.
Le mode opératoire nécessite six étapes successives parmi lesquelles :
Prise d’essai, suspension mère et dilutions.
Pour préparer la suspension mère, utiliser comme diluant :
 soit le l’Eau Peptonée Tamponnée,
 soit le milieu de base du bouillon Fraser au demi sans addition d’agents
sélectifs : ce milieu peut être utilisé comme diluant pour le produit alimentaire si
la méthode de recherche (ISO 11290-1) et la méthode de dénombrement sont
effectuées sur le même échantillon pour essai. Cette opération permet d’éviter la
préparation de deux suspensions mères. Les agents sélectifs ne sont ajoutés à la
suspension mère qu’après la prise d’essai pour dénombrement.
Laisser reposer la suspension mère pendant 1 heure ± 5 minutes à 20°C en
utilisant si nécessaire une étuve afin de revivifier les microorganismes stressés.
Si une gamme de dilutions est utilisée, la préparer après revivification.
Inoculation et incubation.
A l’aide d’une pipette stérile, transférer 0,1 ml de la suspension mère à la
surface de chacune des boites contenant de la gélose PALCAM ou OXFORD
(fondue, refroidie, additionnée des agents sélectifs correspondants, coulée en
boites puis séchée). Répéter l’opération avec les dilutions suivantes à l’aide de
nouvelles pipettes, comme le montre le logigramme n°2.
Etaler soigneusement l’inoculum le plus rapidement possible à la surface de la
gélose en essayant de ne pas toucher les bords de la boite avec l’étaleur. Utiliser
un étaleur stérile pour chaque boite.
Laisser les boites fermées pendant environ 15 minutes à la température ambiante
pour permettre à l’inoculum d’être absorbé dans la gélose.
Retourner les boites et les incuber à l’étuve à 35 ou à 37°C soit en atmosphère
aérobie, soit en atmosphère micro aérobie dans une jarre contenant un mélange
gazeux.
Dénombrement des colonies caractéristiques.
Après incubation pendant 24 heures, et 18 à 24 heures supplémentaires, si le
développement est faible ou si aucune colonie n’est observée après 24 heures
d’incubation, examiner les boites afin de rechercher la présence de colonies
présumées être des Listeria spp.

95
Chapitre II Méthodes d’analyse

Dans le cas d’une incubation en atmosphère micro aérobie, après incubation,


laisser la gélose retrouver sa couleur pourpre en laissant les boites de gélose
PALCAM à l’air libre pendant 1 heure.
Après 24 heures, les colonies caractéristiques de Listeria spp, se présentent sous
forme de petites ou très petites colonies vertes avec des reflets grisâtres, ou vert
olive, avec parfois un centre noir mais toujours entourés d’un halo noir.
Après 48 heures d’incubation, les Listeria se présentent sous forme de colonies
vertes de 1,5 à 2 mm de diamètre avec une dépression centrale et entourées d’un
halo noir.
Compter alors toutes les colonies présumées être des Listerai spp pour chacune
des boites contenant au moins 150 colonies caractéristiques et non
caractéristiques.
Confirmation du Genre Listeria spp.
 Sélection des colonies pour la confirmation : pour cela retenir les boites
contenant au maximum 150 colonies présumées être des Listerai spp à toutes
les dilutions et, si possible au niveau de deux dilutions successives.
Sélectionner Trois à Cinq colonies présumées sur chaque boite retenue. Si
une boite présente moins de cinq colonies présumées, sélectionner pour la
confirmation toutes les colonies présumées.
Ensemencer en stries les colonies sélectionnées sur la surface des boites
contenant de la gélose TSYEA qui seront incubées à leur tour à l’étuve à 35
ou à 37°C pendant 18 à 24 heures.
 Réaction de la Catalase.
Mettre en suspension sur une lame une colonie isolée dans une goutte de la
solution de peroxyde d’hydrogène. La formation de bulles indique une
réaction positive.
 Coloration de Gram.
Effectuer une coloration de Gram sur une colonie isolée. La présence de
petits et minces bacilles à Gram positifs est en faveur du genre Listeria.
Confirmation de l’espèce Listeria monocytogenes.
 Examen de la mobilité.
Prélever une colonie isolée et la mettre en suspension dans un tube contenant
le bouillon TSYEB, à incuber à 25°C pendant 8 à 24 heures jusqu’à ce qu’un
rouble apparaisse.
Observer au microscope optique au grossissement 40, une goutte de ce
bouillon entre lame et lamelle. Listeria monocytogenes apparaît sous forme
de bacilles minces et courts animés d’une mobilité en forme de pirouette.
En alternative, on peut ensemencer à l’aide d’un fil droit une gélose mobilité
à partir d’une colonie sur gélose TSYEA, à incuber à 25°C pendant 24 à 48
heures. Listeria monocytogenes donne une culture typique sous forme d’un
parapluie immédiatement sous la surface de la gélose.

96
Chapitre II Méthodes d’analyse

 Recherche de l’hémolyse.
Prélever une colonie isolée à partir de la gélose TSYEA et l’isoler sur une
plaque de gélose au sang à l’aide d’un fil droit.
Inoculer en parallèle, une culture témoin positive (Listeria monocytogenes) et
négative (Listeria innocua).
 Utilisation des glucides.
A partir du bouillon TSYEB, inoculer des bouillons contenant les sucres à
étudier. Ces bouillons seront alors incubés à 35 ou à 37°C jusqu’à 5 jours.
Remarque. L’identification de Listeria monocytogenes peut se faire également à
l’aide de la galerie miniaturisée de type API – Listeria (Cf page 80).
III. 2. g. Expression des résultats.
Pour qu’un résultat soit valable, on estime en général qu’il est nécessaire de
calculer la valeur de a pour chacune des boites retenues selon la formule
suivante : en prenant en considération les boites contenant au minimum 15
colonies.

b
a= xC
A
où :
b: est le nombre de colonies répondant aux critères d’identification.
A: le nombre total de colonies repiquées en vue de l’identification.
C: le nombre total de colonies dénombrées sur la boite.
Arrondir à un nombre de colonies calculés à deux chiffres significatifs.
Exemple :
Le dénombrement des Listeria dans un produit liquide a donné les résultats
suivants :
 à la première dilution retenue (10-1) : 44 et 60 colonies.
 à la seconde dilution retenue (10-2) : 16 et 8 colonies.
Ont été repiquées :
 pour 44 colonies, 5 colonies dont 3 ont répondu aux critères d’où : a = 27
 pour 60 colonies, 5 colonies dont 2 ont répondu aux critères d’où : a = 24
 pour 16 colonies, 5 colonies dont 4 ont répondu aux critères d’où : a = 13
 pour 08 colonies, 5 colonies dont 2 ont répondu aux critères d’où : a = 3

97
Chapitre II Méthodes d’analyse

Calculer ensuite la valeur du nombre N de microorganismes présents dans


l’échantillon pour essai, en tant que moyenne pondérée à partir de deux dilutions
successives, à l’aide de la formule suivante :

Σa
N=
V (n1 + 0,1 n2) d

où :
Σ a : est la somme des Listeria monocytogenes identifiées sur chaque boite
retenue et qui compte au moins 15 colonies.
V : est le volume de l’inoculum appliqué à chaque boite, en millilitre.
n1 : est le nombre des boites retenues à la première dilution.
n2: est le nombre des boites retenues à la seconde dilution.
d : est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.
Arrondir les résultats calculés à deux chiffres significatifs.
Pour cela, si le dernier chiffre est inférieur à 5, le chiffre précédent n’est pas
modifié ; si ce dernier chiffre est supérieur ou égal à 5, le chiffre précédent est
augmenté d’une unité. Procéder de proche ne proche jusqu’à ce que l’on ait deux
chiffres significatifs.
Retenir comme résultat le nombre de microorganismes par millilitre (produits
liquides) ou par gramme (autres produits), exprimé par un nombre compris entre
1,0 et 9,9 multiplié par la puissance appropriée de 10.
Exemple :

27 + 24 + 13 + 3 67
N= = = 3045,454
-1
0,1 (2 + 0,1 x 2) x 10 0,022

En arrondissant le résultat tel que prescrit ci-dessus, le résultat final sera de :


3045, soit : 3.103 microorganismes par ml de produit ou 3.103 UFC / ml.

98
Chapitre II Méthodes d’analyse

LOGIGRAMME n°2 DE LA METHODE 11290 – 2

25 ml dans
225 ml de
Fraser ½ ss
Additifs

-1
SM = 10
1 heure ± 5 minutes à 20°C

0,1 ml

-2 -3 -4
10 10 10
Transférer
0,1ml 0,1ml 0,1ml

Etalement
Attendre 5 minutes à température ambiante
Incuber à 35 ou à 37°C, pendant 24 à 48 heures,
en atmosphère aérobie ou en atmosphère micro aérobie

Dénombrer les colonies au niveau de deux dilutions successives


Identifier puis calculer la valeur de a puis de N.

99
Chapitre II Méthodes d’analyse

II.3. Approche des risques :


Le modèle que nous avons adopté est celui recommandé par le comité mixte
FAO/OMS, au Codex Alimentarius, relatif à l’analyse du risque. Cette dernière
met en adéquation, un pathogène, un aliment et un hôte, comme le montre la
figure suivante (168).

p a th o g è n e

h ô te a lim e n t

Figure n° 2. Modèle FAO-OMS sur l’analyse du risque.


Ce modèle est donc parfaitement adapté à notre travail, et le choix des trois
principaux facteurs a porté sur :
 d’abord le pathogène ; dans ce cas, nous avons choisi Listeria
monocytogenes, considéré comme un microorganisme émergent ou ré
émergent particulièrement dans les pays industrialisés, sans pour autant
exclure les pays en développement,
 puis un aliment fréquent avec un échantillonnage aussi représentatif que
possible ; dans ce cas nous avons choisi le Lait cru de vache du circuit de
vente directe, principal véhicule de Listeria. monocytogenes à l’homme.
 enfin, un hôte ou plus précisément les hôtes (consommateurs), en veillant
à leur susceptibilité ou non à contracter la maladie, aux portions
journalières ingérées, à la durée de stockage, au mode de
consommation…

L is te r ia m o n o c y to g e n e s

C o n s o m m a te u r L a it c r u

Figure n° 3. Modèle de notre travail sur l’analyse du risque.

100
101
Chapitre I Résultats

Chapitre I. Résultats.
Les résultats de l’analyse bactériologique de l’ensemble des prélèvements de
laits crus analysés par les deux méthodes, sont rapportés dans le tableau XIII et
représentés dans le Logigramme n°3 ci après.

102
Chapitre I Résultats

Tableau XIII. Résultats globaux.

Analyse Qualitative Analyse Quantitative Totaux


Années 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Total des 79 102 649 974 533 121 286 251 2995
prélèvements Nbre % Nbre % Nbre % Nbre % Nbre % Nbre % Nbre % Nbre % Nbre %
Cas positifs 02 04 14 14 18 08 17 19 96
2,53 3,92 2,16 1,44 3,37 6,61 5,94 7,57
60 36 3,20
2,44 6,70
Cas négatifs 77 98 635 960 515 113 269 232 2899
97,47 96,08 97,84 98,56 96,63 93,39 94,06 92,43
2398 501
97,56 93,30 96,80
Total 2458 537 2995
82,07 17,93 100
Caractérisation Biochimique
Listeria 01 03 05 05 16 08 08 11 57
monocytogenes 1,26 2,94 0,77 0,51 3,00 6,61 2,79 4,38
38 1,55 19 3,54 1,90
Listeria 01 01 08 09 02 00 09 07 37
innocua 1,26 0,98 1,23 0,92 0,37 00 3,14 2,78
21 0,85 16 2,98 1,23
Listeria 00 00 01 00 00 00 00 01 02
ivanovii 00 00 0,15 00 00 00 00 0,39
1 0,04 1 0,18 0,07

103
Chapitre I Résultats

Les résultats de l’analyse bactériologique montrent que :


96 cas sont positifs, soit 3,20 %,
2899 cas sont négatifs, soit 96,80 %.

Parmi les cas positifs :


60 cas ont été diagnostiqués par la méthode qualitative, sur un total de
2458 prélèvements, soit, 2,44 %,
36 cas ont été diagnostiqués par la méthode quantitative, sur un total de
537 prélèvements, soit 6,70 %.

La caractérisation biochimique a donnée :


57 souches de Listeria monocytogenes, soit 1,90 %,
37 souches de Listeria innocua, soit 1,23 %.
2 souches de Listeria ivanovii, soit 0,07 %.
Parmi les 57 souches de Listeria monocytogenes retrouvées :
38 ont été isolées et identifiées par la méthode qualitative, sur un total de
2458 prélèvements, soit, 1,55 %,
19, ont été isolées, dénombrées et identifiées par la méthode quantitative,
sur un total de 537 prélèvements, soit 3,54 %.

104
Chapitre II Analyse qualitative

Chapitre II. Analyse qualitative :


Les résultats de l’analyse bactériologique des prélèvements de laits crus de
vaches, traités entre 1998 et 2003, sont rapportés dans le tableau suivant.
Tableau IX. Résultats de l’analyse bactériologique.

Nombre Cas positifs Cas négatifs


Années de
Prélèvements Nombre % Nombre %
02 77
1998 79
2,53 97,47
04 98
1999 102
3,92 96,08
14 635
2000 649*
2,16 97,84
14 960
2001 974**
1,44 98,56
18 515
2002 533
3,37 96,63
08 113
2003 121
6,61 93,39
60 2398
Total 2458
2,44 97,56

Au total, 2458 échantillons ont été analysés et ont montré :


60 cas positifs, soit 2,44 %,
2398 cas négatifs, soit 97,56 %.
Les résultats de la caractérisation biochimique des souches de Listeria isolées
sont rapportés dans le tableau suivant.

105
Chapitre II Analyse qualitative

Tableau X. Caractérisation biochimique des souches isolées.


Années Nombre Souches
de L. monocytogenes L .innocua L .ivanovii
Prélèvements Nombre % Nombre % Nombre %
1998 79 01 01 00
1,26 1,26 00
1999 102 03 01 00
2,94 0,98 00
2000 649 05 08 01
0,77 1,23 0,15
2001 974 05 09 00
0,51 0,92 00
2002 533 16 02 00
3,00 0,37 00
2003 121 08 00 00
6,61 00 00
38 21 01
Total 2458 1,55 0,85 0,04
60
2,44

Les résultats de la caractérisation biochimique des 60 souches de Listeria


montrent que :
38 souches appartiennent à l’espèce Listeria monocytogenes, soit
1,55 %,
21 souches appartiennent à l’espèce Listeria innocua, soit 0,85 %,
1 souche appartient à l’espèce de Listeria ivanovii, soit 0,04 %.

Listeria monocytogenes a été retrouvée chaque année durant la période de


l’étude. Il en est de même pour Listeria innocua, hormis l’année 2003. Quant à
Listeria ivanovii, elle n’a été retrouvée qu’une seule fois en l’an 2000.

106
Chapitre III Analyse quantitative

Chapitre III. Analyse quantitative.


Les résultats de l’analyse bactériologique des prélèvements de laits crus de
vaches, traités entre 2004 et 2005, sont rapportés dans le tableau suivant :
Tableau XI. Résultats de l’analyse bactériologique.

Années Nombre Cas positifs Cas négatifs


de
Prélèvements Nombre % Nombre %
2004 286 17 269
5,94 94,06
2005 251 19 232
7,57 92,43
Total 537 36 501
6,70 93,30
Au total, 537 échantillons ont été analysés et ont montré :
36 cas positifs, soit 6,70 %,
501 cas négatifs, soit 93,30 %.

Les résultats du dénombrement, exprimé par les valeurs «N», obtenues selon les
équations mathématiques dictées par la norme pour l’ensemble des cas positifs
et de l’identification biochimique sont rapportés au cas par cas et par année,
dans les tableaux suivants.

107
Tableau XII ; Résultats du dénombrement et de l’identification biochimique pour l’année 2004.

Cas Première boite Deuxième boite Valeur N Identification biochimique


b A C a1 b A C a2 V D d N
(UFC)
3
1 2 3 18 12 2 3 8 5 0,1 1,1 0,1 1,5.10 Listeria innocua
2 2 3 14 2 3 8 0,1 1,1 0,1 3
9 5 1,3.10 Listeria innocua
3 1 3 22 2 3 5 0,1 1,1 0,1 2
7 3 9.10 Listeria innocua
4 3 3 8 1 3 6 0,1 1,1 0,1 2
8 2 9. 10 Listeria innocua
2
5 4 5 7 6 2 5 5 2 0,1 1,1 0,1 7. 10 Listeria monocytogenes
6 3 3 4 1 3 3 0,1 2,2 0,1 2
4 1 2. 10 Listeria innocua
7 2 3 3 1 3 3 0,1 1,1 0,1 2
2 1 3,6. 10 Listeria innocua
2
8 3 3 3 3 0 3 3 0 0,1 1,1 0,1 2,7. 10 Listeria innocua
2
9 1 3 5 2 1 3 3 1 0,1 2,2 0,1 1,3. 10 Listeria monocytogenes
2
10 2 5 5 2 1 3 4 1 0,1 2,2 0,1 1,3. 10 Listeria monocytogenes
2
11 1 3 7 2 1 3 3 1 0,1 2,2 0,1 1,3. 10 Listeria innocua
12 3 3 3 0 3 3 0,1 2,2 0,1 2
3 0 1,3. 10 Listeria innocua
13 0 3 5 0 1 3 3 1 0,1 1,1 0,1 90 Listeria monocytogenes
14 1 3 3 1 0 3 3 0 0,1 2,2 0,1 45 Listeria monocytogenes
15 1 3 3 1 0 3 3 0 0,1 2,2 0,1 45 Listeria monocytogenes
16 1 3 4 1 0 3 3 0 0,1 2,2 0,1 45 Listeria monocytogenes
17 0 3 6 0 1 3 3 1 0,1 2,2 0,1 45 Listeria monocytogenes

108
Chapitre III Analyse quantitative

Les résultats du dénombrement montrent que les valeurs de N obtenues varient


3
entre 45 et 1,5.10 UFC (cf. tableau XII) et permet le classement des cas
analysés comme suit :
5 cas avec une valeur de N inférieure à 100 UFC, pour lesquels cinq
souches de Listeria monocytogenes ont été identifiées.
10 cas avec une valeur de N comprise entre 100 et 1000 UFC, pour
lesquels trois souches de Listeria monocytogenes et sept souches de
Listeria innocua ont été identifiées.
2 cas avec une valeur de N supérieure à 1000 UFC, pour lesquels deux
souches de Listeria innocua ont été identifiées.

109
Tableau XIII ; Résultats du dénombrement et de l’identification biochimique pour l’année 2005.

Cas Première boite Deuxième boite Valeur N Identification biochimique


b A C a1 b A C a2 V D d N
(UFC)
1 4 5 78 3 5 32 0,1 1,1 0,1 3
62 19 7,3.10 Listeria monocytogenes
2 2 3 38 2 3 12 0,1 1,1 0,1 3
8 5 10 Listeria monocytogenes
2
3 3 3 8 8 1 3 6 2 0,1 1,1 0,1 9. 10 Listeria innocua
4 2 5 16 3 5 7 0,1 1,1 0,1 2
6 4 9.10 Listeria innocua
5 4 5 7 2 5 5 0,1 1,1 0,1 2
6 2 7. 10 Listeria monocytogenes
6 1 3 12 0 3 8 0,1 1,1 0,1 2
5 0 4,5.10 Listeria innocua
2
7 2 3 11 7 0 3 4 0 0,1 2,2 0,1 3.10 Listeria innocua
8 1 3 12 1 3 4 0,1 2,2 0,1 2
4 1 2. 10 Listeria innocua
9 3 3 4 1 3 3 0,1 2,2 0,1 2
4 1 2. 10 Listeria innocua
10 1 3 8 0 3 3 0,1 2,2 0,1 2
3 0 1,3. 10 Listeria innocua
11 2 5 6 2 0 3 3 0 0,1 2,2 0,1 90 Listeria monocytogenes
12 1 5 9 2 0 5 7 0 0,1 2,2 0,1 90 Listeria monocytogenes
13 1 5 10 2 0 3 3 0 0,1 2,2 0,1 90 Listeria monocytogenes
14 0 3 3 0 2 3 3 2 0,1 2,2 0,1 90 Listeria ivanovii
15 0 3 3 0 1 3 3 1 0,1 2,2 0,1 45 Listeria monocytogenes
16 1 5 5 1 0 3 3 0 0,1 2,2 0,1 45 Listeria monocytogenes
17 0 5 6 0 1 5 5 1 0,1 2,2 0,1 45 Listeria monocytogenes
18 1 3 4 1 0 3 3 0 0,1 2,2 0,1 45 Listeria monocytogenes
19 1 5 7 1 0 3 4 0 0,1 2,2 0,1 45 Listeria monocytogenes

110
Chapitre III Analyse quantitative

Les résultats du dénombrement montrent que les valeurs de N obtenues varient


3
entre 45 et 7,3.10 UFC (cf. tableau XIII) et permet le classement des cas
analysés comme suit :
9 cas avec une valeur de N inférieure à 100 UFC, pour lesquels huit
souches de Listeria monocytogenes et une souche de Listeria ivanovii
ont été identifiées.
8 cas avec une valeur de N comprise entre 100 et 1000 UFC, pour
lesquels une souche de Listeria monocytogenes et sept souches de
Listeria innocua ont été identifiées.
2 cas avec une valeur de N supérieure à 1000 UFC, pour lesquels deux
souches de Listeria monocytogenes ont été identifiées.

Tableau XIV. Classification des souches en fonction de la valeur N, pour les


années 2004 et 2005.

Souches Listeria Listeria Listeria


monocytogenes innocua ivanovii
Valeur du N 2004 2005 2004 2005 2004 2005

N = 100 UFC 05 07 00 00 00 01

100 < N = 1000 UFC 03 02 07 07 00 00

N > 1000 UFC 00 02 02 00 00 00

19 16 01
Total 3,54 2,98 0,18
(n = 537) 36
6,70
Au total, sur les 537 échantillons analysés, nous avons 36 souches de Listeria,
soit 6,70 % réparties comme suit :
19 Listeria monocytogenes, soit 3,54 %,
16 Listeria innocua, soit 2,98 %,
1 Listeria ivanovii, soit 0,18 %.

111
Chapitre III Analyse quantitative

Compte tenu de la méthode d’analyse et du caractère pathogène de Listeria


monocytogenes, nous retiendrons uniquement les résultats du dénombrement de
ces dernières.

Leur classement en fonction de la valeur « N », exprimée en UFC par millilitre


de lait, est ainsi rapporté, par année, dans le tableau suivant.
Tableau XV. Classement des souches de Listeria monocytogenes après
dénombrement.
Valeur du N N =100 UFC 100 < N = 1000 UFC N> 1000 UFC
Nombre 12 05 02
% 2,24 0,93 0,37
A partir des dix neuf souches de Listeria monocytogenes isolées et identifiées, la
valeur N permet la répartition suivante :

12 laits à la limite de l’acceptabilité car présentant des valeurs de


Listeria monocytogenes inférieures à 100 UFC par millilitre de lait.
5 laits présentant un danger potentiel de la maladie, car ils renferment
des valeurs de Listeria monocytogenes comprises entre 100 et 1000 UFC
par millilitre de lait.
2 laits présentant un risque réel de listériose, car ils renferment des
valeurs de Listeria monocytogenes supérieures à 1000 UFC par millilitre
de lait.

112
Logigramme n°3 des résultats globaux

2995 échantillons de laits crus analysés

Méthode qualitative Méthode quantitative


2458 537
82,07% 17,93%

Cas Positifs Cas Négatifs Cas Positifs Cas Négatifs


60 2398 36 501
2,44% 97,56% 6,70% 93,30%

L.monocytogenes L.innocua L.ivanovii L.monocytogenes L.innocua L.ivanovii


38 21 1 19 16 1
1,55% 0,85% 0,04% 3,54% 2,98% 0,18%

N =100 UFC 100 < N = 1000 UFC N>1000 UFC


12 5 2
2,24% 0,93% 0,37%

113
114
Chapitre I Discussion

Chapitre I. Discussion :
La présence des Listeria a été mise en évidence dans 96 laits sur 2995 analysés,
soit un taux de 3,20%. L’identification biochimique a montré la prédominance
de Listeria monocytogenes au taux de 1,90 %, suivie de Listeria innocua au taux
de 1,23 %, puis de Listeria ivanovii au taux de 0,07 %.
Le pourcentage de Listeria, obtenu par la méthode quantitative de 6,70 %, est
nettement supérieur à celui obtenu par la méthode qualitative qui n’est que de
2,44 %. Le pourcentage de Listeria monocytogenes, obtenu par la méthode
quantitative de 3,54 %, est nettement supérieur à celui obtenu par la méthode
qualitative qui n’est que de 1,55 %.
Ces deux pourcentages ont une valeur capitale, puisqu’ils ont un rapport direct
avec la méthode utilisée. Les travaux de C.Lahellec et B.Lombard (AFSSA,
2000) ont montré que lors de l'identification biochimique pour la méthode
qualitative, il est quelque fois impossible de faire la distinction entre les
différentes espèces de Listeria. Cela est d'autant plus marqué, que la compétition
existante entre la croissance de Listeria monocytogenes et Listeria innocua est
souvent à l'avantage de Listeria innocua. Cependant à nos jours, il n'existe pas
de meilleure alternative. Des améliorations pourraient être réalisées dans le
futur, en utilisant des géloses chromogènes permettant de faire d'emblée, la
distinction entre Listeria monocytogenes et les autres espèces (67, 111, 112,
164).
La méthode quantitative nous semble beaucoup plus performante pour les
raisons suivantes :
1. Tout d’abord, l’effet inoculum, plus riche dans la seconde méthode (0,1ml en
étalement), que dans la première (une ose en isolement), augmente forcément
la probabilité de retrouver d’avantage les Listeria éventuellement présentes,
2. Elle permet un seuil de détection égal à 10 UFC par ml,
3. sa performance relative à la sélection des Listeria et particulièrement les
Listeria stressés, à partir des prélèvements poly microbiens,
4. le développement et la généralisation des méthodes de dénombrement de
façon générale, au détriment des méthodes de recherche. En effet, les
organismes internationaux de normalisation proposent et préconisent de plus
en plus, l’utilisation de nouvelles méthodes basées sur le dénombrement pour
l’ensemble des pathogènes, particulièrement le genre Staphylococcus, le
genre Campylobacter et Campylobacters thermo tolérants et récemment
encore pour le genre Salmonella par la méthode du NPP (Juillet 2004),

115
Chapitre I Discussion

5. sa contribution à situer et à réviser de façon permanente les critères


microbiologiques nationaux et/ou internationaux de certaines denrées
alimentaires par le biais du dénombrement,
6. sa capacité de servir comme modèle pour la microbiologie prévisionnelle, en
estimant en temps réel, la croissance, la survie et la mort des pathogènes dans
les aliments,
7. son intérêt capital puisqu’elle fournit des réponses à des questions relatives
aux doses réponses depuis longtemps posées,
8. enfin, elle s’intègre particulièrement dans le contexte de l’analyse des risques
Listeria dans les aliments prêts à consommer.
Quelle que soit la méthode utilisée, qualitative ou quantitative, nos résultats ne
font ressortir que trois espèces parmi les sept que compte le genre Listeria avec
une prédominance de Listeria monocytogenes. Ceci est en rapport avec la
littérature qui confirme la rareté dans le monde de certaines souches telles que
Listeria grayi ou encore Listeria welshimeri (77, 164).

Nos résultats confirment bien la présence des Listeria en Algérie, mais aussi leur
rareté. Le taux de 1,90 %, de Listeria monocytogenes, obtenu lors de cette étude
est :
 d’une part, similaire à ceux rapportés :
 en France par J.P Larpent (1995), soit 1,90 %,
 en Espagne par J.M Soriano (2000), soit 2,90%,
 en République thèque par I.Holko et coll soit 2,56 %
 en Algérie par Lebres et Guetarni (2002), soit 1,96 %.
 d’autre part, inférieur à ceux rapportés :
 en Turquie par Gülhan Vardar Ünlü et coll (2000), soit 4 %
 aux USA par J. S. Van Kessel (2004), soit 6,5 %

116
Chapitre I Discussion

Le classement des laits basé sur les résultats du dénombrement (analyse


quantitative) a révélé ce qui suit :
501 laits exempts de Listeria monocytogenes.
12 laits à la limite de l’acceptabilité car présentant des valeurs de
Listeria monocytogenes inférieures à 100 UFC par millilitre de lait.
5 laits présentant un danger potentiel de la maladie, car présentant des
valeurs de Listeria monocytogenes comprises entre 100 et 1000 UFC par
millilitre de lait.
2 laits présentant un risque réel de listériose, car présentant des valeurs
de Listeria monocytogenes supérieures à 1000 UFC par millilitre de lait.
La présence de Listeria monocytogenes dans le lait à des valeurs supérieures ou
égales à 100 UFC par millilitre montre une situation critique et inquiétante aussi
bien pour les laits du circuit de vente directe (points de vente) où la
commercialisation est faite en l’état, que pour les laits du circuit de
transformation (laiteries) où la commercialisation n’est faite qu’après traitement
(pasteurisation). Dans ces deux cas, la vigilance doit être de règle.
Dans le circuit de transformation, si les laits contaminés sont acceptés sous
prétexte qu’ils seront pasteurisés dans un second temps, les pathogènes de type
Listeria monocytogenes qu’ils renferment, se constitueront à un moment ou à un
autre en "colonisateurs d’ateliers". A ce titre, ils pourront alors se développer
aisément et confortablement puisque d’une part, la température qui règne dans
ces établissements leur est favorable, et d’autre part, les traitements de
désinfections qu’utilisent en majorité ces entreprises ne sont pas forcément
réguliers et parfois même, loin d’être listéricides. De plus, il faut tenir compte du
fait que Listeria monocytogenes est elle-même naturellement résistante à
certains agents physiques et chimiques.
Par ailleurs, en qualité de colonisateurs d’ateliers, les Listeria présentes dans le
milieu, et particulièrement Listeria monocytogenes, contamineront sans cesse
d’abord et en premier lieu, l’atelier et par son biais les produits finis, plus tard le
personnel et plus tard encore les consommateurs à petites doses infectantes, au
cas où le contrôle n’est pas institué de façon régulière et correcte.
Enfin, dans le souci de remédier à cela et compte tenu du fait, qu'actuellement
l'état est signataire des accords internationaux de l’OMC, il encourage vivement
les industriels agro-alimentaires à aller vers la certification ISO 22000 incluant
dans sa démarche, la mise en place de systèmes HACCP. Ces derniers, allant de
la fourche à la fourchette visent, l’analyse des dangers et la maîtrise des points
critiques et permettront d’éliminer au moment opportun, toute matière première
et particulièrement le lait cru s’il est contaminé par Listeria ou tout autre

117
Chapitre I Discussion

pathogène. De ce fait, il est de plus en plus urgent pour nous, de s'intéresser aux
questions relatives à l'hygiène environnementale immédiate des animaux de
rente et aux éventuels accidents qu’ils peuvent engendrer.
Dans le circuit de vente directe, les laits contaminés par Listeria
monocytogenes constituent pour le consommateur et particulièrement pour les
immunodéprimés et les femmes enceintes, un danger potentiel voire un risque
réel de Listériose.
On entend par risque en général “la probabilité qu’il existe un écart entre les
données réelles concernant les variables à l’entrée et les résultats à la sortie,
d’une part, et les estimations initiales, d’autre part” (Remenyi, 1999).
Intrinsèquement, le risque peut donc être positif ou négatif. Prendre un risque ou
ne prendre aucun risque pose la question de l’équilibre à trouver entre risques et
opportunités, autrement dit entre les risques tels qu’ils sont perçus et les
avantages escomptés.
Il convient donc, d’établir une distinction entre risque et danger, ces deux
notions étant liées mais distinctes :
 Un microorganisme représente un danger lorsqu’il est susceptible de nuire à
la santé, à l’économie, et à l’environnement. Heureusement, de nombreux
dangers peuvent être maîtrisés ou évités de sorte qu’un danger potentiel ne
constitue pas un risque réel. En termes de fréquence et d’ampleur, les vrais
dangers restent en grande partie inchangés si on considère l’activité humaine
dans le temps.
 Le risque est la probabilité d’un effet préjudiciable dû à l’exposition à un
danger qui est déterminé par deux facteurs, la probabilité de l’exposition et la
gravité des conséquences.
La définition du risque implique la prise en compte d’au moins un des trois
éléments suivants : (137, 141, 161, 168).
 la durée sur laquelle les risques sont examinés,
 la probabilité qu’un ou plusieurs événements surviennent,
 la mesure des conséquences de ces événements.
Ceci nous conduit irrémédiablement vers, une approche moderne qualifiée par le
comité mixte FAO/OMS et par le Codex Alimentarius comme "Analyse du
risque ".

118
Chapitre II Analyse du risque Listeria

Chapitre II. Analyse du risque Listeria.

La charge en morbidité des maladies à transmission alimentaire (MTA) demeure


un véritable problème de santé publique, en dépit des efforts significatifs, d’où
la nécessité d’utiliser cette nouvelle approche : analyse des risques (2, 139, 168).
Cette dernière est littéralement fondée sur trois principaux processus, à savoir :
L’évaluation des risques, (processus scientifique),
La gestion des risques (processus décisionnel).

La communication sur les risques, (processus d’information et


de sensibilisation)

Le modèle d’interaction qui existe entre ces processus est décrit par l’OMS
comme suit.

Analyse des risques

Evaluation des Gestion des


risques risques
Processus Processus de
scientifique décision

Communication
sur les risques

Figure n°4. Modèle d’interaction entre les trois processus


de l’analyse des risques (168).

119
Chapitre II Analyse du risque Listeria

II. 1. L’évaluation des risques.


L’évaluation des risques est un processus scientifique basé sur les résultats de
l’étude de prévalence (dénombrement) d’un microorganisme donné dans un
aliment donné consommé en l’état avec un échantillonnage représentatif.
L’évaluation des risques repose sur trois questions fondamentales, à savoir
l’estimation du risque de maladies graves dues à Listeria monocytogenes
présents dans les aliments :
1. Lorsque le nombre de micro-organismes va de l’absence à 1000
colonies (UFC) dans 25 ml de produit ou ne dépasse pas des niveaux spécifiés
au point de consommation.
2. Pour les consommateurs dans différents groupes de population
sensibles (personnes âgées, nourrissons, femmes enceintes et patients
immunodéprimés) par rapport à la population générale.
3. Dans les aliments qui favorisent sa croissance et son développement et
des aliments qui ne facilitent pas son développement dans des conditions de
stockage et pour une durée de conservation spécifique.

L’évaluation des risques vise à aider les gestionnaires des risques à expliquer
comment certains des facteurs régissant la Listériose d’origine alimentaire
interagissent, favorisant ainsi l’élaboration de stratégies pour prévenir la
maladie.

Le modèle MRA (Microbilogical Risk Assessment) (168) fournit une


description scientifique des risques d’origine alimentaire liés à la présence de
microorganismes pathogènes sur toute la chaîne alimentaire et par étapes. Elle
consiste tout d’abord à identifier les dangers (1), à caractériser les dangers (2),
puis à évaluer l’exposition à ces dangers (3) pour aboutir finalement à la
caractérisation du risque (4) soit donc la probabilité que le danger puisse
s’exprimer réellement, comme le montre la figure suivante.

120
Chapitre II Analyse du risque Listeria

Evaluation des risques Listeria

(1).Identification (2).Caractérisation
des dangers des dangers

(3). Evaluation de
(4).Caractérisation
l’exposition
du risque

Figure n°5: Evaluation des risques Listeria.

II.1.1. Identification des dangers.


Listeria monocytogenes, petit bacille à Gram positif, non sporulé, non capsulé,
naturellement résistant à certains agents physiques et chimiques est largement
répandu dans l’environnement et dans certains aliments. Il peut aisément se
développer à des températures de réfrigérateur et résiste à diverses conditions
environnementales, ce qui lui permet de survivre dans un milieu adverse plus
longtemps que la plupart des autres bactéries non productrices de spores.

La listériose d’origine alimentaire est une maladie relativement rare mais grave
sur le plan clinique, avec des taux de létalité élevés (20-30%). Elle affecte des
segments spécifiques de la population avec une susceptibilité accrue parmi
lesquelles on distingue le plus souvent les personnes atteintes de pathologies
sous-jacentes (traitement immunosuppresseur, SIDA et conditions chroniques
telles que la cirrhose qui inhibent le système immunitaire), les femmes
enceintes, les fœtus, les nouveau-nés et les personnes âgées. La listériose affecte
le système sanguin, le système nerveux central ou l'utérus fécondé. Les
manifestations de la maladie comprennent, entre autres, les pathologies
suivantes: bactériémie/septicémie, méningite, méningo-encéphalite, encéphalite,
avortement, mortinatalité, accouchement précoce, maladies néonatales. La
période d'incubation avant l'apparition des symptômes peut s'étendre de
quelques jours à trois mois (137, 168). Le terme Listériose est employé ici, au
sens de Listériose invasive étant donné que l’impact de la Listériose non
invasive sur la santé publique est faible ou incertain (157, 158, 159).

121
Chapitre II Analyse du risque Listeria

Les aliments le plus souvent associés à la listériose humaine sont les laits
crus, les laits caillés, les fromages à base de laits crus, les glaces et crèmes
glacées et certains produits de la mer (saumon). Certains d’entre eux favorisent
la croissance de Listeria monocytogenes. Ils ont une durée plus ou moins
prolongée de conservation au réfrigérateur et sont consommés sans aucun
traitement listéricide (par exemple, la cuisson). Une grande diversité d’aliments
peut être contaminée par Listeria monocytogenes, mais les flambées et les cas
sporadiques de listériose semblent être associés surtout avec les produits prêts à
consommer. Ces derniers constituent une catégorie vaste et hétérogène
d’aliments qui peut être divisée de différentes manières. Selon la définition du
Codex (CAC/GL 22-1997), il s’agit de toute denrée alimentaire qui est
normalement consommée à l’état cru, ou toute denrée alimentaire manipulée,
transformée, mélangée, cuite ou soumise à toute autre préparation à la suite de
laquelle elle est normalement consommée sans subir de transformation. Par
ailleurs, les aliments prêts à consommer diffèrent selon les pays, les habitudes
alimentaires locales, la disponibilité et l’intégrité de la chaîne du froid et les
règlements concernant par exemple la température maximale au niveau du point
de vente.

122
Chapitre II Analyse du risque Listeria

II.1.2. Caractérisation des dangers.


La caractérisation des dangers est liée à l’examen de la relation dose-réponse.
Les réponses d’une population humaine aux expositions à un pathogène
d’origine alimentaire sont très variables, ce qui indique que l’incidence de la
maladie est fonction de plusieurs facteurs, parmi lesquels :
 Les caractéristiques de virulence du pathogène,
 Le nombre de cellules ingérées,
 L’état de santé général,
 L’état immunitaire de l’hôte,
 Les attributs de la matrice alimentaire qui modifient l’état du microbe ou
de l’hôte,
 L’effet de l’exposition préalable à Listeria monocytogenes d’origine
alimentaire, sur la réponse immunitaire de l’hôte.
L’élaboration et l’évaluation des relations dose-réponse ne peuvent être faites
que sur la base d’hypothèses d’experts ou de données épidémiologiques car il
n’y a aucune donnée provenant d’études chez des "volontaires" avec Listeria
monocytogenes ou un pathogène substitut (157, 159, 160, 168). En raison de la
gravité de la listériose invasive, aucune étude n’a été, ni ne peut être conduite
chez des volontaires car :
 Le délai de réponse qui s’écoule entre la consommation d’un aliment
contaminé et le début de la maladie est long et inconnu.
 La nature sporadique de la listériose rend très difficile toute enquête.

En partant de l’hypothèse que chaque cellule agit indépendamment et qu’une


seule cellule bactérienne est capable de provoquer une maladie, la dose
minimale infectieuse est donc une bactérie. Une relation mathématique, capable
de décrire les interactions entre la dose et la réponse, serait représentée par le
modèle exponentiel basé sur la probabilité qu’une seule bactérie peut causer la
maladie est le même pour toutes les Listeria monocytogenes ingérées. Cette
probabilité est exprimée par un seul paramètre, la valeur "R".

Actuellement, l’approche générale retenue, consiste à tirer parti des données


épidémiologiques, de l’évaluation détaillée de l’exposition au risque et à
simplifier la modélisation en décrivant les relations dose-réponse à l’aide d’un
modèle dose-réponse exponentiel, reposant lui-même sur des données
épidémiologiques avec la meilleure estimation des concentrations de Listeria
monocytogenes dans les aliments.

En Algérie, il n’y a pas de données épidémiologiques pouvant être utilisées dans


le cadre de la caractérisation des dangers en vue de l’estimation de la relation
dose – réponse car les rares cas décrits sont sporadiques.
123
Chapitre II Analyse du risque Listeria

Toutefois, le modèle proposé et retenu par la commission FAO/OMS, en raison


de son applicabilité reconnue pour la modélisation de la listériose grave, de sa
simplicité en tant que modèle à un paramètre et de sa nature log-linéaire aux
fourchettes de dose concernées (152, 153, 154, 155, 156), est l’équation
suivante :

P = 1 - e-RN

où,
P est la probabilité de maladie grave,
N est le nombre de Listeria monocytogenes consommées,
R est le paramètre qui définit la relation dose-réponse pour la population
considérée.

124
Chapitre II Analyse du risque Listeria

II.1.3. Evaluation de l’exposition au risque


L’élaboration de l’approche de l’évaluation de l’exposition au risque est basée
sur deux processus distincts :
Le premier, purement scientifique, est relatif à la prévalence de Listeria
monocytogenes dans les laits crus au niveau des points de vente.
Dans notre étude, la prévalence de 3,54% de Listeria monocytogenes dans les
laits crus analysés se traduit essentiellement par les résultats du dénombrement
suivant :
 12 laits, à la limite de l’acceptabilité, car ils présentent des valeurs de
Listeria monocytogenes inférieures à 100 UFC par millilitre de lait.
 5 laits constituent un danger potentiel de listériose, car ils présentent des
valeurs de Listeria monocytogenes comprises entre 100 et 1000 UFC par
millilitre de lait.
 2 laits constituent un risque réel de Listériose, car ils présentent des
valeurs de Listeria monocytogenes supérieures à 1000 UFC par millilitre
de lait.
Le second est basé sur la collecte d’informations (151, 152, 153, 154, 156)
relatives aux principaux paramètres, soit :

1. Le potentiel de croissance ou d’inactivation de Listeria monocytogenes.


a. Le mode de consommation.
b. La durée de stockage.
c. L’intégrité de la chaîne du froid.
2. L’estimation de la fréquence et de la taille des portions ingérées en
fonction des populations susceptibles et non susceptibles.
3. Le sexe des consommateurs.
4. L’age des consommateurs.
5. La contamination après transformation.

Dans notre étude, les informations ciblées ont fait l’objet d’une enquête par
questionnaire (Cf. annexe 3) auprès de la population de la région centre,
couvrant ainsi les wilayas d’Alger, de Blida, de Tipaza, de Boumerdes, d’Ain
Defla et de Tizi Ouzou, durant la période de Janvier 2004 à Juin 2005 (période
correspondante à l’échantillonnage pour l’analyse quantitative).
Au total, sur les mil (1000) exemplaires distribués de ce questionnaire, nous
avons collecté 926 résultats exploitables, soit 92,6 %.

125
Chapitre II Analyse du risque Listeria

Le traitement combiné des réponses aux questions est d’une importance capitale
puisqu’il permet d’aborder de façon plus rationnelle, l’évaluation de l’exposition
au risque Listeria comme suit.
1. Identification des conditions permettant ou empêchant la croissance de
Listeria monocytogenes entre le point de vente et la consommation, du
produit, autrement dit, le potentiel de croissance ou d’inactivation de
Listeria monocytogenes.
Le potentiel de croissance est un paramètre très significatif en matière
d’évaluation de l’exposition au risque car, d’une part, il permet de faire
d’emblée la différenciation entre les aliments qui permettent la croissance de
Listeria monocytogenes (ex : lait cru) et ceux qui ne le permettent pas (ex :
crème glacée) et d’autre part, il est étroitement lié au mode de consommation (a),
à la durée de stockage(b) et surtout à l’intégrité ou non de la chaîne de froid (c).
(a). Le mode de consommation se définit sur deux types de produits : le lait
ayant subi un traitement thermique (bouilli) et le lait cru englobant le lait caillé
(lait cru maintenu tel quel à température ambiante pendant 1 à 2 jours).

Mode de consommation du lait

600

400

200

0
1 2 3
Nombre 178 204 544
Pourcentage 19% 22% 59%

Cru Caillé Bouilli

La mise en adéquation du potentiel de croissance de Listeria monocytogenes en


fonction du mode de consommation du lait est en faveur de la consommation du
lait ayant subi un traitement thermique (59 %), supérieure à celle du lait à l’état
cru (19 %) et même après fermentation (22 %). Ce qui dénote de la prise de
conscience de la plupart des consommateurs.
Il en ressort que le potentiel d’inactivation de Listeria monocytogenes est de 59
% et le potentiel de croissance de Listeria monocytogenes est de 41 %, exposant
de facto au risque de la maladie.

126
Chapitre II Analyse du risque Listeria

(b). La durée de stockage :


La mise en adéquation du potentiel de croissance de Listeria monocytogenes en
fonction de la durée de stockage du lait est en faveur des longues durées puisque
85 % des consommateurs stockent le lait pendant 2 jours et plus et que
seulement 15 % d’entre eux, le stockent pendant une journée au maximum.

Durée de Stockage du lait

1000

500

0
1 2

Nombre 140 786


Pourcentage 15% 85%

1 jour 2 jours et plus

(c). L’intégrité de la chaîne de froid :


La mise en adéquation du potentiel de croissance de Listeria monocytogenes en
fonction de l’intégrité de la chaîne de froid est en faveur de la conservation du
lait à la température de réfrigération (75 %) contre la conservation à la
température de réfrigération après fermentation naturelle du lait pendant un à
deux jours à température ambiante (25 %).

Mode de conservation du lait

1000

500

0
1 2

Nombre 696 230


Pourcentage 75% 25%

Refrigeration T°Am + Réf

127
Chapitre II Analyse du risque Listeria

Il en ressort que, près de 100 % des consommateurs conservent le lait sous froid,
ce qui se traduit par une parfaite intégrité de la chaîne de froid, favorisant
inévitablement le potentiel de croissance de Listeria monocytogenes. Ce qui,
rappelons-le, a été un des principaux facteurs déclenchants de la Listériose en
Europe en fin d’année 1999, début d’année 2000.
Dans le sens de cette modélisation, mode de consommation, durée de stockage
et intégrité de la chaîne de froid constituent de véritables facteurs de risques
supplémentaires et non négligeables, favorisant inévitablement le potentiel de
croissance de Listeria monocytogenes et exposant ainsi les consommateurs à des
doses minimales infectieuses susceptibles d’être à l’origine de la maladie.

2. Estimation de la fréquence et de la taille des portions de laits


ingérées en fonction des populations susceptibles et non susceptibles.

Dans notre enquête, nous avons considéré deux groupes de population, à savoir :
 La population susceptible, représentée par les femmes enceintes, les
personnes en état de convalescence, les enfants ainsi que les personnes âgées de
plus de 60 ans, frange de population globale présentant une augmentation
significative du risque de développer des affections graves avec un taux de
létalité élevé par rapport à la population non susceptible.
 La population non susceptible, représentée par les adultes sains dans
laquelle, on n’observe qu’occasionnellement des infections graves à Listeria
monocytogenes.

La mise en adéquation de la fréquence et de la taille des portions de laits (la


portion étant estimée à un verre d’environ 30 centilitres) ingérées en fonction de
la population susceptible est en faveur de la consommation journalière de deux
portions chez les femmes enceintes (6,5 %), les convalescents (17 %) et les
personnes âgées de plus de 60 ans (10,5 %) ; contre une seule portion journalière
chez les femmes enceintes (3 %), les convalescents (2,5 %) et les personnes
âgées de plus de 60 ans (1,73 %). Par contre, la situation est inverse chez les
enfants où la consommation journalière d’une portion (6,30 %) prime par
rapport à celle de deux portions qui est de 1,94 %.

128
Chapitre II Analyse du risque Listeria

Fréquence et taille des portions ingérées par


population à risque

160
140
120
100 Femmes enceintes
80
60 Convalescents
40 Enfants
20 60 ans et plus
0
Nombre Nombre
1 Portion / J 2 Portions / J

Il en ressort que pour cette population, naturellement plus exposée, la


consommation de deux portions journalières augmenterait le risque de la
maladie. Une frange de la population des personnes âgées de plus de 60 ans et
des convalescents pense améliorer leur état de santé par l’ingestion de lait cru, à
travers les apports protéiniques et vitaminiques naturels, ignorant de facto,
l’aspect microbiologique. L’apport protéique et vitaminique du lait cru par
rapport à celui de la viande s’impose par le biais du prix.

La mise en adéquation de la fréquence et de la taille des portions de laits


ingérées en fonction de la population non susceptible est en faveur, là aussi, de
la consommation journalière de deux portions (76,5 %) contre une seule (23,5
%). Cette frange de population n’est pas non plus épargnée

Portion journalière en fonction de l'age "Adultes"

800
600
400
200
0
1 2
Nombre 218 708
Pourcentage 23,5% 76,5%
1 P/ J 2 P/ J

129
Chapitre II Analyse du risque Listeria

3. La consommation du lait et le sexe des consommateurs.

Notre enquête n’a pas révélé de relation directe entre la consommation du lait et
le sexe des consommateurs puisque le pourcentage des consommatrices (51 %)
est sensiblement égal à celui des consommateurs (49 %).

Sexe des consommateurs

600

400

200

0
1 2
Nombre 452 474
Pourcentage 49% 51%

Masculin Féminin

4. La régularité dans les achats du lait.

Notre enquête a montré que l’achat du lait est apparemment partagé entre les
acheteurs réguliers (34 %), les acheteurs non réguliers (27 %) et les acheteurs
occasionnels (39 %).

Régularité dans les achats de lait cru

400
300
200
100
0
1 2 3
Nombre 320 248 358
Pourcentage 34% 27% 39%
Rég N.Rég Occas

130
Chapitre II Analyse du risque Listeria

5. La régularité dans la consommation du lait.

Notre enquête a montré que la consommation du lait est partagée entre les
consommateurs réguliers (49 %) et les consommateurs non réguliers (51 %).

Régulation dans la consommation du lait cru

600

400

200

0
1 2
Nombre 450 476
Pourcentage 49% 51%

Cs.Réf Cs.N.Rég

131
Chapitre II Analyse du risque Listeria

II.1.4. Caractérisation des risques


La probabilité de contracter la Listériose dépend de l’évaluation de l’exposition
au risque (1) et de la relation dose-réponse (2).
(1). L’évaluation de l’exposition au risque associe la prévalence de Listeria
monocytogenes dans les laits crus aux points de ventes (a), l’estimation du
potentiel de croissance de Listeria monocytogenes dans les laits (b) et
l’estimation de la fréquence et de la taille des portions journalières ingérées pour
la population susceptible et non susceptible (c).
Le risque de contracter la Listériose est, dans notre cas:
(a). Directement proportionnel à la prévalence de Listeria monocytogenes
dans les laits crus aux points de ventes qui définit, trois situations :
 La première grave pour deux laits car le risque est considérable.
 La deuxième alarmante pour cinq laits car le danger est potentiel.
 La troisième critique pour douze laits car à la limite de l’acceptabilité.
(b). Favorisé par les facteurs qui, augmentent le potentiel de croissance de
Listeria monocytogenes dans les laits, en l’occurrence : le mode de
consommation, la durée de stockage et l’intégrité de la chaîne de froid.
(c) Egalement proportionnel à la fréquence et à la taille des portions
journalières ingérées par la population susceptible et non susceptible.
(2). Le risque de contracter la listériose est également lié à la dose réponse qui,
dans tous les cas, est difficile à déterminer car elle dépend de :
 L’impossibilité de faire une étude chez des volontaires, vu la gravité de la
maladie.
 La durée d’incubation, car longue et indéterminée.
 L’apparition de la maladie, le plus souvent, sous forme de cas
sporadiques.
 L’absence de données épidémiologiques antérieures, dans notre cas, car
absence d’épidémie.

En conclusion, tous les cas de Listériose décrits sont dans leur grande majorité
associés à la consommation d’aliments (laits et autres) qui ne répondent pas aux
normes en vigueur, à savoir zéro Listeria monocytogenes dans 1 millilitre. Par
conséquent, relever la norme de tolérance zéro jusqu’à une valeur plus élevée
(par exemple, 100 UFC/25ml ou 1 UFC/ml) devrait se traduire par une
incidence accrue de la Listériose à partir d’aliments permettant la croissance de
Listeria monocytogenes.

132
Chapitre II Analyse du risque Listeria

II. 2. La Gestion des risques.


La gestion des risques, processus décisionnel (ou prérogative politique),
est réservée pleinement aux pouvoirs publics. Dans le domaine de la sécurité
sanitaire des aliments, elle consiste à protéger la santé publique contre les
risques associés aux aliments par la sélection et la mise en œuvre des mesures
appropriées. Cependant, elle est essentiellement basée sur les résultats et les
recommandations formulés par les scientifiques (79, 153, 154).

Elle repose sur quatre composantes fondamentales, en l’occurrence :


 L’appréciation des risques.
 L’évaluation des différentes options de gestion des risques.
 L’exécution de la décision de gestion.
 Le suivi et le contrôle.

Gestion des risques

(1).Appréciation (2).Evaluation des ≠ options


des risques de gestion des risques

(3). Exécution de la
(4). Suivi et
décision de gestion
Contrôle

Figure n°6 : Représentation schématique de la gestion des risques.

L’appréciation des risques est une démarche qui consiste à identifier le


problème d’innocuité alimentaire posé et à définir un profil de risque. Cela
suppose une description du problème et de son contexte de façon à pouvoir
identifier les éléments cruciaux du danger ou du risque puis à prendre les
décisions qui permettent de gérer les risques.
L’évaluation des différentes options de gestion des risques dépend des
résultats obtenus lors de la caractérisation des dangers et du risque, de la
détermination d’un niveau de risque acceptable, ainsi que de la probabilité qu’un
danger puisse s’exprimer en risque réel.

Dans notre cas, la description du problème et de son contexte, ont été largement
discutés, particulièrement dans le chapitre relatif à "l’évaluation des risques".
133
Chapitre II Analyse du risque Listeria

Ces aspects incluent nécessairement les effets attendus du risque (santé


humaine, problèmes économiques), les conséquences potentielles de la maladie
(mortalité, avortements et séquelles psychiatriques), la perception des risques
par les consommateurs, la répartition des risques entre population susceptible et
non susceptible et enfin la préparation de directives pour l’application des
mesures de sécurité (79, 157, 159).

La démarche de suivi et de contrôle doit être mise en place et évaluée une fois
que la gestion est décidée et est en état d’exécution.

134
Chapitre II Analyse du risque Listeria

II. 3. La Communication sur les risques.


La communication sur les risques, processus d’information et de
sensibilisation, est destinée à la population, particulièrement la population
susceptible.
Elle repose sur huit principes, identifiés par la commission mixte FAO/OMS en
vue d’une communication efficace sur les risques (157, 159, 160), en
l’occurrence :
1. Connaître l’opinion publique, c'est-à-dire comprendre la motivation, les
opinions, les préoccupations et impressions des individus et des groupes
qui forment l’opinion et concevoir des messages communiquant des
informations sur les risques afin d’aborder ces problèmes, permet
d’améliorer la communication.
2. Impliquer les experts scientifiques car pouvant fournir des informations
sur la démarche d’évaluation des risques et sur leurs résultats, y compris
sur les hypothèses et jugements subjectifs. Les décideurs chargés de la
gestion des risques auront ainsi une information et une compréhension
complètes des risques.
3. Disposer de compétences d’experts en communication car l’expertise
en matière de communication est essentielle pour faire passer de façon
claire, compréhensible et instructive, le message approprié d’information
sur les risques.
4. Être une source d’information crédible car l’information qui provient
d’une source crédible est susceptible d’être mieux acceptée par le public.
Pour être crédible, il faut fournir au public la possibilité de reconnaître la
compétence, la fiabilité, l’honnêteté et l’impartialité.
5. Partager les responsabilités car la communication fait intervenir de
multiples acteurs (les fonctionnaires chargés de la réglementation, les
industriels, les consommateurs et les médias).
6. Distinguer la science et les jugements de valeur car lors de l’élaboration
d’un message communiquant des informations sur les risques, il est
essentiel de bien distinguer les faits des opinions.
7. Assurer la transparence car pour être sûr que la population accepte les
messages d’information sur les risques, le processus doit être ouvert et
contrôlable par les parties intéressées.
8. Mettre le risque en perspective en l’examinant sous l’angle de ses
avantages ou en le comparant avec d’autres risques plus familiers.
Cependant, il ne faut pas faire cela de façon telle que la population ait
l’impression que la comparaison sert à diminuer l’importance du risque.

135
Conclusion

136
Conclusion

A travers le monde, les microorganismes émergents et les maladies à


transmission alimentaire (MTA) sont en pleine évolution, si bien que chaque
année beaucoup de personnes en sont victimes, à l’issue parfois fatale. De nos
jours, cette situation est inacceptable car la plupart de ces maladies peuvent être
évitées.

En Algérie, la présence de Listeria monocytogenes, microorganisme émergent et


pathogène à un taux (1,96 %) certes faible, mais similaire à celui rapporté par la
littérature internationale, est encore une fois confirmée. L’utilisation d’une
nouvelle méthode référenciée et homologuée, basée sur le dénombrement a
permis de classer les laits et de définir une situation allant de l’état critique,
c'est-à-dire à la limite de l’acceptabilité jusqu’à celle où le risque est
considérable, en passant par celle où il y a un danger potentiel. Cette situation
montre qu’on n’est plus à l’abri d’une éventuelle flambée épidémique.

La stratégie mondiale de lutte contre les MTA, consiste en l’utilisation d’un


nouveau concept défini par la commission mixte FAO/OMS comme "analyse
des risques" qui comporte de nouveaux outils d’évaluation, de gestion et de
communication sur les risques.

L’adaptation de ce concept à notre travail a montré que parmi les populations


susceptibles, certaines personnes continuent de consommer des aliments (lait cru
ou caillé) pour lesquels, le potentiel de croissance de Listeria monocytogenes, la
durée de conservation et l’intégrité de la chaîne de froid ainsi que la fréquence et
la taille des portions journalières ingérées, constituent en somme, des facteurs
augmentant à un niveau alarmant, le risque d’épidémie. Il est donc temps, de
redoubler de vigilance en mettant en place dès à présent, une réglementation
adéquate suivie et contrôlée ainsi qu’une bonne communication sur les risques
en vue de sensibiliser au mieux la population.

Enfin, le présent travail n’a pas la prétention de résoudre formellement et


définitivement l’analyse du risque Listeria dans les laits crus en Algérie.
Cependant, il retrace toute la démarche de modélisation comprenant l’ensemble
des aspects positifs et négatifs qui mènent vers une analyse du risque applicable
aux autres microorganismes sur d’autres aliments cibles tels que Salmonella
enteritidis dans les viandes crues et viandes de volailles, Campylobacter jejunii
dans les œufs et la volaille, Escherichia coli O 157 :H7 dans les viandes hachées
ou encore Vibrio parahaemolyticus dans les produits de la mer.

137
Recommandations

138
Recommandations

PRECAUTIONS A PRENDRE POUR LA PREVENTION DE LA LISTERIOSE CHEZ


LES FEMMES ENCEINTES, LES PATIENTS IMMUNO-DEPRIMES ET LES
PERSONNES AGEES

ALIMENTS A EVITER

 Eviter la consommation de lait cru,


 Eviter la consommation de fromages à pâte molle au lait cru,
 Enlever la croûte des fromages avant consommation,
 Eviter la consommation de fromages vendus râpés,
 Eviter la consommation de poissons fumés,
 Eviter la consommation de produits de charcuterie cuite consommés en
l'état, ex : pâté, rillettes, produits en gelée, et si achetés, préférer les
produits préemballés et les consommer rapidement après leur achat.
 Eviter la consommation de produits de charcuterie crue consommés en
l'état - Les faire bien cuire avant consommation,
 Eviter la consommation de coquillages crus.

REGLES D'HYGIENE A RESPECTER

 Cuire soigneusement les aliments crus d'origine animale (viandes,


poissons) ; en particulier le steak haché doit être cuit à cœur,
 Laver soigneusement les légumes crus et les herbes aromatiques,
 Conserver les aliments crus (viandes, légumes ...) séparément des
aliments cuits ou prêts à être consommés,
 Après la manipulation d'aliments non cuits, se laver les mains et nettoyer
les ustensiles de cuisine qui ont été en contact avec ces aliments,
 Nettoyer fréquemment et désinfecter ensuite avec de l'eau javellisée votre
réfrigérateur,
 Les restes alimentaires et les plats cuisinés doivent être réchauffés
soigneusement avant consommation immédiate.
 Eviter le contact avec les animaux à risque (bovins, ovins, oiseaux).

139
Recommandations

PRECAUTIONS A PRENDRE POUR LA PREVENTION DE LA LISTERIOSE EN


GENERAL.

AU NIVEAU DES LABORATOIRES

 Poursuite de l’enquête de Listériose et l’étaler à d’autres produits et dans


d’autres régions du pays,
 Mise en place de la méthode de dénombrement de Listeria monocytogenes,
particulièrement les produits qui permettent sa croissance et sa
multiplication,
 Mise en place de techniques rapides de type RapidL’mono,
 Dépistage à l’importation de denrées animales et d’origine animale,
surtout lorsqu’il s’agit d’importation à partir de pays endémiques,
 Evoluer vers la certification ISO des laboratoires.

AU NIVEAU DES ELEVAGES

 Dépistage précoce et isolement des animaux malades ou porteurs sains au


niveau des élevages intensifs de bovins laitiers modernes,
particulièrement dans les cas d’avortements,
 Détruire les cadavres, avortons, placentas.
 Dépistage à partir de l’environnement (alimentation, ensilage),
 Dépistage à l’importation, au niveau des lazarets, surtout lorsqu’il s’agit
d’importation d’animaux, à partir de pays endémiques,
 Veiller à mettre en place des plans réguliers de nettoyage, désinfection et
dératisation

AU NIVEAU DES HOPITAUX ET CLINIQUES

 Dépistage précoce de Listériose particulièrement dans les cas


d'avortements chez les femmes enceintes,
 Mise en place des équipes compétentes chargées des 'enquêtes
hospitalières notamment au niveau des services de maternité,
 Veiller à mettre en place des plans réguliers de nettoyage, désinfection et
dératisation.

140
Recommandations

AU NIVEAU DES POUVOIRS PUBLICS

 Mettre en place le plus rapidement possible un système de veille sanitaire,


 Encourager le développement de la certification ISO et HACCP dans les
entreprises à caractère agro-alimentaires,
 Utilisation des nouveaux outils de contrôle préconisés par l’OMS et la
FAO tels que l’analyse des risques en mettant en place dès à présent, des
équipes de scientifiques chargés de l’évaluation des risques concernant :
o Listeria monocytogenes dans les aliments prêts à consommer,
o Salmonella enteritidis dans les viandes crues et viandes de
volailles,
o Campylobacter jejunii dans les œufs et la volaille,
o Escherichia coli O 157 :H7 dans les viandes hachées,
o Vibrio parahaemolyticus dans les produits de la mer.
 Prendre en considération leurs résultats et désigner les équipes chargées
de la gestion des risques,
 Utilisation de sources crédibles concernant la communication sur les
risques,
 Suivre et contrôler les décisions prises, en insistant sur la mise en place et
le respect des outils de traçabilité.

141
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158
159
Annexes

Annexe : 1
Matériel de travail

 Equipements de laboratoire
Il s'agit en somme, des équipements classiques d'un laboratoire de microbiologie
alimentaire à savoir :
 Etuves bactériennes réglées à différentes températures : 30 et 37°C,
 Bain-marie réglé à 44°C,
 Hotte à flux laminaire,
 Autoclave : 120°C,
 Balance électronique : environ 100 gr
 Combiné : Réfrigérateur - Congélateur,
 Microscope optique binoculaire, grossissement : 40 et 100,
 Bec bunsen.

 Consommable
 Milieux de culture (dont les formules figurent en annexe 2),
 Bouillon Fraser avec supplément,
 Gélose Palcam avec supplément,
 Gélose Oxford et Oxford modifiée,
 Gélose au Sang,
 Gélose TSAYE,
 Gélose mobilité,
 Gélose TSA,
 Gélose de conservation,
 API - Listeria,
 Huile de cèdre.
 Réactifs :
 Eau oxygénée,
 Disque d'oxydase,
 Colorants de Gram,
 Huile à immersion,
 Réactif de Kowacs,
 VP I et VP II,
 Rouge de méthyl,
 Nitrate I et Nitrate II,
 Ampoules de suspension Medium de 2 ml,
 Ampoule de réactif ZYM. B,
 Suspension d'une opacité égale à 0,5 Mac Farland.

160
Annexe

 Matériel biologique : souches de référence :


 Listeria monocytogenes référence : ATCC 19118
 Staphylococcus aureus référence : ATCC 25923
 Rhodococcus equi référence : ATCC 6939
 Verrerie :
 Flacons en verre stériles de 500 ml,
 Pipettes graduées stériles de 1, 2, 5 et 10 ml,
 Pipettes Pasteur,
 Lames et lamelles,
 Tubes de 16 mm de diamètre stériles.

161
Annexe

Annexe : 2

Formules des milieux de culture


1. Bouillon FRASER.

Composition :

Constituants Quantité en g/l


Peptone de protéase 5,0
Tryptone 5,0
Extrait de viande de bœuf 5,0
Extrait de levure 5,0
NaCl 20,0
Na2HPO42H2O 12,0
KH2PO4 1,35
Esculine 1,0
Chlorure de lithium 3,0

Principes :
 La forte teneur en chlorure de sodium permet d’accroître la sélectivité du milieu.
 Les phosphates agissent comme système tampon pour le maintien du pH.
 Le chlorure de lithium inhibe la plupart des Entérocoques susceptibles
d’hydrolyser l’esculine.
Préparation :
Faire dissoudre les composants dans de l’eau, puis chauffer modérément jusqu’à
dissolution complète. Ajuster le pH à 7,2.
Répartir ensuite le milieu à raison de :
 225 ml par flacon qui serviront aux enrichissements primaires,
 10 ml par tubes qui serviront aux enrichissements secondaires.
Stériliser ensuite le milieu à 121°C pendant 15 minutes.
Supplément sélectif pour Bouillon Fraser.
Au moment de l’utilisation du bouillon Fraser au demi tout comme le bouillon
Fraser, ils doivent être additionnés de leur supplément dont la formule est la
suivante :
Constituants Quantité
Acide nalidixique 22,5 mg
Acriflavine 28,125 mg
Citrate de Fer (III) ammoniacal 1,125 g

162
Annexe

Reconstituer stérilement un flacon de supplément par 22,5 ml d’un mélange 1/1


eau/éthanol stérile (soit 11,25 ml d’eau distillée stérile et 11,25 ml d’éthanol ).
Mélanger doucement pour dissoudre, puis ajouter ensuite aseptiquement :
 2,25 ml de la solution ainsi préparée, à 225 ml de bouillon Fraser au demi,
 0,10 ml de la solution ainsi préparée, à 10 ml de bouillon Fraser.
Bien mélanger avant d'introduire l’inoculum.
Une fois reconstitué, le supplément doit être maintenu à +4°C, à l’abri de la
lumière et ne doit pas dépasser les 8 jours.
Ce supplément est un mélange inhibiteur composé de 2 antimicrobiens et d’un
réactif : le citrate de fer, dont les rôles sont les suivants :
 l’acide nalidixique bloque la réplication de l’ADN des microorganismes
sensibles à cet antimicrobien (Gram négatifs surtout ),
 l’acriflavine supprime la croissance de la microflore secondaire Gram positif,
y compris Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus,
 le citrate de fer ammoniacal permet de visualiser l’esculétine produite par
Listeria à partir de l’esculine présente dans le milieu.
En présence des ions ferriques, l’esculétine forme un complexe noir qui apparaît
progressivement. La présence de fer favorise également la croissance des
Listeria.

2. Gélose PALCAM
Composition :

Constituants Quantité en g/l


Peptone 23,0
Amidon 1,0
Agar - Agar 20,0
Chlorure de sodium 5,0
D(-) mannitol 10,0
Ammonium de fer III citrate 0,5
Esculine 0,8
Glucose 0,5
Chlorure de lithium 15,0
Rouge de Phénol 0,08

163
Annexe

Principes :
 La peptone favorise la croissance des Listeria.
 L'extrait de levure est une source du complexe vitaminique B.
 Le glucose et l'amidon représentent les sources énergétiques du développement.
 Le chlorure de sodium maintien l'équilibre osmotique.
 La fermentation du mannitol par les germes contaminants qui pourraient
cultiver, est mise en évidence par le virage au jaune du rouge de phénol,
permettant ainsi d'orienter le diagnostic.
Préparation :
Faire fondre le milieu puis le refroidir à une température de l'ordre de 48°C.
Ajouter par la suite 2,25 ml du supplément Palcam reconstitué.
Homogénéiser et couler en boites de Pétri stériles.
Laisser solidifier sur paillasse puis les sécher à l'étuve.
Les boites ainsi préparées peuvent également être conservées à +4°C pendant 4
à 5 jours.
Supplément sélectif pour gélose Palcam

Constituants Quantité
Sulfate de Polymyxine B 5,0 mg
Ceftazidime 10,0 mg
Acriflavine 2,5 mg
Il s'agit d'un mélange de deux antibiotiques (Polymyxine et Ceftazidime ) et d'un
colorant antiseptique ( l'acriflavine ).
 La Polymyxine B inhibe les Gram négatifs, y compris Pseudomonas
aeruginosa , ainsi que quelques Gram positifs.
 La Ceftazidime est un antibiotique à large spectre auquel Listeria est
résistante.
Mode d'emploi.
On reconstitue le supplément en y ajoutant aséptiquement 5 ml d'eau distillée
stérile.
Mélanger doucement et soigneusement, puis répartir en boites de Pétri, qu'on
laisse refroidir et sécher sur paillasse.
Les boites ainsi préparées peuvent être gardées à +4°C, pendant au plus 48 à 72
heures.

164
Annexe

3. Gélose OXFORD.

Constituants Quantité
Colombia agar base 39 g
Esculine 1g
Ferrique ammonium citrate 0,5 g
Chlorure de sodium 15 g
Cycloheximide 400 mg
Colistine sulfate 20 mg
Acriflavine 5 mg
Céfotétan 2 mg
Fosfomycine 10 mg
Eau Distillée QSP 1000 ml

Préparation
Dissoudre 34 g du milieu déshydraté dans l’eau, en portant à ébullition. Ajuster
le pH à 7,0 à 25°C, puis répartir dans des flacons à raison de 225 ml.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

4. Gélose OXFORD Modifiée.

Constituants Quantité
Colombia sang agar base 39 g
Esculine 1g
Ferrique ammonium citrate 0,5 g
Chlorure de sodium 15 g
1 % Colistine solution 1 ml
1 % Moxalactame solution 1 ml
Agar 2g
Eau Distillée QSP 1000 ml

Préparation
Dissoudre 34 g du milieu déshydraté dans l’eau, en portant à ébullition. Ajuster
le pH à 7,0 à 25°C, puis répartir dans des flacons à raison de 225 ml.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

165
Annexe

5. Gélose TSAYE

Composants Quantité
Bouillon tryptone soja (1) 30,0 g
Extrait de levure 6,0 g
Agar Agar 9 à 18,0 g (2)
Eau 1000 ml
(1)Digestat enzymatique de caseïne 17,0 g
Digestat enzymatique de farine de soja 3,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Hydrogénophosphate dipotassique 2,5 g
Glucose 2,5 g
(2) selon le pouvoir gélifiant de l’Agar-Agar

Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant
à ébullition. Ajuster le pH à 7,3 à 25°C, puis répartir dans des flacons ou dans
des tubes, selon les préférences. Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15
minutes.
Les tubes seront refroidis en position inclinée. Les flacons seront refroidis en
position debout ; au moment de leur utilisation, ils seront fondus, puis refroidis à
environ 45°C, puis coulés en boîtes de Pétri.

6. Gélose au sang de mouton.

Composants Quantité
Digestat enzymatique de tissus animaux 15,0 g
Digestat enzymatique de foie 2,5 g
Extrait de levure 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Agar Agar 9 à 18,0 g
Eau 1000 ml
Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant
à ébullition. Ajuster le pH à 7,3 à 25°C, puis répartir dans des flacons. Stériliser
à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Les flacons seront ensuite refroidis ; au moment de leur utilisation, ils seront
fondus, puis refroidis à environ 45°C, puis on leur ajoute aséptiquement deux
ampoules de sang de mouton défibriné. Mélanger soigneusement, puis répartir
en boites de Pétri. Ce milieu est utilisé pour la mise en évidence de l’hémolyse.

166
Annexe

7. Gélose TSA

Composants Quantité en g/l


Tryptone de caseïne 15
Farine de soja 5
Chlorure de sodium 5
Agar 20

Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant
à ébullition. Ajuster le pH à 7,3 à 25°C, puis répartir dans des flacons. Stériliser
à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Les flacons seront ensuite refroidis ; au moment de leur utilisation, ils seront
fondus, puis refroidis à environ 45°C, puis on leur ajoute aséptiquement deux
ampoules de sang de mouton défibriné. Mélanger soigneusement, puis répartir
en boites de Pétri. Ce milieu est utilisé pour la mise en évidence de l’hémolyse
dans le Camp-test.

8. Gélose Mobilité.

Composants Quantité
Digestat enzymatique de caseïne 20,0 g
Digestat enzymatique de tissus animaux 6,1 g
Agar Agar 3à6g
Eau 1000 ml

Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant
à ébullition. Ajuster le pH à 7,3 à 25°C, puis répartir dans des tubes à raison de 5
ml par tube. Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Il s’agit d’un milieu semi-solide qui favorise la mobilité des germes. Il doit donc
être régénéré au bain-marie avant utilisation et l’ensemencement se fera alors
par piqûre centrale.

167
Annexe

Annexe : 3
Questionnaire sur l’évaluation de l’exposition au risque Listeria du lait cru
Wilaya : ……………

1. Etes- vous un consommateur régulier de lait cru de vache ?


Oui Non

2. Etes vous un acheteur ?

Régulier Non Régulier Occasionnel

3. Quel est le volume de lait cru acheté ?

Moins d’1 litre Entre 1et 2 L 2 L et plus

4. Consommation du lait cru pendant :

Grossesse Convalescence

Portion : 1 verre / J 2 verres / J Autres, préciser

5. Quel est le sexe du consommateur ?

Masculin Féminin

6. Quel est l’âge du consommateur ?

Enfant Adulte Plus de 60 ans

Portion : 1 verre / J 2 verres / J Autres, préciser

7. Comment le lait est-t-il consommé ?

Cru Caillé Bouilli

8. Quelle est la durée de stockage ?

1 jour 2 jours Autres, préciser

9. Mode de conservation du lait ?

Réfrigérateur A température ambiante T° ambiante puis réfrigérateur

NB : Barrer les mentions inutiles.

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