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I) Le monde microbien
Ce sont les Archeobactéries que l’on trouve dans les milieux les plus hostiles. Leur ADN ne
sera pas en fusion à 100°C, donc ce sont des organismes interessants à etudier d’un point de
vue biotechnologique.
Les virus ne sont pas vivants. Ils sont incapables de se procréer de manière autonome. Ce sont
des parasites obligatoires.
On trouve les bactéries surtout dans le sol et l’eau. Elles se retrouvent en grande concentration
dans les organismes Eucaryotes, le corps humain est constitué de presque plus de bactéries
que de cellules humaines.
Les microorganismes sont les pionniers de la vie sur Terre. L’apparition de l’oxygène est due
au fait que des bactéries deviennent aptes à effectuer la photosynthèse, les Cyanobactéries.
Elles colonisent les milieux extrêmes. Ce sont les ancêtres des organites Eucaryotes.
A l’origine des mitochondries, il s’agit d’une bactérie qui aurait envahit une cellule Eucaryote.
Les chloroplastes de la même maniere. C’est la théorie endosymbiotique.
Points communs
Eucaryotes Procaryotes
Cytoplasme (Cytosol) oui oui
Matériel Génétique oui oui (masse fibreuse, un seul
chromosome circulaire)
Membrane (cyto)plasmique oui oui
Différences
Noyau (+Membrane nucléaire) oui non
(Voir tableau 1.3)
Une bactérie fait environ de 0,5 à 1µm de long. Une cellule Eucaryote fait de 5 à 20µm.
Les Procaryotes ont une reproduction de type asexué (clonale). Ils se divisent par scissiparité
(division binaire).
Nutrition
Métabolisme
Génétique
Biochimie
Plantes : Elles tirent l’energie de la lumiere et ont besoin de CO2 pour le carbone.
Animaux : Ils tirent l’énergie et le carbone des molécules organiques (bactéries, animaux,
végétaux).
Micro-organismes : Photosynthétiques et/ou utilisation de molécules organiques.
Ils ont une diversité métabolique différente des animaux et des végétaux.
On pense que pour chaque molécule carbonée naturelle qui existe à la surface de la planète, il
existe un micro-organisme capable de la métaboliser, même pour le cyanure, les
hydrocarbures, le TNT (Trinitrotoluène), le benzène, ...
Il y a une grande diversité métabolique d’une espèce à une autre. Certaines ne sont capables
d’utiliser qu’un composé carbonné, tandis que d’autres peuvent en utiliser jusqu’à une
centaine de différents. La nutrition chez les procaryotes est un processus par lequel les
microorganismes puisent et utilisent les aliments pour produire à la fois de l’energie et des
matériaux de structure.
Comment constituer un milieu adéquat à la culture d’un micro-organisme ? Il va être basé sur
les éléments présents dans un micro-organisme. A 90% une bactérie est composée d’eau. Le
reste est représenté sur le tableau. Il y a surtout C, O, N, H, le reste étant des sels minéraux.
Dans la niche écologique, la concentration en nutriments dans le milieu extérieur est très
faible. Il faut que cette concentration en nutriments soit 100 à 1000x supérieure à l’intérieur
du procaryote pour permettre sa croissance. Plusieurs cas de figure pour y arriver :
a) Transport passif (selon le gradient de concentration)
Diffusion passive.
A faible concentration, la diffusion facilité permet d’avoir une entrée plus importante que la
diffusion passive. On arrive à une phase plateau, où on arrive à un équilibre : une protéine
membranaire interne à la membrane cytoplasmique est utilisée, la perméase.
Lorsque que la concentration du substrat sera trop importante on va arriver à une saturation,
car toutes les protéines seront occupées.
Système de transport utilisant les protéines capables de lier l’ATP. Elles se trouvent dans
différents endroits selon la bactérie. Chez les bactéries Gr+ elle est intrinsèque. Chez les Gr-
elle est libre dans le périplasme. Les perméases membranaires sont en général présentes à
deux copies. Elles sont hydrophobes.
La protéine ATPase est coté cytoplasme mais intéragit avec la membrane.
La différence de charge qui existe de part et d’autre de la cellule est due à un phénomène
établi au cours du transport des électrons au travers de la membrane plasmique.
Les organismes respirent de manière aérobie ou anaérobie. Le milieu extérieur est chargé
positivement, le milieu intérieur est chargé négativement.
Conséquence : ces forces électrochimiques et protomotrices vont servir à permettre la
synthèse d’ATP, et à faire du transport de substrat.
Force proton-motrice :
N’a pas son équivalent chez les Eucaryotes. Ces systèmes servent au transport des sucres.
(Chez Escherichia coli, le glucose rentre par ce système).
L’energie est amenée par la liaison hautement énergietique du phospho-énol-pyruvate.
L’hydrolyse de cette liaison permettre de faire rentrer le sucre de l’extérieur vers l’intérieur de
la membrane. Au cours du transport le glucose sera phosphorylé (glucose6P).
Le fer est un composant essentiel des cytochrones et des protéines Fer-Soufre, servant au
transport des électrons dans la respiration. Le fer naturel est Fe3+. Ainsi il est insoluble, donc
intransportable. Les micro-organismes sécrètent des agents chélateurs de bas poids
moléculaire appelés sidérophores dans le milieu extérieur lorsque leur concentration en fer va
baisser. Ces sidérophores vont fixer le fer et se fixer sur un recepteur membranaire spécifique
et faire rentrer le fer dans la cellule.
On met ces bactéries dans un milieu liquide ou solide (en ajoutant de l’agar à 15g/L) et on
stérilise par autoclavage.
On part d’un mélange et on obtient une souche pure. Animation sur http://www.ac-
creteil.fr/biotechnologies/doc_streakplate.htm.
Physiologie de la croissance dans ces conditions est connue et cette croissance peut être
décrite mathématiquement.
A) Mesure de la croissance
1) Mesure du nombre de cellules
b) Comptage direct
Chambre de petroff-Hausser. Utilisé pour les levures car elles sont suffisament grosses pour le
comptage. On a une lamelle creuse où on dépose un champ precis et on denombre les cellules
observées.
c) Compteur électronique
Compteur de Coulter. On a un flux où les cellules passent une par une et un detecteur relié à
un compteur va compter les cellules.
- Temps de génération g
- Taux de croissance µ
- Nombre de générations n
- Biomasse M
µ = nombre de générations ou divisions binaires par unité de temps. Cela traduit la vitesse de
division.
µ = n/t (en h-1)
n = µt Xt = X02µt
La courbe la plus exploitable est celle avec les logarythmes. Elle se divise en 6 phases de
croissance différentes : a, b, c, d, e et f.
Etapes d’adaptation.
f : Phase de déclin. Cette phase n’est pas toujours observable, on la voit surtout chez les
bactéries. Elles vont lyser et libérer les contenu intracellulaire (elles meurent). µ < 0.
Pourquoi les phases décélération et stationnaire la croissance s’arrête –t-elle pour arriver à 0 ?
Car il n’y a plus de nutriments, plus de source de C et d’énergie. Ensuite le micro-organisme
va rejetter des déchets toxiques. Et une variation de l’équilibre ionique du milieu va faire
varier le pH.
La biomasse (mg/L) = M = masse de microorganismes formés / litre de culture = rendement.
Milieu minimum :
Excès de tous les nutriments
Un limitant en concentration dans le milieu.
Y = Rendement de croissance : efficacité avec lequel un microorganisme va pouvoir
pousser dans un substrat = Masse de microorganisme formé (mg/L)/ masse de substrat
consomé (g/L)
E : Les enzymes qui catabolisent le fructose sont déjà présence, contrairement aux enzymes
qui interviennent dans la dégradation de l'arabinose. Elles sont synthétisées pendant la phase
de latence.
Tant qu’il y a du fructose dans le milieu, les enzymes catalysant l’arabinose ne sont pas
synthétisées.
b) Turbidostat
1) Pression osmotique
* Non halophiles ou osmotolérants ([NaCl] = 0,5 à 3M). Elles vont tout faire pour rejetter le
sel à l’extérieur « SALT IN ».
* Halophiles modérés à extrêmes ([NaCl] = 2,8 à 6,2M). Le sel reste en concentrations très
élevées à l’intérieur « SALT OUT ».
Choc osmotique : La concentration en NaCl exterieure sera plus élevée. Par osmose la cellule
va avoir tendance à diluer le milieu extérieur : l’eau va sortir. Son cytoplasme va se
deshydrater. La replication de l’ADN va s’arrêter ainsi que la synthèse d’ATP, la respiration,
les éléments nutritifs ne vont plus pouvoir entrer, les protéines vont se dénaturer et le volume
du cytoplasme va beaucoup diminuer, donc les molécules toxiques seront en concentration
plus grandes. Plus de pression exercée sur la paroi. L’alongement ne se fait plus.
Arrêt de la croissance
Mais la bactérie est osmotolérante et ne va pas mourir. Elle va être capable de faire rentrer
l’eau dans le cytoplasme pour revenir dans des conditions standard. Pour cela elle va
accumuler des solutés couplables au transport de l’eau (K+), quelques nanosecondes après le
choc osmotique.
Réponse primaire.
Mais cette accumulation de potassium est à long terme toxique pour la bactérie. Des solutés
compatibles s’accumulent et sont non toxiques (sucres, acides aminés, bétaines, ...)
Réponse secondaire.
2) pH
4) L’Oxygène
Certaines bactéries ont des équipements enzymatiques qui permettent de détoxyfier l’ O2.
Ex : Catalase du peroxyde d’hydrogène: 2H2O2 2H2O + O2
5) Pression
- Barotolérance.
- Barophile : 400 à 500 atm et même jusqu’à 600 à 1100 atm pour microorganismes des
grandes profondeurs.
Observation au microscope
Microscope optique à fond clair = L’ensemble du champ de vision (objet + fond) est
illuminé.
a) Bactéries unicellulaires
- Forme sphérique = Coque ou coccus : PHOTO
Selon l’axe de division de la bactérie au cours de sa croissance, et si les cellules ne se
séparent pas : on va pouvoir donner un nom à la bactérie.
- Diplocoques
- Streptocoques
- Tetrades
- Sarcines
- Staphylocoques
- Forme cylindrique = bâtonnet ou bacille PHOTO
- Bacille simple
- Diplobacille
- Streptobacille
- Coccobacille
- Forme hélicoïdale PHOTO
- Vibrion (hélice ≤ 1 tour)
- Spirille (hélice longue et rigide)
- Spirochète (hélice longue et flexible)
- Bactéries à prosthèque PHOTO
b) Bactéries pluricellulaires
- Actinomycètes.
- Cyanomycètes ( bactéries photosynthétiques ) comme Oscillatoria ou Anabaena.
Reproduction asexuée
Chromosome bactérien
- Masse moléculaire d’ADN = 109 à 1010 Da.
- Nombre de copies = 1 copie de chromosome unique circulaire.
- Taille du génome de 0,65 mégabase à 10Mb (moyenne à 4 Mb).
- Séquençage systématique des génomes :
Ex : Escherichia coli : 4,6 Mb – 4600 gènes.
Plasmide
- ADN circulaire double-brin extra-chromosomique.
- Rôle dans l’adaptation mais non-essentiel au développement.
- Les ribosomes :
- Libres ou en polysomes.
- Rôle dans la traduction de l’ARNm en protéine.
- Phospholipides (7 différents).
- Protéines (jusqu’à 200 protéines différentes).
- Pas de stérols.
- Cations divalents.
Le règne des Bacteria est divisé en deux groupes selon la réaction à la coloration de Gram :
- Gram+ : violet.
- Gram- : rose.
1) Frottis
2) Coloration au cristal violet
3) « Mordre » au lugol (iode)
4) Décoloration à l’alcool
5) Contre-coloration à la fuschine (ou safranine)
La structure de l’enveloppe cellulaire est beaucoup plus complexe chez les Gram- que chez
les Gram+ :
Gram +
Gram -
Fonction de la paroi :
Empêcher la lyse cellulaire par osmose dans un envirronement le plus souvent hypotonique.
Composition de la capsule :
- Polysaccharides majoritairement (homopolymère, hétéropolymère).
- Polypeptides.
Les flagelles
- Rôle dans la mobilité en milieu aqueux.
- 10 à 20 nm de diamètre.
- 5 à 20 µm de long.
Disposition des flagelles chez les microoganismes :
- Polaire monotriche (ex : Pseudomonas).
- Polaire lophotriche.
- Amphitriche.
- Péritriche.
Structure de la flagelle :
- Energie chimique transformée en énergie mecanique grâce à la force proton motrice
(environ 1000 protons par tour de flagelle).
- Vitesse de rotation de 200 à 1000 tours/min = 10-20 µm/sec = 65 km/h.
- La longueur d’onde des ondulations est spécifique à chaque espèce.
Une bactérie péritriche (E. coli) se déplace grâce à l’alternance nage/culbute (sens horaire,
anti-horaire).
La mobilité chez les spirochètes se fait grâce à la présence d’un filament axial.
f) Les endospores
Phénomène unique aux bactéries et seulement chez certaines G+. Ces endospores se forment
lorsque la bactérie rencontre une carrence nutritionnelle, ce qui lui confère une résistance
extrème :
- à des substances chimiques
- à des rayonnements
- à l’absence d’eau
- au gel
- à la chaleur
On a retrouvé des endospores de 7500 ans.
Deux catégories :
Catabolisme (réactions exergoniques) : dégradation de composés organiques complexes
(polysaccharides, lipides, protéines). Réactions de classe 1 souvent liées à des réactions
d’hydratation. On part d’un composé qui va devenir oxydé.
ATP libéré.
1) La production d’énergie
L’énergie n’est pas stockée sous forme d’ATP. Lorsque les nutriments sont dissociés en
éléments plus simples, l’energie dégagée va être transférée sous une autre forme.
Ared + NAD+ Aox + NADH + H+
Le NADH est une molécule hautement énergétique. Elle est utilisée dans la chaîne respiratoire
chez certaines bactéries. Par chimioosmose elle servira à synthétiser de l’ATP.
b) La production d’ATP
Source d’énergie
(donneurs d’électrons)
Soleil et pigments photosynthétiques Glucose, soufre, ammoniac ou hydrogène à
ensemble l’état gazeux
Phototrophes Chimiotrophes
Chimioorganotrophes (donneur
d’électron : composé organique)
Chimiolithotrophe (donneur d’électron :
composé inorganique réduit)
|
Electrons
|
| ATP
|
v
Transporteurs d’électrons
NADP+ NAD+
FAD+
|
| ATP
|
v
Accepteurs d’électrons finaux
O2 NO3-, SO42- Composé organique
(respiration aérobie) (respiraction anaerobie) (fermentation)
2) Le catabolisme des glucides
NO2- NH3 N2
Aerobiose ; Anaerobiose
Bilan de l’oxydation du glucose en CO2 (glycolyse et une partie du cycle de Krebs) lors
de la respiration anaerobie (pas de chimioosmose) :
c) La fermentation
Les organismes construisent toutes leurs molecules carbonnées soit à partir d’un lipide soit à
partir d’une protéine.
a) Les lipides
Les lipides ne passent pas les membranes. Donc les microorganismes synthétisent des lipases
extracellulaires qui les hydrolysent dans le milieu extérieur en acides gras + glycérols.
b) Les protéines
Les protéines ne passent pas la membrane plasmique. Les microorganismes synthétisent des
protéases-peptidases excrétées dans le milieu extérieur. Les protéines seront catalysées en AA
( symport ou système ABC transport ) ou dipeptides ou oligopeptides ( systèmes ABC
transport).
Les AA sont dégradés selon différentes voies :
- Desamination NH4.
- Decarboxylation CO2.
- Déshydrogénation.
- Test de fermentation :
Sucre + indicateur de pH + 1 protéine.
Ils utilisent comme donneur d’electron un composé chimique inorganique qui va être oxydé.
Grande quantité de matière inorganique est nécessaire à ces bactéries pour se développer
(impact écologique).
« Nitrification »
(Phase sombre)
a) Photoautotrophes
Cyanobactéries :
Les atomes d’H de l’H2O servent à réduire le CO2 Production d’oxygène
(aérobie) = Photosynthèse oxygénique.
Localisation du système photosynthétique (PSI et PSII)
- Structures spécialisées.
Bactéries vertes sulfureuses (ou bactéries vertes sulfo-reductrices) et bactéries
pourpres sulfureuses (ou bactéries vertes sulfo-réductrices) :
Bactéries incapables d’utiliser H2O pour réduire le CO2 pas de production
d’oxygène (anaérobie) = photosynthèse anoxygénique.
Utilisent S, H2, ou H2S pour réduire le CO2 et oxydation en SO42-, H2O.
Bactéries pourpres et vertes ???
b) Photohétérotrophes
- Flore microbienne
- Bactéries pathogènes
Microflore normale :
- Le mutualisme : sorte de symbiose à l’echelle humaine, association bénéfique pour
les deux partenaires. (Ex : bactéries du côlon qui apportent des vitamines essentielles
au métabolisme cellulaire. Les nutriments de l’homme aideront à la croissance des
bactéries.)
- Le commensalisme : association dans laquelle un seul des deux organismes tire un
bénéfice. (Ex : dans la bouche on a des bactéries non pathogènes qui tirent un bénéfice
grâce aux nutriments.)
- L’opportunisme : bactéries de la microflore normale qui se retrouvent dans un
compartiment normalement stérile, ou que l’hôte modifie sa réactivité et devient
immunodéprimé, et qui deviennent pathogènes.
Un adulte contient 1014 bactéries par 1013 cellules somatiques. Donc on a presque autant de
cellules que de bactéries dans notre corps.
- Peau : 106 bactéries/cm² (zone humide comme les aisselles, les pieds, les cheveux).
ex : Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium, Micrococcus, Acinetobacter,
Bacillus.
Ces bactéries se nourissent des nutriments contenus dans la sueur sécrétée par les
glandes sudoripares, des composés lipidiques sécrétés par les glandes sébacées.
- Appareil digestif : 10 bact./ml dans l’estomac. On n’y trouve que des bactéries qui se
développent à pH acide : Lactobacille, Candida albicans, Helicobacter pylori
(pathogène).
1011 bact./g de matière dans le colon. On y trouve surtout des bactéries
G+ : Duodenum, Jejunum, Ileum.
Lactobacille.
Bactéries aérobies : Bifidobacterium, Lactobacille, Escherichia coli, Clostridium.
Ce sont ces bactéries, dans le colon, qui synthétisent les vitamines nécessaires à
l’hôte : Vitamine B12, riboflavine, biotine, Vitamine K.
30% de la matière fécale excrétée par jour est composée de microorganismes.
- Appareil urogénital : Vessie, rein, et urètre doivent être stériles. La partie inférieure
est colonisée par des bactéries. L’appareil de la femme est plus complexe : evolution
de la flore en fonction du cycle menstruel. Notament au niveau du vagin : levures
(candida albicans, des bactéries qui reistent à un pH acide, et des germes qui produire
de l’acide lactique pour maintenir le pH ambiant à 4,5.
Dans les conditions normales, les barrières constituées par la peau, les muqueuses, sont quasi-
infranchissables par les microorganismes. Un moyen naturel de rejeter les microorganismes :
- Le lysozyme est une enzyme presente dans les larmes, la salive, les secretions nasales
et le sang.
Il y a une porte d’entrée pour les microorganismes due à l’ateration des tissus, lors d’une
coupure/piqûre. Dans ces cas là une réaction inflammatoire se met en place : dilatation
immediate des capillaires, irigation de la zone lésée activation au niveau de la paroi des
capillaires qui entraîne la synthèse de sélectine par chimiotachisme, des cellules
phagocytaires seront recrutée sur le site inflammé.
Symptômes : rougeurs, douleurs, voire augmentation locale de la température.
- porte d’entrée
- fixation du pathogène
- multiplication du pathogène
- production de toxines
Pathologie de la maladie.
1) Adhésion
Parfois, une fois que la contact a eu lieu, une deuxième étape se passe : on a pénétration dans
les épithéliums, ce sont des bactéries intracellulaires invasives. Parfois on a transport vers
d’autres organes (listeriose, salmonellose, shigellose, méningite, ...).
Ex : Listeria monocytogenes : Entrée dans la cellule par une vacuole qu’elle lyse,
multiplication intracellulaire, mouvement intracellulaire par poussée des bactéries dans un
certain sens, passage de cellule en cellule, puis lyse de la vacuole à 2 membranes.
S’il n’y a pas d’adhesion, ce sont des bactéries non invasives qui exercent leur toxicité à
l’extérieur de la cellule hôte. (coqueluche, diphtérie, choléra, ulcère, ...).
Ex : Helicobacter pylori (ulcères de l’estomac). Elle resiste au pH acide et produit une uréase
qui neutralisera localement le pH et degradera le mucus protégeant les cellules du
l’epithélium.
La multiplication de l’agent pathogène se fait lorsque les défenses de l’hôte vont être
débordées. Il faut éliminer le maximum de corps étrangers avant que la multiplication ait lieu.
Parmi les enzymes produites par le pathogène pour la destruction des cellules de l’hôte :
- Collagènase
- Elastase
- Hyaluronidase
- Lécithinase
Perforation de la cellule hôte
IV – Les toxines
1) Les endotoxines
- Partie lipide A du LPS : toxique à haute dose, peu spécifique d’ un site, thermostable, peu
immunogène. Chez les G-. Quand le lipide A va être libéré dans le milieu, l’effet toxique se
fera sentir.
Mode d’action :
- Altération de l’épithélium endothélial des vaisseaux sanguins :
Interleukine 1 (IL-1)
Facteur de coagulation de Hegaman
Entraine thrombose (obturation des vaisseaux sanguins) et fibrinolyse. Coagulation
généralisée du système vasculaire qui entraine un risque d’hemoragie de tous les organes. La
pression arterielle va chuter, detresse respiratoire, perte de conscience, chute de la pression
sanguine puis mort.
2) Les exotoxines
3) Toxines et fièvre ?
- entérotoxine
- neurotoxine
- cytotoxine
- toxine pyrogénique