Diagnostic bactériologique des

infections sur biomatériaux

Ecole supérieure des sciences et techniques de la santé de Monastir

04/11/2016
 Biomatériaux
• Toute substance (autre qu'un médicament) ou
une combinaison de substances synthétiques
ou naturelle, qui peut être utilisé (quelque soit
la période de temps) comme un tout ou partie
un système ou une partie de système qui
traite, améliore ou remplace un tissu, organe
ou une fonction du corps.

• tout matériau utilisé dans un dispositif

médical destiné à interagir avec les systèmes
biologiques
Exemples
Pathogénie: Biofilm : Assemblage de bactéries irréversiblement
rôle du Biofilm associées à une surface inerte, incluses dans une
matrice extracellulaire polysaccharidique

Bactéries
planctoniques
Bactéries
sessiles

Attachement Sécrétion de Maturation Détachement

réversible matrice Structure des
extracellulaire tridimensionnelle bactéries
Formation de communications
micro-colonies intercellulaires :
Attachement Quorum sensing
irréversible
 Biofilm Nutriment
s
O2

Surface inerte

Bactéries non adhérentes Bactéries adhérentes (surface inerte et entre elles)

à croissance exponentielle à croissance stationnaire, «SCV»
« vie planctonique » « vie en biofilm »
 Interactions microbes-hôte

• Les biomatériaux sont dépourvus de circulation

sanguine: limitation des défenses de l’hôte →
un très faible nombre de bactéries peut causer
une infection.
 Infections de prothèse ostéo-
articulaires IPOA

• Les infections sont une

complication redoutable des
prothèses articulaires

• Prothèses de hanche et genoux ++

• Manifestations cliniques variables

 3 catégories cliniques

Temps 0–3 mois 3–24 mois >24 mois

Précoce Retardé
Type Post- Tardif
(chronique)
opératoire

Voie
de contamination Péri-opératoire Hématogène (peau,
tractus respiratoire, dents,
infection urinaire)

Signes Fièvre, épanchement, Douleur persistante, Aigü ou subaigü

chaleur, drainage Descellement,
Fistule

Bactéries S. aureus Coagulase-negative S. aureus

Streptococci staphylococci E. coli…
Enterococ P. acnes…
ci…
 Diagnostic bactériologique:
indispensable

La référence pour le diagnostic positif (identifier le micro-

organisme) et le traitement (antibiogramme)
 Diagnostic bactériologique
résultat dépend

Qualité des prélèvements

Rapidité du transport

Techniques utilisées au laboratoire

Prise en charge bactériologique des IOA

Chirurgien orthopédiste
Evacuer / Nettoyer
Prélever

Microbiologiste
Détecter
Identifier
Etudier la sensibilité aux
antibiotiques

Infectiologue
Choisir l’antibiothérapie optimale
 IPOA
Caractéristiques bactériennes

Issues de la flore cutanée Interactions bactéries/matériaux

(contaminants ou pathogènes ?)
Biofilm
 Caractères culturaux modifiés
Différemment  Bactéries déficientes 'SCV’ :
distribuées dans résistantes aux ATB
les tissus  Adhérence au matériel : broyage
sonication
 Bactéries anaérobies

Prélèvement Milieux et
s techniques
 Prélèvements
• Afin de ↓ le risque d’obtenir des résultats
faussement Θ, il est glt recommandé de respecter
un délai min de 15 j par rapport l’antibiothérapie.
• Afin de ↓ le risque d’obtenir des résultats
faussement Ꚛ, il est recommandé de respecter
une asepsie chirurgicale lors du prélèvement.
 Prélèvements pré-opératoires

• Ponction articulaire:
En cas d’épanchement intra-
articulaire ou d’abcès au contact
du matériel ostéo-articulaire
Conserver le liquide prélevé dans la
seringue qui a servi au pvt.
Inoculer des flacons
d’hémocultures pour aérobies et
anaérobies si le délai
d’acheminement >à 2 h, et une
partie du liquide doit être
recueillie dans un tube hépariné
pour l'examen direct : cytologie
et colorations
Fistule ou cicatrice:

- Écouvillonnage superficiel : NON

- Aspiration profonde APRES

Préparation cutanée et rinçage de
la fistule: ?
pvt peu fiable 
Prélèvements per-opératoires

Issues de la flore cutanée (contaminants ou pathogènes ?)

Différemment distribuées dans les tissus

Prélèvements multiples
• 5 prélèvements: au début de
l’intervention, zones
macroscopiquement pathologiques
• Ecouvillons: NON
• Changer d’instrument entre
chaque prélèvement
5 prélèvements per-opératoires

Liquides Solides
 pvt post-opératoires

Liquide de drainage post opératoire

→ Surveillance

positif au même germe

risque accru de rechute ou de récidive

de l’infection
Identification pvt et demande d’analyse
 Sur le prélèvement :
 Nom/ Prénom /Date naissance du patient
 Nom du service prescripteur
 La localisation du site et nature de chaque prélèvement

 Sur le bon de prescription :

 1 bon de prescription par prélèvement
 Nom/ Prénom /Date naissance du patient,
 Nom du service prescripteur
 Nom et fonction du préleveur/prescripteur
 la date et l'heure du prélèvement
 La localisation du site et nature de chaque prélèvement doivent être
renseignées.
 Les informations cliniques :
 antibiothérapie?
 antécédents?
La recherche éventuelle de mycobactérie devra être précisée sur la demande.
 Transport
• Rapide <2h. Si pas possible → milieu de
transport (notamment pour la préservation des
anaérobies)

• Température ambiante
• Il est recommandé que le laboratoire note les
retards d'acheminement des prélèvements.
Au laboratoire: éviter contamination des pvts:
toutes les mainpulations sous PSM Classe II
 Poste de Sécurité Microbiologique type
II: Avant de commencer le travail

• Mettre en marche le PSM

• Vérifier l’alimentation en air et la grille

d’évacuation (obstructions)

• Désinfecter les surfaces internes

• Charger tout le matériel nécessaire

pour le travail immédiat dans le PSM

• Vortex et centrifugeuse à l’arrière
• Du papier absorbant peut être mis au niveau de
la surface de travail
• Séparer le matériel propre du matériel sale

• Laisser le PSM en marche au moins 5 minutes

 Travail au PSM

• Porter les EPI

- blouse de laboratoire boutonnée

- une surblouse avec manches serrées de

préférence réservée au PSM

- gants
• Eviter les mouvements inutiles des mains, bras et
matériel dans la zone proche de l’ouverture
frontale
• Considérations ergonomiques
• Attendre une minute

• Faire les opérations qui génèrent les

aérosols à l’arrière de la zone de travail (à

> 10 cm de la grille frontale)

• Garder les déchets et le matériel

contaminé à l’arrière de la zone de travail

• Ne pas jeter les articles contaminés à

l’extérieur du PSM

• Éviter les contaminations croisées

 A la fin du travail
• Fermer les récipients ouverts

• Désinfecter la surface externe de tous les objets à retirer du

PSM
• Mettre tous les déchets contaminés dans les récipients réservés à
cet effet à l’intérieur du PSM
• Enlever et jeter les gants contaminés. Se laver les mains

• Porter des gants propres

• Désinfecter les surfaces internes du PSM à l’aide d’un

désinfectant convenable non corrosif
• Enlever et jeter les gants contaminés. Se laver les mains
 Prétraitement des prélèvements
• Prélèvements liquides: homogéiniser

• Prélèvements solides:
Broyage Sonication

Mortier/pilon?

Broyeur à bille à usage

unique (Ultra Turax) :
mise dans le poudrier
stérile directement par
le préleveur
-libération des bactéries
de la marice
osseuse/biofilm
-limite les manipulations
et donc les
contaminations
-pas possible pour les
gros morceaux
 Examen direct
• Permettre éventuellement une orientation diagnostic
rapide
• Présence d’une réaction cellulaire? Présence de bactéries ?

doit comporter :
• coloration de Gram : bactéries / morphologie
– sensibilité faible (6 %)

– spécificité (99 %)

• coloration adaptée pour l’appréciation semi-quantitative

des leucocytes et de la formule leucocytaire
 Cytologie
• Liquide articulaire:
• prélèvement recueilli avec citrate ou héparine
• quantification des leucocytes
• formule leucocytaire:
Leucocytes PMN (%)
Liquide articulaire normal <200 <25
Infection sur articulation sans prothèse >50 000 >90
Infection sur prothèse articulaire Hanche >4 200 >80
Genou >1 700 >65
 Culture
Bactéries IOA = biofilm
-donc des bactéries cachées,
engluées et adhérentes
-des bactéries stressées
-des bactéries physiologiquement peu
actives
Bactéries IOA = très diverses
-donc des bactéries aérobies
-des bactéries anaérobies
-des bactéries a croissance
rapide/lente
-des bactéries classiques / des
bactéries exigeantes/non cultivables

- milieux riches variés, nombreux

- incubation longue, sous différentes atmosphères
• Au moins:
- Gélose au sang incubée en aérobie.
Lectures à J1, J2, J5 voire J14
- Gélose au sang cuit supplémentée en
vitamines (= gélose chocolat) incubée
sous 5 à 10 % CO2. Lectures à J1, J2 et
J5 voire J14
- Milieu liquide enrichi tq bouillon Lecture sous Poste de
Schaedler. Lecture régulière jusqu’à J14. Sécurité Microbiologique
(Gram +/- repiquage systématique à J14 s’il classe II
reste clair)
• Autres milieux en fonction du On peut doubler l’ensemencement
contexte (exemple: recherche de des géloses. seconde boite ouverte
que pour la lecture tardive
mycobactéries).

Lecture attentive :
. recherche des différents aspects de colonies
. recherche micro-colonies/SCV : présence de variants métaboliques
 Small Colony Variants
• Apparition de colonies punctiformes
ou de diamètre < au 1/10 à celui d’une
colonie de phénotype normal
• Colonies petites, culture retardée

• Surtout au cours des infections

chroniques

culture positive précoce en milieu solide ne dispense pas

– des lectures suivantes
– d’une incubation complète jusqu’a au moins 14 J
Exemple de culture sur milieu solide
• Rare (1 colonie) Staphylococcus
aureus culture positive en 24h

• Quelques colonies de
Staphylocoque a coagulase
négative a J4

• Nombreuses petites colonies de

P. acnes a J10
• Isoler tous les isolats avec au moins:

– identification et antibiogramme sur les colonies

différentes
• Parfois difficultés d’identification des staphylocoques
à coagulase négative, des streptocoques et des
anaérobies → intérêt du MALDI-TOF
 Détection moléculaire

• En complément des cultures conventionnelles

• 2 stratégies:
- PCR universelle
- PCR spécifique: cible un genre ou une espèce
 Compte rendu

• positivité oui/non
• délai positivité
• nbre prelts +/-
• nbre de milieux et nature +
• nbre de colonies/milieu
• nbre prelts +/- par patient
 Conservation
• Conservation des prélèvements :

congélation -80°C ou -20°C

au moins jusqu’a la fin des incubations
le mieux 1-2 mois, le temps que les cliniciens réagissent
s’ils veulent plus (PCR)
• Conservation des souches :

congélation -80°C ou -20°C

Le plus longtemps possible (rechutes,récidives, …)
 Pathogenèse de l’infection de cathéter

• Infection extraluminale
– Mécanisme dominant la première semaine
• Site d'insertion contaminé lors de la pose
– Contamination secondaire plus rare (pansement)
• Contamination endoluminale
– Colonisation d'un raccord KT - Ligne veineuse
• Manipulations septiques (injections, déconnexion...)
– Flore hospitalière colonisant les mains du personnel soignant
• Hématogène ( <10% )
– secondaire à un foyer infectieux à distance
• Contamination de l'infusat
 Les germes impliqués

• Staphylocoques +++ SCN majoritaires, S.aureus

• Entérobactéries, Pseudomonas et apparentés
• Autres: +/-
 Culture semi-quantitative
Ablation aseptique du KT: technique de MAKI
• n’explore que la portion extra luminale de cathéters
(inconvénient)
• Extrémité distale (5 cm) sur gélose au sang roulée

avec pince stérile

• incubation 48h, 35°C)

• Dénombrement des colonies, seuil > 15 UFC

• Avantage: praticable, simple, répandue

Maki, NEJM, 1977

 Culture quantitative
• Ablation aseptique du KT: technique de Brun-Buisson
• Extrémité distale (5 cm) vortexé 1 min dans 1 mL H2O physiologique
(ou soniquée, 5 mL, 25 khz)
• Mise en culture de 0,1 mL sur gélose au sang,
• incubation 48h, 35°C
• Dénombrement des colonies ramené à 1 mL, seuil >1000 UFC/mL
(sonication idem mais >100 UFC/mL)
• • Sensibilité 88%, spécificité 97%, explore la face
• endoluminale et externe, simple

Brun‐Buisson et al. Arch Intern Med 1987; 147:873

 Diagnostic cathéter en place

• Ecouvillonnage du point de ponction

• Hémocultures différentielles

• Hémocultures quantitatives (abandonnées)

 Ecouvillonnage du point de ponction

• Ecouvillonnage du site (3 cm) et inoculation

sur gélose, dénombrement >15 UFC comparé

à germe obtenu par les hémocultures
• Bonne valeur prédictive négative si <15 CFU
• Intérêt en cas de suspicion mais pas pour

dépistage systématique
 Hémocultures différentielles

• Temps comparé de positivation des HC

• Prélèvement simultané (<10 min) sur cathéter (après purge) et

veine 2x2 hémocultures (volume identique)

• Introduction automate simultanée

• Délai de début de croissance (variation fluorescence) donné par

l’automate doit être transmis (connexion) sur l’édition du résultat

• Une différence de croissance d’au moins 2h pour les flacons issus

du KT/ veine est prédictive de la colonisation du matériel