Le : / 05 / 2023

Nom et Prénom :
Ben hadj tahar oussama
Bourghes hadjer
Bellatreche amira
Hamadat sabrina
Laouari nour elhouda
Section : M1 PCP/ G4

TP : Extraction et purification des protéines du foie de souris

Introduction :
Les protéines sont des macromolécules composées d'acides aminés liées par des liaisons
peptidiques, présentent chez les organismes vivants et essentiels à leur fonctionnement.

De nombreuses méthodes ont été mises au point afin de les doser, chacune présente des
caractéristiques différentes : sensibilité, fiabilité, rapidité, présence de substances interférentes…

La méthode choisit dans notre TP est la méthode de Biuret.

But : - Extraction des protéines hépatiques de souris par l’action des détergents.
- Dosage des protéines totales par l’utilisation de la méthode du biuret.
- Utilisation de la capacité du détergent à solubiliser les protéines membranaires du
tissu hépatique
- Evaluation de la concentration protéique à partir d’une courbe étalon grâce aux Do
obtenues à l’aide du réactif de biuret.

A/ Extraction des protéines :

Principe de d’action des détergents sur les protéines :

Les détergents sont des molécules amphiphiles qui ont largement contribué à l’analyse des
membranes cellulaires car ils désorganisent cette dernière en s’intercalant dans les bicouches
phospholipidiques et en solubilisant des lipides et les protéines,
Il existe des détergents ioniques(forts) tel que :
le SDS : qui détruisent les liaisons non covalentes et dénaturent les protéines.
Et des détergents non ioniques tel que :
le TRITON X-100 (forts ) : Agent tensioactif non-ionique, soluble en milieu aqueux et
contenant en moyenne 10 moles d'oxyde d'éthylène. Ces caractères chimiques permettent au
Triton d’entourer les protéines en interagissant avec ses parties hydrophobes et les déchausser
en les recouvrant de charges.
Il est utilisé dans notre TP à fin de purifier les protéines membranaires sans les dénaturer.
Mode opératoire :

[SDS] 0.1 0.3 0.4 0.5

[Triton X100] (%)
Volume initial de 0.03 0.09 0.12 0.15
détergent (ml)
Volume d’eau 2.970 2.910 2.880 2.850
(ml)
Volume 0.5
d’échantillon
Incubation 1h à 4°C puis centrifugation 2min à 10000g à 4°C

B/Dosage des protéines par la méthode du Biuret :

Principe :

C’est une méthode de dosage colorimétrique des protéines, en milieu alcalin ces
dernières forment avec le CU2+ un complexe bleu violet, son intensité sera mesurée
par spectrophotométrie a 540 nm, en utilisant le réactif de GORNALL (sulfate de
cuivre + soude + tartrate).

L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en protéines dans le

tube .
Mode opératoire :

1/- Gamme étalon :

Définition de la Gamme étalon :
Est l’ensemble de solutions appelées solutions étalons, réalisés à partir d’une solution
mère qui contiennent l’espèce chimique à doser en différentes concentrations
encadrent la concentration d’une solution inconnue.
On déduire la concentration par :
- Le mesure des densités optique de ces solutions à l’aide d’un
spectrophotomètre.
- La réalisation d’une courbe d’étalon et on extrapole la densité (celui de
concentration inconnue) pour trouver la valeur de concentration qui la
correspond.
 2 /mode opération :
a/ - La gamme étalon est réalisée à partir d’une solution mère de BSA à 0,1% diluée
dans de l’eau distillée pour un volume totale de 0,5 ml au quel on rajoute 1 ml de réactif
de biuret.

La gamme étalon est réalisée comme suit :

Tubes 0 1 2 3 4 5
(blanc)
BSA (0,1%) en µl 0 10 20 30 40 50
[BSA] (µg/ml) 0 6.66 13.33 20 26.66 33.33
H2OD (µl) 500 490 480 470 460 450
DO à 540nm 0 0.105 0.036 0.047 0.073 0.104
Réactif de biuret 1 1 1 1 1 1
(ml)
Lecture de la DO à 540 nm

Graphe1 : Courbe d’une gamme d’étalon de DO en fonction de concentration de BSA DO

= f [BSA]

courbe d'etalon
0,12
y = 0,0028x
0,1
R² = 0,9866
0,08
DO à540nm

0,06

0,04

0,02

0
0 5 10 15 20 25 30 35
consentration de BSA (ug/ml)

Interprétation :
La courbe de la gamme étalon représentant la DO (densité optique) en fonction des différentes
concentrations croissantes de la solution de BSA .
Elle est représentée par un nuage de points homogènes aux tours d’un axe linéaire qui passe par
l’origine , ce qui veux dire que la DO dépend de la concentration en protéines de la solution dans
spectrophotomètre, en augmentant sa concentration la DO augmente (l’absorbance augmente).
b / Complétez le tableau si dessous :
on à a partir de l’équation de courbe d’étalon :

Y = a . X donc : DO =0.0028 . [BSA]

[BSA]= DO / 0.0028 [BSA] s1= DO( s1 ) /0.0028

=0.259/0.0028=92.5ug /ml
92.5 . 10¯³ = 0.092 mg/ml

…Ext pour les autres solutions !

TABLEAU 3 :

Solution DO à 540nm Concentration en mg/ml

S1 (SDS) 0.259 0.092 mg/ml
S2 (SDS) 0.428 0.152
S3 (SDS) 0.478 0.170
S4 (SDS) 0.297 0.106
T1 (TX100) 0.235 0.083
T2 (TX100) 0.210 0.075
T3 (TX100) 0.243 0.086
T4 (TX100) 0.243 0.086

-Graphe2 : Courbe de DO en fonction de concentration [SDS et TX100] .

DO=f [SDS et TX100].

courbe de DO en fonction de [SDS et TX100]

0,6

0,5

0,4
DO à 540nm

0,3
SDSS
0,2

0,1 TX100S
0
DS
0,092 0,152 0,17 0,106
concentration de détergent [SDS et TX100] en mg/ml
Résultats et discussion :

D’après le tableau 3 et le graphe on remarque que :

 Pour le détergent SDS : le tube 3 (s3) possède la DO (0.478nm) et la

concentration de protéine ( = 0.170 mg/ml ) les plus élevées par rapport
aux 3 autres tubes (S1.S2.S4 ) donc c’est la concentration idéale du
détergent SDS pour une solubilisation optimale de protéine BSA .
 Pour le détergent TX100 : les tubes T3+T4 possèdent la même DO
(= 0.243nm) donc une même concentration (0.086 mg /ml) qui est la plus
élevé par rapport aux 2 autres tubes (T1 ,T2) donc elle correspond au
concentration idéale du Triton X-100 pour une meilleure extraction des
protéines .

Conclusion :
La meilleure méthode d’extraction c’est celui de tube S3 car La
densité optique (DO) étant la plus significativement élevée et
correspondant à une concentration de BSA élevée (entres tous
les tubes de SDS et tx100).
(La meilleure extraction= La concentration la plus élevée = Le meilleur
détergent SDS ou TX100)
Donc :le meilleur détergent c’est SDS , il donne une meilleure
solubilisation des protéines , ce qui signifie une bonne extraction
à partir des cellules hépatiques du foie de souris.