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TP : CHROMATOGRAPHIE Chromatographie dacides amins sur papier

But du TP : -mettre en oeuvre une chromatographie sur couche mince (CCM)


- sparer et identifier les constituants dun mlange dacides amins

I- Principe de la technique
La chromatographie est une technique qui permet de sparer et didentifier les constituants dun mlange. Les soluts (ici les solutions dacides amins) sont dposs sur une phase stationnaire (ici le papier). Il stablit des liaisons faibles entre les molcules et la surface du papier: on dit que les molcules sont adsorbes et on parle de chromatographie dadsorption. Suivant la polarit des soluts, la fixation sera plus ou moins forte. Dans un deuxime temps, un solvant (ou luant), constituant la phase mobile, migre par capillarit le long du papier : il dcroche et entrane les soluts en commenant par les moins fixs. Les vitesses dentranement des soluts sont diffrentes, et on peut sparer les constituants dun mlange, condition de bien choisir lluant.

II- Mode opratoire


ATTENTION : manipuler avec des gants pour ne pas dposer sur le papier des acides amins prsents sur la peau.

Prparation du papier
On utilise du papier Whatman n1 sous forme de rectangles de dimensions 10 x 12 cm

Prparation de lluant
On utilise un solvant contenant (en pourcentage volumique) :butan-1-ol : 40% /acide actique pur : 10% /eau : 50% -Verser de ce solvant dans le bcher sur une hauteur de 2-3 mm. Recouvrir le bcher.

Dpts
-Prendre le papier dans le sens vertical -Tracer au crayon de papier une ligne de dpt horizontale environ 1 cm du bas -Matrialiser 6 croix rgulirement espaces sur cette ligne ( 2 cm du bord). -Raliser laide de capillaires ou de piques apritif en bois (sans appuyer et aprs avoir lgrement cras la pointe), les dpts dacides amins (solutions 0,01 mol.L-1) : - Alanine ALa /Glycine Gly /Leucine Leu / Lysine Lys /Proline Pro /Mlange M

Dveloppement
-Plier le papier de chaque ct sur 1cm pour quil ne saffaisse pas dans le bcher.Placer le papier dans le bcher et laisser migrer lluant jusqu 2 cm du bord suprieur

Rvlation
Les soluts tant incolores, il faut les faire apparatre par une raction chimique. On utilise pour cela la ninhydrine qui donne une coloration violette aprs raction avec les acides amins (sauf avec la proline : couleur jaune). -Sortir le papier -Matrialiser au crayon de papier la ligne de front du solvant. -Scher le papier, ventuellement laide dun sche-cheveux. -Pulvriser la ninhydrine sous la hotte. -Placer la plaque ltuve 80C pendant quelques minutes. -Analyser le chromatogramme obtenu, identifier les constituants du mlange et calculer le rapport frontal de chaque tache de migration (Rf= distance parcourue par la substance (au centre de la tache) / distance parcourue par le solvant). Le rapport frontal Rf est caractristique dune substance donne dans un solvant donn.
1 STL- JPF- LEGTA AURILLAC