Contrôle microbiologique des

aliments

PRESENTE PAR :
Dr Mouhamadou Moustapha GUEYE
Dr Demba MAKALOU
 Plan
1. GENERALITES
2. POLITIQUE DU CONTRÔLE
3. MICRO-ORGANISMES RECHERCHES
4. PRELEVEMNTS
5. ANALYSE MICROBILOGIQUE
6. INTERPRETATION DES RÉSULTATS
CONCLUSION
 1- Généralités

Les risques microbiologiques liés aux denrées alimentaires constituent

une source majeure de maladie d’origine alimentaire

 le contrôle de la qualité microbiologique des aliments est important afin

de vérifier que les denrées alimentaires ne contiennent pas de micro-
organismes ni leurs toxines qui présentent un risque pour la santé humaine

Il repose sur un ensemble de mesures et de contrôle qui nécessitent une

maitrise de la biologie des bactéries concernées.
 1- Généralités
Aliment ou denrée alimentaire: toute substance ou produit,
transformé, partiellement transformé ou non transformé, destiné à être
ingéré ou raisonnablement susceptible d’être ingéré par l’être humain.
Terme recouvrant: boissons, gommes à mâcher et toute substance,
intégrée intentionnellement dans les denrées alimentaires au cours de
leur fabrication, préparation ou traitement
 1- Généralités

Les micro-organismes dans l’alimentation humaine peuvent avoir des

effets bénéfiques, comme effets néfastes:

Modifications de leurs caractères organoleptiques

Altération de leur qualité marchande.

Pathogénicité / toxicité > danger pour la santé publique.

 1- Généralités
Aliments contrôlés pour:

Raisons économiques

Raisons de santé publique

 respect de la législation

Suivi ou la sélection de « bons microbes

 1- Généralités

Principe:

Rechercher ou dénombrer bactéries à risque pour chaque type

d’aliments

Déterminer critère d’acceptation quantitatif ou qualitatif

Appliquer critères pour interprétation

Utilisant aspects réglementaire Normes

 1- Généralités
Buts:
Assurer la salubrité (qualité bactériologique) > éviter ou limiter la
présence et la prolifération des bactéries pathogènes pour l’homme
ou des bactéries d’altération.
Contrôle de la stérilité pour les produits soumis à des traitements
antimicrobiens de stabilisation (température, additifs..)
Estimation du nombre des contaminants (flore aérobie mésophile
totale, coliformes, anaérobies sulfito-réducteurs) ou leur détection et
identification (Salmonella, listeria..)
 2- Politique du contrôle
❑ Contrôle des produits alimentaires peut être effectué à n’importe quel
niveau de la chaîne de :
• Fabrication
• Transformation
• Traitement
❑ Nécessite la mise au point d’une stratégie tenant compte:
• des niveaux de contrôle
• des paramètres à contrôler
 2- Politique de contrôle
1. Niveaux de contrôle:
❑Préventif: avant la fabrication, sur les matières premières et les
adjuvants
❑En cours de fabrication: sur le produit, le matériel, les locaux et le
personnel
❑Sur les produits finis: pour conclure leur conformité aux normes
❑Démarche d’assurance sécurité (HACCP: hazard analysis critical control
point)
❑NB: fréquence des contrôles établie sur la base de:
• expérience et moyens
• Type de produit (type de fabrication)
• Type d’usine (unité de production)
 2- Politique de contrôle
2. Paramètres à contrôler:
afin d’éviter les risques d’accident de fabrication et de situer l’origine de la
contamination > analyse microbiologique:
❑Matière première avant son entrée à l’usine, voire son origine.
❑Eaux de lavage, de consommation et de transformation des produits.
❑Surfaces des locaux et des ustensiles.
❑Air ambiant: ateliers de transformation et hangars de stockage.
❑Personnel intervenant dans le processus de fabrication.
❑Matériel de conditionnement et emballage.
 2- Politique de contrôle
2. Paramètres à contrôler:
Résultats seront comparés aux “critères microbiologiques” établis par
des commissions de spécialistes au sein d’organismes:
❑AFNOR (association française de normalisation)
❑ISO 22000:2018 (organisation internationale de standardisation)
❑ICMSF (international commission on microbial specifications for
foods)
❑Codex alimentarius créé par: FAO /OMS
❑ITA (institut de technologie alimentaire): au Sénégal
❑SDE (Sénégalaise des Eaux)
 3- Microorganismes recherchés
Espèces Aliments Caractéristiques

E.Coli Lait cru, fromages au lait cru Meilleur indicateur de contamination fécale
+++ Viande hachée de bovin Sérotype O157:H7 > colite hémorragique
sévère
Clostridium perfringens Viandes préparées Germe tellurique anaérobie strict
Résistant à la chaleur > survie à la cuisson
(Type A) Sauces
Conserves familiales Risque élevé de contamination car très
Clostridium botulinum poissons, miel grande toxicité de l’exotoxine

Produits de pâtisserie Contamination lors de manipulations

Staphylococcus aureus Produits hachés Entérotoxine staphylococcique colonise les
Crèmes glacées aliments contaminés, pas totalement
Fromages / salaison inactivée par la chaleur
 3- Microorganismes recherchés
Espèces Aliments Caractéristiques
Céréales, riz, pâtes Germe tellurique
Bacillus cereus Aliments non réfrigérés après 2 formes:
cuisson et une première - f. émétique: 1 à 5 h incubation
consommation - f. diarrhéique: 6 à 24h incubation
Vibrio parahaemolyticus Fruits de mer Germe d’origine marine responsable d’une
TIA
Eau Fréquence faible de son implication dans
Streptococcus Poissons crus les maladies alimentaires

Aliments crus: lait, Seules certaines souches sont pathogènes

Yersinia enterocolitica coquillages, viandes, vollailes Très sensibles à la chaleur (cuisson ou
pasteurisation)
 4- Prélèvements
1- Condition de prélèvement

Echantillon doit être :

- Représentatif

- Stable qualitativement et quantitativement

- Transport rapide avec température adaptée dans conteneur stérile

- Conservation à température adéquate

- Broyage si solide puis dilution dans diluant stérile

 4- Prélèvements
2- Nature des prélèvements

 Liquide:

 Réalisation variable selon le produit, le volume et forme du contenant

 toujours s’assurer d’une homogénéisation parfaite du liquide

Instruments: pipette ou flacon stérile

 4- Prélèvements
2- Nature des prélèvements

 Solide

Élimination préalable de la surface exposée à l’air avant de prélever par

grattage ou par cautérisation ou flambage.

Instruments:

 Scalpel ou sonde (fromage, produits mous)

 Pipette harpon
 4- Prélèvements
3- Transport et conservation des échantillons

Affectation d’un numéro ou une codification à l’échantillon en précisant:

• Heure,

• Lieu et,

• Nom de l’operateur

 Transport et conservation à des basses températures

 4- Prélèvements
4- Préparation de l’échantillon

Quelque soit la nature initiale du produit l’analyse s’effectue sur une

suspension

Pour les produits liquides: il faut homogénéiser par une agitation

manuelle vigoureuse

Pour les produits solides: il faut broyer par diverses méthodes

 4- Prélèvements
4- Préparation de l’échantillon

Broyeur de potter
Broyeur mortier/pilon Broyeur de potter
Pilon conique
Pilon rond en verre

Broyeur électrique a couteaux

 4- Prélèvements
4- Préparation de l’échantillon

Les analyses microbiologiques se font à partir des suspensions liquides.

Nécessite une dilution des produits solides après broyage.

Préparation indispensable pour ramener les produits sous forme liquide.

Par revivification du produit de broyage avec:

• Eau peptonée à 10%

• Solution de Ringer diluée au ¼

 5- Analyse microbiologique
1 .Examen macroscopique

Vérification des caractères organoleptiques :

 aspect (opaque, mat, brillant, rugueux...)
 couleur (verdâtre, blanc, noir, jaune, rouge...)
 turbidité (pour les liquides)
Odeur (Seuil de détection des composés organiques volatiles = 10 -6-
10-9 g)
Gout
texture
2
2
 5- Analyse microbiologique
2. Examen microscopique

• Réalisé sur l’échantillon brut

• Intérêt
- estimation de la flore totale
- mise en évidence des contaminants dans la flore de fabrication
(levures ou bactéries Gram (-) dans les ferments lactiques)
- dénombrement directe des germes avec un hématimètre
- étude cytologique du lait (formule leucocytaire)  état sanitaire
de l’animal

23
 5- Analyse microbiologique
2. Examen microscopique

• Etat frais  après dilution avec :

- eau physiologique pour les germes morts
- eau formolée à 10% pour les germes vivants

• 2 colorations couramment utilisées : bleu de méthylène et Gram

• Procédés actuels : marqueurs fluorescents

24
 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes
2 méthodes de contrôle :
Méthodes directes : Comptage des cellules microbiennes

Techniques de cultures: classiques, longues et couteuse

Techniques microscopiques: MO et colorants simple ou complexe (BM

et double GRAM)
 Méthodes indirectes: Néphélométrie
Impédancemétrie
Détermination du poids sec
25
 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes
Méthodes directes

Techniques microscopiques

a. Utilisation des cellules à numération

b. La méthode de Breed

c. Technique de filtration à épifluorescence directe (DEFT)

d. Numération après passage sur un milieu d’enrichissement

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 5- Analyse microbiologique
3.Dénombrement des germes
Méthodes directes

Techniques microscopiques
a. Utilisation des cellules à numération

Comptage à l’hématimètre

• Numération des cellules au microscope utilisant une microchambre graduée

de volume connu :

ex : cellules de Thoma, Malassez, Nageotte..

27
 5- Analyse microbiologique
3.Dénombrement des germes
Méthodes directes

Techniques microscopiques

Hématimètre de THOMA

- Placer 1 goutte de suspension sur la lame

- Recouvrir d’une lamelle qui se repose
sur les 2 renflements de la lame
- Observation à l’état frais au microscope optique à X40 28
 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes
 Méthodes directes
Techniques microscopiques
b. Méthode de Breed

• Utilise des lames comportant une zone délimitée (1 cm3) sur laquelle on
dépose 0.01 ml de la suspension de l’aliment à examiner.

• Après séchage, fixation et coloration au bleu de méthylène ou éventuellement

la coloration de Gram,

• Microorganismes sont comptés dans 30 à 50 champs microscopiques. 29

 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes

Méthodes directes

Techniques microscopiques
b. Méthode de Breed

• Méthode est rapide et bien adaptée pour le comptage des bactéries.

• Ne distingue pas les cellules mortes des cellules vivantes.

• Existence des amas de cellules sont comptés comme une seule cellule ce qui
diminue de la précision de la méthode. 30
 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes
 Méthodes directes

Techniques microscopiques
c. Technique de filtration à épifluorescence directe (DEFT)

• Permet la numération de la flore totale en moins de 20 min

• Repose sur :
- filtration sur membrane permettant de concentrer les bactéries sur le filtre

- lecture par microscopie en épifluorescence (X100) utilisant l’acridine

orange qui se fixe sur les acides nucléiques les rendant fluorescents 31
 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes
Méthodes directes
Techniques microscopiques
c. Technique de filtration à épifluorescence directe (DEFT)
Lecture : 30 champs pris au hasard puis on compte entre 30 et 100 bactéries /champ

concentration en bactéries (CB) = (N X M X D) / V

N : concentration bactérienne dans un champ

M : nombre total de champs microscopiques occupant la surface filtrable de la membrane

D : dilution éventuelle
32
V : volume filtré
 5- Analyse microbiologique
3.Dénombrement des germes
 Méthodes directes

Techniques microscopiques
d. Numération après passage sur un milieu d’enrichissement

• Qualitative : pour des espèces déterminées (Lactobacilles, Salmonelles, etc.)

• Existe une corrélation Nbre de Urgo au début et à l’issue de l’incubation.

• Suspension de l’aliment à examiner dans un milieu d’enrichissement sélectif

• Incubation aux temps et température appropriés du microorganisme,

• Numération sur lame au microscope optique. 33

 5- Analyse microbiologique
3.Dénombrement des germes
 Méthodes directes
Techniques microbiologiques de culture
 En milieu liquide
• Principe : ensemencement d’un milieu liquide, toute croissance microbienne
provient au moins d’un germe
• Technique :
- Diluer la suspension mère dans une série de dilutions de facteur 10
- Utiliser un milieu de culture approprié au germe
- Incubation dans les conditions optimales de croissance 34
 5- Analyse microbiologique
3.Dénombrement des germes
 Méthodes directes

Techniques microbiologiques de culture

Protocole expérimental d'une dilution successive de facteur 10 35

 5- Analyse microbiologique
3.Dénombrement des germes
Méthodes directes

Techniques microbiologiques de culture

 En milieu solide

• Principe : Chaque colonie macroscopiquement visible provient d’une

cellule microbienne

• Technique: Choisie en fonction du rapport du « germe à dénombrer » avec

« l’oxygène », peut être réalisée en : boite de pétri et en tubes
36
 5- Analyse microbiologique
3.Dénombrement des germes
 Méthodes directes
Techniques microbiologiques de culture
En milieu solide : boites de Pétri
Technique : à partir dilutions  ensemencer au moins 2 boites de Pétri :
- mettre 1 mL de la suspension dans une boite de Pétri vide
- ajouter 10-15 mL de milieu gélosé en surfusion à 40-45°C
- homogénéiser le mélange par des mouvements circulaires
- laisser se solidifier à la température du laboratoire
NB :pour assurer l’anaérobiose  faire couler une seconde couche assez
épaisse sur la première 37
 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes

Méthodes directes

Techniques microbiologiques de culture

En milieu solide : boites de Pétri

Lecture : dénombrement réalisé par comptage des colonies

à l’aide d’un compteur de colonies

38
 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes
Méthodes directes

Techniques microbiologiques de culture

En milieu solide : boites de Pétri

Déterminer le nombre de cellules vivantes par mL de la suspension mère (UFC/mL)

N (UFC/mL) = Σc (n1 + n2) X 0,1d

Σc = nombre totale de colonies comptées dans les boites (doit être compris entre 20 et 300)

n1 : nombre de boites de Pétri comptées dans la 1ère dilution

n2 : nombre de boites de Pétri comptées dans la 2ème dilution

d : facteur de dilution à partir duquel les premiers comptages ont été faits 39
 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes

Méthodes directes

Techniques microbiologiques de culture

En milieu solide : tubes (culot de gélose)

• Même principe que sur boites de Pétri

• ++ utilisé pour dénombrer les Clostridium sulfito-réducteurs (anaérobies)

• Rarement utilisé vu les difficultés rencontrées lors du dénombrement des

colonies qui sont difficilement accessibles à l’œil nu 40
 5- Analyse microbiologique
3.Dénombrement des germes
Méthodes directes
Techniques microbiologiques de culture

41
 5- Analyse microbiologique
3.Dénombrement des germes
 Méthodes indirectes

 Techniques microbiologiques de culture

Néphélométrie
Principe : basé sur la proportionnalité entre :
- densité optique (turbidité) de la suspension microbienne
- quantité de la biomasse
• Utilise les modifications de la conductance d'un milieu de culture du fait
de la croissance et du métabolisme de la flore microbienne de l'échantillon
• ++ utilisée pour le contrôle du lait, de l’eau, des boissons alcoolisées...
42
 5- Analyse microbiologique
3. Dénombrement des germes
 Méthodes indirectes
 Techniques microbiologiques de culture
Impédancemétrie
• Des bactéries cultivées dans un milieu liquide provoquent des modifications
chimiques qui perturbent la résistance électrique (impédance).
• Utilisé en laiterie : consiste à introduire l’échantillon de lait dans des flacons obturés
par des bouchons en caoutchouc munis de 2 électrodes reliées au
« Bactometer 32 microbial system »
• Un témoin de lait stérile est mis dans les mêmes conditions. 43
 6. Interprétation des résultats
❑ Dénombrement  résultat obtenu en multipliant le nombre de
bactéries/ quantité (g ou mL) d’aliment analysé
❑ L’interprétation/ comparaison de ce résultat à une valeur tolérable
considérée comme normale pour cet aliment = norme

44
 6. Interprétation des résultats

❑ L’échantillonnage microbiologique exprimé en fonction de plans à 2

classes ou 3 classes selon le niveau de risque.

❑ Les plans à 2 classes utilisés quand on ne tolère pas, dans un aliment,

la présence d’une contamination microbienne

❑ L’échantillonnage à 3 classes utilisé quand on tolère la présence d’un

certain niveau de contamination

45
 6. Interprétation des résultats
❑ Plan à 3 classes : désigné ainsi car les résultats des examens
interprétés sur cette base permettent de fixer 3 classes de
contamination :
- inférieure ou égale au critère m
- comprise entre le critère m et le seuil M
- supérieure au seuil M

46
 6. Interprétation des résultats
m = critère fixé par le présent arrêté (règlement 178/2002/CE)
 tous les résultats égaux ou inférieurs sont considérés comme satisfaisants

M = seuil limite d'acceptabilité

 tous les résultats supérieurs ne sont plus considérés comme satisfaisants, sans que le
produit soit considéré toxique

n: nombre d’unités de prélèvements qui sont prélevés au hasard dans un lot et examinés pour
répondre aux exigences définies.

 c: nombre maximal permis d’unités prélevées de qualité marginale.

Si le nombre d’unités de qualité marginale est supérieur à c, le lot dont provient l’échantillon
est inacceptable/insatisfaisant. 47
 6. Interprétation des résultats
❑ La qualité du lot est considérée comme satisfaisante ou acceptable
en application de l'article 1er (FAO) du présent arrêté lorsque aucun
résultat ne dépasse M

48
6. Interprétation des résultats
Milieu liquide

49
 6. Interprétation des résultats
Plan à 2 classes : désigné ainsi car les résultats des examens interprétés
sur cette base permettent de déterminer seulement 2 classes de
contamination

❑ Ce plan n'accepte aucune tolérance, même de caractère analytique,

il correspond +++ aux expressions :
- « absence dans » : résultat considéré comme satisfaisant
- « présence dans » : résultat considéré comme non satisfaisant
 produit déclaré impropre à la consommation

50
6. Interprétation des résultats
Milieu solide

51
 Conclusion
❑ Pour garantir et maîtriser la sécurité microbiologique des aliments
et prévenir les crises sanitaires, la connaissance et la surveillance
des micro-organismes pathogènes depuis la production jusqu’à la distribution
des denrées alimentaires sont indispensables.

❑ Afin d’éviter tout risque sur la santé du consommateur, les examens

microbiologiques et hygiéniques des aliments  rôle prépondérant.

❑ Analyse microbiologique des aliments  indispensable car permet d’éviter la

commercialisation et la consommation de produits dangereux ou non
conformes.

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 Références bibliographiques
❑ Lydia Mutsch. Critères microbiologiques applicables aux denrées
alimentaires : lignes directrices pour l’interprétation. Ministère de la
santé. Gouvernement du Grand-Duché de Luxembourg. Aout 2018
❑ C. Bonnefoy., F. Guillet., G. Leyral., E. Verne-bourdais.
Microbiologie et qualité dans les industries agroalimentaires. Série
Sciences des aliments. Collection Biosciences et Techniques. 2002
❑ Mostefa Naimi. Techniques de contrôle microbiologiques.
❑ http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/fr
❑https://www.iso.org/fr/iso-22000-food-safety-management.html

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