Universit Abou Bekr Belkad Tlemcen

Enseignants : A.Bedrane & F.Lahfa

ETUDE DE LA POLYPHENOL OXYDASE DE LA POMME

La polyphnol oxydase (E.C. 1.14.18.1) catalyse la premire tape du brunissement enzymatique qui transforme les composs phnoliques en produits quinoniques prcurseurs des mlanines colores. Lacide chlorognique et le catchol prsents dans de nombreux tissus vgtaux sont des substrats de la polyphnol oxydase.

Lune des mthodes de dosage de lactivit polyphnol oxydase consiste suivre au spectrophotomtre lapparition des produits colors. 1. Extraction de la polyphnol oxydase de la pomme

Peler une pomme, la dcouper en morceaux et en broyer 25 g avec 50 mL dactone glace. Transvaser dans un pot centrifuger, rincer avec 30 mL dactone glace. Centrifuger 10 minutes 10 000 x g et 4C. Eliminer le surnageant, ajouter 30 mL dactone glace, mlanger puis centrifuger dans les mmes conditions. Eliminer le surnageant, scher le culot sous courant dazote. Remettre le culot en suspension dans 50 mL de tampon actate pH 5,6 ; 0,05 mol/L. Agiter 30 minutes 4C. Centrifuger 10 minutes 20 000 x g 4C. Prcipiter les protines par addition dactone glace (3 vol dactone pour 2 vol dextrait). Agiter 2 minutes et laisser 1 h 4C. Le prcipit floconneux, rcupr par centrifugation 10 000 g 4C constitue lextrait enzymatique. 2. Cintique

2.1. Ractifs et matriel extrait enzymatique, S = solution de catchol 3.10-2 mol/L en tampon actate 0,05 mol/L ; pH 5,6,

T = tampon actate 0,05 mol/L ; pH 5,6, Si = solution de catchol 3.10-2 mol/L en tampon actate 0,05 mol/L ; pH 5,6 + acide benzoque 2.10-3 mol/L, Ti = tampon actate 0,05 mol/L ; pH 5,6 + acide benzoque 2.10-3 mol/L, spectrophotomtre avec cuve thermostate.

2.2.

Prparation des solutions de substrat S1 20 0 S2 20 10 S3 15 15 S4 10 20 S5 7,5 22,5 S6 5 25

S (mL) T (mL)

Si (mL) Ti (mL)

Si1 20 0

Si2 20 10

Si3 15 15

Si4 10 20

Si5 7,5 22,5

Si6 5 25

2.3.

Mesures

Les mesures sont ralises 30C sur un mlange de 3 mL de substrat et 50 L dextrait. Les absorbances sont lues 400 nm. 2.4. Dtermination des caractristiques cintiques

Dterminer les vitesses initiales. Calculer KM, VM et Ki. Quel est leffet de lacide benzoque ?