TP 

: LES METHODES
Chromatographique (CCM/CC)
(Extraire et identifier des espèces chimiques)

Généralité sur la chromatographie

La chromatographie est une méthode analytique d’analyse chimique, qui permet de séparer
et d'identifier les composés chimiques dans un mélange. Elle est basée sur leur différence
d'affinité ou polarité entre deux phases la phase stationnaire, ou phase fixe et la phase
mobile appelée également l’éluant et constituée d'un mélange de solvant. Divers procédés
peuvent être utilisés :

 chromatographie sur colonne.

 chromatographie sur couche mince.

La technique de chromatographie sur colonne repose sur le même principe que la

chromatographie sur couche mince : les espèces chimiques à séparer sont plus ou moins
entrainées par un éluant sur une phase fixe :

 La phase fixe est un solide, le plus souvent de la silice ou de l’alumine remplissant

une colonne.
 L’échantillon est déposé en haut de la colonne. la séparation des espèces chimique
est obtenue par l’écoulement continu d’une phase mobile (l’éluant) à travers la
colonne.
I. Chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince est une méthode d’analyse qualitative,

l’objectif de cette méthode est :

 Identification rapide de composés ou d’un mélange

 Etudié les fractions avant la chromatographie sur colonne
 Suivi la réaction chimique (vitesse d’une réaction)
 Analyse des phases mobiles et les phases stationnaires

1. Réalisation d'une CCM

a. Matériel utilisé
La CCM nécessite l’utilisation du matériel de chimie suivant :
Une phase fixe : plaque de chromatographie (plaque d’aluminium recouverte de gel de
silice).

Une phase mobile : solvant ou mélange de solvants (dichlorométhane, chlorure de sodium,

etc...).

Une cuve munie de son couvercle.

Tubes capillaires : tubes très fins.

b. Protocole expérimental

En Travaux Pratiques, la chromatographie se réalise suivant le protocole suivant :

 Préparer la plaque.

On trace au crayon, à 1 cm du bord, une ligne à l’aide d’une règle : c’est la ligne de dépôt.

On place de fines croix à l’aide d’un crayon sur cette ligne, qui correspondent chacune :

- au mélange
- aux témoins : ce sont les produits susceptibles d’entrer dans la composition du
mélange.

On respecte des espaces réguliers entre chaque dépôt. Sous chaque croix, on repère par une
lettre ou un nom les constituants à analyser.

 Préparer les dépôts.

On réalise les différents dépôts à l’aide de capillaires puis on les sèche pour bien les fixer sur
le support.

 Préparation d'un capillaire

Au laboratoire, les capillaires sont préparés au départ de pipettes pasteur :

• Chauffer la partie centrale de pipette dans la flamme d'un torche au propane en

tomant le tube jusqu'à ce qu'il mou.
• Retirer de la flamme et étirer la pipette.
• Laisser refroidir et couper la partie fine de milieu.
 Préparer l’éluant.

On verse environ 0,5 cm d’éluant dans la cuve à chromatographie puis on la referme avec un
couvercle, de manière à ce que l’éluant sature la cuve en vapeur.

Le niveau de l’éluant versé dans la cuve doit être en dessous de la ligne de dépôt sur la
plaque de chromatographie.

 Placer la plaque dans la cuve.

 On place la plaque dans la cuve, au centre et à la verticale, puis on pose le couvercle sur la
cuve.S

 Sortir la plaque de la cuve.

On laisse l’éluant migrer par capillarité (phénomène d'ascension d'un liquide). Il faut sortir la
plaque lorsque ce dernier arrive à ~0,5 cm du haut de la plaque, en y traçant un nouveau
trait appelé « front de l’éluant ».

II. Chromatographie sur colonne

L'opération de remplissage de la colonne conditionne l'efficacité de la séparation :

1. Fixer verticalement la colonne à l'aide d'une pince.

2. Placer un petit morceau de coton dans le bas de la colonne à l’aide d’une tige de
verre
3. Remplir la colonne avec la phase mobile avec laquelle on débute la
chromatographie.
4. Mettre la phase stationnaire (gel de silice) +phase mobile « 10g de silice »
remplissage a humide car il est conseillé, (1 g de produit besoin de 10 g de silice) à
l’aide d’un entonnoir.
5. Ouvrir le robinet (la phase stationnaire est entrain de déposer).
 Mais attention il faut jamais oublie les choses suivent  pour réaliser une bonne
séparation :
 Eliminer les bulles d’air pour éviter les différent chemines (L’air + La phase mobile
+ la phase stationnaire), dégazé avec la spatule et pour obtenir deux phases
homogènes pour avoir le chemine homogène bien remplie et bine tacé.
 il faut que la phase stationnaire soit bien tassée (tapoter).
 il ne faut jamais sécher la phase stationnaire.
 La phase mobile traverse la silice lentement car les deux phases sont polaires (ils
ont une affinité commune).
 il faut que le produit soit dépose directement sur la phase stationnaire.
 Si les matérielles sont chaudes il faut éviter deux choses :
• Inflammation
• Vaporisation

La partie expérimentale de la TP :

L’objectif ou le but de notre manipulation

• séparer les constituants colorés d’un sirop de menthe et grenadine.

• Réaliser une chromatographie sur colonne.

• séparer les constituants colores d’un sirop de menthe (colorants alimentaires : le E124 et
le E131 - E330 - E211 - E202) puis montrer l’intérêt de la chromatographie sur colonne vis
à vis de la chromatographie sur couche mince.
 a) Préparation de la cuve :
Nous utilisons huit solutions comme solvants :
1. 10 ml d’eau
2. 10 ml de NaCL 5g/L
3. 10 ml de NaCL 10g/L
4. 10 ml NaCL 20g/L
5. 10 ml NaCL 40g/L
6. 10 ml NaCL 50g/L
7. 10 ml NaCL 100g/l
8. 5ml Ethanol +5ml NACL 40g/l

Résultats

 J’observe que le sirop vert ou sirop de menthe se décompose en deux tâches au

même niveau que celles des deux colorants J’en déduis que le vert contient les
colorants E131 et E102.
 Le sirop de menthe est vert (mélange de bleu et de jaune)
  J’observe que le sirop de grenade contient uniquement une seule tâche : la
couleur rouge qui se déplace sur la couche de mince (E124)

 Donc la séparation des colores de sirop de menthe se fait avec la phase mobile NaCl
(10g /l) pour sépare les deux colores (jeune et bleu), puis en utilise la phase mobile L’eau
distillée pour séparer les colores bleu (bleu = mélange de deux colores bleu) et pour la
sortie couleur bleu reste dans la colonne il faut utiliser alcool (Et-OH), ou bien bien séparé
sans modification de la vitesse de séparation.

NaCL 10g/L (séparation de jeune) 10 ml d’eau séparation des bleus

(L’eau+Et-OH)

En fin, nous obtenons les solutions suivantes :

  La résolution est acceptable.

N.B :

 C’est la résolution est faible donc en utilise plusieurs tubes des

petits volumes ou au lieu travaille avec 1g à 10g de silice il faut
augmenter la quantité c’est-à-dire augmentation de la longueur
de la colonne car la résolution est proportionnelle avec la
longueur.
Révélation
Certains composés sont colorés : il n'est pas nécessaire de les révéler. La
plupart sont incolores. Voici quelques méthodes utilisées pour révéler les
plaques.

 Si les constituants sont colorés, ils sont directement visibles sur la

plaque.
  La révélation aux UV permet de mettre en évidence sous forme de
taches sombres des substances qui absorbent les UV, elle nécessite
l'emploi de plaques particulières comportant un révélateur UV.
 Les autres méthodes de révélation sont des méthodes chimiques : on
met la plaque en contact avec un réactif plus ou moins spécifique de
certaines fonctions, qui donne un produit coloré par réaction chimique
avec les substances à révéler.( MnO4-, I2 , etc...) .

Encadré par :

Mr LAMCHARFI ELHADI

Réaliser par :

RHAOUI ABDELOUAHED 2022/2023