TP1

Microbiologie environnementale
analyses de l’eau

Licence de Microbiologie

Module HAV620V
écologie microbienne

Responable Pr T. Vallaeys
contact tatiana.vallaeys@umontpellier.fr
Microbiologie Environnementale
• I-Microbiologie aquatique
– eau, eaux, Risques microbiologiques danger
et exposition
– Milieux de culture
– Mode opératoire
• II- Microbiologie de l’air
• III- Microbiologie des surfaces
 TP1
Microbiologie environnementale

L’EAU,
Master Biologie Agrosciences
IMHE Interactions Microorganismes Hôtes et
Environnements

Module HMBA 110 : écologie microbienne

Responable Pr T. Vallaeys
contact tvallaey@univ-montp2.fr
 I-Microbiologie des eaux
• Les germes à rechercher
dépendent de l’usage
– Eaux de boisson (eau de source, eau
traitée, embouteillée ou non)
– Eaux de baignade (mer, lac, piscine)
– Eaux d’ élevage (Pisciculture et
conchyliculture)
– Autres cas
 Voies de contamination des humains
à partir des matières fécales et des eaux usées

Mer Coquillages

Eaux de surface Cultures maraîchères

Eau de boisson

Humain

Matières fécales

Eaux usées
 Micro-organismes pathogènes transmis par l’eau

Bactéries
Porte d’entrée digestive
Enterobacteriaceae
Salmonella : salmonellose
Shigella : shigellose
E. coli enteropathogène
Yersinia enterolitica
Vibrionaceae
Vibrio cholerae : cholera
Vibrio parahaemolyticus : gastroentérites
Aeromonas : gastroentérites
Spirillacae
Campylobacter jejuni et coli : gastroentérites
 Vibrio cholerae: l’agent responsable du cholera
• Bactérie mobile (flagelle unique et polaire)
• Bactérie pathogène non invasive (production d’une toxine)
• Diarrhées déshydratantes/ vomissements
• Episodes locaux et Vagues d’épidémies (Asie du sud-est et Amérique latine)

Le Cycle du Cholera
Adhérence à la bordure en brosse
de l’épithélium intestinal
Principaux facteurs
de virulence
Adhérence et Multiplication • toxine cholérique
pénétration dans le mucus • pili=adhèrence
de l’intestin grêle

Passage à travers la barrière

gastrique
Diarrhea
Ingestion par voie orale d’eau ou
de nourriture contaminée Réservoirs
- habitat aquatique
-huîtres, crabes, etc.
-plancton
 Micro-organismes pathogènes transmis par l’eau

Bactéries
Porte d’entrée cutanéo-muqueuse
Aeromonas (infection de plaie)
Leptospira (hémorragies et jaunisse)
Mycobacterium
Staphylocoques
Voie respiratoire
Legionella (infection respiratoire)

Protozoaires
Giardia lamblia (gastroentérites)
Cryptosporidium
Acanthamoeba (encéphalite)
Naegleria fowleri (encéphalite)
 Micro-organismes pathogènes transmis par l’eau

Virus
Picornaviridae Enterovirus Virus poliomyélite, Virus coxsackie A et B,
Echovirus, Enterovirus 68 à 71, Virus Hépatite A
Reoviridae Reovirus Rotavirus
Caliciviridae Calicivirus Calicivirus humain, Virus de Norwalk,
Small round virus, Virus Hépatite E

?? Atrovirus Astrovirus humain

Coronaviridae Coronavirus Corinavirus humains
Toroviridae Corinavirus-like
Adenoviridae Mastadénovirus Adénovirus humains

Paralysie, Méningite, infection respiratoire, gastro-entérite, hépatites …

Voies de transmission des microorganismes dans l’environnement

Virus
On estime entre 105 et 108 le
nombre de particules virales/gr
de selle chez un individu atteint
d’une gastroentérite virale

Bactéries
1011 Bactéries/gr de selles (flore du tube
digestif = environ 400 espèces
différentes). Un individu atteint de
maladie infectieuse de type gastroentérite
peut liberer des microorganismes
pathogènes dans l’environnement (E. coli,
salmonelles, vibrio cholerae…).
Recherche dans l’eau de marqueurs de
contamination fécale.
Les problèmes de bactéries pathogènes et de
virus dans les boues d’épuration

Les traitements en station d’épuration

ne suffisent pas toujours à éliminer
tous les microorganismes pathogènes
 BACTERIES
1011 Bactéries/gr de selles (flore du tube
digestif >400 à 4000 espèces différentes).
Un individu atteint de maladie infectieuse de
type gastroentérite peut liberer des
microorganismes pathogènes dans
l’environnement (E. coli, salmonelles, vibrio
cholerae…). Recherche dans l’eau de
marqueurs de contamination fécale.
 Risque
=
Danger
+
Exposition
 Mise en évidence des bactéries et des virus dans un échantillon

A partir d’un échantillon liquide ou rendu liquide

Par culture : normes de contrôle

Par observation direct des cellules ou de bioindicateurs

Par biologie moléculaire (amplification génique) : quelques normes de contrôle

 Eaux de distribution
Limites de qualité Références de qualité
E. coli 0/100 mL
Entérocoques 0/100 mL
Bactéries coliformes 0/100 mL
Bactéries sulfito-réductrices y compris les spores 0/100 mL
Germes aérobies revivifiables à 22°C et 37°C Variation dans un
rapport de 10 / à la valeur habituelle

Eaux conditionnées en bouteilles

Limites de qualité
E. coli 0/250 mL
Entérocoques 0/250 mL
Pseudomonas aeruginosa 0/250 mL
Bactéries sulfito-réductrices y compris les spores 0/50 mL
Germes aérobies revivifiables à 22°C 100/ mL
Germes aérobies revivifiables à 37°C 20/ mL
 Indicateurs de pathogènes

Définition selon Stetler (1984)

L’indicateur doit :
-être présent quand les pathogènes sont présents, absent quand les pathogènes
sont absents

-Avoir des caractéristiques de croissance et de survie similaires dans les milieux où

il est recherché à ceux des pathogènes

-Doit se retrouver dans un rapport constant avec les pathogènes afin que
l’indicateur donne une bonne estimation du nombre de pathogènes

-Être présent en large excès par rapport à la concentration en pathogènes

-Doit être résistant aux effets des facteurs environnementaux et aux désinfectants
au même degré que les pathogènes

-Ne doit pas être pathogène

-Doit être facilement quantifiable dans tous les types d’eaux, le test ne devant pas
donner de réactions faussement positives
 Analyse microbiologique
Grande diversité de micro-organismes pathogènes plus ou moins difficiles à
identifier et à quantifier (méthodologies lourdes et complexes)

Utilisation d’organismes indicateurs de pollution

Bactéries témoins de contamination fécale
E. coli
Streptocoques fécaux
Quantification relativement simple (étalement, filtration, gélose ou milieu liquide )
Normes de potabilité, de baignade, …

Utilisation d’organismes indicateurs d’efficacité de traitement

Doivent être au moins résistants ou mieux plus résistants que les pathogènes
Clostridium sulfito-réducteurs (anaérobie, spores)
Bactériophages de E. coli (coliphages somatiques, coliphages ARN-F)
Microbiologie Environnementale
• I-Microbiologie aquatique
– eau, eaux, Risques microbiologiques danger
et exposition
– Milieux de culture
– Mode opératoire
• II- Microbiologie de l’air
• III- Microbiologie des surfaces
 TP1 mode opératoire: milieux
• Faire fondre au bain Marie et couler sous
hotte et faire bien sécher
– milieu GNO/ Nutrient Agar (flore totale)
– gelose Tergitol TTC (coliformes
totaux/fecaux)
– milieu de Slanetz (Streptocoques)
– Milieu de Chapman (Staphylocoques)
 TP1
Microbiologie environnementale
analyses de l’eau

Licence de Microbiologie

Module HAV620V
écologie microbienne

Responable Pr T. Vallaeys
contact tatiana.vallaeys@umontpellier.fr
 Gélose lactosée au TTC et au
Tergitol 7: coliformes

http://www.solabia.fr/solabia/produitsDiagnostic.nsf/0/
AB70B39EC7115FD1C12574C60045673C/$file/FT_BK123_BM093_147_v7.pdf
• Pollard, en 1946, avait démontré l'action bactéricide du Tergitol
7 sur les microorganismes à Gram positif,
• puis le milieu a été développé par Chapman qui fit des
numérations de coliformes environ 30% supérieures à celles
effectuées sur d'autres milieux sélectifs.
• La formule a ensuite été modifiée par l'auteur par incorporation
de TTC (chlorure de triphényltétrazolium) qui s'est révélé utile
pour la reconnaissance rapide d'Escherichia coli et
d'Enterobacter aerogenes. Ces microorganismes produisent
des colonies jaunes entourées d'un halo jaune, tandis que les
autres bactéries à Gram négatif (incluant Proteus et
Pseudomonas) donnent des colonies rouge foncé.
• PRINCIPES –
Le Tergitol 7 inhibe la croissance des microorganismes à Gram
positif, limite l'envahissement par les Proteus et favorise la
récupération des coliformes.
- Les coliformes présentent des colonies de coloration jaune ou
orangée, à l'intérieur d'un halo jaune visible sous la
membrane. Celui-ci est provoqué par l'acidification du lactose
en présence de l'indicateur coloré, le bleu de bromothymol.
- Les autres microorganismes présentent des colonies dont la
coloration rouge est due à la réduction du TTC en formazan
insoluble.
- Les germes qui ne fermentent pas le lactose présentent des
colonies entourées d'un halo bleu.
 Slanetz et Bartley:
Streptocoques
• La gélose de Slanetz et Bartley est un milieu sélectif utilisé pour le
dénombrement des entérocoques intestinaux dans les eaux
d’alimentation, les boissons, les eaux usées et divers produits
biologiques d’origine animale, par la technique de filtration sur
membrane.
• FORMULE - TYPE du milieu complet (pouvant être ajustée de façon
à obtenir des performances optimales)
Pour 1 litre de milieu : -
• Tryptose............................................................... ..20,0 g –
• Extrait autolytique de levure.............................. ..... ....5,0 g –
• Glucose.....................................................................................2,0 g –
• Phosphate dipotassique............................................. .....4,0 g –
• Azide de sodium ....................................................... .......0,4 g –
• Chlorure de 2, 3, 5 triphényltétrazolium .................................0,1 g –
• Agar agar bactériologique......................................................10,0 g
• pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,2 ± 0,2.
• Rappel….
- I-
Le genre Streptococcus
 Reclassification du genre
Streptococcus, en 1984

Enterococcus

Lactococcus
Streptococcus
Streptococcus sensus stricto
 Classification « médicale »
classique des Streptocoques
• Des cocci à gram positif
• Groupés ou disposés en chaînettes
• Métabolisme anaérobie-aérobie facultatif
• Présentant ou non une capsule
• Auxotrophies chez les pathogènes
• Sensibilité aux antibiotiques
• Production ou non de -hémolysine
 Test de l’activité hémolytique sur
milieu au sang (blood agar)
production

 peroxyde
 hemolysine
 - S. Pyogenes

Beta (clear)
hemolysin
The type of hemolytic reaction displayed on blood
agar has long been used to classify the
streptococci.
• Hemolysis type
– alpha-hemolysis is a partial or "green" hemolysis associated
with reduction of red cell hemoglobin.
– Beta -hemolysis is associated with complete lysis of red cells
surrounding the colony
– Nonhemolytic colonies have been termed gamma-hemolytic.

• The property of hemolysis is not very reliable for the

absolute identification of streptococci, but it is widely
used in rapid screens for identification of S. pyogenes
and S. pneumoniae
 La classification sérologique
de Rebecca C. Lancefield , 1933
• Le test cherche à mettre en évidence la présence ou non d’un antigène lié à un
polysaccharide de paroi spécifique de groupe de A à H et de K à V

• Relations entre classification des streptocoques selon leur caractères

hémolytiques et sérotypiques:
– Les groupes A, B, C ou G caractérisent les espèces de streptocoques -
hémolytiques les plus pathogènes.
– Les streptocoques - hémolytiques ou non hémolytiques appartiennent à d’autres
groupes ou sont « non-groupables» et sont habituellement commensaux
• Les streptocoques du groupe A sont presque toujours -hemolytiques.
• Les streptocoques du groupe B présentent une hémolyse de type alpha,
beta ou gamma.
• La plupart des souches de S. pneumoniae sont alpha hémolytiques mais
peuvent présenter une hémolyse de type beta lors d’une incubation en
conditions anaérobies.
• La plupart des streptocoques oraux et enterocoques sont non
hemolytiques.

Lancefield,RC, 1933. A serological differentiation of human and other groups of streptococci. J.

Exp. Med. 59: 571-595
Identification of the beta-hemolytic streptococci
• SLANETZ: HISTORIQUE
• détection des
• Streptocoques fécaux

• Le milieu a été formulé par Slanetz et al. afin de dénombrer les

entérocoques dans l’eau et les boissons par la technique de filtration sur
membrane.
• Une modification utilisant l’addition de TTC (chlorure de
triphényltétrazolium) au milieu permet d’obtenir de meilleurs comptages
lorsque les membranes sont placées directement à la surface de la gélose.
• La formule actuelle donne des résultats comparables à ceux obtenus par
la technique mise au point par Litsky, Mallmann et Fifield pour la détection
des streptocoques fécaux.
 SLANETZ: PRINCIPES
• - L’azide de sodium permet d’inhiber la croissance des
microorganismes à Gram négatif. - Le TTC est un
indicateur de la croissance bactérienne. Il est réduit en
formazan insoluble à l’intérieur de la cellule. Cette
réaction se manifeste par l’apparition de colonies de
couleur rouge à marron.
 Alternative la gélose BEA:
Entérocoques/streptocoques

• La gélose à la bile, à l’esculine et à l’azide de sodium

(BEA) est un milieu sélectif utilisé pour les isolement et
dénombrement des entérocoques dans les produits
alimentaires, les produits destinés à l’alimentation
animale, et les produits pharmaceutiques. Elle est
également utilisée pour le dénombrement des
entérocoques intestinaux dans les eaux.
 HISTORIQUE
Rochaix a le premier montré l’intérêt de l’hydrolyse de
l’esculine pour l’identification des entérocoques;
puis, Meyer et Schonfeld ont démontré que cette hydrolyse, dans
un milieu bilié, constituait un excellent test pour la mise en
évidence des streptocoques du groupe D.
Les premières formulations décrites par Swan ont été modifiées
par Isenberg qui a obtenu un milieu à la fois plus sélectif et en
même temps apte à favoriser une croissance rapide et une
bonne récupération des germes recherchés.
La formule actuelle est décrite dans la norme NF EN ISO 7899-
2 comme milieu de confirmation des entérocoques
intestinaux dans les eaux, lorsque le dénombrement est
effectué par la méthode de filtration sur membrane.
 Principe
• L'azide de sodium provoque
l’inhibition des bactéries
contaminantes à Gram négatif.
• La bile de bœuf empêche la
croissance des bactéries à Gram
positif.
• Les entérocoques hydrolysent
l'esculine en glucose et en
esculétine. Ce dernier composé
forme un complexe noir en
présence des ions ferriques
apportés par le citrate de fer.
FORMULE - TYPE (pouvant être ajustée de façon
à obtenir des performances optimales) Pour 1 litre
de milieu : -
• Tryptone................................................................17,00 g
• Peptone pepsique de viande ........ .3,00 g
• Extrait autolytique de levure .................... ..5,00 g
• Bile de bœuf bactériologique ........................... 10,00 g
• Chlorure de
sodium.....................................................................5,00 g
• Esculin...................................................................1,00 g
• Citrate ferrique ammoniacal....................................0,50 g
• Azide de sodium ..............................................0,15 g
• Agar agar bactériologique................................ 13,00 g
pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,1 ± 0,2.
Gelose de Chapman au Manitol:
Staphylocoques
• DOMAINE D’UTILISATION
• La gélose de Chapman au mannitol permet l’isolement
sélectif, la recherche et le dénombrement des
staphylocoques pathogènes dans le lait, les produits
carnés, les produits de la mer, les autres produits
alimentaires, les produits pharmaceutiques, les produits
cosmétiques et les prélèvements biologiques d’origine
animale.
• Elle est également employée au cours de l’examen
bactériologique des eaux filtrables telles que les eaux de
piscine, de consommation humaine ou encore
d’établissements de soins.
 Phylogenetic time trees of Staphylococcaceae and mammals
Bayesian MCMC analysis S. epidermidis ATCC 12228
using 31 orthologous sequences S. haemolyticus JCSC1435
S. lugdunensis HKU09-01
S. pasteuri SP1
S. warneri SG1
( S. saprophyticus ATCC 15305T )
( S. carnosus TM300 )

( S. pseudintermedius ED99 )

JCSC5402

from Hiramatsu et al., J. Infect. Chemother., 2014

 Les méthodes dichotomiques Gram négative

Stratégie d’identification des bactéries: Test de Gram

Gram négative
Cristal violet (30s) Lavage en éthanol 95%
Gram positive
Rinçage à l’eau ou acétone(10-30s)

Propriètés différentes des membranes

Gram positive

Test catalase: détection d’

un enzyme catalysant
2H2O2 2H2O + O2

Différenciation
Streptocoques/
Staphylocoques

Test coagulase: Détection de la la coagulase qui entraine la

coagulation du plasma sanguin
 Staphylocoques
• HISTORIQUE
• Les expériences de Koch ont montré que les
staphylocoques supportent les milieux
hypersalés à 7,5%.
• Chapman a confirmé ces premiers résultats en
observant que les staphylocoques coagulant le
plasma de lapin présentaient des colonies
jaunes sur le milieu auquel il a donné son
nom, alors que la plupart des autres bactéries
étaient inhibées.
• PRINCIPES - La forte concentration en chlorure de
sodium inhibe la croissance de la plupart des bactéries
autres que les staphylocoques. –
• La fermentation du mannitol, mise en évidence par le
virage au jaune de l’indicateur pH (rouge de phénol),
permet d’orienter le diagnostic.
• La mise en évidence des staphylocoques pathogènes
devra être confirmée par la recherche de la coagulase
et, éventuellement, de la désoxyribonucléase et de la
phosphatase.
 Chapman formule type
Staphylocoques
• Pour 1 litre de milieu : -
Trypton......................................................................5,0 g
• Peptone pepsique de viande ..................... ... 5,0 g
• Extrait de viande ......................................... 1,0
g
• Mannitol .............................................. 10,0
g
• Chlorure de sodium ....................................... 75,0 g
• Rouge de phénol .............................................. 25,0 mg
• Agar agar bactériologique............................... 15,0 g
pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,4 ± 0,2.
 Gelose GNO: flore totale
• PRINCIPES
Relativement simplifiée, la
formulation apporte les
éléments nutritifs
nécessaires à la croissance
d’une grande variété de
germes non exigeants.
• Base pour la re-purification
 GNO (ou LB)
formule type
• Historique Luria Bertani Broth and Agar
Microbiologie Environnementale
• I-Microbiologie aquatique
– eau, eaux, Risques microbiologiques danger
et exposition
– Milieux de culture
– Mode opératoire
• II- Microbiologie de l’air
• III- Microbiologie des surfaces
 TP1 Mode opératoire
coliformes
• réaliser 2 filtrations chacune à partir de
100 ml d’eau de « baignade »
• Bien rincer à l’eau du robinet puis
rapidement à l’eau (physiologique) stérile
(10ml) l’appareil de filtration entre 2
opérations
 TP1
Microbiologie environnementale
analyses de l’eau

Licence de Microbiologie

Module HAV620V
écologie microbienne

Responable Pr T. Vallaeys
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 TP1 mode opératoire:
mise en place stérilement de la
membrane sur le porte filtre

• Mettre le filtre en place

• puis brancher la pompe à vide
 TP1 mode opératoire: filtration
• Prélever dans une
éprouvette 100 ml
d’eau de rivière et
filtrer sur une
membrane à l’aide de
la pompe à vide,

• TRES FRAGILE!!!!
 COLIFORMES
• Placer la membrane sur une boite de
Petri contenant le milieu tergitol TTC
• Renouveler l’opération avec 100 ml d’eau
de riviere apres rinçage
• Incuber
– une boite à 37°C (coliformes totaux)

– Une boite à 44 °C (coliformes fécaux)

 STREPTOCOQUES D/
ENTEROCOQUES
• Renouveler l’opération
• Placer la membrane
• sur une boite de milieu de SLANETZ
(streptocoques fécaux)
• ou gelose BEA: enterocoques)
(face de contact de l’eau vers le haut!)
 Staphylocoques
• Renouveler l’opération
• Placer la membrane
• sur une boite de milieu de CHAPMAN
(streptocoques fécaux)
• ou gelose BEA: enterocoques)
(face de contact de l’eau vers le haut!)
 TP1 mode opératoire: flore
totale
Réaliser des suspensions dilutions de l’eau de
rivière dans de l’eau physiologique

Disposer des gouttes de 20 l des différentes

dilutions sur une boite GNO NE PAS ETALER
Bien laissé secher
Mettre au point de nouvelles
méthodes de detection de
pathogènes
 TP2 lecture
• -1- numération des coliformes (gélose
Tergitol TTC)