Sommaire

‫الشعبية الجزائرية‬ ‫الجمهورية الديمقراطية‬

République Algérienne démocratique et populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Faculté des Science de la Nature et de la Vie

Département de biologie

Laboratoire de Microbiologie Appliquée

« Exposé scientifique de Master 2 Microbiologie Appliquée »

« Génie Génétique »
Thème :

Persistance de Listeria monocytogenes dans le fromage et

Méthodes de Détection

Présenté par : Sous la supervision :

• BELBRAOUAT SIHEM • Dr Z.BENMECHERNENE

• BELHADJ HALIMA

Année Universitaire: 2023/2024

 - Introduction

- Listeria monocytogenes: une bactérie Persévérant

- Méthodes de préservation du fromage

- Persistance de Listeria monocytogenes dans le fromage

- Méthodes de détection de Listeria monocytogenes

- Exemples de Cas Réels

- Normes de Sécurité Alimentaire

- Conclusion

Introduction:
La sécurité alimentaire est un aspect crucial de notre vie quotidienne, ayant un impact direct
sur notre santé et notre bien-être. La persistance de bactéries pathogènes dans certains
aliments, tels que le fromage, peut entraîner des problèmes graves. Parmi ces bactéries,
Listeria monocytogenes est l'une des plus préoccupantes en raison de sa capacité à survivre
dans des conditions hostiles et de sa capacité à provoquer des infections graves chez les
humains.

Listeria monocytogenes : Une Bactérie Persévérant

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène qui peut provoquer des infections
alimentaires graves, appelée listériose . Elle est présente dans l'environnement, notamment
dans le sol, l'eau et les végétaux. Elle peut également contaminer les aliments, notamment
les fromages.

1•Caractères bactériologiques:

Les caractères bactériologiques de Listeria monocytogenes sont les suivants :

Morphologie : Listeria monocytogenes est une bactérie à Gram positif, à forme de bâtonnet,
qui mesure environ 0,5 à 2,0 µm de long et 0,2 à 0,5 µm de large. Elle est un bacille
immobile, non sporulé et non capsulé.

Culture : Listeria monocytogenes est une bactérie mésophile, qui se développe à des
températures de 10 à 45 °C, avec un optimum de 30 à 37 °C. Elle est également une bactérie
psychrotrophe, qui peut se développer à des températures inférieures à 10 °C.

Milieu de culture : Listeria monocytogenes peut être cultivée sur des milieux de culture
sélectifs, tels que le milieu PALCAM (Phenylalanine-Adenine-L-Lysine-Citrate-Agar for Listeria
monocytogenes) ou le milieu Oxford. Sur ces milieux, elle forme des colonies de 1 à 2 mm de
diamètre, de couleur blanche à crème, avec un halo de β-hémolyse.

Caractéristiques biochimiques : Listeria monocytogenes est une bactérie catalase positive,

oxydase négative et lactose négative. Elle est également capable de fermenter le glucose, le
mannitol et le rhamnose.

Résistance : Listeria monocytogenes est une bactérie résistante à de nombreux facteurs

physiques et chimiques. Elle est capable de survivre à des températures de congélation, à
des pH extrêmes et à des concentrations élevées de sel.

2•Les risques pour la santé humaine:

Les fromages les plus à risque de contamination sont les fromages à pâte molle à croûte
fleurie, tels que le camembert, le brie ou le crottin. Ces fromages ont une croûte humide et
poreuse qui permet à la bactérie de se développer.Les fromages à pâte pressée non cuite à
affinage court, tels que le morbier, le reblochon ou le saint-nectaire, sont également à
risque. Ces fromages ont une croûte plus dure, mais la bactérie peut tout de même se
développer à l'intérieur du fromage.

Les personnes les plus à risque de contracter une infection par Listeria monocytogenes sont
les personnes suivantes :

Les personnes âgées

Les femmes enceintes

Les enfants de moins de 5 ans

Les personnes immunodéprimées

Les symptômes de la listériose apparaissent généralement entre 2 et 30 jours après

l'ingestion de l'aliment contaminé. Ils peuvent inclure de la fièvre, des maux de tête, des
douleurs musculaires, des nausées, des vomissements et de la diarrhée. Dans les cas graves,
la listériose peut entraîner la mort.

3• Les sources de contamination du fromage :

peuvent être classées en deux catégories principales : les sources pré-traitement et les
sources post-traitement.

- Sources pré-traitement:

Les sources pré-traitement sont celles qui se produisent avant que le lait ne soit transformé
en fromage.

- Sources post-traitement:

Les sources post-traitement sont celles qui se produisent après que le lait a été transformé
en fromage.

Méthodes de Préservation du Fromage :

La préservation du fromage est une opération importante pour garantir sa sécurité et sa
durabilité. Les méthodes de préservation du fromage sont les suivantes :
La fabrication : les méthodes de fabrication du fromage, notamment la coagulation,
l'égouttage, le salage et l'affinage, contribuent à la préservation du fromage. La coagulation
et l'égouttage permettent de réduire la quantité d'eau dans le lait, ce qui rend le fromage
plus résistant à la dégradation. Le salage permet de réduire l'activité de l'eau dans le
fromage, ce qui le rend encore plus résistant à la dégradation. L'affinage permet au fromage
de développer des arômes et une texture qui le rendent plus attrayant pour les
consommateurs, mais qui contribuent également à sa conservation.

Le stockage : les conditions de stockage du fromage, notamment la température et

l'humidité, ont une influence sur sa durée de conservation. Les fromages doivent être
stockés à une température fraîche et humide, ce qui permet de ralentir la croissance des
micro-organismes.

Conservation du fromage au réfrigérateur: Le réfrigérateur est le moyen le plus courant de

conserver le fromage. Les fromages doivent être stockés dans le bac à légumes du
réfrigérateur, qui est la partie la moins froide, mais surtout la plus humide. L'humidité est
importante pour empêcher le fromage de se dessécher.

Conservation du fromage au congélateur: Le congélateur permet de prolonger la durée de

conservation du fromage pendant plusieurs mois. Pour congeler du fromage, il est important
de le couper en morceaux d'environ 2,5 cm d'épaisseur et de moins de 500 grammes. Avant
de congeler le fromage, il est également important de l'emballer hermétiquement pour
éviter qu'il ne prenne le goût des autres aliments.

Conservation du fromage à température ambiante:Certains fromages, comme le Parmigiano-

Reggiano ou la Mozzarella, peuvent être conservés à température ambiante pendant
plusieurs jours. Ces fromages ont une teneur élevée en sel, qui contribue à leur
conservation.

Persistance de Listeria monocytogenes dans le fromage:

• Les facteurs qui favorisent la persistance de Listeria monocytogenes dans le fromage
comprennent :
• Une teneur en humidité élevée : la Listeria monocytogenes se développe mieux dans les
aliments à teneur en humidité élevée. Les fromages à pâte molle, tels que la mozzarella, le
brie et le camembert, ont une teneur en humidité élevée, ce qui favorise la croissance de la
bactérie.

Fromage
à pâte molle

• Une

température de stockage et de distribution basse : la Listeria monocytogenes peut survivre à

des températures froides. Les fromages à pâte dure, tels que le parmesan et le gruyère, sont
généralement conservés à des températures inférieures à 10 °C, ce qui peut favoriser la
croissance de la bactérie.

Fromage à pâte dure

• La présence
de niches

environnementales favorables : la Listeria monocytogenes peut se développer dans des

niches environnementales favorables, telles que les fissures et les crevasses du fromage.

Fissures et crevasses dans le fromage

• La capacité de formation des biofilms :Listeria monocytogenes est une bactérie capable de
former des biofilms, ce qui contribue également à sa persistance dans le fromage. Les
biofilms sont des communautés de cellules bactériennes agglomérées qui sont entourées
d'une matrice extracellulaire. Les biofilms sont plus résistants aux désinfectants et aux
antibiotiques que les cellules bactériennes libres, ce qui les rend plus difficiles à contrôler.

• Système de communication Agr : Listeria monocytogenes possède un système de

communication Agr qui lui permet de persister dans le sol en s'adaptant aux caractéristiques
de l'environnement
 Les méthodes de détection de Listeria monocytogenes:
Il existe plusieurs méthodes de détection de L. monocytogenes dans les fromages.

1. Identification bactériologique classique:

A- Enrichissement
- Un enrichissement primaire au jour 0 avec 25 g dans 225 cm3 de bouillon soit une dilution
au 1/10.
- Un enrichissement secondaire au jour 1 avec 0,1 cm3 de bouillon d'enrichissement
primaire dans 10 cm3 de bouillon soit une dilution au 1/100.
B- Isolement
Les milieux d'isolement utilisés contiennent de nombreux inhibiteurs pour éliminer un
maximum des germes présents en grande quantité dans le produit initial. (Fromage, viande,
…). Ces inhibiteurs sont souvent des antibiotiques antibactériens ou antifongiques, ainsi que
le chlorure de lithium et l'acriflavine
Gélose OXFORD-CURTIS
Gélose PALCAM
Gélose Mox (Gélose OXFORD modifiée au moxalactam)
C- Identification
L'identification au genre Listeria repose sur les caractères morphologiques, sur la recherche
de la catalase, sur la mobilité à 25 °C (étudiée en ensemençant deux bouillons nutritifs
incubés pendant environ 4 heures, l'un à 25 °C et l'autre à 37 °C ou étudiée en gélose
mobilité ce qui permet d'observer l'image caractéristique en sapin renversé), sur l'hydrolyse
de l'esculine (hydrolyse rapide observée en 2 à 3 heures), sur l'acidification du D-glucose, sur
une réponse positive aux tests RM et VP et sur l'absence de production d'H2S. Il est possible
de confondre une Listeria sp. avec une souche appartenant à un autre genre bactérien
2. Méthodes modernes:

2.1- La méthode "Rapid'L.Mono":

Cette technique utilise un milieu gélosé sélectif permettant une identification en 24-48
heures après l'étape de pré-enrichissement. Le milieu Rapid'L.Mono permet la détection
chromogénique d'une phospholipase C produite par Listeria monocytogenes et Listeria
ivanovii et une différenciation de ces deux espèces basées sur la capacité d'acidification du
xylose.

Schéma : Méthode RapidL’mono

2.2- La méthode de routine AFNOR NF V 08 055:
La norme AFNOR V08 055 (déc 1993) est une méthode de routine de recherche de L.
monocytogenes : détection, identification. Méthode relativement lourde, elle comprend les
étapes suivantes :

- Enrichissement primaire sur bouillon FRASER au 1/2 (24 h à 30°C)

- Isolement sur gélose PALCAM ou OXFORD (37°C, 24 ou 48 heures)

- Enrichissement secondaire sur bouillon FRASER incubé 24 et 48 h à 37°C

- Isolement sur gélose PALCAM ou OXFORD (37°C, 24 ou 48 heures)
- Les colonies caractéristiques sont identifiées à l’aide de la méthode traditionnelle ou au
moyen de galeries miniaturisées (la galerie API 20 STREP est bien adaptée).Cette méthode
est schématisée ci-dessous :

Schéma : Méthode de routine AFNOR V08 055 déc 1993 (Listeria

monocytogenes)

2.3- L’utilisation de la PCR (polymerase chain reaction):

Les étapes de la PCR (réaction de polymérisation en chaîne) pour la détection de Listeria
monocytogenes dans les fromages :

1/Préparation de l'échantillon: L'échantillon de fromage est d'abord broyé ou haché pour

libérer les cellules bactériennes. L'échantillon est ensuite dilué dans une solution saline
stérile pour faciliter l'extraction de l'ADN.

2/Extraction de l'ADN : Isoler l'ADN de l'échantillon de fromage, généralement en utilisant

des méthodes d'extraction spécifiques( À l'aide d'un kit d'extraction d'ADN, Ce kit utilise une
combinaison de méthodes physiques et chimiques pour séparer l'ADN des autres
composants de l'échantillon).

3/Amplification : Utiliser la PCR pour amplifier une région spécifique de l'ADN de Listeria
monocytogenes. Les réactifs de PCR, y compris des amorces spécifiques, sont ajoutés.

4/Denaturation : Chauffer l'échantillon pour séparer l'ADN en brins simples.

5/Hybridation des amorces : Refroidir l'échantillon pour permettre aux amorces de se lier
spécifiquement à la région cible de l'ADN.

6/Élongation : Utiliser une enzyme pour synthétiser une nouvelle chaîne d'ADN
complémentaire à la région cible.

7/Répétition : Répéter le processus de denaturation, hybridation et élongation plusieurs fois

(cycles) pour amplifier l'ADN de manière exponentielle.

8/Détection : Analyser les produits de PCR pour la présence de l'ADN amplifié de Listeria
monocytogenes, souvent à l'aide de techniques comme l'électrophorèse ou des méthodes
de détection moléculaire.( Par exemple détecté à l'aide d'un instrument de PCR en temps
réel. Cet instrument mesure l'intensité de la fluorescence émise par les sondes TaqMan
utilisées pour la PCR. Une augmentation de l'intensité de la fluorescence indique la présence
d'ADN Listeria monocytogenes.)

2.4- La méthode Gen-probe Listeria monocytogenes:

est un test d’identification utilisant une sonde d’ADN spécifique à marquage
chimioluminescent, complémentaire de l’ARN ribosomal de Listeria monocytogenes : les
hybrides formés sont détectés au moyen d’un luminomètre. Ce test nécessite deux phases
d’enrichissement (bouillon FRASER au 1/2 puis gélose PALCAM). Les colonies s’y développant
sont soumises à une hybridation moléculaire après lyse bactérienne.

Principe :
Les tests par hybridation d’acides nucléiques sont basés sur la capacité de brins
complémentaires d’acides nucléiques à s’apparier de manière spécifique pour former des
complexes bicaténaires stables . La méthode AccuProbe utilise une sonde ADN
monocaténaire conjuguée à un marqueur chimiluminescent complémentaire de l’ARN
ribosomal (ARNr) de l’organisme cible. Lorsque l’ARNr de l’organisme cible est libéré, la
sonde s’hybride avec celui-ci pour former un complexe ADN-ARN stable. Le Réactif de
Sélection permet de différencier les sondes hybridées des sondes non hybridées. Le
luminomètre Hologic permet de mesurer le signal lumineux émis par les hybrides ADN-ARN.
Le résultat est positif si le luminomètre indique une valeur supérieure ou égale à la valeur
seuil; le résultat est négatif s’il indique une valeur inférieure.

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS:

Les résultats du Test AccuProbe Listeria monocytogenes sont interprétés en fonction d’une
valeur seuil. Les échantillons produisant un signal lumineux de valeur supérieure ou égale à
ce seuil sont considérés comme positifs. Les signaux lumineux inférieurs à ce seuil sont
considérés comme négatifs. Lorsque le résultat est situé dans la zone d’incertitude, le test
doit être répété. Si la seconde analyse donne toujours des résultats équivoques, il faut
repiquer la souche afin de vérifier sa pureté.

Études de cas de contaminations de fromage par Listeria monocytogenes

Étude de cas 1 : épidémie de vacherin Mont-d'Or en Suisse en 1987

En 1987, une épidémie de listériose a éclaté en Suisse, faisant 18 morts. La source de

l'épidémie a été identifiée comme étant le vacherin Mont-d'Or, un fromage au lait cru
fabriqué dans le canton de Vaud.
L'enquête a montré que la contamination du fromage avait eu lieu au cours de la fabrication.
Les bactéries Listeria monocytogenes étaient présentes dans le lait cru utilisé pour fabriquer
le fromage. Elles ont ensuite proliféré pendant la fermentation du fromage, qui se déroule à
une température de 10 à 12 °C, favorable à la croissance de cette bactérie.

Étude de cas 2 : épidémie de fromages au lait cru en France en 2015

En 2015, une épidémie de listériose a éclaté en France, faisant 22 morts. La source de

l'épidémie a été identifiée comme étant des fromages au lait cru fabriqués dans le sud de la
France.

L'enquête a montré que la contamination des fromages avait eu lieu au cours de la

fabrication. Les bactéries Listeria monocytogenes étaient présentes dans le lait cru utilisé
pour fabriquer le fromage. Elles ont ensuite proliféré pendant la fermentation du fromage,
qui se déroule à une température de 10 à 12 °C, favorable à la croissance de cette bactérie.

Étude de cas 3 : épidémie de fromages à pâte molle en Allemagne en 2022

En 2022, une épidémie de listériose a éclaté en Allemagne, faisant 15 morts. La source de

l'épidémie a été identifiée comme étant des fromages à pâte molle fabriqués dans le nord de
l'Allemagne.

L'enquête a montré que la contamination des fromages avait eu lieu au cours de la

fabrication. Les bactéries Listeria monocytogenes étaient présentes dans le lait cru utilisé
pour fabriquer le fromage. Elles ont ensuite proliféré pendant la fermentation du fromage,
qui se déroule à une température de 10 à 12 °C, favorable à la croissance de cette bactérie.

Normes de Sécurité Alimentaire :

L'Algérie a mis en place des normes de sécurité alimentaire strictes pour protéger la santé
des consommateurs. Ces normes sont conformes aux normes internationales, telles que
celles du Codex Alimentarius.

En ce qui concerne la Listeria monocytogenes dans le fromage, les normes algériennes

exigent que les producteurs de fromage mettent en place des mesures de maîtrise des
risques pour prévenir la contamination. Ces mesures comprennent notamment :

- La pasteurisation du lait, qui tue les bactéries Listeria monocytogenes

- L'analyse microbiologique des produits finis, qui permet de détecter la présence de la
bactérie

- La mise en place de bonnes pratiques d'hygiène (BPH), qui réduisent le risque de

contamination croisée

Les producteurs de fromage sont également tenus de respecter les directives suivantes :

- Le lait cru ne doit être utilisé que pour la fabrication de fromages à pâte dure ou à pâte
semi-dure.

- Les fromages à pâte molle ne doivent être fabriqués qu'à partir de lait pasteurisé.

- Les fromages fabriqués à partir de lait cru doivent être affinés pendant au moins 60 jours.

- Les fromages doivent être conservés à une température inférieure à 4 °C.

Les autorités réglementaires algériennes, telles que le ministère du Commerce et de la

Promotion des Exportations, sont chargées de la surveillance du respect de ces normes. Elles
peuvent procéder à des inspections des établissements de transformation des produits
alimentaires pour s'assurer que les normes sont bien appliquées.

Les consommateurs algériens peuvent également jouer un rôle important dans la prévention
des contaminations alimentaires. Ils doivent respecter les bonnes pratiques alimentaires,
telles que :

- La cuisson complète des fromages à pâte molle.

- La conservation des fromages à une température inférieure à 4 °C.

- L'élimination des fromages périmés ou abîmés.

Conclusion:

• Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène zoonotique qui peut provoquer la
listériose, une maladie grave qui peut être mortelle.

• Les fromages sont des produits alimentaires susceptibles d'être contaminés par Listeria
monocytogenes.

• Les fromages à pâte molle, en particulier, sont plus à risque car ils ont une teneur en eau
élevée et une durée de conservation plus longue, ce qui favorise la croissance de la bactérie.

• Listeria monocytogenes peut persister dans les fromages pendant une longue période,
même à des températures froides.
• La détection de Listeria monocytogenes dans les fromages est importante pour prévenir la
listériose.

• La surveillance constante de la présence de Listeria monocytogenes dans les fromages est

essentielle pour protéger la santé des consommateurs.

• Les producteurs de fromage, les autorités réglementaires et les laboratoires de contrôle

doivent collaborer pour mettre en place un système de surveillance efficace.

• Les méthodes de détection de Listeria monocytogenes doivent être améliorées pour être
plus sensibles et plus spécifiques. Les recherches en cours visent à développer de nouvelles
méthodes de détection plus efficaces.

• Les producteurs de fromage doivent mettre en place des mesures de prévention et de

contrôle pour réduire le risque de contamination par Listeria monocytogenes.

• Les consommateurs doivent respecter les bonnes pratiques alimentaires pour se protéger
de la listériose.

Références bibliographiques :

• Béranger, D., & Lejeune, A. (2019). Persistance de Listeria monocytogenes

dans les fromages. Lait, 99(2), 299-310.

• EFSA. (2017). Scientific Opinion on the occurrence of Listeria monocytogenes

in cheese. EFSA Journal, 15(12), 5221.

• Ministère de l'Agriculture et de la Pêche. (2023). Règlementation des

fromages au lait cru.
• Awad, A., El-Hakim, H., El-Sharkawy, S., & Abdel-Gawad, A. (2022).
Comparison of methods for detection of Listeria monocytogenes in cheese.
Journal of Food Protection, 85(6), 1288-1294.

• Diaz, M., Sanchez, M., Gonzalez, M., & Hernandez, M. (2021). Development
of a rapid and sensitive method for the detection of Listeria monocytogenes in
cheese. Food Control, 127, 107570.

• Liu, Y., Li, Y., Zhang, Y., & Wang, X. (2020). Detection of Listeria
monocytogenes in cheese using a multiplex polymerase chain reaction assay.
Food Control, 116, 107480.
ntialité et Bard