Sécurité alimentaire

Master Spécialisé : Nutrition humaine, sécurité

alimentaire et Management de la qualité

Pr NASSRI ILHAM

2020
Outil analytique
Aliment
Pr NASSRI ILHAM
2020
 Objectifs
Notions de bases sur les différentes techniques
analytiques utilisées : La mise en culture.
Présentation des différentes méthodes
conventionnelles par type de pathogène ou
indicateur de qualité et par rapport au type
d’aliment
Plan:
1. Méthodes d’analyse pour les contaminations microbiologiques

2. Les étapes à suivre pour une analyse d’un aliment

3. Exigences en terme de qualité microbiologiques

 1.Méthodes d’analyse pour les
contaminations microbiologiques
MÉTHODES D’ANALYSE :

Certains pathogènes doivent être absents Il faut détecter

Les indicateurs de qualité doivent se trouver en quantité limitée

Il faut dénombrer

Certaines bactéries pathogènes doivent se trouver en quantité

limitée Il faut confirmer et dénombrer
 Méthodes de référence normalisées
– Microbiologie conventionnelle
Large domaine d’application: tous type d’aliments
ou eau pour la recherche et le dénombrement des
Salmonella, L. monocytogenes, Campylobacter, S.
aureus, C. perfringens, B. cereus, V.
parahaemolyticus/cholerae ……
– Technologies récentes (quand microbiologie
conventionnelle non satisfaisante)
• PCR en temps réel (PCR: Polymerase Chain
Reaction)
• PFGE (Pulsed field gel electrophoresis )
 Méthodes alternatives
Kits commercialisés
• Technologies récentes
• Résultats plus rapides, automatisation
A condition d’être validées
Par rapport à la méthode de référence
correspondante (résultats équivalents)
• Selon protocole de la Norme ISO
• Par tierce-partie: AFNOR Certification, ou
MicroVal
 Techniques de biologie
moléculaire (PCR en temps réel)
 utilisées pour l’identification des bactéries dans
les produits alimentaires
basées sur l’amplification spécifique d’une
séquence d’ADN afin de rechercher et d’identifier
des microorganismes :
♦ quelque soit leurs caractères phénotypiques
♦indépendamment de leurs états
physiologiques

PCR: Polymerase Chain Reaction

 Techniques de biologie
moléculaire
Elles permettent de développer :
♦ des tests de diagnostic rapides, sensibles,
spécifiques et quantitatifs pour venir
confirmer les résultats obtenus par les
méthodes traditionnelles
♦ des tests pour le diagnostic de
microorganismes dont la croissance s’avère
difficile ou l’identification incertaine par la
voie classique.
 Méthode bactériologique
conventionnelle
Le principe:
Fondées presque exclusivement sur l'utilisation
de milieux spécifiques pour isoler et dénombrer
les cellules bactériennes dans l'aliment
 Méthode conventionnelle
• Mise en culture
• Isolement
• Identification (biochimique, sérologique)
 Principe d’un milieu de culture
• Multiplication des bactéries
Gélose: PCA, Gélose au chocolat
Bouillon: BHI, Thioglycollate
• Multiplication sélectives des bactéries
– Gélose désoxycholate lactose , milieux contenant
des ATB, Hektoen, Selenite, Palcam
• Identification des bactéries
– Sucres, plasma de lapin, mannitol, gélose Dnase
 Eau
• Composant crucial des milieux de culture
• La qualité de l’eau est importante
– Distillée, desionisée, osmose inverse
– Les ions métalliques doivent être enlevés
– Faible conductivité
– pH neutre
• Évitez de stocker l’eau
 Agents nutritifs des milieux
• Peptones
– Protéines digérées enzymatiquement
• Hydraytes de carbone
– Dextrose, glucose, lactose
• Extraits de viande
– infusion cœur cervelle
• Extraits de soja
• Extraits de levures
• minéraux
• sang
• Sérum
 Agents sélectifs
• Antibiotiques
– Amikacine, acide nalidixique, vancomycine,
chloramphénicol
• Autres agents
– Biselenite de sodium
– Crystal violet
– Bile
Agents de croissance supplémentaires
• Vitamines, acides aminés, acides gras, oligo-
éléments
• Charbon
– Gélose BCYE (légionelles)
• Lysats de levures
• Sang cuit (chocolat)
 Contrôle de qualité - Sterilité
• Prendre des échantillons de chaque lot de
manière aléatoire
– La taille des échantillons est cruciale
• Incuber à 30ºC pendant 72 heures
• Vérifier chaque jour la présence de
contaminants
• Acceptez / rejetez le lot en fonction du
nombre de contaminants vus
 Contrôle de qualité –Spécificité
• Prenez des échantillons aléatoires de chaque lot
• Utilisez les micro-organismes supposés pousser sur le
milieu
• Vérifiez que l’inhibition de micro-organismes se
produit effectivement sur les milieux sélectifs
• Taille de l’innoculum
• Souches de référence
Exigences d’étiquettage des milieux
• Chaque unité doit être étiquetée
• Identification
– Nom du produit
• Numéro de lot
• Date de péremption
• Température de stockage
2. Les étapes à suivre pour une analyse
d’un aliment
 Aliment
 Méthode
 Interprétation
 Rendu des résultats
 Méthodes
Prélèvement:
Depuis le prélèvement jusqu'au traitement de l'échantillon, il
faut respecter les conditions nécessaires pour stabiliser
qualitativement et quantitativement la flore présente au
moment du prélèvement et qui sont :
• un transport rapide
• une température adaptée pour limiter les multiplications
bactériennes
• un contenant stérile
• un délai court entre le prélèvement et l’analyse
L’ensemble de ces actions est normalisé pour assurer la
reproductibilité des résultats
 Paramètres recherchés
• Paramètres recherchés et dénombrés
Les microorganismes revivifiables à 30°C, les coliformes totaux,
les coliformes fécaux (E.coli), Staphylococcus aureus, les
anaérobies sulfito-réducteurs, les levures et moisissures.

• Paramètres recherchés et détectés

Salmonella spp,
L.monocytogenes,
 Méthodes
Préparation de l'échantillon :
 Peser 3 × 25 gr du produit à analyser aseptiquement dans
chaque sachet stérile
• La 1ère pesée servira au contrôle bactériologique
(dénombrement)
• La seconde servira à la recherche des Salmonella (détection)
• La troisième servira à la recherche de Listéria (détection)
 Diluer dans un diluant stérile pour obtenir une solution mère
et assurer la survie de tous les micro-organismes
 Broyer l’aliment dans un broyeur
 Réaliser ensuite des dilutions décimales successives de la
solution mère dans le diluant (dénombrement)
 Paramètres recherchés et dénombrés
 Les microorganismes revivifiables à 30°C,
 Les coliformes totaux,
Les coliformes fécaux,
Staphylococcus aureus,
Les anaérobies sulfito-réducteurs,
Les levures et moisissures.
 Préparation de la solution mère et
des dilutions

NM 08.0.100
 Dénombrement sur milieu solide

Une bactérie, placée sur un milieu solide

favorable, donnera naissance à une colonie
macroscopiquement visible après culture.
UFC = Unité formant colonie
 Dénombrement sur milieu solide

NM 08.0.120
 Recherche et dénombrement des microorganismes
revivifiables à 30°C
Gélose PCA (Plate Count Agar)
Principe
Les substances nutritives apportées par la
Tryptone, les facteurs vitaminiques de l'extrait
de levure et le glucose utilisé comme Source
énergétique favorisent la croissance de la
plupart des bactéries.

Après incubation

NM 08.0.121
 Recherche et dénombrement des
coliformes totaux
La gélose au désoxycholate lactose
• 2 inhibiteurs des bactéries Gram+ à faible
concentration :
• Le désoxycholate (sels biliaires)
• Le citrate de sodium.
Caractère recherché : le lactose
Colonies rouges 
Après incubation bactéries lactose+ 
coliformes
 Colonies incolores
 bactéries lactose-
37°C 24 h
NM 08.0.142
 Recherche et dénombrement des
coliformes fécaux
La gélose au désoxycholate lactose
• 2 inhibiteurs des bactéries Gram+ à faible
concentration :
• Le désoxycholate (sels biliaires)
• Le citrate de sodium.
Caractère recherché : le lactose
Colonies rouges 
Après incubation bactéries lactose+ 
coliformes
 Colonies incolores
 bactéries lactose-
44°C 24 h
NM 08.0.124
 Recherche et dénombrement de
Staphylococcus aureus
La gélose Baird Parker
2 inhibiteurs :
- le chlorure de lithium
-le tellurite de potassium
Caractères recherchés
-réduction du tellurite  en tellure noir
-protéolyse des protéines du jaune d'œuf  halo clair autour de la colonie
- hydrolyse par une lécithinase des lécithines du jaune d'œuf  liseré blanc
opaque autour de la colonie

Après incubation

37°C 24 h à 48 h

NM 08.0.112
 Test de confirmation des
Staphylococcus aureus
Test de la coagulase en tube
• À l’aide d’un fil stérile, prélever deux à cinq
colonies colonie à tester et l’ensemencer dans
un tube de bouillon coeur-cervelle
(BHI)Incuber à Incuber à 37°C
• Ajouter stérilement 0,1 ml de la culture à 0,1
ml de plasma de lapin et incuber à 37°C
• Examiner la coagulation du plasma après 4 h
et 24 h.
NM 08.0.112
 Recherche et dénombrement des
anaérobie sulfito-réducteurs
La gélose: Sulfite, polymixine, sulfadiazine (SPS)
• Les sulfites (SO3²-) et le fer permettent de révéler par un précipité noir la présence de
sulfures d’hydrogène (H2S) issus de la réduction des sulfites par les bactéries
En présence d’ions ferreux Fe2+ Fe2+ + S 2- FeS Formation d’un précipité noir

• Les polymyxines ont un effet bactéricide sur les bacilles Gram -, en particulier les
Pseudomonas et les coliformes

• La sulfadiazine est un antibiotique

On recherche la forme végétative des bactéries anaérobie sulfito-réducteurs à 46°C

46°C pendant 24h

NM 08.0.125
 Recherche et dénombrement des
levures et moisissures
• Gélose Sabouraud
Milieu acide inhibe la croissance de nombreuses bactéries.
-La peptone pepsique de viande constitue la source azotée de croissance, le glucose
est une source énergétique.
-Le chloramphénicol, antibiotique thermostable à large spectre antibactérien, inhibe
le développement de la microflore contaminante.

Incuber à 25-30°C pendant 3 jours.

Levures

Gélose Sabouraud
Moisissures
NM 08.0.123
Paramètres recherchés et détectés

• Salmonella spp,
• L.monocytogenes,
 Protocoles adaptés aux bactéries pathogènes
 Phase de pré-enrichissement
Echantillons alimentaires incubés dans un milieu nutritif non
sélectif revivification des bactéries stressées.

 Phase d’enrichissement sur milieu sélectif

Croissance de la bactérie cible tout en diminuant celle de la
microflore saprophyte

 Isolement des milieux sélectifs et ou chromogènes

(reconnaissance facile des colonies suspectes)

 Identification avec réalisation d'une série de tests

biochimiques, caractérisation sérologique.
 Recherche de Salmonella spp
Recherche systématique des Salmonella spp pour tout
type d’aliment
• Pré-enrichissment sur bouillon eau peptonée
tamponnée
• Enrichissement sur bouillon de Rappaport Vassiliadis
• Isolement sur gélose Hektoen, Salmonella Shigella
Agar
• J+3 : suspicion de présence de Salmonelles
• J+4 : confirmation ou non par la galerie API

NM 08.0.103
 Recherche de Salmonella spp
Les Salmonella lactose- colonies incolores, avec
ou sans centre noir d’H2S+.
Les Shigella sont incolores.
Les coliformes colonies rouges ou rosées

La gélose SS
Les microorganismes fermentant au moins
l’un des 3 glucides: lactose, saccharose,
salicine colonies “saumon” Escherichia,
Levinea, Citrobacter diversus, Klebsiella,
Enterobacter, Serratia, Yersinia

les autres donnant des colonies bleues ou

vertes. Suspicion de Shigella ou de
Salmonella
Les microorganismes H2S+ colonies à
centre noir. Suspicion de Salmonella, à
La gélose Hektoen différencier de Proteus mirabilis
 Identification de Salmonella spp
Après incubation

Gélose nutritive
Etape 2: Préparation de l’inoculum
Etape 1: On ensemence
une colonie caractéristique
sur gélose nutritive pour le
test biochimique

Etape 3: Introduire la suspension

bactérienne dans chaque tube à l’aide
d’une pipette pasteur stérile, pointe
appuyé à l’intérieur et sur le coté pour
éviter la formation des bulles
 Test biochimiques :
L’identification biochimique est réalisée par des galeries
biochimiques classiques ou bien par des galeries biochimiques
prêtes à l’emploi (Galerie API 20 E) en suivant les indications du
fabricant.
Ce sont des entérobactéries bacilles à Gram négatifs, ayant une
mobilité peritriches, mannitol +, aéro-anaérobies facultatifs,
glucose+, lactose -, H2S + (ou -), indole-, citrate+
Uréase- , oxydase -, béta-galactosidase-, lysine décarboxylase+,
arginine déshydrogénase +,ornithine déshydrogénase +, nitrate
réductase +
 La galerie Api 20E
Api sans suspension bactérienne

Api avec suspension bactérienne avant étuvage

Identification de Salmonella spp par la galerie
Api 20E
Recherche de Listeria monocytogenes

Recherche des Listeria spp pour certaine catégorie

d’aliment (produit laitier, viande…)
• Pré-enrichissment sur bouillon Fraser 1/2
• Enrichissement sur bouillon Fraser

• Isolement sur gélose Oxford ou Palcam

• suspicion de présence de Listeria monocytogenes
• confirmation ou non par la galerie API

NM 08.0.110
Recherche de Listeria spp Listeria
monocytogenes
 Api Listeria

La galerie miniaturisée API Listeria

• 10 tests pour d'identifier les espèces de Listeria en 24 heures

• 10 microtubes contenant des substrats Déshydratés permettant la
réalisation de tests enzymatiques ou des fermentations de sucres.
• la lecture des réactions se réalise avec le tableau de lecture et
l'identification obtenue grâce à la liste des profils de la notice technique.
 Biotype de L. monocytogenes :
Petits bâtonnets mobiles Gram+, catalase+,
l’esculine +, glucose +, esculine + , maltose + ,
rhamnose + , xylose - , fructose +, mannose+,
cellobiose +, tréhalose +, gentobiose +, mannitol -,
D arabitol +, esculine+, amygdaline +, salicine +,
uréase -, indole -, H2S -, RM +, VP +, nitrate
réductase -, hémolyse ß +.
3. Exigences en terme de qualité microbiologiques

Ex: Viande et fromage

 Principe
Pour chaque type de bactérie:
 on détermine un critère d'acceptation quantitatif ou
qualitatif.
 on applique ces critères pour interpréter les résultats
et définir si la qualité de l’aliment est satisfaisante ou
non.

Les critères qualitatifs sont de la forme : absence de la

bactérie dans l’aliment
Les critères quantitatifs sont définis sous forme d'une
valeur.
 Critère microbiologique
Un critère microbiologique pour un aliment
définit son acceptabilité en se basant sur
l’absence ou la présence, ou le nombre de
microorganismes/ou une quantité de leur(s)
toxine/métabolites, par unité de masse ou de
volume
les critères sont utilisés pour définir ou vérifier la
conformité d’un aliment en regard des exigences
 Interprétation
La qualité de l’aliment est satisfaisante si
 toutes les valeurs sont inférieures à la limite pour les dénombrements
(Microorganisme aérobies 30°C, coliformes totaux, coliformes fécaux,
Staphylococcus aureus, Anaérobies sulfito-réducteurs , Levures moisissures
 et absence pour les recherches (Salmonelles, Listeria monocytogenes)

La qualité de l’aliment est non satisfaisante si

 au moins une valeur est supérieure à la limite pour les dénombrements
(Microorganisme aérobies 30°C, coliformes totaux, coliformes fécaux,
Staphylococcus aureus, Anaérobies sulfito-réducteurs , Levures moisissures
 ou présence pour une recherche (Salmonelles, Listeria monocytogenes)
 Arrêté conjointe N°1737-02
Arrêté conjointe du Ministère de l'Agriculture et
du Développement Rural, du Ministère de la
santé et du Ministère de l'Industrie, du
Commerce et des Télécommunications relatif au
normes microbiologiques auxquelles doivent
répondre les denrées animales ou d’origine
animales
 Critères microbiologiques d’une
Viande hachée
Paramètres microbiologiques Concentration maximale
admissible
Microorganismes revivifiables à 30°C, 24h 5.105
UFC/gr
Coliformes fécaux à 44°C, 24h (E.Coli) 100
UFC/ gr
Staphylococcus aureus à 37°C, 24h-48h 100
UFC/ gr
Anaérobie sulfito-réducteurs à 37°C, 24h 10
UFC/ gr
Salmonella spp Abs
UFC/ 25 gr
Listeria monocytogenes Abs
UFC/ 25 gr
 Critères microbiologiques de fromage à
pate molle au lait traité thermiquement
Paramètres microbiologiques Concentration maximale
admissible
Microorganismes revivifiables à 30°C, 24h
UFC/gr -
Coliformes totaux à 37°C, 24h 104
UFC/ gr
E.Coli, 24h 102
UFC/ gr
Staphylococcus aureus à 37°C, 24h-48h 102
UFC/ gr
Anaérobie sulfito-réducteurs à 37°C, 24h
UFC/ gr -
Salmonella spp Abs
UFC/ 25 gr
Listeria monocytogenes Abs
UFC/ 25 gr