Cours de premire anne rsidanat

2012/2013
Service de Toxicologie

Ralis par : Yamoun Assia

PLAN
I.

Introduction

II. Tests in vivo

1. Etude de la toxicit aigue
a. Systmique
b. Locale
2. Etude de toxicit par administration ritre
3. Etude de la reprotoxicit
4. Etude de la mutagense/gnotoxicit
5. Etude de la cancrogense
Avantages des tests in vivo
Limites des tests in vivo

*Ethique en exprimentation animale

PLAN

III. Tests in vitro

1.Alternatives aux tests dirritabilit
2.Dtermination du pouvoir mutagne
3.Autres tests
- Avantages des tests in vitro
-Limites des tests in vitro
IV. Conclusion

I. INTRODUCTION

Les tests de toxicologie descriptive sont appliqus pour

toute substance nouvelle afin de mettre en vidence ses
ventuels effets toxiques
Tests in vivo

Tests in vitro
tests pratiqus sur

tests pratiqus sur

des tissus /cellules

animaux vivants

isoles/constituants de

exprimentale

cellules(organites ,enz)/
mme sur des organismes

I. INTRODUCTION

Buts des tudes de toxicit

Dterminer le potentiel cytotoxique dune substance
En tirant les conclusions sur le plan administratif
(indications, contre-indications,)
Prvenir le risque toxique
Traiter les intoxications + valuer les nouvelles thrapies

Mettre sur le march un produit possdant une activit

pharmacologique originale et conforme

AMM

TESTS IN VIVO

II. TESTS IN VIVO

In vivo au sein de la vie : tests pratiqus sur animaux vivants qui

ont constitu pendant longtemps le point de dpart de la toxicologie
exprimentale

Des investigations toxicologiques sur les animaux de laboratoire sont

effectues avant AMM de nouveaux mdicaments
Les animaux les plus utiliss sont les rongeurs (rat, souris, cobaye) et
dans quelques cas dautres mammifres (chien, singe,lapin)

II. TESTS IN VIVO

Etude de la toxicit aigue

II. TESTS IN VIVO

Etude de la toxicit aigue

" Etude qualitative et quantitative des phnomnes toxiques et de

leur apparition dans le temps aprs administration unique "

Systmique

Locale

Etude de la toxicit aigue

Systmique

Dterminer le danger ventuel que reprsente une

exposition ponctuelle une substance chimique par voie
orale/cutane /respiratoire

* DMM
* DL 50
*Test Acute toxic class

Etude de la toxicit aigue

Systmique

DMM

Dose minimale de substance capable de tuer un

animal/ IVL
choix des doses utiliser pour la DL50
*Espce animale:
-Rongeurs +++
-Autre si mtabolisme du rongeur diffrent de
celui de lhomme

-Animaux des 2 sexes, jeunes et gs

Etude de la toxicit aigue

Systmique

DL50 indicateur quantitatif de

la toxicit

Dose de substance causant la

mort de 50 % des animaux dans
un lot dexperience
DL50: mg/Kg
+chiffre est petit
est toxique

+la substance

DL50

DL50

Modalits exprimentales

*Animaux : souris, rats/males et femelles/ environ 200 animaux

*Doses : Chaque lot reoit une dose / des doses qui provoquent un taux de mortalit de
0-100%, le rapport entre deux doses successives 1.2-1.5
*Voie dadministration : voie dutilisation ou dexposition chez lhomme
*Dure : observation 14j
*Examen clinique :
perte de poids, fonctions respiratoires, cardiaques, digestives, SNC
(comportement, mouvements..) ,prise alimentaire, ,,

*Sacrifice :
pour les animaux mourants: en cours de lessai
pour les animaux survivants : fin de lessai
*Autopsie :
tous les animaux de lessai/examens macroscopiques des organes et
anatomopathologiques si lsions

DL50

Dtermination de la DL50

Trevan(1927)

DL50

Dtermination de la DL50

*But : rendre plus accessible la

dtermination de la DL50
Bliss tentait par un changement des
coordonnes de transformer la courbe de
TREVAN en une droite
% de mortalit Probits
Dose Log dose
*Avantage: assez prcise
*Inconvnient: Droite de rgression
entrane erreurs Calculs difficile

Bliss( 1938)

DL50

Dtermination de la DL50

Miller et Tainter(1944)

% mortalits (en probits) en fonction de log-dose

*Correction: 0% et 100% (probits )

*Calcul: ecart type et ecart la moyenne

*Avantage: pratique/simple /rapide
*Inconvnient: valeurs de la dl50 approches

DL50

Dtermination de la DL50

Kraber / Behrens

Approximation par calcul rapproch

DL50= (DL100-AB)N
A= diffrence entre 2 doses successives
B= moyenne de mort entre 2 doses successives
N= nombre moyen danimaux par lot
*Inconvnient: manque de prcision

DL50

Dtermination de la DL50

Mthode semi-graphique/
Pratique/simple /rapide
Calcul de lintervalle
de confiance de la DL50
Valeurs DL50 obtenus
ne sont quapprochs

Litchfield / wilcoxon (1943)

DL50

Intrt de la DL 50

1.Classification de sub selon leurs toxicit

2. Evaluation du danger en cas de surdosage
3. Programmation des tudes de toxicit subaigu/ chronique
4. Apport dinformation sur:
Les mcanismes de toxicit
Linfluence de lage /sexe/facteurs environnementaux
Les variations dans la rponse chez espces animales
5. Programmation des essais thrapeutiques chez lhomme
6. Contrle de qualit
7. Mdicaments: calcul d'un index thrapeutique
8. Dtermination des effets de la substance sur la sant court terme
9.Dterminer les doses < qui seront utilises pr les tudes long terme

Mthodes de rechange pour les essais CLASSIQUES

OCDE

Mthodes de rechange pour les essais classiques

L'OCDE (organisation de coopration et de

dveloppement conomique)a fait de la DL50 un test
officiel (LD pour les essais 401 ) en 1981
En 1987, elle a rduit 20 au lieu de 30 le nombre min
d'animaux que doit contenir l'ch test
En 2001, elle a approuv 3 nouvelles mthodes
destines remplacer la DL50 et occasionner une
moindre souffrance animale et qui sont :
Mthode de la dose prdtermine
Mthode par classe de toxicit aigu
Mthode de lajustement des doses

OCDE

Mthode de la dose prdtermine

N'implique plus la mort de l'animal

Rduit les niveaux de douleur et de dtresse
Nombre d'animaux utiliss est +rduit

Elle constitue donc un raffinement par rapport au

test DL 50

OCDE

Mthode de la dose prdtermine

Essai n 420: Toxicit orale aigu

Principe: seules des doses modrment toxiques

Animal: rat/ un seul sexe(femelle)
Doses: fixes de 5, 50, 300 et 2000 mg/kg
De nouveaux groupes peuvent tre doss des doses fixes > < selon la
prsence / absence des signes de toxicit / mortalit
Ce procd continue jusqu' la dose causant une toxicit vidente ou la mort
Administration: dose unique /sonde gastrique
Un total de cinq animaux d'un seul sexe /dose
Examen: pese 1/ semaine / observations quotidiennes /autopsie gnrale

OCDE

Mthode par classe de toxicit aigu

N'implique pas la dtermination d'une valeur prcise de la DL 50

Consiste plutt tenter de trouver une fourchette de dosages
susceptibles d'entraner la mort

On utilise moins d'animaux, mais ceux que l'on utilise subissent

toujours le stress et la douleur

OCDE

Mthode par classe de toxicit aigu

Essai n 423: Toxicit orale aigu

Sub /voie orale un groupe danimaux une des doses dfinies
Animal: rongeur (femelle)
Processus squentiel: 3 / dose /tape
Resultat :dtermine ltape suivante
Observation: 4 premires h / quotidiennement par la suite, pour un
total de 14 jours
Tous les animaux devraient subir une autopsie gnrale

OCDE

Mthode par classe de toxicit aigu

Essai n 436 : Toxicit aigu par inhalation

Animaux exposs dans des chambres dinhalation C prdfinie /4h

Animal: rongeur (femelle)

Processus squentiel: 3 /dose /tape

Resultat :dtermine ltape suivante

Observation : quotidiennement pendant au moins 14 jours

Tous les animaux font lobjet dune autopsie gnrale

OCDE

Mthode de l'ajustement des doses

Permet de faire une estimation par intervalle de confiance de la

valeur de la DL 50

Par rapport au test initial de la DL 50:cette mthode rduit le

nombre d'animaux utiliss, mais l encore, des effets nfastes,
des dommages et la mort sont observs dans le lot des animaux
qui subissent le test

OCDE

Mthode de l'ajustement des doses

Essai n 425: Toxicit aigu par voie orale

Animal:rongeur(femelle )

Administration: dose unique/ gavage

Des animaux uniques sont doss un par un/ toutes les 48h

Observation: 4 premires h / quotidiennement/14 j

Tous les animaux devraient subir une autopsie gnrale

Resultat :dtermine ltape suivante

DL50 est calcule suivant la mthode de maximum de vraisemblance

Etude de la toxicit aigue Systmique

Test Acute toxic class

Administration dune dose dorientation

Lot de 3 animaux
Resultat: dtermine le choix de la dose associe
la posologie ultrieure:
** Si mortalit < 2 animaux
la dose X 10 ltape suivante
** Si mortalit 2 animaux
la dose est rduite
Donc: 7 8 animaux seulement

Etude de la toxicit aigue

Locale

Permet lvaluation du potentiel irritant /corrosif / sensibilisant de subs aprs

administration locale (peau, il, muqueuse)

*Lirritation : est une raction rversible de la peau /muqueuses des

produits(rougeur +inflammation)

*La corrosion: consiste en des dommages irrversibles causs des tissus

par suite du contact avec un produit
*Sensibilisation cutane : une raction immunitaire mdiation cellulaire
(prolifration des LT)qui se traduit par une
augmentation de la sensibilit aprs un contact rpt
avec sub.2 tapes (" induction / " dclenchement ")

Etude de la toxicit aigue

Locale

Test Dirritation cutane de Draize

Test de sensibilisation cutane
Test dirritation oculaire de Draize

Etude de la toxicit aigue

Locale

Test Dirritation Cutane de Draize

Lindexe dirritation est obtenu selon lquation suivante:

rythme (24h+72h)/2+dme (24h+72h)/2

Test Dirritation Cutane de Draize

Formation drythme et descarre

Score

Formation doedme

Score

-Pas drythme

-Pas ddme

-rythme lger ( peine visible)

-dme trs lger

-rythme bien visible

-Lger dme (bord bien dfini)

-rythme modr svre

-dme modr (hauteur: 1mm)

-rythme svre jusqu une lgre

escarre

-dme svre (plus de 1mm

dhauteur)

Lindexe dirritation est obtenu selon lquation:

Score Erythme (24h+72h)/2+dme (24h+72h)/2
trs lgrement irritant :
modrment irritant
:
trs irritant
:

2
2-5
>5

Etude de la toxicit aigue

Locale

Test de sensibilisation cutane

Ds les essais avec adjuvant :sensibilisation est

potentialise par l'inj de l'Adjuvant Complet de Freund (ACF)
ACF :Solution d'antigne mulsionne dans l'huile minrale.
Se compose des mycobactries tues+sches( MT++ )
Elle agit en stimulant l'immunit cellulaire et renforce la
production des Ig chez animaux

Test de maximalisation de Kligman et Magnusson(GPMT : Guinea Pig Maximization Test)

Test de maximalisation de Kligman et Magnusson

(GPMT : Guinea Pig Maximization Test)

Nombre d'animaux: min de 10 animaux/5 animaux dans le groupe tmoin

1-Phase dinduction:C max entranant une irritation cutane lgre modre
J1 : Trois paires dinjections ID de 0,1 ml sont effectues dans la rgion de
l'paule pralablement dbarrasse de ses poils
Injection 1 : mlange 1:1 (v/v) d'ACF et d'eau ou de srum physiologique
Injection 2 : substance d'essai dans un vhicule appropri
Injection 3 : substance d'essai la concentration choisie dans un mlange
1:1 (v/v) d'ACF et d'eau ou de srum physiologique
J7 : 2me exposition : application topique pendant 48h S/pansement occlusif
2-Phase dclenchement: C max non irritante
J21: application topique pendant 24h sous pansement occlusif

Test de maximalisation de Kligman et Magnusson

(GPMT : Guinea Pig Maximization Test)

3- Lecture:
*24h et 72h aprs : intensit de lrythme
*Examen histopathologique /mesure de l'paisseur du pli cutan,
peuvent tre utilises pour clarifier des ractions douteuses
Test + si incidence>30%
Test GPMT est not comme un essai trs sensible surestimant
parfois le potentiel sensibilisant dune substance en raison entre
autres,de lapplication intradermique de la substance

Test de Buehler
Nombre d'animaux : min de 20 animaux / au - 10 groupe tmoin
1-Phase dinduction :Application topique pendant 6h
Jour 6-8 et 13-15 :on effectue la mme application qu'au jour 1 sur
la mme zone d'essai
2-Phase de dclenchement :
Jour 27-29: Reapplication topique de lAg sur site diffrent /C max
non irritante =>valuation de la raction cutane. Un
examen histopathologique /mesure de l'paisseur du
pli cutan, peuvent tre utilises pour clarifier des
ractions douteuses
Test+ si incidence>15%
Le Buehler contrairement au test GPMT sous-estime le potentiel
sensibilisant dune substance

Test de sensibilisation cutane

Test de sensibilisation cutane

dans la veine caudale

LLNA

Test de sensibilisation cutane

LLNA

Test de sensibilisation cutane

Mouse Ear Swelling Test (MEST)

Gonflement de loreille de souris

1-Phase dinduction : C peu irritante

2 inj ID dadjuvant ACF
4 applications topiques de la sub la surface du corps rase
2-Phase de dclenchement : C non irritante

Au -4 J aprs: appliquer la sub /voie topique au niveau de loreille

+24h: mesurer lpaisseur des oreilles
Hypersensibilit retarde :gonflement marqu de l'oreille
/l'oreille controlatrale de contrle

Rponse +au moins une paisseur de 20% > l'oreille contrle

Etude de la toxicit aigue

Locale

Test Dirritation oculaire de Draize

*J.H. Draize est un toxicologue amricain qui a standardis depuis les

annes 1950 divers tests sur animaux, mais dont le nom est
surtout rest attach un test d'irritation oculaire

*But : valuer l'effet irritant /corrosif de toute substance pouvant venir

en contact avec les yeux, entre autres des produits mnagers
et cosmtiques

Test Dirritation oculaire de Draize

*On utilise le lapin: ses yeux produisent peu de larmes

Il ncessite l'utilisation de 9 lapins

Dans un il de chaque lapin: on instille 0,1 ml du produit (liquide) /

100 mg (solides)dans le cul de sac conjonctival
-Lautre il sert de tmoin

Chez 3 animaux : le produit est lav avec 20ml d'eau tide 2 s aprs l'instillation

Pour trois autres: 4 s aprs l'instillation

Chez les trois derniers: le produit est laiss au contact de l'il

Les ractions oculaires sont apprcies l'il nu ou l'aide d'une fente lumineuse

II. TESTS IN VIVO

Etude de toxicit par administration ritre

II. TESTS IN VIVO

Etude de toxicit par administration ritre

M e e des altrations fonctionnelles et/ou anatomopathologiques

conscutives ladministration ritre de la substance et tablir
les conditions dapparition de ces altrations en fx de la dose

II. TESTS IN VIVO

Etude de toxicit par administration ritre

II. TESTS IN VIVO

Etude de toxicit par administration ritre

Toxicite subaigue (30 jours)
* Informations sur organes cibles, dose maximale tolrable, dose sans effet
* Tolrance physiologique et mtabolique faibles doses
Toxicite sub-chronique (jusqu 3 mois)
* Confirmation de la relation dose-effet pour les tudes longues
* Evaluation de la toxicit cumulative
Toxicite chronique (>3mois)
* Calcul du facteur de scurit / utilisation chez lhomme
* Dcouvertes de nouvelles anomalies
* Toxicit cumulative

II. TESTS IN VIVO

Etude de la reprotoxicit

II. TESTS IN VIVO

Etude de la reprotoxicit
*Buts:

Mettre en vidence tout effet

- sur la fertilit( , )
- sur le ftus et lembryon
- sur le fonctionnement pri/ post-natales

II. TESTS IN VIVO

Etude de la reprotoxicit

Etude de la reprotoxicit
Segment1:Fertilit et developpement embryonaire prcoce

Etude de la reprotoxicit

Segment1:Fertilit et developpement embryonaire prcoce

Etude de la reprotoxicit

*Sacrifier les femelles gestantes juste 1 j avant la parturition, prlever lutrus

*Noter le nbre /sites dimplantations, corps jaunes, ftus vivants et morts
*Examiner les ftus pour voir si anomalies externes, internes et le squelette

Etude de la reprotoxicit

Segment 2: effet sur le dveloppement embryofoetal,tratogense

La teratogncit : apparition de malformations congnitales au cours du

dveloppement embryonnaire

Lexemple le plus dramatique des effets tratognes

est celui du Thalidomide : mdicament dou de proprit
sdatives/ anxiolytiques/antinauseuses
Au dbut des annes 1960, dans plusieurs pays
europens et au Japon ; sont ns environ 10 000
enfants porteurs de malformations caractristiques telles que :
Phocomlies / Amelies

Leurs mres avaient toutes t traites par le Thalidomide*

pendant le premier trimestre de leur grossesse

Etude de la reprotoxicit

*Animal : rat / souris

*Administration: quelques j avant mise bas / pendant tte la dure de lallaitement

Etude de la reprotoxicit

II. TESTS IN VIVO

Etude de la mutagense/gnotoxicit

II. TESTS IN VIVO

Etude de la mutagense/gnotoxicit

II. TESTS IN VIVO

Etude de la mutagense/gnotoxicit

Etude de la mutagense/gnotoxicit

Etude de la mutagense/gnotoxicit

Test de MN in vivo sur rythrocytes

*Protocole
-Souris : 5 /dose /sexe
-Produits : le toxique tester, un tmoin (-) : vhicule, un tmoin (+) :
mitomycine C,thylnitrosoure
-Doses : 3doses (toxicit nulle
maximale)
-Exposition : 24-48 h
-Sacrifice : prlvement de MO, faire un frottis ,et le colorer
-Comptage micronoyaux /200 rythrocytes polychromatophiles

*Ce test permet la dtection simultane des mutations

chromosomiques/gnomiques
*Certains agents capables daugmenter les fr de MN chez lHomme et chez
certains animaux :radiations ionisantes/loxyde dthylne/ benzne / tabac

Test de MN in vivo sur rythrocytes

Etude de la mutagense/gnotoxicit

Mthode de lhte intermdiaire

(Host Mediated assay)

Test in vivo avec microorganismes

Les microorganismes sont injects dans la cavit
pritonale dun mammifre hte (souris)
la substance tester est administre pralablement
lhte

Aprs quelques heures, on sacrifie lanimal et on

rcupre le microorganisme pour examiner les
mutations ventuelles

Etude de la mutagense/gnotoxicit

Spot test chez la souris

Permet de dtecter d'ventuelles mutations somatiques

dans les cellules foetales la suite de l'absorption
transplacentaire de la substance tudier

Etude de la mutagense/Gnotoxicit

Spot test chez la souris

*Principe de la mthode
Epreuve in vivo effectue sur souris dont les embryons en
dveloppement sont exposs une substance chimique

Les cellules cibles des embryons en dveloppement sont des

mlanoblastes et les gnes-cibles sont ceux responsables de la
pigmentation des poils

Les embryons en dveloppement sont htrozygotes pour un

certain nombre de ces gnes de coloration du pelage

Etude de la mutagense/Gnotoxicit

Spot test chez la souris

*Principe de la mthode

Une mutation au niveau de l'allle dominant /perte de l'allle dominant d'un

tel gne dans un mlanoblaste se traduit par l'expression du phnotype
rcessif dans les cellules
entrane l'apparition d'une tache d'une
autre couleur dans le pelage de la souris obtenue

La frquence des taches comptes dans la descendance du groupe trait est

compare celle qui est observe chez les souris issues du groupe tmoin

*Test : peu coteux + ne demande que quelques semaines

*Il peut parfois donner de faux(+) mais, il na pas donn de faux (-)

Etude de la cancrognse

II. TESTS IN VIVO

Etude de la cancrogense

II. TESTS IN VIVO

Etude de la cancrogense

*La grande majorit des cancers ont pour origine les agents chimiques
*Les cancrognes sont classs selon leurs modes daction :
***Cancrognes gnotoxiques: lsion de lADN
-Cancrognes action directe (cancrogne ultime) : formes ractive
lectrophile qui se lient aux sites nuclophiles au niveau des pr- /lADN
-Pr-cancrognes : Ncessitent bio activation

cancrignes ultime

***Cancrognes pi-gntiques: naltrent pas lADN mais favorise la

croissance des tumeurs induites par les cancrognes gnotoxiques

Etude de la cancrogense
*But: dpister les agents capables

-Induire des tumeurs

-Augmenter lincidence des tumeurs
*Animaux : souris /rats animaux de choix
*Dure : toute la vie
24 mois (souris)
30 mois (rats)
*Voie dadministration: Identique celle dexposition chez lhomme
*Dose: 3 doses, forte dose, , 1/4
La dose la plus forte sera la dose maximale tolre ; les deux doses
infrieures sont gnralement des fractions de la dose la plus forte et
seront censes permettre lanimal de survivre en bonne sant jusqu
lapparition de tumeurs
*Examen:
-poids du corps et consommation alimentaire
-observations cliniques
-examens post mortem : les animaux survivants la fin de ltude doivent
tre sacrifis, examins et les organes pess

Etude de la cancrogense

Classification du centre international de recherche sur le cancer (CIRC)

II. TESTS IN VIVO

Avantages des tests in vivo

Les tests in vivo intgrent un plus grand nombre dvnements

gntiques ou cellulaires et permettent dvaluer au plus prs le
risque potentiel chez lhomme
Ils permettent en effet de tenir compte de facteurs tels que :
-la voie de pntration
-le transport jusqu la cible
-la distribution
-la mtabolisation
-la spcificit dorgane

II. TESTS IN VIVO

Avantages des tests in vivo

Lintrt de lutilisation de ces tests se rsume la prise en

compte de la complexit de lorganisme vivant dans sa globalit et
permettent ltude des interactions entre les cellules; les organes
constituant la physiologie et ne pouvant tre tudis que dans
lorganisme entier

Lexprimentation animale reste aujourdhui irremplaable lorsque

lon doit rechercher le pouvoir tratogne, cancrogne,
toxicomanogne dune substance, ou ses effets nfastes sur la
descendance

II. TESTS IN VIVO

Limites des tests in vivo

-Problmes de transposition lhomme des rsultats obtenus lors

de lexprimentation animale, et ceci pour diverses raisons :
* Diffrence dans la cintique et le mtabolisme
*Certains effets ne peuvent tre m e e chez lanimal
- consommation grandissante danimaux de laboratoire entranant
lorganisation de compagnes cette utilisation massive danimaux

LETHIQUE EN EXPRIMENTATION ANIMALE:

CONCEPTS ET PRATIQUE

Lthique En Exprimentation Animale

-La toxicologie est la discipline la plus sensible au problme thique

puisque lapprciation de la souffrance est en quelque sorte lobjectif
mme de cette discipline
-Notre socit accepte globalement le principe de lexprimentation
animale lorsque lobjectif est de contribuer la sant humaine
-Cependant, elle nest pas moins sensible aux conditions
dexprimentations, dsapprouvant mme quelques manipulations
sur lanimal vivant
-Les scientifiques et les lgislateurs ne sont pas indiffrents au souci
thique de lopinion publique

Lthique En Exprimentation Animale

Cette thique a pris la forme de rgles et de principes dont la plus connue

est la rgle des 3 R dicte par Russell et Burch en 1957

REMPLACER
l'exprimentation animale chaque fois que possible par une
mthode alternative en dveloppant cette dernire

REDUIRE
le nombre des animaux utiliss

RAFFINER
les mthodes exprimentales de faon supprimer la
douleur et l'inconfort

Lthique En Exprimentation Animale

Diffrents exprimentateurs rajoutent souvent un 4me R

RESPECTER
l'animal;responsabilit des exprimentateurs, qui
constitue le fondement des comits d'thique

Demandez aux exprimentateurs pourquoi ils

exprimentent sur les animaux, et la rponse est:
Parce que les animaux sont comme nous
Demandez aux exprimentateurs pourquoi il est
moralement OK pour exprimenter sur les
animaux, et la rponse est: Parce que les
animaux ne sont pas comme nous !!!

L'exprimentation animale repose sur

une contradiction logique

 La naissance d'une thique animale impose de diminuer chaque

fois que cela est possible, l'exprimentation sur l'animal
La lgislation internationale en vigueur ne permet l'utilisation de
l'exprimentation animale qu' condition qu'il n'y ait pas d'autres
mthodes qui puissent utilement lui tre substitues
Pour ces raisons de nouvelles stratgies ont t dveloppes en
toxicologie. Celles-ci s'appuient principalement sur l'utilisation de
tests in-vitro

TESTS IN VITRO

III.TESTS IN VITRO

Les mthodes dexprimentation in vitro sont apparues dans les

premires annes du 20me sicle

In vitro dans le verre :dans une boite de Ptri /tube essai

Il y a 2 faons pour tudier les parties dun organisme vivant in vitro :
. Maintenance in vitro du fragment dun tissu/organe
. Culture de cellules et de tissus in vitro
On distingue les tests sur la cytotoxicit, la mutagnecit, cest surtout
dans le domaine de la dtection des effets mutagnes que des tests in
vitro court terme ont t le plus systmatiquement utiliss

III.TESTS IN VITRO

Cultures cellulaires

Principe :Trs simple/on prend des cellules/ tissus /fragments d'organes

sur un tre vivant / bactries / on les place dans un milieu favorable leur
survie
(37C, pH 7,2, glucose 1g/l pour les cellules humaines)
Il existe 2 types de culture cellulaire

PRIMO CULTURE

-Directement issue de lanimal

-Trs proche de lorg dont elles proviennent
-Ne sert qu une seule exprimentation

LIGNES CELLULAIRES

-Population homogne
/stables/mitoses successives
-Capacit illimite de division
-Grande reproductibilit
-Tendance des cellules perdre
certaines de leurs spcificits

III.TESTS IN VITRO

Les alternatives aux tests dirritabilit

Les alternatives aux tests dirritabilit

Irritection System Eytex*

lirritation oculaire aigue rsulte de la dnaturation des pr- de la corne

Dans Eytex, on quantifie ce phnomne en mesurant la turbidit dune matrice

synthtique de protines dorigine vgtale extraite du pois sabre

Ds le test de Draize: estimer le degr des dgts causs

Eyetex: dgts peut tre mesur /un spectrophotomtre (DO405) +fiable

Ce test a t compar au test de Draize : une quivalence suprieure 95%

a t trouve
Test reste grossier +ne suffit pas m e e un risque : il laisse passer de faux -

Les alternatives aux tests dirritabilit

Epiderme humain reconstitu

-Plusieurs couches de peau humaine cultives en labo

-Et que lon peut utiliser pour les tests dirritation cutane
-Echantillons commercialiss sous les noms : Skin Squared /Episkin
-Il existe plusieurs possibilits pour valuer les dgts causs /sub irritante:
- examiner les cellules au scope
- observer les dgts au niveau des mb par extraction des enz
- une inflammation peut tre dtermine par la libration dIL
Rsultat +prcis,contrairement aux tudes animales dans lesquelles on
estime les dgts en observant la rougeur ou lenflure

Les alternatives aux tests dirritabilit

Lignes cellulaires cornennes

- SIRC :ligne cellulaire continue des cellules cornennes

du lapin
- cellules cultives en laboratoire /aucun lapin nest tu

-Le test permettait dvaluer la quantit ncessaire dune

substance pour tuer la moiti des cellules
-Lorsquon testait des shampooings :
rsultats sensiblement similaires au test de Draize

Les alternatives aux tests dirritabilit

Test de fixation du Rouge Neutre

Les alternatives aux tests dirritabilit

Test de diffusion de lagarose

Mthode agarose overlay

Problme de la culture de cellules dans le test de fixation

RN:cellules se trouvent dans un fluide --- substances solubles

Les alternatives aux tests dirritabilit

HET CAM: Hens egg

test chorio allantoic membrane

Test aujourdhui trs dvelopp

Etude sur un tissu organis complet :la mb chorioallalntoidienne de luf

de la poule embryonn

Il donne une meilleure corrlation avec les tests in vivo que la culture
cellulaire qui compte 30% de faux (-)

Principe:

Avantages: rapide, peu couteux

Classification : non irritant

irritant

Les alternatives aux tests dirritabilit

Tests sur corne isole

* De nombreux travaux ont t prsents sur ces mthodes qui

utilisent des yeux de buf, porc ou poulet
*On a pu montr une bonne corrlation avec les tests in vivo
*Ainsi ces tests ont permis de prdire le potentiel irritant dun
grand nombre de produits chimiques

Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP)

Les alternatives aux tests dirritabilit

Tests sur corne isole

Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP)

Contact 10sec 4h
2 mesures :
1- Changement dopacit : opacimtre
2- Permabilit transcornenne:
Passage de fluorescine travers la corne : Spectro UV/Visible 490 nm

Score ( potentiel dirritation) + analyse histologique

Les alternatives aux tests dirritabilit

Le microphysiomtre

Un produit irritant induira des changements dans le

fonctionnement des cellules

Le microphysiomtre : instrument qui dtecte des

changements infimes dans le mtabolisme cellulaire L929
(fibroblastes de souris) en mesurant les changements de pH du
fluide nutritif de la culture de cellule

Cette mthode constitue un instrument prometteur comme

alternative au test de Draize/permet de m e e les mcanismes
de toxicit + fournit des informations concernant la rversibilit de
latteinte des cellules

III.TESTS IN VITRO

Dtermination du pouvoir mutagne

Dtermination du pouvoir mutagne

Test dAmes /Mutatest

Test de mutation gnique sur cellules procaryotes

Il consiste examiner si une substance est capable d'induire des mutations
spcifiques chez souches de Salmonella typhimurium
Souches utilises :porteuses d'une mutation dans un des gnes gouvernant la
synthse de AA histidine
Cette mutation His- rend les souches incapables de pousser sur 1 /2 -histidine
Test d'Ames permet de quantifier l'induction des mutations rverses His+

Dtermination du pouvoir mutagne

Avantages

Simplicit
Cot modique
Test est rapide (48h) /sensible
Rponse quantitative
Pouvoir prdictif (mutagnes/
cancrignes) :70-90%
Le plus utilis des tests de
Toxicologie Gntique

Test dAmes /Mutatest

Inconvnients
*Test bactrien : approximative de ce

qui peut se passer chez l'homme

*Produits bactricides (ATB) :induire
des fausses rponses
*La sensibilit (cancrignes
/mutagnes) 40-50%

*Gntiquement instables : fausses +

Dtermination du pouvoir mutagne

Test de mutation au locus de TK

Test MLA (mouse lymphoma assay)

Test de rfrence mutation gnique /ch sur cellules eucaryotes

Dtermination du pouvoir mutagne

Mutations gniques sur locus

HGPRT

Le gne HGPRT, localis sur le ch X chez lhomme, code lhypoxanthineguanine phosphoribosyltransfrase: catalyse la transformation des analogues
puriniques (6-TG) ce qui les rend cytotoxiques pour les cellules normales
---- les cellules dont ce gne est mut, survivent un trt par la 6-TG

Ce test est applicable in vivo et in vitro sur splnocytes /fibroblastes

(v 79 fibroblastes dhamster)

-Incuber des cellules R la TG + cellules de type naturel + de TG:

le signal intercellulaire transmis------ les cellules R meurent aussi

Des promoteurs de tumeurs tels que le phnobarbital,DDT suppriment la

signalisation : les cellules R survivent

Dtermination du pouvoir mutagne

value la capacit dun agent chimique

dinduire le systme de rparation SOS
(rponse primaire )

SOS : un systme de contournement

qui permet la rplication de se
poursuivre en dpit du blocage occasionn
par la prsence dune lsion gnique
Principe de ce test est davoir conditionn
la synthse de la B -Galactosidase
linduction du systme SOS

Dtermination du pouvoir mutagne

Souche E. coli K 12 qui porte une fusion gntique :gne Lac Z (B

galactosidase) s /ctrl de gne Sfi A /sous contrle du rpresseur Lex A
du systme SOS
En cas de lsion gntique ncessitant lintervention du systme SOS, la
B galactosidase est exprime et des colonies dE. coli K 12 apparaissent
Substrat:X gal =BCIG ( 5-bromo-4-chloro-indolyl--D galactopyranoside
Hydrolyse

Bleu

Dtermination du pouvoir mutagne

une simple valuation qualitative visuelle du degr de dommages l'ADN des

cellules de l'exprience en observant la couleur obtenue

Une valeur plus quantitative peut tre obtenue par spectrophotomtrie en

utilisant un lecteur de microplaque

Ce test prsente certains avantages :

- Les rsultats sont obtenus en 4-5h
- La technique est facile mettre en uvre
-La quantification des mesures et la reproductibilit sont excellentes
-Une seule souche est utilise
Cependant, Les capacits de ce test identifier des carcinognes sont
infrieures de celles du test dAmes. La sensibilit est de 58%

Dtermination du pouvoir mutagne

Test Des Comtes

*Permet de mesurer les cassures induites directement /agent

gnotoxique, indirectement lors des processus enz de rparation
des dommages /lors de processus II aire de fragmentation de
lADN tel que lapoptose

*Nom du test vient de la forme des images (comtes) analyses

sous le microscope

* Il comporte une lectrophorse en micro gel qui permet

dvaluer les dommages lADN cellule par cellule

Le test se droule en plusieurs tapes :

Obtention de cellules individuelles
Prparation des lames : cellules sont emprisonnes
dans un gel dagarose l fix sur une lame de scope
Lyse cellulaire
Dnaturation de lADN dans un tampon alcalin +
Electrophorse :permet aux fragments librs de migrer
sous leffet du champE vers lanode
Neutralisation :reconstituer lADN double brin
cest une tape essentielle pour la coloration
Coloration /agent intercalant :le bromure dthidium
Lecture et analyse en scopie fluorescence
Une cellule intacte : forme dune sphre de 25-35um
Une cellule lse prend la forme dune comte et la
taille de cette comte est directement proportionnelle au
nombre de cassures de brins

Dtermination du pouvoir mutagne

Test Des Comtes

Applications :
Le test des comtes est utilis au dpartement des Polluants Chimiques pour
des applications environnementales in vitro: il montre le caractre gnotoxique de
contaminants organiques +permet aussi de calculer la concentration
dquivalents Benzo[a]Pyrne dans les chantillons de lenvironnement

Cellules HepG2
non traites (X400)

Cellules HepG2 traites

/50 M de B[a]P (X400)

Cellules HepG2 traites par

100 M de B[a]P (X400)

Dtermination du pouvoir mutagne

Test de micronoyaux sur

lymphocytes humains en culture

MN :entits surnumraires forms dans les Ly en cultures

pendant la transition mtaphase/anaphase de la mitose
MN :un ch complet /fragment acentrique dun ch
Les types cellulaires tudis sont exposs aux divers agents
mutagnes, puis prpars pour le comptage du taux de MN qui
est compar celui du tmoin afin de dterminer laquelle des C
de ces agents induit un effet gnotoxique +
Ce test permet la dtection simultane des mutations
chromosomiques et gnomiques

Dtermination du pouvoir mutagne

Test des aberrations

chromosomiques

Dtermination du pouvoir mutagne

Dtection des adduits

Les lectrophiles ont une affinit pour les sites nuclophiles sur lADN /
liaisons covalentes : adduits
erreur rplication /mutagense

3 mthodes de dtection:
**la mthode physicochimique par hydrolyse de lADN suivie dune
sparation des nuclotides
**la mthode immunologique :AC anti-adduits
**la mthode du post marquage :La plus sensible des 3 Aprs hydrolyse
de lADN et le marquage des nuclotides avec du P32 , les nuclotides
sont soumis une sparation lectrophortique
Lapparition de nouveaux spots par rapport aux plaques tmoins rvle la
prsence dadduits

Dtermination du pouvoir mutagne

Microtox

Tests de toxicit rapide

Consiste mettre en contact une souche de bactries marines

(Photobacterium phosphoreum), qui prsentent une luminescence
naturelle bleu-vert (490 nm) , avec la sub analyser

Cette luminescence reflte leur degr de vie

La substance mutagne toxique inhibe le mtabolisme cellulaire et

fait diminuer la luminescence proportionnellement sa C

Il existe aussi une variante de cette mthode qui utilise un mutant

naturel du Vibrion Fischeri

Cette toute rcente mthode permet de reprer la prsence de

substances mutagnes. Ce mutant naturel nest pas lumineux,
mais sil entre en contact avec une substance mutagne, il subit
une transformation et devient lumineux

III.TESTS IN VITRO

Autres tests

Autres tests

Limb bud /whole embryo culture

Ce test est ralis dans la plupart des cas avec des embryons de
rat ou de souris en vue du dpistage des lsions pendant les
phases embryonnaires et ftales

Aprs extraction utrine, une excroissance coelomique limb

bud // la totalit de lembryon ( whole embryon ) peut tre
expos aux substances test pendant une dure pouvant aller
jusqu 4 jours

Les aboutissements sont :

vitalit, croissance ou anomalies morphologiques

Autres tests

Gnotoxicit

Etude de la cancrogense

Lsion

Mutation

Cancrisation

est dans la majorit des cas impliqu dans le dveloppement du

cancer
Pour cette raison les tests de gnotoxicit et de mutagnicit peuvent
tre utiliss comme tests rapides et prdictifs dune activit
cancrigne

III.TESTS IN VITRO

Avantages des tests in vitro

Simplicit + rapidit
Les mthodes in vitro permettent :
de multiplier les essais
de suivre avec prcision un phnomne dans le temps
dexpliquer un mcanisme daction
de prdire la proportion de faux ngatifs et de faux positifs
de limiter le nombre danimaux dexprience : avantage thique
les essais sur des cellules humaines permettent dviter la
diffrence despce

III.TESTS IN VITRO

Limites des tests in vitro

Les cellules en culture ne rendent pas compte de la complexit de

lorganisation du vivant dans sa globalit

Elles ne refltent donc pas la ralit physiologique

Elles ne permettent pas dtablir des corrlations prcises entre

dose et toxicit

VI.Conclusion

Il est ncessaire de tenir compte des impratifs d'exigence de

scurit des tres vivants vis--vis des produits toxiques auxquels ils
sont exposs
La recherche animale est la fois coteuse, parfois peu
reprsentative de la toxicit chez lhomme, et de plus en plus
critique sur le plan thique
Les tests in vitro reprsentent des mthodes simples, dune bonne
fiabilit et reproductibilit.Cependant en raison de leur cot lev,
elles restent mal exploites
Enfin, lvolution de la toxicologie traditionnelle vers une toxicologie
mcanistique, explicative et prdictivede la rponse chez lhomme
est un objectif atteindre afin de mettre en vidence les effets
toxiques des differents produits chimiques

Merci
pour votre
attention