Chromatographie sur couche

mince
 Plan

Définition

Principe de la CCM

Avantages de la CCM

Equipements et composantes

Mise en œuvre de la technique

Détermination des résultats et exploitation

CCM bidirectionnelles ou bidimentionnelles

Application de la CCM
Définition

La Chromatographie sur Couche Mince (CCM ou TLC dans la terminologie

anglo-saxonne) et de la HPTLC (High Performance Thin Layer
Chromatography = chromatographie sur couche mince de haute
performance)

Elle permet de
- Analyser un mélange ;
- Caractériser et d’isoler de petites quantités de ces composés
organiques.
Principe de la CCM
La CCM

- est basée sur les phénomènes d’adsorption et d’interactions

- consiste à déposer de très petites quantités de solution de l’échantillon à

analyser sur un adsorbant qui constitue la phase fixe ou stationnaire.

- la phase stationnaire solide est fixée sur une plaque de verre ou

d’aluminium ou encore de plastique. La phase mobile liquide ou éluant,
est un solvant ou un mélange de solvants.

- la phase stationnaire est mise au contact de la phase mobile

Principe de la CCM
La CCM

-phénomène d’élution, qui permet la séparation des constituants du

mélange à analyser

- composé (polaire ou apolaire) développe des interactions

électrostatiques avec le solvant (phase mobile qui peut être polaire ou
apolaire) ainsi qu’avec la phase stationnaire
Avantages

- La CCM ne nécessite pas un appareillage sophistiqué

- son coût de revient est très faible
- elle offre la possibilité de traiter rapidement un grand
nombre d'échantillons (pour des analyses de routine).
 
La CCM est un procédé de partage multi-étapes qui dépend
essentiellement des composés à séparer.
Equipements et composantes
• la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de
forme variable, fermé par un couvercle étanche ;
• la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice
ou d'un autre adsobant est fixée sur une plaque de verre à l'aide d'un
liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris) l'amidon ou
un polymère organique ;

• l'échantillon : environ un
microlitre (µl) de solution diluée
( 2 à 5 %) du mélange à analyser,
déposé en un point repère situé
au-dessus de la surface de
l'éluant ;
• l'éluant : un solvant pur ou un
mélange : il migre lentement le
long de la plaque en entraînant
les composants de l'échantillon.
 Comment choisir l’adsorbant et l’éluant en CCM?

Le choix de l’adsorbant et de la phase mobile dépend essentiellement de la

nature des composés à séparer. Selon que les composés sont polaires ou
pas, l’on choisira un adsorbant et un éluant adapté.

Adsorbants
Les principaux adsorbants utilisés en CCM sont :
- le kieselguhr (terre d’infusoires),
- l’alumine,
- la cellulose,
- et le gel de silice (SiO2 hydratée).

L’adsorbant se présente sous forme de poudre de granulométrie relativement

homogène de l’ordre de 5 à 50 µ. Il est souvent additionné de sulfate de calcium
hydraté (plâtre de Paris, 5 – 10%) ou l’amidon ou un polymère organique, qui
sert de liant et confère à la couche d’adsorbant une meilleure résistance
mécanique
 Eluants
Deux facteurs interviennent lors de l’interaction entre l’éluant et le
soluté et affectent le choix de l’éluant :

- Solubilité : on doit être en mesure de dissoudre le soluté dans l’éluant

pour que la migration se fasse

- la polarité de l’éluant va déterminer à quelle vitesse le composé migre

faire des essais de séparation avant de lancer l’analyse

chromatographique véritablement

Un solvant polaire entraînera facilement les substances polaires et peu les

substances apolaires
 Eluants

- Classification des
solvants ou de leurs
Pouvoir
mélanges utilisés éluotrope
comme éluants en décroissant
fonction de leur
pouvoir éluotrope
(capacité à entraîner
des composés
polaires dans un
système
chromatographique).

ε0 = force éluotropique ; p’ = indice de polarité

Quelques méthodes pour déterminer l’éluant adapté

Méthode 1. préparer des solutions de l'échantillon dans différents

solvants, en concentration d'environ 2 à 5% en volume. Déposer une
goutte de chaque solution sur une plaque, chacune séparée d'environ 1
cm. Le meilleur éluant est celui qui, lorsqu'il a terminé sa migration, a
entraîné le soluté à une distance d'environ la moitié de celle qu'il a
parcourue
Quelques méthodes pour déterminer l’éluant adapté

Méthode 2. déposer une solution des substances à analyser en

plusieurs points, séparés d'environ 2 cm. Après séchage, appliquer au
centre de chaque point une micropipette remplie de solvant; Après
diffusion, l'éluant qui convient sépare les solutés

Exemple pour le choix de l’éluant approprié

 Mise en œuvre de la technique
Dépôt de l’échantillon
- Mettre en solution l’échantillon (0,1 à 10%) dans un solvant volatil et de
faible pouvoir éluotrope,
- Tracer sur la plaque à 1 cm du bord inférieur un très fin trait au crayon de
papier représentant la ligne de départ, et qui servira à repérer les dépôts.
Attention!!! ne pas abîmer la surface de la plaque
 Mise en œuvre de la technique
Dépôt de l’échantillon

- Déposer la solution à analyser en un

point de cette ligne à l’aide d’un tube
capillaire en appuyant légèrement et
brièvement l’extrémité du tube sur la
couche d’adsorbant en prenant soin de ne
pas la détériorer.

Remarque : Il est important que le

diamètre de la tache produite au moment
du dépôt soit faible. Il ne doit pas
dépasser 3 mm
 Mise en œuvre de la technique
Développement du chromatogramme
-Introduction de la plaque portant les spots
dans la cuve préalablement préparée,

- L’atmosphère de la cuve doit être saturée

des vapeurs de l’éluant,

- La plaque est mise dans une position

presque verticale avec le niveau de l’éluant
en dessous de la ligne de base.

- Pendant toute la durée du développement

du chromatogramme, la cuve doit rester
bien fermée et ne devra pas être déplacée.

- La durée de ce développement dépend de

la nature des solvants d’élution
Mise en œuvre de la technique
Révélation du chromatogramme
La révélation est l’opération qui permet de mettre en évidence ou de rendre
visibles les composés séparés Si les composés sont colorés, il n’y a pas
besoin de faire cette étape et les produits sont détectés à l’œil nu.

Examen sous lampe ultraviolette

Les molécules qui absorbent les UV à 254 nm seront visibles (noyaux
aromatiques par exemple)

Méthode de révélation très sensible

et permet de récupérer les
substances séparées : entourer les
substances concernées au crayon,
gratter et mettre dans un solvant
approprié non miscible avec la phase
stationnaire
Mise en œuvre de la technique
Révélation du chromatogramme
Avec un révélateur chimique
-Exposition aux vapeurs d’iode qui est le premier révélateur à tester,
car il est non destructif. Il permet de révéler des doubles liaisons et les
halogénures. L’iode est évaporé à chaud ou dans la hotte.

- D’autres révélateurs chimiques existent : KMnO4, acide

phosphomolybdique, vanilline, ninhydrine…
 Détermination des résultats et exploitation

Rapport frontal ou référence

Composé moins polaire,
frontale (Rf) = le rapport de la moins accroché
distance parcourue par le
composé sur la distance
parcourue par le front de Composé plus polaire,
plus accroché
l’éluant

distance parcourue par le composé (mesurée au

Rf = centre de la
distance parcourue par le front du solvant tache)

0 ≤ Rf ≤ 1
Détermination des résultats et exploitation
Exemples de Rf
 
 
Détermination des résultats et exploitation

Le rapport frontal d’un produit donné dépend de nombreux

paramètres : nature du revêtement de la plaque CCM (silice ou alumine),
concentration de l’échantillon, nature des solvants d’élution… C’est
pourquoi il n’existe malheureusement pas de table de rapports frontaux
pour tous les composés organiques

La référence frontale ou rapport frontal est une grandeur

caractéristique de chaque constituant pour un éluant et pour une
phase fixe donnés
CCM bidirectionnelles ou bidimentionnelles

Eluant 1 Eluant 2 différent de l’éluant 1

Application de la CCM
Application qualitative

Suivi d’une réaction

La CCM permet d’assurer le suivi d’une réaction chimique à
moindre coût. C'est-à-dire déterminer :
- à quel moment les réactifs de départs on été totalement
consommés,
- à partir de quel moment la réaction semble ne plus avancer
- le nombre de produits formés.
Pour cela, il suffit d’un petit prélèvement du milieu réactionnel,
d’un échantillon des réactifs et d’un solvant d’élution et d’assurer
le suivi en faisant :
- un dépôt par réactif de départ
- un dépôt mélangé (réactifs de départ + milieu réactionnel)
- un dépôt du milieu réactionnel.
Après élution et révélation, on obtient les différents produits de
départ, intermédiaires et finaux.
Application de la CCM
Application qualitative

Purification des composés

La CCM va enfin permettre la purification d’un composé. La CCM va alors
pouvoir être employée :
-comme étude préliminaire à une purification par chromatographie
liquide flash

-comme moyen de purification à l’aide de plaque spéciale.

Dans le cadre d’une étude préliminaire, la CCM va permettre de

sélectionner le solvant ou le mélange de solvant à employer pour
permettre une purification efficace d’un produit.
 Application de la CCM
Application quantitative

Utilisation de solutions standards des composés présumés du

mélange à séparer et des quantités connues des composés, l’on peut
en déterminer les concentrations approximatives en considérant
que la surface de la tâche est proportionnelle au logarithme de la
masse du composé élué
 Conclusion

La chromatographie sur couche mince est une méthode d’analyse

rapide et d’une sensibilité intéressante ne nécessitant pas
d’importantes quantités de produits ni de gros appareillages. Sa
mise en œuvre simple et son accessibilité en font une technique
chromatographique pour les pays à faibles revenu ne disposant pas
d’équipements sophistiqués