La parasitologie médicale

Un parasite est un être vivant qui vit aux dépens d’un hôte (ici, l’homme) et qui peut lui causer des
dommages.
On distingue :
Les ectoparasites Les endoparasites

Vivent à l’extérieur du corps (peau, nez, Vivent à l’intérieur du corps (cavités

bouche, oreilles) profondes, sang, tissus)

Infestations Infections

Protozoaires Helminthes (vers) Arthropodes

Unicellulaire, doués de Métazoaires Insectes, acariens

mouvement responsables de la gale
Ex : nématodes (vers ronds,
Ex : Toxoplasma Plasmodium oxyure, ascaris, vers plat : Mollusques et annélides
taenia, douve, schistosoma) (métazoaire pluricellulaires et
Leishmania Trichomonas…
possédant des tissus
différenciés)

1.1 Diagnostic d’orientation :

Anamnèse : récit des antécédents +
interrogatoire du malade : voyage en
Principaux signaux cliniques Imagerie
zone tropicale, mode de vie,
alimentation, animaux domestiques

1.2 Diagnostic parasitologique

Diagnostic direct Diagnostic indirect (ou immunologique)

Mise en évidence du parasite sous ses Détection d’anticorps humoraux ou

différentes formes (adultes, larves, œufs, cellulaire + antigène circulants
kystes, levures ou filaments) nécessite la
connaissance de son cycle, par un examen
macro et ou microscopique

1.3 Les types de prélèvements

a) Le sang
1
Examen direct : examiner directement à frais + anticoagulant (en fonction du parasite, EDTA, ou
héparine)
Placer une petite goutte de sang entre lame et lamelle, ) observer avant qu’ils ne meurent  10 à 15
min après la préparation de l’étalement.
Frottis sanguin : La pureté absolue des lames porte-objets est essentielle à la confection d’un bon
frottis. Une petite goutte de sang est déposée à l’extrémité d’une lame porte-objet.
Etalement par capillarité. (c’est comme en hématologie)
Immédiatement après confection du frottis agiter la lame pour la faire sécher rapidement. Ceci évite
la déformation des globules rouges et la rétraction des microfilaires car l’attitude (tortillée ou
enroulée) prise par celles-ci est des éléments diagnostics.
Coloration au GIEMSA :
Fixation à l’alcool
Coloration au Giemsa 3.5% 20-30’
Egouttage + 2 rinçages à l’eau courage (jet de robinet ou bac d’eau)
Observation à l’immersion 100x
Goutte épaisse : consiste à examiner quelques µl de sang après hémolyse des globules rouges et
coloration selon la méthode de Giemsa

Piquer à l’annulaire sur le côté de la pulpe du doigt. Placer

une goutte de sang sur une lame porte objet.
Défibriner immédiatement par un mouvement en spirale fait à
l’aide du coin d’une autre lame (20 à 30 secondes pour
l’agglutination des thrombocytes  étalement du sang sur une
surface de 1 à 2 cm de diamètre.
! l’étalement doit être d’une épaisseur telle qu’il est possible
de voir des caractères d’un journal à travers.

Laisser sécher :
Sans chauffage pour éviter la fixation des hématies (qui empêcherait leur destruction)
Horizontalement dans un endroit à l’abri des insectes
La goutte épaisse ne peut être colorée que lorsque celle-ci est complètement sèche (environ une
nuit mais ne pas dépasser 24-48 heures de séchage)
 Couvrir
complètement la
préparation de
Giemsa dilué à 3.5
% dans de l’eau
tamponnée à pH
7.2 pendant 20 à
30 minutes
Rôle de Giemsa dans la goutte épaisse :
Double action : hémolyse et coloration
Pas de fixation préalables  les globules rouges éclatent et la couche épaisse de sang devient
transparente. Seuls restent sur la lame les leucocytes (au moins les noyaux) et les parasites
éventuels. Les plaquettes sanguines sont parfois bien visibles et forment de petits amas.
2
 Risque d’auto-fixation si lame non colorée gardée + de 48 h :
Réaliser une hémolyse avant coloration avec du tampon Ph 7.2 pendant 15 minytes
Egoutter ensuite et colorer
Lame combinée : combine les deux techniques précédentes
1) Tout d’abord on dépose une petite et une grosse goutte de sang frais sur la lame porte objet.
2) On prépare d’abord le frottis avec la petite goutte et puis on étale la goutte épaisse en défibrinant.
b) Les selles
Mise en évidence des helminthes et des protozoaires + donne le diagnostic de certitude d’un grand
nombre de parasitose qui quittent leur hôte dans les selles
1. Prélèvement : éviter le contact entre l’urine et les selles (altération des formes végétatives des
protozoaires). Avant la mise en route d’un traitement spécifique
3 jours avant le prélèvement :
 Pas de purgation, ni laxatifs huileux
 Régime pauvre en légumes, féculents et fruits
 Eviter la consommation de foies et de pâtés
 Arrêt de médications telles que le bismuth, charbon de bois, mucilage, levures, suppositoires
qui surchargent les préparations et gênent l’examen microscopique
 Les selles ne peuvent pas être recueillis (ou conservées) sur du matériel absorbant pour éviter
la dessiccation. Recueil dans les petits pots en plastique à large ouverture
Conservation :
 De préférence au réfrigérateur à +4°C si examen réalisé en différé.
 Recommandé d’ajouter un produit bloquant les fermentations sans trop altérer les éléments
parasitaires (formol, merthiolate et merthiolate iode formol MIF ou alcool polyvinylique  surtout
pour les kystes de protozoaires et les œufs d’helminthes
 Dès l’arrivée de l’échantillon au laboratoire
But à déterminer :
 La consistance (selles moulées, molles, diarrhéiques, aqueuses, dysentériques)
 La présence éventuelle de sang et de glaires
 La présence de segments de vers ou de vers adultes
2. Examen microscopique
 Se fait soit à l’examen direct et à l’examen du culot d’enrichissement. Permet de voir
(échantillon observé dans la demi-heure) : les formes végétatives d’amibes et de flagellés (mobilité)
 Les larves vivantes d’anguillule et les kystes de protozoaires et œufs d’helminthes
 Avec et/ ou sans coloration

Selles liquides Selles de consistance normal

On place une goutte sur une lame porte objet. Mise en suspensions sur la lame porte objet
Le tout est recouvert d’une lamelle couvre-objet dans un goutte d’eau physiologique pour former
un mélange homogène. Le tout est recouvert
d’une lamelle (observation par ligne)
Lugol : permet de repérer plus facilement les kystes des protozoaires. Dans une solution
iodée, le cytoplasme des kystes se colore en jaune ou en brun clair et les noyaux en brun foncé.

3
 Coloration MIF (merthiolate iode formol) : conserve les kystes de protozoaires colorés par
l’iode tandis que les autres constituants des selles sont colorés par l’éosine du merthiolate.
Pour les formes végétatives, les différents éléments du noyau sont brun-noir, les cytoplasmes
apparaissent en rose plus ou moins foncé, les vacuoles digestives sont claires et les inclusions sont
brunes plus ou moins foncées.
Pour les kystes : le cytoplasme est clair sur fond rose et semble verdâtre en opposition, le
noyau est en général déjà coloré par l’iode et les vacuoles sont brun foncé.
Certains œufs sont difficilement identifiables à frais  nécessite une technique de coloration =
Coloration de Ziehl-Neelsen modifiée
2.1 Techniques de concentration des selles
Technique utilisée pour concentrer les parasites, trop rares pour être décelés à l’examen direct et
permet aussi de séparer les éléments parasitaires des selles des multiples autres constituants. On
peut distinguer deux groupes de techniques de concentrations.
Technique de sédimentation Technique de flottaison

Les selles sont diluées dans un liquide de densité
inférieur aux éléments parasitaires ⇒parasites se
concentrent dans le culot.
Les selles sont diluées dans un liquide dont la
densité est supérieure à celle des éléments
parasitaires qui se contreront en surface (les œufs
de trématodes, de poids élevé, ne seront pas
retrouvés par cette méthode)

Méthode diphasique de Ritchie = Technique de concentration par sédimentation

 Selles diluées en eau physiologique (faible densité)
 Résidus fécaux dissous dans l’éther
 Parasites entraînés dans le fond par centrifugation
 Permet de concentrer tous les types d’œufs de vers, les larves et les kystes de protozoaires
2.2 Lavage des selles
1) Prélever une quantité de selles assez grande (5 à 10 g) en plusieurs endroits (parasites
irrégulièrement répartis dans le bol fécal)
 Utiliser en spatule en bois pour les selles consistantes et une cuillère pour les selles liquides
 Déposer dans un récipient de taille suffisante, par exemple un pot de 500 ml
2) Mettre en suspension les selles dans environ 20 ml d’eau physiologique de manière progressive
et en mélangeant délicatement afin de fluidifier la préparation
3) Faire passer la dilution de selles au travers d’un tamis métallique (style passoire à thé du
commerce) dans un récipient à large ouverture
 Rincer le tamis au-dessus du récipient avec le restant d’eau physiologique gardé en réserve
(entraîner les éléments parasitaires retenus dans les mailles)
 Les tamis sont rincés sous jet d’eau du robinet ou dans un port avec désinfectant, puis séchés
au four Pasteur
 S’il reste des débris dans les mailles, ils peuvent être flambés au bec bunsen
4) Transférer immédiatement la suspension de selles tamisée en tube à centrifuger à fond conique,
gradué et fermé hermétiquement (pas en polyéthylène)
Pour éliminer les résidus lourds (facultatifs) :
A) Recueillir le liquide tamisé dans un verre à pied

4
 B) Laisser reposer une minute environ
C) Et récupérer le surnageant dans un tube à centrifuger graduer à fond conique.
5) Centrifuger à 1500-2000 rpm pendant 5 minutes
6) Jeter le surnageant
7) Ajouter de l’eau physiologique au culot, agiter fortement (bouchon) et faire décoller le culot
8) Centrifuger à nouveau
 Répéter deux fois l’opération
 Après avoir éliminé le dernier surnageant
9) Ajouter environ 9 ml d’eau physiologique formolée à 10 % + agiter fortement le tube
10) Ajouter 3 ml d’éther (ou essence ou acétate d’éthyl), ajouter facultativement 2 gouttes de xylol
11) Boucher hermétiquement le tube et agiter vigoureusement durant 1 minute
12) Centrifuger à 1500 rpm durant 2 minutes : Nous obtenons 4 phases
 Ether et graisses
 Débris
 Eau physiologique (formolée)
 Culot de sédimentation contenant les parasites éventuels.
13) Détacher la couche collante (gâteau) avec un bâtonnet en bois + décanter le contenu liquide en
retournant complètement le tube pot à bleach
14) Nettoyer la paroi du tube à l’aide d’un coton et une pince fine
16) Remettre le culot en suspension dans 1 ml d’eau physiologique formolée
17) Prélever le culot de centrifugation avec une pipette et recouvrir d’une lamelle 20 mm x 20 mm
Observation systématiquement au microscope à l’objectif 10 x puis 40 x
2.3 Technique d’analyse
Examen systématique d’une préparation : la recherche des œufs et des larves d’helminthes (et des
formes végétatives des ciliés) se fait à l’objectif 10 x d’un examen à frais. La totalité de la préparation
est systématiquement examinée.
Un examen systématique se fait en regardant une préparation champ après champ, puis bande, sans
laisser d’espace entre les champs ou les bandes.

2.4 Calibration
 Le dénombrement microscopique des parasites sera transformé en parasitémie = le nombre
de parasite par µl ou ml de sang
 Mais celui-ci demande une calibration des échantillons :
 Frottis mince : nombre moyen d’hématies par champs (objectif 100x) afin d’établir le %
d’hématies parasitées.
 Compter sur ¼ de champ puis multiplier par 4 et faire une moyenne sur un minimum de 3
champs non contigus.
 Goutte épaisse : nombre moyen de leucocytes par champ (objectif 100x) afin d’établir le
nombre de champs à comptabiliser pour atteindre 200 leucocytes
 Sur autant de champs que nécessaire pour atteindre 200 leucocytes (quantifier le nombre de
champs)
2.4.1 Numération des protozoaires intra-érythrocytaires en frottis mince

5
  Compter le nomre de globules rouges par ¼ champs et multiplier par 4 (faire me calcul sur 3-
10 pour avoir une moyenne) = calibration
 Compter le nombre moyen d’hématies parasitées par champs + faire le quotient du
 Nombre moyen d’hématies parasitées par champs / nombre moyen d’hématies par champs
 Nombre de parasites par µl de sang (si la numération leucocytaire du patient n’est pas
disponible, l’OMS recommande d’utiliser la moyenne de 5 000 000 érythrocytes par µl de sang
 Remarque : pour les helminthes, compter le nombre de parasite sur toute la préparation via
un examen systématique
2.4.2 Numération des protozoaires en goutte épaisse
Compter le nombre de parasite sur autant de champs qu’il faut afin d’atteindre 200 leucocytes
(nombre de champs = calibration)
Faire le quotient :(Nombre de parasite / nombre de leucocytes comptés) x Numération leucocytaire
Nombre de parasite par µl de sang.
Si la numération leucocytaire du patient n’est pas disponible, l’OMS recommande d’utiliser la
moyenne de 8000 leucocytes par µl de sang
Remarque : pour les helminthes, compter le nombre de parasites sur toute la préparation via un
examen systématique.
2.5 Les mesures au microscope – coefficient micrométrique
Principe : il est possible d’avoir une première estimation de la taille d’un parasite par comparaison
avec un élément de taille connue (les plus souvent globules rouges)
Il est possible d’avoir une estimation de la taille par comparaison avec le diamètre du champ
microscopique observé
En divisant le champ de vision des oculaires par le grossissement des objectifs, on obtient le vrai
diamètre du champ microscopique observé.
Le diamètre (mm) du champ observé :

I n d i c e d e c h a m p(c h a m p d e v i s i o n)
G r o s s i s s e m e n t o b j e c t i f x f a c t e u r d u t u b e ( ¿ 1)

Champ de vision = cercle que l’on

Oculaires Objectifs Diamètre du champ microscopique observé
voit
10 x 18L 4x 4.5 mm

10 x 18L 10X 1.8 mm

10 x 18L 40X 4.5 mm

10 x 18L 100 x 0.18 mm

2.5.1 Coefficient micrométrique

 Pour mesurer avec précision des éléments qui se trouvent dans un champ microscopique, il
est nécessaire que l’oculaire possèdent une échelle de mesure (micromètre oculaire)
 Un micromètre oculaire est un oculaire muni d’une lentille portant gravé une échelle, les plus
souvent divisée en 100 graduations.

6
 En observant par cet oculaire on observe simultanément dans l’oculaire l’image de l’objet et la
graduation de l’échelle. On peut donc indiquer immédiatement la grandeur relative d’un objet
microscopique en unités de l’échelle
 Toutefois cette mesure ne dit rien sur la dimension réelle de l’objet + ces graduations auront
une valeur différente selon le grossissement de l’objectif du microscope
 Le microscope oculaire doit donc être calibré pour chaque objectif de chaque microscope
 La calibration consiste à donner une valeur en µm pour chaque graduation et pour chaque
objectif par comparaison avec une mesure de référence. Cette valeur porte le nom de coefficient
micrométrique (ou valeur micrométrique)
 La calibration consiste à donner une valeur en µm pour chaque graduation et pour chaque
objectif par comparaison avec une mesure de référence. Cette valeur porte le nom de coefficient
micrométrique (ou valeur micrométrique)
 L’échelle (graduation) de l’oculaire reste identique quand on change le grossissement (quand
on passe de l’objectif 10x à l’objectif 40x par ex)
 Impossible de mesurer la cellule/ objet
 Il faut une référence pour attribuer une valeur à cette échelle.
 Pour donner une valeur aux graduations de l’oculaire, nous utilisons en laboratoire une lame
graduée appelée lame micrométrique. La graduation de la lame micrométrique est de 1 mm ou 2 mm
au total.
 Contrairement à la graduation de l’oculaire, la graduation de la lame micrométrique va
s’agrandir en augmentant le grossissement de l’objectif
 Pour donner une valeur aux graduations de l’oculaire, il faut leur faire correspondre les
graduations de la lame micrométrique (graduations numérotées)
 De cette façon, on peut attribuer une valeur à chaque graduation de l’oculaire
 L’échelle totale de la lame micrométrique étant de 100 graduations pour 1 mm (1000 µm)

Comment faire ?
1. Remplacer un oculaire usuel (droit ou gauche selon le meilleur œil, mais toujours le même par la
suite) par l’oculaire portant le micromètre
2. Placer sur la platine un micromètre-objet et faire la mise au point sur l’échelle
3. Amener les deux échelles (oculaires et objet) au centre du champ, en parallélisme rigoureux et en
faisant coïncider les zéros
4. Trouver une concordance entre graduation du micromètre-oculaire et du micromètre-objet, en
commençant avec l’objectif le plus faible. La plus grande précision est obtenue en choisissant le plus
grand nombre possible de graduations sur l’échelle oculaire.
5. Compter alors le nombre de graduations de l’échelle oculaire nécessaire pour qu’il y ait
coïncidence avec celles du micromètre-objet, lequel nous donnera la valeur en mm

7
6. Un calcul simple permet alors de retrouver le coefficient micrométrique, soit la longueur exprimée
en microns d’une graduation du micromètre oculaire pour un objectif donné.
3. Constituants des selles (faux parasites)
 Le diagnostic microscopique des éléments parasitaires de selles est souvent difficile :
 Ressemblance entre eux des kystes de protozoaires ou œufs d’helminthes
 Présence dans les selles de très nombreux éléments divers leur ressemblant = les pseudo-parasites
 La bonne connaissance de ces pseudo-parasites est importante car elle permet d’éviter des
erreurs de diagnostic à l’origine de traitements inutiles et retardant la découverte de la véritable
étiologie.
3.1 Pseudo-parasites
Difficulté du diagnostic différentiel avec les vrais éléments parasitaires :
 La taille peut être voisine de celle d’un parasite (importance du micromètre oculaire)
 La forme peut être régulière, arrondie, ovalaire, semblable à celle des œufs ou des kystes
 La coque peut être mince semblable à celle cdx kystes ou épaisse comme celle de certains
œufs
 Mais la structure interne est presque toujours différente de celle des éléments parasitaires.
Les matières fécales humaines sont constituées principalement :
 Résidus normalement digestibles à l’alimentation
 Les fibres musculaires bien ou mal attaquées
 Les lipides, gouttelettes de graisses neutres et cristaux d’acide gras, etc.
 De nombreuses bactéries
 D’éléments non digérés (surtout d’origine cellulosique)
 D’autres éléments non digérés plus difficiles à différencier des vrais parasites
(pseudoparasites)
 Des éléments pathologiques tels que le sang, pus

3.2 Origine des faux parasites

Les débris d’aliments digérés ou mal digérés. Les pollens inhalés ou ingérés, variables selon les
circonstances saisonnières ou géographiques. Les spores des champignons comestibles (mais aussi
des mycoses parasites des végétaux de notre alimentation)
Fibres conjonctives : Elles proviennent de la viande, en particulier lorsque celle-ci est consommée
crue, comme par exemple les nombreux jambons séchés ou fumés. Ce sont des filaments réunis en
faisceau, ramifiés, entrecroisées, contenant souvent des débris de fibres musculaires. De grande
taille, elles peuvent être vues à l’œil nu, lors de l’examen macroscopique de la selle. Elles ne posent
pas de problèmes de diagnostic différentiel avec les éléments parasitaires, mais ont un intérêt dans le
cas de l’étude de la digestion (insuffisance gastrique)
Bulles d’air : Bulles d’air et globules de graisse se situent à la surface des préparations
microscopiques, juste en dessous de la lamelle et la mise au point du microscope est donc

8
habituellement différente de celle faite pour les éléments parasitaires, qui eux ont, au contraire,
sédimenté.
Graisses neutres Bulles d’air

Paroi très fine, transparente Paroi épaisse noire, visible

Cristaux acides gras : Ce sont des aiguilles fines, de longueur variable, à bords parfois dentés, ils sont
souvent réunis en amas de cristaux.
4. Les techniques d’identification
L’identification d’un micro-organisme consiste à
Lui rechercher de Un certain nombre de De comparer les résultats
manière hiérarchisée caractères (marqueurs aux caractères des souches
phénotypiques et/ou décrites des homologies ou Nommer la souche
génomiques) des similitudes

4.1 De quoi a-t-on besoin pour identifier un micro-organisme ?

a) Une base de données, dans laquelle se trouvent répertoriées tous si possible les micro-organismes
existants
Le nom complet de la souche
La description de ses caractères morphologiques, structuraux, biochimiques, physiologiques,
antigéniques, etc.
Les systèmes d’identifications compatibles à utiliser
b) Des techniques d’identification correspondant à chaque classe de base de données.
4.2 La taxonomie / Définitions
La taxonomie est la science des lois de la classification des formes vivantes
Classification : arrangement ordonné selon certains critères qui peuvent varier selon le but poursuivi
Le classement qui résulte de l’étude de caractères phénotypiques et génomiques aboutissent à
l’élaboration de taxons
Les taxons sont des groupes naturels de similitude reconnus par le code international de
nomenclature de l’ONU (et groupes constitués par l’usage, n’ayant pas de reconnaissance officielle
mais utilisés et admis pour la facilité sur le plan pratique
Espèce microbienne  unité taxonomique de base
 « Sont rassemblés dans la même espèce les micro-organismes qui ont le plus d’affinité
génétique, c’est-à-dire les souches qui sont supposées descendre d’un ancêtre commun. »
 Une espèce microbienne donnée rassemble des souches pour lesquelles il existe une
similitude entre un très grand nombre de caractères, mais non entre tous, en raison des lois de
l’évolution et du rôle de la sélection qui diffèrent vis-à-vis des divers mutants issus d’une même
cellule parentale.
Toute espèce renferme :
Souche médiane qui est considérée comme typique de l’espèce, ou souche-type.
Souches excentriques qui s’écartent plus ou moins de cette souche médiane.
Pour décrire ces souches excentriques sur base de leurs différences de nature métabolique
(biochimique), antigénique ou de virulence, on parle de :
Biotypes, biovariants, biovars Sérotypes, sérovars, sérogroupes Biosérovars

9
 Pathotypes, pathovars Chimiotypes
4.3 Taxons d’ordre supérieur
 Les espèces qui ont en commun un certain nombre de caractères sont rangées dans un même
genre. Les genres apparentés dans un même famille et ainsi de suite en remontant vers les groupes
taxonomiques de rangs supérieurs.
 Marqueurs taxonomiques : Pour identifier des souches inconnues : rechercher un certain
nombre de marqueurs (phénotypiques, génomiques) qui caractérisent les souches et permettent
d’affirmer leur identité ou leur dissemblance.
 Les marqueurs phénotypiques sont les plus accessibles et les plus utilisés pour identifier les
souches (définies par des identités génomiques, techniques de biologie moléculaire)
 Il pourra exister une différence
Analyse macroscopique :
1. La forme :

2. Le relief :

3. Le contour :

4. La surface :
 R (rough-rugeux)  M (mucous – muqueuse)
 S (smooth-lisse)
5. La taille : mm
6. L’opacité :
 Opaques  Opalescentes
 Translucides
7. La couleur : gamme blanc, gris, beige
Analyse microscopique :
1. Forme :
 Coque (rond)  Bacille (bâtonnets)

10
2. Groupement :

Coque diplocoque coque encapsulé staphylococcus

Coccobacille bacille

Diplobacille palisade

Streptobacille
Streptococcus sarcina tétrade amas

3. A quoi sert l’examen a frais :

 Morphologie  Capsule ou non
 Mobilité  C’est fait avec de l’eau et sans fixation
4. A quoi sert l’examen à l’encre de chine :
 Mis en évidence de la présence ou non de capsule
 Déposer une goutte d’eau, y mettre des bactéries et ensuite mettre à côté une petite goutte
d’encre de chine 40% et le contraste de phase
Test d’orientation :
1. Coloration de Gram :
Goutte d’eau + bactérie ⇒ faire sécher
Fixation : Mettre de l’alcool ⇒ faire sécher
Coloration : Mettre du cristal violet 1 minute ⇒ rincer
Mordançage : Mettre du lugol 30 sec à 1 minute ⇒ rincer
Décoloration : Mettre de l’alcool ⇒ rincer (étape 2 fois)
Contre- coloration : Mettre de la safrine 1 minute ⇒ rincer
Faire sécher
Si le gram est mauve ou bleu c’est un BGP ou un CGP
Si le gram est rose c’est un BGN ou un CGN
2. Oxydase :
A l’aide d’une pipette Pasteur bouché prélevée aseptiquement est écrasée sur un support
(papier filtre) imprégné du réactif
Une coloration rose-pourpre violette endéans la minute indique une réaction positive ⇒ c’est
que ce sont des BGN ou CGN
L’absence de cette pigmentation indique une réaction négative
3. Catalase :
Déposer une goutte de perhydrol (= H2O2 diluée à 1/3) sur une lame de verre
Prélever à l’aide de la pointe d’une pipette pasteur bouchée préalablement stérilisée et
refroidie, une ou plusieurs colonies
Poser la pipette avec la colonie dans la goutte de perhydrol et observer le dégagement de
bulles ⇒ BGP ou CGP
Si pas de bulles réaction négative
4. Voie d’attaque du glucose : Etude des hydrates de carbone en milieu O/F
11
 Inoculation
Par quelques gouttes de suspension bactérienne en eau physiologique
Piqûre centre avec une pipette pasteur ouverte (arrêter à 1 cm du fond) de 2 tubes
Recouvrir l’un des 2 tubes d’huile de paraffine (F)
Lectures des résultats
Si dans le tube O il y a du jaune c’est que les bactéries sont oxydatives
Si dans le tube O il y a du bleu c’est un que les bactéries sont inertes au glucose
Si dans les 2 tube il y a du jaune c’est que les bactéries sont fermentatives

Niveau de confinement et classement des agents infectieux :

1. Groupe 1 :
 Comprend les agents biologiques non susceptibles de provoquer une maladie chez l’homme
 Les laboratoires de base.
 De simples paillasses, le respect de bonnes pratiques de laboratoire se traduisant par l’emploi
des techniques rigoureuses de la microbiologie et de matériel de confinement primaire pour les
techniques générant des aérosols suffisent à manipuler ces germes dans les conditions les plus sures
2. Groupe 2 :
 Comprend les agents biologiques pouvant provoquer une maladie chez l’homme et constituer
un danger pour les travailleurs ; leur propagation dans la collectivité est peu probable ; il existe
généralement une prophylaxie ou un traitement efficace
 Les agents biologiques de niveau 2 peuvent être séparés en 2 :
 Manipulés en BL1 avec précautions particulières et isolement du laboratoire
 Manipulés dans des locaux de sécurité de niveaux 2 :
 PSM  Pression négative dans la pièce
 Surblouse  1 sas d’entrée/sortie identique
3. Groupe 3 :
 Comprend les agents biologiques pouvant provoquer une maladie grave chez l’homme et
constituer un danger sérieux pour les travailleurs
 Leur propagation dans la collectivité est possible, mais il existe généralement une prophylaxie
ou un traitement efficace
 Niveau 3 :
 PSM  Lunettes
 2 SAS d’entrée  Déchets solide et liquide inactivés pendant
 Pièce en pression négative 24h sous PSM
 2 SAS de sortie  Autoclavage
 Surblouse  Organisation du plan de travail
 Surchaussures 2 paires de gants
4. Groupe 4 :
 Comprend les agents biologiques qui provoquent des maladies graves chez l’homme et
constituent un danger sérieux pour les travailleurs
 Risque de leur propagation dans la collectivité est élevé
 Il n’existe généralement ni prophylaxie ni traitement efficace
 Niveau 4 :

12
 Plusieurs SAS, cascade de dépression
 Travail sous hotte, appareil de destruction d’échantillons
 Combinaison renforcée, scaphandre, dispositifs à oxygène
Définition :
1. Désinfection : C’est un traitement qui détruit le potentiel infectieux du matériel traité. Il s’agit
le plus souvent de procédés chimiques ⇒ javel
2. Antisepsie : Correspond au phénomène de désinfection mais appliquée cette fois à un être,
tissu vivant. Il s’agit aussi de procédés chimiques ⇒ gel hydroalcoolique
3. Stérilisation : c’est un traitement par lequel on élimine du matériel traité tout micro-
organisme viable. Il s’agit de traitements létaux physiques ou chimiques ; Ce traitement tue les micro-
organismes mais ne les élimine pas du matériel ⇒ flambage/autoclavage
 Désinfection du plant de travail à la javel
 Le bec bunsen, il crée une aire stérile d’un diamètre d’environ 15-20 cm vers laquelle seront
dirigées les ouvertures des récipients pendant le temps de la manipulation
4. Outils d’inoculation : ensemencement ou inoculation : toute introduction volontaire et
contrôlée de micro-organisme dans un milieu de culture
5. Méthodes de stérilisation :
 Chaleur  Irradiations
 Filtration  Vapeurs bactéricides
6. Stérilisation par la chaleur :
 Chaleur sèche :
 Le processus de stérilisation à la chaleur sèche est accompli par conduction
 En effet, la chaleur est absorbée par la surface extérieure du dispositif que l’on veut stériliser
 Ensuite la chaleur diffuse dans la couche suivante
 Finalement, la totalité de l’élément atteint la bonne température nécessaire pour obtenir la
stérilisation
 La chaleur sèche détruit les micro-organismes en provoquant une coagulation des protéines
 Le dispositif doit être sec avant la stérilisation car l’eau pourrait interférer avec le processus
 Les outils :
 Four pasteur ou poupinel
 Tubes, erlens à faibles diamètre (tubes munis de bouchons à visser, engager le bouchon,
donner un tour mais ne serrer à fond qu’après la stérilisation)
 Récipient à large ouverture
 Technique de flambage avec le bec bunsen
 Chaleur humide :
 La stérilisation à la chaleur humide est affectée au moyen de vapeur saturé et sous pression
 Le matériel à stériliser sont placés sur des grilles ou dans des conteneurs perméables à la
vapeur puis exposé à l’action de la vapeur d’eau saturée et sous pression avec des paramètres
temps/ températures déterminés
 Les températures à atteindre sont, en principe, de 121°C pendant 20 minutes pour détruire les
bactéries et de 134°C pendant 18 minutes à une pression de 2,2 bars pour les prions
7. Autoclavage : c’est une enceinte qui permet d’amener la vapeur d’eau à une température
supérieur à 100° par augmentation de la pression, le chauffage se faisant à volume constant

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8. Transfert aseptique :
 Il s’agit de pouvoir :
 Ouvrir et refermer un récipient stérile
 Transférer un produit stérile ou non d’un récipient à un autre
 Tout en maintenant la stérilité/ asepsie du produit et des récipients
9. Prélèvement :
 Soit pour l’opération consistant à prendre un fragment de culture
 Soit pour du matériel ou liquide recueilli en vue d’examens de laboratoire
10. Ensemencement ou inoculation : toute introduction volontaire et contrôlée de micro-
organismes dans un milieu de culture
11. Repiquage : transfert d’une culture pure dans un milieu neuf, pour maintenir sa viabilité ou
pour en étudier les caractéristiques
12. Isolement : technique destinée à obtenir une culture pure à partir d’un échantillon contenant,
ou supposé tel, une population mixte de micro-organismes

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