Universit Abou Bekr Belkaid Tlemcen

Enseignants : F.Lahfa & A.Bedrane Les lipides membranaires 1- Isolement des membranes d'Hematies: -100 ml de sang animal, rcupr sur milieu hparin, sont centrifugs 15 mn 4.000t/min et +4c.Observer. -rcuprer le culot contenant les hmaties. - un volume de globules rouges, ajouter un volume d'eau distille et 0.4 volume de ttra chlorure de carbone -homogniser, puis laisser reposer 15 min +4c.Observer. -centrifuger 3.000t/min pendant 20 min. -liminer l'hmolyst enrichi en hmoglobine et rcuprer la phase blanchtre correspondant aux fantmes de globules rouges. 2-Extraction des lipides: - un volume de phase blanchtre, ajouter deux volumes d'un mlange chloroforme/mthanol.(2/1 v/v). -agiter au vortex, puis ajouter un volume d'eau distille. Homogniser. -centrifuger 3.000t/min pendant 10 min et 4c. -rcuprer l'hypo phase chloroformique. 3-Etude qualitative des lipides: Elle est ralise par chromatographie sur couche mince. Les chromatoplaques doivent tre rgnres (actives) 120c au minimum 1 heure avant utilisation. La phase fixe est reprsente par du gel de silice. Le choix de la phase mobile devra tre tabli la fin de ce TP. Pour cela, 2 cuves contenant 2 mlanges

monophasiques distincts sont mises votre disposition. Phase 1: Chloroforme/actone/mthanol/acide actique/eau (5/2/1/1/0.5; v/v). Phase 2 :Ether de ptrole/ther thylique/acide actique.(9/1/1; v/v). Tracer trs lgrement une ligne de dpt 2 cm du bord infrieur de la plaque. Dposer soigneusement les extraits(hmaties) sur chaque plaque, l'aide de capillaire. Le diamtre de chaque spot doit tre infrieur 4 mm. Introduire rapidement les chromatoplaques dans les cuves. Laisser migrer. Arrter la migration lorsque le front du solvant est situ 2 cm du bord suprieur du gel de silice. Remarque: Surveiller la migration dans les 2 cuves car les temps de migration peuvent tre diffrent. La rvlation se fera l'iode qui colore les lipides en jaune. En raison de la grande reproductibilit de la technique, l'interprtation des rsultats se fera par comparaison avec deux(2) plaques de rfrence (une pour chaque phase) qui seront mises votre disposition. Questions: Discuter les rsultats obtenus pour chacune des phases utilises. Prciser en justifiant votre rponse, le choix de la nature de la phase en fonction du matriel biologique considr. Comparer les rsultats obtenus pour les chloroplastes et les hmaties en vous basant sur une recherche bibliographique. Reconsidrer le protocole exprimental partir du matriel biologique brut( feuilles d'pinards) que vous prsenter sous forme d'un schma rcapitulatif. Tirer des conclusions ou faire d'ventuelles propositions.