Analyses microbiologiques

Application

Domaine de santé Domaine de bio-industries Domaine de l’environnement.

Homme Agroalimentaire Eau

Animal Pharmaceutique Air
Végétal Cosmétique Surface
Autres

Réalisation

Prélèvements biologiques Matières premières Différents échantillons

ou végétaux Produits finis
Produits en cours de fabrication
Outils et appareils utilisés
Air et surfaces
Personnel
 Objectifs et type d’analyses microbiologiques
avec expression des résultats

1 Recherche, isolement et identification de microorganismes pathogènes ou toxiques

Analyse microbiologique qualitative

Résultats sont exprimés sous forme de présence ou absence de germes

2 recherche & dénombrement de germes spécifiques ou particuliers

Analyse microbiologique quantitative

Résultats sont exprimés en nombre ou concentration de germes par mL ou gr d’échantillon

La démarche et les techniques développées lors de l’analyse microbiologique dans le domaine

médical sont différents de celles appliquées en bio-industrie et l’environnement. Pour ces
derniers, les méthodes utilisées reposent sur des normes et les résultats sont interprétés en
fonction des critères microbiologiques.
 Prélèvement & échantillonnage

Domaine médical (Homme)

 Les prélèvements biologiques doivent se faire le matin à jeun

 Le matériel utilisé doit être étiqueté et porte toutes les informations nécessaires
 Le transport doit se faire le plus rapidement possibles au laboratoire d’analyse
 Les conditions de conservation et de transport doivent être bien respectées

Domaines des bio-industries et d’ environnement

 Le matériel utilisé doit être stérile et étiqueté

 L’échantillon collecté doit être représentatif
 Il faut éviter tout risque de contamination accidentelle du produit
 Il faut réaliser sur place (in situ) certaines analyses
 Noter toutes les informations nécessaires sur l’étiquette
 Le transport au laboratoire d’analyse doit être court et rapide

Il est à savoir que les analyses doivent se faire dans des

laboratoires spécialisés selon le type de prélèvement ou d’échantillon
 Méthodes de prélèvement
1. Méthode d’écouvillonnage

Elle est pratiquée pour réaliser des prélèvements en surface à l’aide d’ un écouvillon de
coton hydrophile imbibé par soit une solution stérile de Ringer au 1/4 , un bouillon
tryptone-sel additionné de Tween (0,5°/°°) ou de l’eau physiologique stérile

2. Méthode de rinçage

Elle est utilisée dans le cas de récipients ou de tuyauteries. Un volume connu de solution
stérile est introduit dans le matériel à analyser. Après agitation, le liquide est
récupéré et soumis à l’analyse
 3. Méthode d’empreintes

Elle est très utilisée dans les domaines de bio-industries et d’environnement

Un ruban adhésif stérile est appliqué sur la surface à étudier. Après quelques secondes
de contact il est retiré et appliqué sur la surface d’un milieu de culture gélosé

4. Méthode du cylindre

Elle est très utilisée dans le domaine des bio-industries en particulier en agro-alimentaire

Un cylindre creux stérile est appliqué sur la surface à analyser. introduit quelques
millilitres de diluant stérile, et après contact, le diluant est retiré et analysé

5. Méthode d’impaction en milieux solides

Elle est très utilisée dans le domaine de l’environnement (Air)

L’air est aspiré par un impacteur à une certaine vitesse au travers des grilles. Les germes
seront donc collectés sur une plaque contenant un milieu gélosé et placée
sur le trajet du flux d’air
 6. Méthode d’impaction en milieux liquides
(NF S 98-030 « 2012 », NF EN 16442 « 2015 »)

Elle permet d’ aspirer l’air au travers d’un tube capillaire et le propulsé à l’intérieur ou
à la surface d’un liquide de collection (Milieu de culture ou solution physiologique
avec des agents de protection contre les chocs osmotiques)

7. Méthode de filtration

Elle est utilisée pour les domaines d’environnement (Air, eaux)

et des bio-industries (produits liquides)

Elle utilise des filtres ou des membranes en ester de cellulose ou autres polymères synthétique

8. Méthode de sédimentation
(NF S 98-030 « 2012 », NF EN 16442 »2015 »)

Elle est appliquée dans le domaine d’environnement (Air)

 9. Méthode des PETRIFILMS

Elle est utilisée dans le domaine d’environnement (Surfaces)

Ils se présentent sous forme d’un film fin contenant au centre un milieu gélosé spécifique

10. Méthodes d’éponges stériles

Elle est utilisée dans le domaine d’environnement (Surfaces)

11. Méthode des BOITES CONTACT

Elle est utilisée dans le domaine d’environnement (Surfaces)

 12. Prélèvement de produits liquides

Elle est appliquée surtout dans le domaine des bio-industries (Agro-alimentaire)

Il faut procéder à une bonne homogénéisation du liquide (agitation)

avant de faire le prélèvement

13. Prélèvement de produits solides

Elle est appliquée surtout dans le domaine des bio-industries (Agro-alimentaire)

Le prélèvement pourra se faire par un scalpel, une sonde ou une pipette harpon
 Analyse microbiologique au laboratoire
Préparation des échantillons

Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique

s’effectue toujours à partir d’une suspension

 Cas de produit liquide: L’homogénéisation est obligatoire

 Cas de produit solide: Le broyage dans un volume connu de diluant neutre et stérile est
obligatoire 1 ère dilution (D = 1/10)

Domaine des bio-industries et environnement

a. Prise d’essai

 Cas des produits solides: Elle est destinée à la préparation de la suspension mère et de ses
dilutions
 Cas des produits liquides : Elle est réalisée après homogénéisation.

b. Broyage

Il est réservé aux produits solides, et peut être réalisé par plusieurs techniques

Pour ce but, La prise d’essai (10 à 25g) de produit sont broyés dans (90 à 250 ml) de diluant.
 c. Préparation des dilutions

Le diluant utilisé doit être neutre et stérile

 Cas de produit liquide

- Agiter manuellement le récipient de l’échantillon à diluer

- Prélever 1mL de cet échantillon et l’introduire dans le 1 er tube contenant 9mL de diluant stérile
- Agiter par des mouvements de rotation ou au moyen d’un Vortex (homogénéisation).

Obtention de la première dilution (D = 1/10 ou 10 -1 )

Prélever 1mL de D = 10-1 et l’introduire dans un autre tube contenant 9mL de diluant stérile.

Obtention de la deuxième dilution (D = 1/100 ou 1O -2 )

Procéder de la même manière pour réaliser les autres dilutions

Le nombre de dilutions à préparer varie selon la nature et le type du produit à analyser
(Produit traité ou non, conditionné ou non, ect, ..)

Le traitement peut être une pasteurisation, une filtration, une chloration, ect….
 Pré-enrichissement et revivification

Il est appliqué surtout au cours de la recherche des germes à pouvoir pathogènes

et autres dans les produits traités

Un traitement technologique appliqué pour certains produits de bio-industries

et d’environnement provoque un stress à de nombreux germes

Ainsi, la présence des germes en état de stress peut conduire à des variations dans les
numérations, et porter à croire à une absence ou présence non significative des
germes et par conséquent absence de risque pour la santé du consommateur

Milieux de culture & méthode d’ensemencement

Milieux de culture

En fonction de la composition d’un milieu de culture on distingue

 Milieu de culture synthétique: Il est utilisé pour étudier les bactéries autotrophes ou étudier
les besoins nutritifs d’un germe

 Milieu de culture empirique: Ils se caractérise par une composition connue Exemple:
Columbia, Tryptycase soja, ect….
 Milieu de culture non sélectif : C’est un milieu à spectre large et favorise la croissance de la
plupart des microorganismes cultivables

 Milieu de culture non sélectis enrichi: Il est obtenu par ajout à un milieu de base des liquides
ou suspensions riches en molécules organiques diverses. Il permet la croissance de nombreux
germes exigeants ou très exigeants.

 Milieu de culture sélectif: Il peut être riche ou non, contenant d’agents chimiques ou
d’ATB comme agent selectif (Inhibiteurs) et favorise la croissance des germes d’un groupe
microbien donné

 Milieu de culture électif : Il favorise la croissance de germes particuliers en limitant celle

des indésirables ou en avantageant seulement celle de ceux appartenant à un genre ou une espèce
recherchés

 Milieu d’enrichissement: Il est utilisé pour augmenter le nombre d’un sous-groupe de

Germes dans un ensemble plus vaste. Il est souvent liquide (Bouillon) et contient des molécules
à action sélective
 Méthodes d’ensemencement

Ensemencement

liquide-liquide liquide-solide par étalement solide-solide solide-liquide

Identification & caractérisation

Elle est effectuée après la purification des souches

Elle concerne l’étude des critères morphologiques, physiologiques

physico-chimiques, sérologique, antigéniques et biochimiques par lest tests
biochimiques classiques et les galeries api

Actuellement, l’identification par application des méthodes de la biologie moléculaire

est très utilisée (séquençage de l’ARNr 16S, hybridation, acides gras de la paroi, ect..)
 Microorganismes rencontrés dans les domaines
des bio-industries et d’environnement

1. Microorganismes d’altération de la qualité des produits

A Indices de contamination fécale

Leur habitat naturel est le tube digestif de l’homme ou de l’animal et leur présence
dans un produit traduit une contamination fécale avec un risque sanitaire

1 2 3
Coliformes totaux Entérocoques Clostridium sulfito-réducteurs (C.S.R)
+ « Clostridium perfringens »
coliformes fécaux
« Escherichia coli »

 Les coliformes: Ce sont des entérobactéries et regroupe les genres Escherichia, Enterobacter,
Klebsiella et Citrobacter. Avec certaines espèces du genre Serratia.

Ils fermentent en plus du glucose, le lactose avec production de gaz

après 24 - 48h d’incubation à 30 - 37°C.
 Escherichia coli fermente le lactose avec production de gaz à 44 ± 0.5°C en présence
des sels biliaires et produisent de l’indole sur l’eau peptonée exempte d’indole
(Test de MACKENZIE)

C’est un germe thermo-tolérant et résistant au phénol à 0,85 ‰.

C’est un indice de contamination fécale récente.

Au cours de la recherche des CT + CF, plusieurs milieux de culture sont utilisés

Gélose lactosée au bouillon lactosé bilié au Bouillon lactosé au pourpre de

tergitol7 TTC vert brillant «BLBVB» bromocrésole «BCPL»)
(avec cloche) (avec cloche)

Méthode de filtration Méthode du nombre le plus probable « NPP »

(loi de KASS) (Table de Mac-Grady)

Les méthodes de recherche et de dénombrement des coliformes

sont connues sous le nom de COLIMETRIE
 Les entérocoques: Ce sont en forme de cocci à Gram (+), catalase (-), oxydase (-), micro-
aérophiles mais se comportent comme des aéro-anaérobies facultatifs.

Leur habitat est le tube digestif des animaux à sang chaud et l’homme

Ils se prolifèrent à 45°C dans des milieux contenant 40% de bile

Leur présence n’indique pas obligatoirement un risque sanitaire mais plutôt signe d’un
défaut d’hygiène de fabrication ou de conditions de conservation défectueuses

Au cours de la recherche des ET + EF, plusieurs milieux de culture sont utilisés

Milieu de Slanetz & Bartley Milieu de Rothe avec M ilieu de Litsky avec
avec azide de sodium + TTC azide de sodium azide de sodium + ethyl violet
(agent sélectif) (agents sélectifs)

Méthode de filtration Méthode du nombre le plus probable « NPP »

(loi de KASS) (Table de Mac-Grady)

Confirmation sur milieu gélosé « B.E.A » bile, esculine, agar

Au cours des analyse des eaux, si le rapport CF / EF > 1, la contamination est d’origine
humaine, par contre s’il est CF / EF < 1 d’origine animale
 Clostridium sulfito-réducteurs «Clostridium perfringens»: Ce sont des hôtes normaux du
tube digestif de l’homme et de l’animal

Ils son fréquemment rencontré dans la nature en particulier le sol bactéries telluriques

Ils sont très résistants en raison de leur caractère sporulé

Ce sont des indices de contamination fécale ancienne

Les méthodes d’analyses appliquées sont: méthode des tubes et des boites de Petri

Les conditions de culture sont 24h-72h à une température allant de 42 à 46°C

n milieu gélosé viande foie + additifs (sulfate de sodium + alun de fer)

 Bactériophages fécaux: Ils sont souvent excrétés dans les selles de l’homme et des animaux
et retrouvés en grandes quantités dans les eaux usées brutes

Leur recherche est recommandée surtout au cours des analyses d’échantillons d’eaux
 B Indices de salubrité des produits

 La flore mésophile totale : Elle regroupe l’ensemble des germes mésophiles, pathogènes ou
d’altération avec tout les types respiratoires

Sa évaluation permet de garantir une certaine sécurité hygiénique

et un certain niveau organoleptique des produits

 La flore mésophile aérobie totale (FMAT) ou revivifiable: Elle comporte des germes
pathogènes ou non, aérobies et capables à se multiplier à des températures allant de 20°C à 45°C.

Le dénombrement de cette flore permet de bien estimer l'indice de salubrité et de qualité

des produits des bio-industies (agro-alimentaire) au cours du contrôle industriel

La numération directe des cellules viables après culture est réalisée sur milieux
gélosés usuels et non sélectifs tels que la gélose PCA et la GN
 C Indices de la qualité marchande

 Les levures : Ce sont des germes très hétérotrophes et acidophiles

Ils produisent des enzymes protéolytiques et lipolytiques

Ce sont des indices de pollution qui déprécie l'aspect et le goût

de certains produits de bio-industries

 Les moisissures (Champignons) : Elles sont filamenteuses, très hétérotrophes, aérobies et

acidophiles.
Elles se développer sur des produits à faible activité d’eau (a w ≈ 0.65)

Elles sont dotées de propriétés lytiques importantes

Ces deux indices sont des agents de détérioration des produits

alimentaires acides ou à faible activité d’eau

Ces microorganismes peuvent être isolés sur des milieux acidifiés

ou additionnés d’agents antimicrobiens
 2. Microorganismes à pouvoir pathogène et toxique

Ils sont responsables de nombreuses infections et de toxi-infections

Bactéries Levures Moisissures Virus Parasites & protozoaires

Le pouvoir pathogène dépend de plusieurs facteurs de virulence

Prolifération et envahissement Production de toxines Pouvoir pathogène mixte

(infection) (toxi-infection) (infection + intoxication)

Mycobacterium tuberculosis Clostridium botulinum Staphylococcus aureus

Vibrio cholerae

Analyses microbiologiques qualitatives

 Méthodes de recherche, de dénombrement
et
d’isolement des microorganismes

1 Méthodes de référence & la normalisation

Ce sont des méthodes d’analyses normalisées (Normes)

Définition de la Norme

C’est un document établit par consensus et approuvé par un organisme reconnu

EX: AFNOR (Association Française de Normalisation ), ISO (Organisation Internationale de Normalisation)

Pour l’Union européen , la norme expérimentale est équivalente

à la Spécification Technique (TS)

Méthodes de routine appliquées pour les dénombrements, mais qui ne sont pas
validées par rapport aux méthodes de référence correspondantes selon le
protocole de la norme NF EN ISO 16140.
 Exemple: Utilisation d’une boîte de milieu de culture par dilution
au lieu de deux boîtes ou plus par dilution pour la méthode de référence.

2 Méthodes alternatives

Ce sont des méthodes rapides appliquées pour quantifier, détecter et identifier les
microorganismes dans les produits de bio-industries surtout et l’environnement

Elles sont basées sur des données d’immunologie, de génétique, de sérologie,

de biochimie, de biophysique, de chimie et d’instrumentation avec
d’autres méthodes de microbiologie moléculaires

Selon la norme ISO 16140, pour valider une méthode alternative on doitréaliser

Une étude préliminaire Une étude collaborative

Elle consiste à caractériser la méthode et
évaluer les performances par comparaison
avec une méthode de référence.
 Exactitude relative
 Spécificité relative
 Sensibilité relative
C’est une étude inter-laboratoires qui consiste
à comparer entre les performances de cette
méthode à valider et celle de référence dans de
nombreux laboratoires et des conditions de
répétabilité et de reproductibilité bien définies.
Elle est réalisée sur des échantillons
artificiellement contaminés avec au moins trois
 Méthodes de référence
1 Méthodes des boites
Elle repose sur le principe qu’un microorganisme vivant et cultivable après culture
en ou sur milieu gélosé favorable donne naissance à une colonie

Dans le cas d’une évaluation de la charge, le nombre de colonies obtenues

est exprimé en nombre d’UFC dans l’inoculum (volume ensemencé)

1. Recherche et dénombrement des cellules viables

après culture en milieux gélosés
Elle est appliquée pour la rechercher et le dénombrement
de la flore mésophile totale (FMT)

MODE OPERATOIRE

 Liquéfier les milieux gélosés dans un bain-marie bouillant, puis maintenir à 45±1°C,
 Marquer les boites de Petri (référence sur le bord du fond de la boite),
 Introduire 0.1 à 1mL de l’échantillon brut et de ses dilutions dans chaque boite de Petri,
 Couler dans chaque boite 18 à 20 mL de milieu gélosé en état liquide (GN, PCA, autres),
 Homogénéiser par agitations circulaire et alternative horizontales,
 Laisser refroidir les boîtes jusqu’à solidification complète,
 Retourner les boîtes et incuber à une température adéquate.
 La flore mésophile totale (FMT) correspond à l’ensemble
des types respiratoires

Dans le cas des germes anaérobies stricts, la méthode appliquée est

celle de la double couche

Lecture & expression des résultats

Seules les boites avec un nombre d’UFC allant de 30-300 feront l’objet de la lecture
Les résultats seront exprimés sous forme de nombre de germes par
millilitre ou gramme de produit analysé selon la loi de Kass

2. Recherche et dénombrement des cellules viables

après culture sur milieux gélosés

Elle est appliquée pour la rechercher et le dénombrement de la flore

aérobie mésophile totale (FAMT) flore revivifiable

La numération en surface n’est réalisable que sur une surface

de milieu parfaitement sèche
 MODE OPERATOIRE

 Liquéfier les milieux gélosés dans un bain-marie bouillant, puis maintenir à 45±1°C,
 Marquer les boites de Petri (référence sur le bord du font de la boite),
 Couler dans chaque boite 18 à 20mL de milieu gélosé (GN, PCA et autres),
 Laisser refroidir les boîtes bien à plat jusqu’à solidification complète,
 Retourner les boîtes et les mettre dans l’étuve à 30°C pendant 18-24h,
 Déposer au centre de la boite 0.l à 0.5mL de l’échantillon brut et de ses dilutions,
 Etaler sur toute la surface de la boite et de façon uniforme ce volume,
 Laisser sur la paîllace pendant 5-10 min,
 Incuber les boites en position renversée à une température adéquate,

Lecture & expression des résultats

Seules les boites avec un nombre d’UFC allant de 30-300 UFC feront l’objet de la lecture
Les résultats seront exprimés sous forme de nombre de germes par
millilitre ou gramme de produit analysé selon la loi de Kass

La microflore aérobie revivifiable demande une incubation à

22°C 24h à 3j & 37°C 24-48h (GN, PCA)
 2 Méthode des tubes

Elle est appliquée pour la recherche des bactéries anaérobies sulfito-réducteurs

(Clostridium perfringens) & l’évaluation du nombre de leurs spores

MODE OPERATOIRE

 Liquéfier un flacon de milieu gélosé riche (viande foie) dans un bain-marie,

 Introduire dans des tubes à essai stériles ≈ 2mL de l’échantillon mère et de ses dilution,
 Placer les tubes dans un bain-marie à 80°C pendant10 minutes (traitement thermique),
 Procéder à un refroidissement brusque sous l’eau du robinet (choc thermique),
 Ajouter deux additifs au milieu de culture liquéfié (sulfite de sodium + Alun de fer),
 Couler dans chaque tube un volume bien définit (20mL) de milieu avec additifs,
 Après solidification (en culot), incuber les tubes à 42°C - 46°C pendant 24 à 72h.

Lecture & expression des résultats

Faire le comptage des colonies entourées d’un halo noir en masse chaque jour

Exprimer les résultats en nombre de spores par 20mL

L’espèce Clostridium perfringens produit des colonies de grande taille en houpe noire
 3 Méthode de filtration sur membrane
Elle est appliquée pour les produits liquides non visqueux ou très faiblement
visqueux et sans substances susceptibles de colmater le filtre

Elle est adaptée pour le dénombrement des bactéries en faible concentrations

La prise d’essai analysée doit être importante (Ex: eau de consommation)

Matériel utilisé

Appareil de filtration Membranes à base d’acétate de Milieux de culture gélosés variés

cellulose (0.22 à 0.45μm) selon les des microorganismes

Figure 1. Rampe de filtration

 Analyse microbiologique de l’eau de consommation

Elle est réalisée aux points de distribution pour rechercher et

dénombrer les microorganismes suivants:

 Fore aérobie revivifiable à 22°C et 37°C ……………. (EN ISO 6222),

 Coliformes totaux et fécaux (Escherichia coli)… ……(AFNOR NFT 90-414 / ISO 9308-1),
 Entérocoques………………………………………...... (AFNOR NFT 90-416/ ISO 7899-2),
 Spores des anaérobies sulfito-réducteurs……………. (AFNOR NF EN 26461),
 Pseudomonas aeruginosa………………………………….(AFNOR NFT 90-421)

Milieux gélosés appropriés

 Gélose PCA ou GN
 Gélose + lactose + Tergitol 7 + TTC,
 Milieu de Slanetz & Bartley + Azide de sodium + TTC,
 Gélose Viande Foie + Additifs
 Gélose sélective à l’acide nalidixique + cétrimide

Pour la recherche des coliformes thermo-tolérants, des entérocoques et de

Pseudomonas aeruginosa dans l’eau conditionnée (eau naturelle)
la prise d’essai est de 250 mL
 MODE OPERATOIRE

 désinfecter l’appareil de filtration puis rincer à l’eau stérile,

Déposer le filtre au centrée de la plaque-support perforée à l’aide d’une pince stérile,
 Revisser l’entonnoir pour assurer de l'étanchéité du système de filtration,
 Verser stérilement la prise d’essai d'eau à analyser dans l’entonnoir (100 - 250 mL),
 Mettre en marche la pompe à vide manuelle puis filtrer en créant le vide,
 Rincer à l’eau stérile l’entonnoir ,
 Démonter le système,
 Retirer le filtre et le placer au centre d’une boite de Petri à l’aide d’une pince stérile,
 Faire adhérer le filtre à la gélose pour éviter les bulles d’air entre le filtre et le milieu,
 Incuber les boites de Petri à une température et pendant un temps adéquats,

Lecture & expression des résultats

Seules les boites avec un nombre d’UFC allant de 20-80

feront l’objet de la lecture

Les résultats seront exprimés en nombre de microorganismes par

100mL et 250 mL d’eaux analysées selon la loi de Kass
 Tableau 2. Critères microbiologiques retenus pour l’eau conditionnée (eau minérale)

Microorganismes Volume d’eau Milieux de culture Limites de qualité

recherchés filtré et autres conditions

Flore aérobie revivifiable à 22° C 100 mL PCA 72 h à 22°C ≤ 100 UFC/100 mL........(1)
Flore aérobie revivifiable à 37° C 100 mL PCA 48 h à 37°C ≤ 20 UFC /100 mL……..(1)
Escherichia coli « thermotolérant » 250 mL G. Lac +TTC+Tergitol7 48h à 44°C < 1 UFC /250 mL
Entérocoques fécaux 250 mL Slanetz + TTC 48h à 37°C <1 UFC /250 mL……….
(2)
Pseudomonas aeruginosa 250 mL Gélose + Cétrimide 48h à 37°C < 1 UFC /250 mL
Spores de bactéries sulfito-réductrices 100 mL Viande foie + additifs à 37°C < 1 UFC /50 mL

(1). Selon la norme l’incubation à 22°C ± 2°C 68 ± 4h et à 36°C ± 2°C 44 ±4h.

(2). Si en 2 jours il y a des colonies présumées d'entérocoques, transférer la membrane sans la

retourner sur le milieu gélose BEA (bile+esculine+azoture) et incuber 2h à 44°C

Les colonies typiques sont entourées d'un halo noir

 Recherche et dénombrement des microorganismes
en milieux liquides (AFNOR, 1974)

1. Méthode du nombre le plus probable (NPP) en tubes

Elle est basée sur le fait que la croissance des microorganismes en milieu liquide
est mise en évidence par un trouble et on parle alors
d’unité formant trouble (UFT)

Elle est réservée à la recherche et au dénombrement

des coliformes & des entérocoques

L’étude expérimentale est effectuée en deux étapes

« test présomptif et test confirmatif »

Principe de la méthode

Il est basé sur l’hypothèse de distribution statistique normale

des germes dans un milieu liquide

Les échantillons de même taille et de même origine contiennent un nombre identique

de germes en moyenne, mais Certains peuvent s’en écarter en plus ou moins
et le nombre moyen est le nombre le plus probable « NPP »
 Définition du nombre le plus probable « NPP »

C’est une estimation statistique de la densité des microorganismes et des intervalles

de confiance sont attachés à cette estimation moyenne

L’interprétation mathématique des résultats est basée sur les résultats de Mc Grady
obtenus après ensemencement d’une gamme de tubes à essai pour chaque
dilution d’une suspension mère et le calcul des probabilités qui ont
conduit l’auteur à établir des tables qui sont encore en usage

MODE OPERATOIRE
1ère Etape: Recherche & dénombrement des « CT + ET »

 Préparer des dilutions décimales de l’échantillon mère très concentré,

 Préparer des séries de tubes (2, 3, 5) contenant chacun 9 - 9.9mL de milieu liquide,

bouillon lactosé bilié au Bouillon lactosé au pourpre de

vert brillant «BLBVB Coliformes bromocrésole «BCPL»)
(avec cloche) (avec cloche)

Milieu de Rothe Milieu de Litsky avec

avec azide de sodium Entérocoques azide de sodium + ethyl violet
(agent sélectif) (agents sélectifs)
 Ensemencer un volume connu (0.1 - 1mL) de l’échantillon mère et de ses dilutions,
 Incuber les tubes à température et temps adéquats,

Lecture des résultats

1 Pour les coliformes totaux (CT)

Les tubes présentant un trouble, un virage d’indicateur du pH coloré (cas de l’eau)

avec dégagement de gaz seront considérés comme positifs

2 Pour les entérocoques totaux (ET)

Les tubes présentant juste un trouble seront considérés comme positif

 Pour chaque série de tubes de la même dilution, compter le nombre de tubes positifs,
 Déterminer le nombre caractéristique composé de trois chiffres,

Il correspond à 3 dilutions successives et la 1 ère dilution utilisée est la plus forte

et ayant donné le plus grand nombre de tubes positifs)

Théoriquement, le chiffre correspondant à la dernière dilution égale à zéro (n = 0)

Dans le cas (n = 1) pour la dernière + l’avant dernière, la valeur obtenue peut être
ajoutée au dernier chiffre du nombre caractéristique
 INTERPRETATION DES RESULTATS & LES COMBINAISONS POSSIBLES

Si la lecture d’une galerie de 3 tubes a donné le résultat 3211

le nombre caractéristique « 322 »

Si le nombre de germes est faible dans la suspension mère, on peut ne pas obtenir
le chiffre maximum possible pour le premier tube, il faut prendre alors
les chiffres des 3 premiers tubes quels qu’ils soient
(exemple: 100 ou 200)

Si les dilutions sont insuffisantes et plusieurs chiffres du nombre caractéristique

correspondent au nombre maximum possible, on prend donc les chiffres
des 3 dilutions les plus fortes (333, 332 ou 331)

Si les tubes peu dilués négatifs précèdent ceux positifs, il peut s’agir donc
d’une inhibition due au produit de départ et qui disparaît avec la
dilution. On ne tient pas compte alors des tubes négatifs
(exemple: 002211 se traduira par 211 ou 222)

Remarque : il est possible d’effectuer des numérations d’une seule dilution en ensemençant
« N » tubes de cette dilution et pour la lecture, appliquer la formule : NPP = N. ln [N/ (N-X)].

N = nombre de tubes ensemencés, X = nombre de tubes positifs.

 Détermination du nombre caractéristique avec toutes les possibilités de lecture

 Grouper en nombre de 3 chiffres la suite des chiffres obtenue en commençant par le chiffre
obtenu pour la plus faible dilution dont le maximum de tubes est positif, dans l'exemple: 210,

 Lire la valeur du NPP correspondante au nombre caractéristique sur la table de Mac Grady,

 Nombre de bactéries = NPPx1/vx1/d. La valeur de la dilution correspondant au premier

chiffre dans l'exemple. D’après la table, pour 210, le NPP égal à 1.5.
2ème Etape: Recherche et détection des « CF + EF »
A partir d’un tube positif de la 1ère étape, inoculer un tube contenant le bouillon lactosé bilié au
vert brillon avec un autre de l’eau peptonée exempte d’indole (CF) et pour les (EF), un tube
contenant le milieu de Litsky
Incuber l’ensemble des tubes à 44°C
Lecture et interprétation des résultats
CF:

EF:
 2. Méthode de NPP en microplaques (NF EN ISO 9308-3)

Elle est appliquée pour la recherche et le dénombrement des coliformes fécaux

et des entérocoques fécaux dans les échantillons d’eaux

Généralités sur les microplaques

 Chaque microplaque comporte 96 puits (8 rangées de 12 puits) ,

 Le substrat de l'activité enzymatique bactérienne recherchée est constitué de

MUG MUD
= =
(4-méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide) (4-méthylumbelliféryl-β-D glucopyranoside)

coliforme fécaux entérocoques fécaux.

La réhydratation du milieu se réalise lorsque l’eau à analyser est introduite dans les puits

Présence des coliformes fécaux

Hydrolyse de MUG 4-méthylumbelliférone + glucuronide
 Présence d’entérocoques fécaux
Hydrolyse de MUD 4-méthylumbelliférone + glucose

Le 4-méthylumbelliférone est un composé à fluorescence bleue qui peut être

observée à l'aide d'une lampe UV proche du visible à 366 nm

Quantification des Escherichia coli dans les eaux

(NF CEN ISO 9308-3, 1999)

Remarque: Pour les eaux chlorées, bromées ou ozonées, ajouter stérilement du thiosulfate de
sodium en excès dans le récipient collecteur pour neutraliser les oxydants et obtenir une totale
récupération des micro-organismes

MODE OPERATOIRE

 Homogénéiser l'échantillon pour obtenir une répartition homogène des bactéries,

 Réaliser une 1ère dilution au demi (les diluants : BR003, BM088 ou bien BM115),
 Préparer le reste des dilutions à l'aide d’un diluant cité selon le cas,
 Transférer la 1ère dilution dans un récipient stérile approprié,
 Inoculer 200μL dans chaque puits de la microplaque à l'aide d'une micropipette,

Le nombre de dilutions à ensemencer est fonction de la nature e

et du niveau de contamination de l’eau
 Le remplissage des puits doit être effectué soigneusement pour éviter
les risques de contaminations croisées

Opérer de manière identique avec les autres dilutions préparées (1/20, 1/200, 1/2000, etc.),
 Recouvrir chaque microplaque avec l'adhésif stérile fourni dans le coffret

Ce dispositif permet de limiter la déshydratation du milieu ensemencé dans

les puits et de protéger le système des contaminations pendant la période d'incubation

 Incuber à 44 ± 0,5°C pendant 36h au minimum et 72h maximum.

Lecture & interprétation des résultats

 Observer les microplaques sous une lampe à UV à 366 nm et à l’obscurité,

 Compter le nombre de puits avec fluorescence bleue pour chaque dilution,
 Déterminer le nombre caractéristique à partir du nombre de puits positifs pour chacune des
dilutions choisies.

La lecture peut être effectuée au-delà de la période d'incubation minimale

du fait que la fluorescence ne diminue pas au cours du temps

Le nombre caractéristique doit se terminer par un zéro « 0 »

.
Escherichia coli (+) fluorescence bleue (Enzymz d’hydrolyse β-D-glucuronidase)

Les plages de mesures du nombre de bactéries détectées sont indiquées dans le tableau ci-
dessous.

Tableau 5. Mode opératoire, lecture et expression des résultats

Nature Nombre Nombre Plages de mesures

de l’échantillon de dilutions de puits/dilution (bactéries/100 mL)

Eaux 2 64 puits au 1/2 1,5 x 10 1 à 3,5 x 10 4

de baignade 32 puits au 1/20

Autres eaux 4 24 puits au 1/2

de surface 24 puits au 1/20 4,0 x 10 1 à 3,2 x 10 6
24 puits au 1/200
24 puits au 1/2000

Eaux résiduaires 6 16 puits au 1/2 jusqu'à 6,0 x 10 1 à 6,7 x 108

et stations d’épuration 16 puits au 1/200 000
 Calcul du NPP et de son intervalle de confiance

Le NPP est l'estimation statistique de la concentration des germes

recherchés dans l'échantillon analysé

Elle répond à la loi de Poisson et Les limites inférieures et supérieures

correspondent à un intervalle de confiance de 95%

Exemple sur les eaux de baignade

 Ensemencer 2 dilutions successives (1/2, 1/20) dans 64 & 32 puits,
 Déterminer le nombre caractéristique, le NPP et ses limites après incubation

Lecture et expréssion des résultats

Dilution 1/2 : 25 puits positifs sur 64 le nombre caractéristique est de 25/3

Dilution 1/20 : 3 puits positifs sur 32

Par comparaison avec la table statistique fournie, l'exemple 25/3 indique

NPP = 524 E. coli/100 mL,

Limite inférieure = 360 E. coli/100 mL,
Limite supérieure = 763 E. coli/100 mL
 Méthodes alternatives

1 Méthodes Chromogéniques
Ce sont des méthodes de microbiologie classique utilisant
des milieux de culture sélectifs ou électifs

Le principe de ces méthodes est basé sur les activités métaboliques et

enzymatiques spécifiques des microorganismes (bactéries)
(un groupe un genre ou une espèce donnée)

Le composé final résultant des réactions métaboliques & enzymatiques

est coloré ce qui donne une coloration spécifique aux colonies
Exemple
 Recherche & dénombrement de L.monocytogenes milieu chromogénique « ALOA »
pour la détection de l’activité β-glucosidase (EN ISO 11290-1 et ISO 11290-2)

 Recherche & dénombrement de L.monocytogenes mlieu RAPID’ L.mono

pour la détection spécifique de la phosphatase C et son inaptitude de métaboliser le xylose
a été validé selon la norme ISO 16140 comme méthode alternative à la norme de référence
(NF EN ISO 11290-2)
 Recherche & dénombrement des coliformes + E.coli RAPID’E.coli 2
pour la detection simultanée de 2 activités enzymatiques (β-D-glucuronidase + β-D-
galactosidase)

Coliformes (Gal+ / Gluc-) Colonies bleues à vertes,

E.coli (Gal+ / Gluc+) Colonies violettes à roses.

Les milieux chromogéniques selectifs RAPID pour la détection d’activités

enzymatiques permettent la recherche et le dénombrement d’un grand
nombre de bactéries (Salmonella, Staphylococcus, Listeria campylobacter, ect...)

2 La Cytométrie en flux
Elle faire défiler des particules, des molécules ou des cellules à grande vitesse dans
le faisceau d'un laser. La lumière réémise par diffusion ou fluorescence
permet de visualiser et de dénombrer ces particules

Les signaux mesurés sont liés aux

 Propriétés optiques intrinsèques des particules qui correspondent à la diffusion lumineuse

(fonction des dimensions de la particule),
 A la fluorescence obtenue par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions
cellulaires. Les marqueurs utilisés sont dits de viabilité et ne marque que les cellules vivante
Principe de la cytométrie de flux selon J.P Robinson
 MODE OPERATOIRE

 Préparation de l’échantillon à analyser,

 Réalisation d’une coloration avec un fluorochrome,
 Injection d’un volume connu de la préparation au centre de la veine liquide,
 Chargement électrique de la veine liquide,
 Fractionnement de l’échantillon en une succéssion de gouttelettes,
 Exposition des cellules au faisceau laser en un flux très fin une par une, ce qui provoque leur
fluorescence,
 Mesure de la lumière difractée par les cellules au travers des capteurs,
 Transfert des informations à un ordinateur,
 Déviation de la gouttelette contenant la cellule en passant dans un champ électrostatique, et
récupération dans un récipient collecteur.

Remarque : Si la cellule appartient à une sous-population non sélectionnée, ou si la gouttelette

formée ne contient pas de cellule, la veine liquide ne sera pas chargée et la gouttelette va être
éliminéé (Tri cellulaire).

La CMF se distingue par cinq caractéristiques

Analyse Analyse Tri cellulaire Rapidité Sensibilité de détection

quantitative multi-paramétrique
(Cellule par cellule)
 3 Méthodes immunologiques

Elles sont capables de détecter les microorganismes

pathogènes (Salmonella, ect..) et des toxines

Exemple

Tests Tests Tests Tests

d’agglutination immuno-précipitation immuno-enzymatique immuno-concentration

Le pré-enrichissement & l’enrichissement sont obligatoires pour réaliser

ces tests, car la detection demande ≈ 104 cellules / mL

Tests immuno-enzymatiques
Ils sont basés sur la reconnaissance d’antigènes spécifiques du
germe recherché dans les milieux d’enrichissement

Actuellement, il existe 2 principes différents utilisant une phase solide lors

de la réaction pour permettre la fixation du complexe Ag-Ac
 a. Recherche par réaction immuno-enzymatique de type ELISA ou ELFA

Test ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) Révélation par colorimétrie

Test ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) Révélation par fluorescence

La révélation immuno-enzymatique remplace l’isolement sur boite pratiqué dans

le cadre des méthodes de référence et permet de gagner 24 à 48h

Réaction ELISA (Technique sandwich)

Etapes de travail:

 Fixer l’anticorps aux parois d’un support solide (tube, cupule, ect,..),
 Incuber le produit contenant ou susceptible de contenir les antigènes dans ce récipient,
 formation d’un complexe Ag-Ac,
 Ajouter le conjugué Ac-enzyme au système,
 Formation d’un complexe avec l’anticorps ayant fixé l’antigène
 Ajouter le substrat de l’enzyme pour visualiser la fixation,

La réponse est proportionnelle à la quantité d’antigène

Ce test est réalisé en routine pour rechercher Salmonella dans 2h

 Anticorps spécifique Substrat
Couplé à une enzyme

Bactérie/Antigène Produit coloré

ou
Anticorps spécifique Fluorescent

Réaction ELFA (Immuno-fluorescence)

Pour la détection de Salmonella

Etapes de travail:

 Sur une lame propre, réaliser un frottis à partir de 1μL de milieu d’enrichissement,
 Selon la méthode, ajouter des anticorps anti-Salmonella conjugués à la fluorescéine,
 Observer les lames au microscope à épifluorescence,

Le seuil de détection est d’une bactérie pour 100 champs

soit ≈ 104 cellules/mL de milieu d’enrichissement

Il n’y a pas de faux négatifs mais ≈ 20 % de faux positifs

 Réaction immuno-concentration
(immuno-capture)

Principe
Il repose sur l’utilisation d’anticorps spécifiques aux bactéries recherchées
couplés à une bille magnétique pour capturer et concentrer les germes

Pour détecter les germes on procède

soit à un ensemencement sur boite de gélose

soit par la méthode immuno-enzymatique

Cette méthode permet de réduire le temps nécessaire pour l’étape d’enrichissement

Anticorps spécifique couplé à une bille magnétique

Aiment

Milieu gélosé
Principe de la recherche par réaction immuno-concentration
Remarque : Ces 2 méthodes peuvent donner des résultats faussement positifs lors des réactions
croisées à cause de certaines espèces qui peuvent porter des antigènes proches de ceux de
l’espèce cible et seront reconnus par les anticorps. Ce type de résultats à été observé surtout dans
le cas d’utilisation d’anticorps poly-clonaux contrairement aux anticorps mono-clonaux plus
spécifiques. Des résultats faussement négatifs peuvent aussi être obtenus si le germe ne porte pas
l’antigène cible.

Méthode de fixation de phage spécifique (Lysotypie)

Elle consiste à étudier la sensibilité ou la résistance d’un germe à des bactériophages

La lysotypie est une méthode plus discriminante que la sérotypie

Elle permet de distinguer des types à l'intérieur des sérotypes donnés

MODE D’ACTIVITE

Les protéines de surface du phage se lient aux récepteurs spécifiques à la

surface du germe et la sensibilité de ce dernier au phage spécifique
se manifeste par une plage de lyse cellulaire

Exemple
pour le sérotype Salmonella typhimurium, 37 phages sont utilisés
pour classer les souches parmi 210 lysotypes
 4 Méthodes de biologie moléculaire

Elles sont très rapides avec des résultats très satisfaisants

Elles sont appliquées pour la recherche & la détection des

microorganismes pathogènes ou non

La PCR (Polymerase Chain Reaction)

Elle est rapide, spécifique et permet l’identification des germes par la

mise en évidence d’un ou plusieurs fragments de leurs génomes

Elle est basée sur l’amplification des fragments d’ADN

spécifiques du germe recherché

Une réaction de PCR correspond à la succession de 30 cycles

avec 3 étapes différentes pour chacun à savoir:

1. Dénaturation d’ADN (séparation des doubles brins) par élévation de la T°C (chauffage à
95°C),
2. Hybridation des amorces suite à une diminution de la T°C (40 - 45°C, en fonction de la
longueur et de la séquence des amorces),
3. Elongation des brins d’ADN grâce à la Taq Polymérase à partir des deux amorces, suite à
l’augmentation de la T°C à 72°C (T°C optimale pour l’action de la Taq Pol, enzyme
permettant la synthèse d’ADN «ajout des nucléotides »).

Hybridation ADN-ADN ou ARN-ARN

Elles sont très spécifiques et simples et appliquées pour la recherche et la détection

rapide (Présence ou absence) des germes pathogènes ou des virus dans les
produits de bio-industries agro alimentaires et de l’environnement

Puce à ADN
Définition

C’est un ensemble de molécules d'ADN fixées sur

une petite surface (verre, silicium, ect,…)

Des dizaines de milliers de sondes peuvent être fixées sur une même puce, ce qui permet
de rechercher plusieurs germes différents en même temps dans un échantillon

Le séquençage de l’ADN
Il consiste à déterminer la séquence nucléotidique
d’un gène ou d’un fragment de gène
 Produits pharmaceutiques

1. Produits cosmétiques
Ce sont des substances ou des préparations destinées à être mise en contact
avec les diverses parties superficielles du corps humain

Cosmétique = médicament à usage cutané

La maitrise des bonnes pratiques de fabrication (BPF) et d’hygiène (BPH) est obligatoire

Les analyses microbiologiques sont réalisées le plus souvent sur

Matières premières Produits intermédiaires Produits finis Système conservateur

+ +
ingrédients produits en vrac
Les analyses microbiologiques concernent aussi

L’atmosphère Les surfaces Le personnel

Germes critère d’hygiène générale

 Recherche & dénombrement de la flore mésophile aérobie totale (F.M.A.T)…… ISO 21 149
 Recherche & dénombrement de la flore mésophile totale (F.M.T)
 Germes pathogènes à risque pour la peau

 Recherche & détection de Staphylococcus aureus,

 Recherche & détection de Pseudomonas aeruginosa ,
 Recherche & détection de Candida albicans ,
 Recherche & détection d’Escherichia coli

Germes indicateurs de contamination fécale

 Recherche & détection d’Escherichia coli

Contrôle de qualité microbiologique des produits finis

Neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit

La validation de la neutralisation est réalisée en contaminant le produit avec des souches

de référence et en effectuant le dénombrement par comparaison avec un témoin sans produit

Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa ou E.coli Candida albicans

ATCC 6538 ATCC 9027 ATCC 8739 ATCC 1023

Au cours de la lecture L’écart entre le témoin et l’essai

ne doit pas excéder 50% (0,3 log)
 Recherche & détection de micro-organismes spécifiés et non spécifiés
Enrichissement (Eugon)
Isolement (TSA)

Gram

Non
Coque G + Bacille G- autre Levure

Catalase + Catalase -
Catalase +
Non Non
Non Non
Kit d’identification Kit d’identification Kit d’identification Kit d’identification
adapté adapté adapté adapté

S.aureus ? P. aeruginosa? E. coli? C. albicans

Présence de Présence de Présence de Présence de

S.aureus ? P. aeruginosa? E. coli? C. albicans

Présence d’un micro-organisme non spécifié

 Tableau. Recherche & détection des germes pathogènes
Souche et norme Ps. aeruginosa St aureus E.Coli C.Albicans
(ISO 21 150) (ISO 21 718) (ISO 21 148) (ISO 18 416)

Milieu Cétrimide Baird parker Mac Conkey SDA

Colonies Pigment jaune-vert Colonies noires et Colonie rouge Colonies convexes

caractéristiques (pyocyanine), brillantes, entourées brique; peut être et crémeuses, de
fluorescent sous d'un halo clair (de 2 entourée d'une zone couleur blanche à
rayonnement UV mm à 5 mm) de bile précipitée. beige

Méthode Gram Gram Gram Gram

d’identification* Test enzymatique Test enzymatique Test enzymatique Test de
Isolement sur Test coagulase Isolement sur EMB filamentation
« Pseudomonas P » (24 à 48 H à Test de
(24 à 48 H à 32,5°C) chlamydosporulatio
32,5°C) n

Résultat Bacille Gram – Coque Gram+ Bacille Gram – Cellules ovoïdes

Oxydase + Catalase + Oxydase – violettes
Colonies entourées Coagulase + Colonies bleu noir à Filaments
d’une zone bleu- reflet métallique sur Chlamydospore
verte (pyocyanine) EMB Blastospore
ou rouge marron
(pyorubine)
 Lignes directrices du Comité Scientifique des Produits de Consommation

Catégorie de produit FMAT Germes pathogènes

Catégorie 1* ≤10 2UFC/ g ou mL Absence dans 0,5 g ou mL

Catégorie 2 : ≤10 3UFC/ g ou mL Absence dans 0,1g ou mL

* destinés aux enfants < 3 ans ou en contact avec les yeux et les muqueuses recommandation du SCCP

PR NF EN ISO 17516 (août 2013) Cosmétiques – Microbiologie – Limites microbiologiques

La recherche et l’identification des microorganismes pathogènes

dans les produits finis sont réalisées dans le cas ou les résultat
du dénombrement de la FMAT sont très importants

Un produit cosmétique fortement contaminé ou contenant germes pathogènes

peut avoir des conséquences graves sur l’écologie cutanée de l’utilisateur
surtout sur une peau lésée ou chez des individus peu résistants
 2. Préparations médicamenteuses
Ce sont des préparations médicales utilisées pour
prévenir, restaurer et traiter les maladies

Produits finis + en vrac Matières premières Matériel de conditionnement

Types de médicaments & les analyses réalisées

Médicaments Médicaments
obligatoirement Stériles non obligatoirement stériles

Essai de stérilité Recherche & dénombrement des germes

aérobies viables totaux + Levures
+
Recherche & détection des germes spécifiés
Pseudomonas aeruginosa, E. coli,
Staphylococcus aureus, Candida albicans
Salmonella

Recherche de
germes + endotoxines
 MILIEU HOSPITALIER & PRELEVEMENTS BIOLOGIQUES

Types de prélèvements réalisés

Prélèvements poly-microbiens Prélèvements mono-microbiens

Selles + gorge + crachats, ect, .. Sang + urine + liquide amniotique, ect,…

Enrichissement Milieux non sélectifs riches

(Ex: Salmonella) (Hémocultures Sang)

Isolement
Milieux sélectifs
et discriminatifs Identification

Identification
 Caractères culturaux
(temps + T°C de croissance, ect…)
 Caractères morphologiques macroscopiques + microsp
 Caractères biochimiques
 Analyses microbiologiques réalisées

Analyse microbiologique qualitative Analyse microbiologique quantitave

(pour quelques prélèvements)

Rechercher de germes responsable s

d’une infection ou trouble de santé
(germes pathogène sou toxiques)

Les analyses effectuées dans le domaine de santé humaine

Examen cytobactériologique des urines (ECBU)

Examen bactériologique des selles (Coproculture)
Examen bactériologique des prélèvements de gorge
Examen bactériologiques des prélèvements de sécrétions bronchiques
Examen bactériologiques des prélèvements génitaux chez la femme et l’homme
Examen bactériologiques des prélèvements de suppurations, plaies surinfectées
Examen bactériologiques du liquide céphalo-rachidien (LCR)
Examen bactériologiques du sang (Hémoculture)