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Qu’est-ce qu’un biofilm?
Communauté de micro-organismes fixés à une surface, enchâssés
dans une matrice d’exopolymères
Processus naturel
Structure vivante, dynamique, en perpétuel
remaniement
Dominant en milieu hostile
Structure et physiologie du biofilm =>
conditions d’organisation sociale proches
de celles qu’établissent entre elles les
cellules eucaryotes au sein des tissus
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Qu’est-ce qu’un biofilm?
Mode de vie ubiquitaire
Observé sur tous types de surfaces
tissus animaux & végétaux
matériaux chimiquement inertes
Observé pour tout milieu de suspension
air
liquide
aliment
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Les biofilms en IAA…
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Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Chaînes de transformation des aliments : rôle majeur dans la
contamination des produits
1996-1998: 40% des TIAC = conséquence d’une contamination des
équipements (Haeghebaert, 2001)
+ récemment: ~ 25% des infections par les aliments dues à une
contamination durant le procédé de transformation
Japon 2000: > 14 000 personnes malades par consommation de lait
contaminé (vanne encrassée)
Problème domestique
Surfaces des cuisines à l’origine de nombreuses contaminations
30% des salmonelloses
nombreuses épidémies à Campylobacter, E. coli O157
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Où trouve-t-on les biofilms en IAA
Ateliers (viandes, poissons, fromages, etc.)
Équipements
Murs, sols
Aération, air conditionné, écoulement des eaux usées, siphons
Équipements fermés (produits laitiers, etc.)
Circuit de fabrication
Conditionnement
Circuit de nettoyage
Cuisines collectives ou non
Surfaces en contact direct ou non avec les aliments
+/- Éponges, torchons
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Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Aliments / ingrédients
Feuille de salade
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Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Surfaces d’équipements
Industrie de la viande
=> Surface de réfrigérateur
ex: Listeria monocytogenes
Pisciculture
=> Surface de bassin
ex: Yersinia ruckeri
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Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Domestique, restauration
Planche de découpe
Eponge
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Les biofilms en environnements agro-alimentaires
Domestique, restauration
Torchons
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Spécificités de ces biofilms
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Bactéries capables de se développer dans les
conditions difficiles rencontrées en environnement
d’ateliers
(dessiccation, présence de sel, pH acides, T° basses, …)
Rôle du matériau
• physico-chimie de surface
• topographie
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Exemples de micro-organismes pathogènes en
biofilms d’environnement agroalimentaire
L. monocytogenes (biofilms mixtes, adaptation au froid)
acier, polymères (tapis convoyeurs, bacs saumurage), bois (maturation
fromage), siphons
filière lait, viande, poissons, légumes
Salmonella spp.
acier, ciment, polymères, verre
filières volaille, viande (abattoirs), eau
E. coli
acier (couteaux), polymères (tapis convoyeurs)
filière viande
Bacillus cereus… (cellules végétatives et spores)
acier (conduites, tanks, remplisseuses), polymères (joints), papier
filière lait, légumes
.15
Exemples de micro-organismes d’altération en
biofilms en environnement d’IAA
Pseudomonas spp. (biofilms hébergeant Listeria, Salmonella)
sols, aliments (viande), siphons, eau
filière lait (bas pH), viande, légumes, fruits
Bactéries lactiques
Lactobacillus sake (viande)
Carnobacterium spp. (lait, viande, poisson)
Bactéries thermorésistantes
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Détection de souillures
.17
Choix du protocole
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Caractéristiques du test à prendre en compte?
Vitesse
Tests biochimiques.
Surveillance et vérification des procédures de nettoyage et désinfection.
Sensibilité, exactitude
Tests microbiologiques, PCR, visualisation directe des surfaces
Établissement de la validité des méthodes de surveillance
Simplicité
Facilité de mise en œuvre ou automatisation complète
Reproductibilité
Influence du manipulateur…
Coût
Méthodes par contact…
Technique reconnue
Publiée ou testée par organismes reconnus
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Caractéristiques de la souillure à prendre en compte?
Constituants du biofilm
Microorganismes / matière organique / matière minérale
Etat des microorganismes
Vivants et cultivables
VNC
Morts
Où se situe le biofilm?
Accessibilité ou non
Surface place lisse / recoin / surface rugueuse
Pop. totale
Pop. cultivable
Objectif
Diagnostic de la pertinence des produits et procédures d’autocontrôle sur la
détermination du niveau d’encrassement par des souillures complexes à l’issue
des opérations de nettoyage et désinfection
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Outils de contrôle de l’hygiène des surfaces
Evaluation de l’hygiène des surfaces
Souillure
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Approche expérimentale
.23
Méthodes d’étude
Biofilms
3 souches bactériennes (IAA)
• Pseudomonas fluorescens D3-276 (produits laitiers)
• Escherichia coli CECT 434 (légumes)
• Bacillus cereus CUETM 98/4 (produits laitiers)
Matériaux 1 6 2
Très répandus dans les IAA
• Acier inoxydable 304 2B (1)
• Acier inoxydable 304 2R (2)
• Polyéthylène (3)
• Polypropylène (4)
4 3 5
• Téflon (5)
Verre (6)
.24
Propriétés des matériaux
Acier Acier
Verre Polypropylène Téflon Polyéthylène
inoxydable 2R inoxydable 2B
Rugosité moyenne
<0,01 0,02 0,13 0,14 0,45 11,61
Ra (µm)
Angle de contact à .25
25,5° 43,0° 50,3° 97,1° 113,0° 89,0°
l’eau
Mode opératoire
Production de biofilms
Immersion horizontale
Incubation 24 h à 25°C
Méthodes test Coloration
incubation
48 h à 30°C
Dénombrement
.26
Décrochement par frottis
.27
Outils de décrochement
Ecouvillons (différentes « tiges », différents matériaux de prélèvements…)
Coton (Copan)
Rayonne (Copan)
Fibre de Polyester (Texwipe)
Nylon floqué (Quantiswab, Copan)
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Outils de décrochement
Mousse Polyester biseautée (Enviro-Swab, 3M)
Chiffonnette (Grosseron)
.29
Efficacité des outils de prélèvements, rôle du matériau
.31
Méthodes par contact
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Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact
Géloses contact:
Pétrifilms™ (Coliformes et
Flore Totale, 3M)
Lames bifaces gélosées
(Coliformes et Flore Totale,
LiofilChem)
Boîtes contact (Flore Totale,
ATL)
Résultats proches pour les 3
méthodes
.33
Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact
Boites contact (RODAC, ATL)
Gélose présentant ménisque convexe
Reproductibilité de pression et durée => applicateurs
Applicateur (500 g, 10 s)
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Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact
PétrifilmTM 3M
Double film
• partie inférieure contenant un milieu déshydraté
(réhydratation de 30 min à 1-2 h)
• film supérieur quadrillé pour le dénombrement
Reproductibilité de pression et durée => applicateur
Lecteurs automatiques disponibles commercialement
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Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact
Lames gélosées (LiofilChem)
Lames biface (milieux différents)
Application manuelle
Incubateur
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Outils de détection des souillures microbiologiques par
contact
Intérêts / inconvénients
Facilité d’utilisation
Empreinte d’une surface => localisation précise d’une contamination
Consommables bon marché (1-2 €) +/- mini-étuves, applicateurs et
portoirs commercialement disponibles
Accessibilité nécessaire
• Géométrie
• Surfaces plates et lisses [boîtes contact]
Récupération partielle des souillures
• Bonne sur surface mouillée, moins bonne parfois sur surface sèche
• +/- reproductible [ex : lames gélosées, pas d’applicateur]
Incubation longue (24 h à 72 h)
Problème des cellules mortes et VNC, de résidus bactéricides
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Méthodes biochimiques
.38
Outils biochimiques
.39
Outils biochimiques
Protéines :
Clean-Trace Plus (3M)
Clean-Trace Instant (3M)
Pro-Clean (Hygiena)
Rida et Path-Check (R-Biopharm
/ Microgen)
Flash (Biocontrol)
.40
Outils biochimiques
Protéines, sucres et lipides :
Clean Test (LiofilChem)
Glucose/lactose :
Spotcheck Plus (Hygiena)
NAD(P)/NAD(P)H :
Speed Check (Ecolab)
Résidus alimentaires :
Vericleen (Charm)
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Outils biochimiques
Bilan efficacité
Spotcheck Plus (lactose /glucose) pas adapté aux biofilms
Vericleen et Flash : les moins performants surtout sur le Polyéthylène
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Outils biochimiques
Intérêts / inconvénients
Meilleure accessibilité que méthodes par contact
Très rapides (qq secondes à qq minutes)
Très faciles à mettre en œuvre (avec gabarit usage unique [~1 €] ou acier [~25 €])
Sensibilité faible: qq µg qq 10aines µg (selon auteurs)
Influence du manipulateur (pression appliquée, schéma de prélèvement)
Conclusion
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Méthodes biochimiques : méthodes rapides, relativement
sensibles, bon complément aux méthodes microbiologiques
pour détecter des biofilms sur des surfaces