ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE

Vérification des performances

d’une méthode selon le SH FORM 44 :
application à la coloration de Gram
Hélène Astier-Théfennea,*, Audrey Wolfa, Chrystelle Darlesa, Éric Garnotela

RÉSUMÉ
La coloration de Gram qu’elle se fasse manuellement ou grâce à un colo-
rateur est une étape incontournable mais aussi critique en bactériologie qui
contribue à la fois au diagnostic clinique et à l’orientation thérapeutique.
Il s’agit d’une méthode en portée A de type qualitatif.
L’objectif de ce travail est de contribuer à répondre aux exigences de la
norme ISO 15189 en termes de vérification des performances, d’harmoni-
sation des pratiques professionnelles et d’évaluation des compétences en
respectant le formalisme du document SH FORM 44. L’analyse des risques
est décisive qu’elle se fasse selon la méthode des 5 M ou par l’analyse
des modes de défaillance, de leurs effets et de leur criticité et doit aboutir
à la mise en place de moyens cohérents de maîtrise adaptés à sa propre
pratique. Sur site, l’étude des performances a consisté à évaluer la conta-
mination entre échantillons (n = 12, le bac de coloration et le carrousel du
colorateur ne permettant pas de réaliser plus de 12 colorations de Gram
simultanées) et à comparer la coloration manuelle versus la coloration
automatisée sur système PREVI Color de bioMérieux, sur 20 échantil-
lons de contrôles. Les critères d’acceptabilité ont porté sur la coloration
(Gram positif, Gram négatif) et la morphologie observée (bacille ou cocci)
de 4 souches de référence connues de la Collection de l’Institut Pasteur.
En pratique, si la compétence de l’utilisateur reste un point crucial à maî-
triser, le biologiste doit aussi pleinement s’impliquer, les normes n’étant
pas toujours adaptées, les recommandations des sociétés savantes et la
bibliographie restant rares.
Coloration de Gram – vérification sur site/validation des méthodes –
SH FORM 44 – norme ISO 15189 – accréditation – gestion des risques.
1. Introduction
La vérification sur site/validation des méthodes en biologie
médicale est une des exigences de la norme NF EN ISO
15189 [1]. En effet, dans le paragraphe 5.5, il est indiqué
« Les méthodes et les procédures sélectionnées doivent
être évaluées et donner des résultats satisfaisants avant
SUMMARY
Verification assessment of Gram staining according
to SH FORM 44
Gram staining manually made or in a automated way
is an inescapable but also critical stage in bacteriology
which contributes at the same time to the clinical dia-
gnosis and to the therapeutic orientation. It is about
a qualitative method in impact A.
The aim of this work is to contribute to meet the
requirements of the standard ISO 15189 in terms of
performances’check, harmonization of the profes-
sional practises and evaluation of the skills/know-
how by respecting the formalism of SH FORM 44.
The risks’analysis is decisive that it makes accor-
ding to the 5 M method or by the analysis of the
failure modes, their effects and their criticality and
has to end in the implementation of coherent means
of control adapted to its own practice. On-site, the
study of the performances consisted in estimating the
contamination between samples (n=12, the stain dish
and the carousel of the automated staining system
allowing to realize no more than 12 Gram staining
simultaneously) and to compare the manual Gram
staining versus automated on system PREVI Color
de BioMérieux, on 20 samples of controls. The cri-
teria of acceptability concerned the staining (positive
Gram, negative Gram) and the observed morphology
(bacillus or cocci) of 4 reference bacteria known for
the Collection of Institut Pasteur.
In practice, if the competence of the user stays a crucial
point to be mastered, the biologist so completely has
to get involved, the recommendations of the standards,
the learned societies and the bibliography not being
very numerous still and adapted to the microbiology.
Gram staining – Verification assessment – SH FORM 44 –
standard ISO 15189 – accreditation – risk management.

a Laboratoire de biologie
Hôpital d’Instruction des Armées Laveran d’être utilisées pour les analyses médicales. ». De plus
34, bd Laveran – CS 50004 (paragraphe 5.3), « Il doit être démontré (lors de l’instal-
13384 Marseille cedex 13 lation et au cours de l’utilisation courante) que le matériel
est capable d’atteindre les performances requises et qu’il
* Correspondance est conforme aux spécifications se rapportant aux analyses
biologie.laveran@gmail.com concernées ».
Les méthodes dites reconnues (dispositifs médicaux de
article
ti l reçu le
l 19 décembre,
dé b accepté té le
l 26 février
fé i 2014.
2014 diagnostic in vitro marqués CE ou méthodes « fournisseur »),
© 2014 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés. sont a priori validées dans leur domaine d’application

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461 // 37

 et le laboratoire doit, pour ses méthodes, vérifier qu’elles sont
utilisées dans leur domaine d’application, qu’elles corres-
pondent aux besoins de ses clients (patients/prescripteurs)
et qu’elles sont maîtrisées au sein du laboratoire (« vérifica-
tion de méthodes – portée A »). En revanche, le laboratoire
doit caractériser les critères de qualité de la méthode et la
valider (« validation de méthode-portée B ») dès lors qu’il
ne s’agit pas d’une méthode reconnue ou que celle-ci est
employée hors de son domaine d’application (modification
de la prise d’essai ou de la matrice/milieu biologique,…).
L’objectif est donc de vérifier la mise en application
d’une méthode dans son environnement propre et
de démontrer que la méthode fonctionne correctement
dans les conditions opératoires du laboratoire et qu’elle
donne des résultats sûrs et fiables pour les patients et
les cliniciens, beaucoup de facteurs pouvant affecter ses
performances (conditions d’expédition et de stockage des
réactifs, conditions ambiantes locales, compétence de
l’utilisateur notamment pour les méthodes manuelles…).
En bactériologie, les conditions ne sont pas forcément
simples car il y a beaucoup de méthodes manuelles, les
échantillons de contrôles sont parfois absents, les critères
de performance ne sont pas forcément aussi bien défi-
nis que pour des méthodes automatisées quantitatives :
l’analyse des risques devient alors une étape décisive.
Le biologiste a un rôle majeur à jouer. La vérification de
la coloration de Gram, technique incontournable en bac-
tériologie, est présentée dans cet article. C’est une étape
essentielle mais aussi un point critique en bactériologie.
Qui n’a pas hésité en lisant un Gram d’une hémoculture ?
Qui ne s’est pas trompé dans ce diagnostic ?
2. Quelles sont les informations
pertinentes à connaître
au préalable ?
L’étape de vérification/validation sur site doit être précédée
d’une étape préparatoire, véritable travail d’expertise réalisé
par le biologiste ou un opérateur habilité. La catégorisation
de la méthode est indispensable de façon à appliquer la
méthode de validation prévue.
r Dans un premier temps, il faut définir le type de flexi-
bilité de la méthode (SH REF 08, [2]).
- Méthodes « fournisseur » (portée flexible standard A),
dites adoptées, avec uniquement une vérification de
performances sur site.
- Méthodes adaptées ou développées en interne (portée
flexible étendue B), avec une validation de méthode.
Il est préférable d’adopter chaque fois que cela est pos-
sible des méthodes en portée A. Cela peut paraître simple,
mais dans le cas de méthodes manuelles, cela ne se limite
pas à l’utilisation de réactifs marqués CE ; de plus, le mar-
quage CE correspond à une conformité des produits aux
directives et à une autorisation de mise sur le marché qui
ne correspond pas forcément à un gage de qualité [3].
Il convient aussi de vérifier qu’en pratique la méthode
respecte scrupuleusement les informations figurant sur
la notice du fabricant.
r Puis dans un second temps, il faut connaître le type de
méthodes (quantitatif ou qualitatif, manuel ou automatisé).
38 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461
- Les méthodes de type quantitatif fournissent un résultat
chiffré. Sont également assimilés au type quantitatif, les
examens fournissant un résultat de type qualitatif, extra-
polé à partir de la mesure d’un signal continu quantifiable,
avec interprétation par rapport à un seuil.
- Les méthodes de type qualitatif fournissent un résultat
qui n’apporte pas d’information sur la quantité de l’analyte
(cellule ou organisme) mais seulement sur sa présence
ou son absence (positif/négatif) ou l’identification de la
caractéristique recherchée. On classe dans cette catégorie
les examens où aucune mesure d’une donnée quantifiable
n’est déterminée en continu et ceux dont le résultat est
obtenu par l’observation de la réaction, par comparaison
avec des témoins positif et négatif notamment.
La coloration de Gram en mode (c’est la méthode) manuelle
ou automatisée sur le système PREVI Color Gram (bio-
Mérieux) est une méthode en portée A de type qualitatif.
Dans ce cas, la « validation » correspond à une vérification
des performances annoncées par le fabricant et souhaitées
par le laboratoire en mode manuel ou du couple automate-
réactif, lors de la mise en application dans le laboratoire.
r Il faut aussi donner le principe de la méthode (technique
de coloration) car cela est abordé dans le SH FORM 44 [4]
ainsi que le SH INF 50 [5].
3. Vérification sur site
(portée flexible A) : les étapes
La validation des méthodes en portée A est réduite à une
vérification sur site pour s’assurer que les performances
annoncées et souhaitées sont atteintes dans les condi-
tions de travail du laboratoire. Elle comprend une phase
initiale, avant sa mise en œuvre effective en routine et
une phase de vérification continue et de confirmation des
performances, dans le cadre du fonctionnement normal
et quotidien du laboratoire.
3.1. Vérification des performances
3.1.1. Détermination des critères de performance
pertinents à établir et choix des limites d’acceptabilité
Le choix des critères de performances (spécificité, sen-
sibilité…) et limites d’acceptabilité (seuils) pour une
méthode donnée doit se faire PRÉALABLEMENT à
l’étude expérimentale. Il doit refléter l’état de l’art et la
pertinence clinique sans oublier le bon sens et l’expé-
rience. Il peut s’appuyer sur des recommandations de
sociétés savantes, de groupes de travail, de confé-
rences de consensus, de publications scientifiques, sur
des valeurs limites utilisées pour la gestion du contrôle
interne de qualité (CIQ), sur des résultats de campagnes
de comparaisons inter laboratoire,… et sera confronté
aux données du fournisseur.
Des recommandations sur le choix des critères de per-
formance sont établies dans le SH GT 04 [6] et figurent
dans le tableau I. En bactériologie cependant, il convient
de bien réfléchir au protocole expérimental pour vérifier
ces critères de performance. Les critères d’acceptabilité
devront être choisis sans jamais perdre de vue l’impact
clinique du résultat.
 ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE

Tableau I – Recommandations sur la vérification/validation

d’une méthode d’analyse qualitative selon le SH GTA 04.
Paramètres à vérifier Vérification sur site Validation
Bibliographie
et/ou à connaître Portée de type A Portée de type B

Spécificité analytique Oui Non Oui

Sensibilité diagnostique Oui Non Oui

Contamination entre échantillons (s’il y a lieu) Oui Oui Oui

Stabilité des réactifs (après ouverture, embarqués) Oui Non Oui

Robustesse Oui Non Oui

Comparaison avec méthode de référence Oui Non Oui (si existe)

Comparaison avec méthode déjà utilisée au laboratoire Oui (si existe) Oui (si possible) Oui
Le dossier doit conclure sur l’avis d’aptitude de la méthode ou du système analytique (en cas de dépassement des spécifications choisies a priori par le
laboratoire, celui-ci justifie l’acceptation des écarts pour pouvoir conclure à l’aptitude de la méthode et l’enregistre).

r D’après ces recommandations, on voit que la vérifica- (retard pour le rendu des résultats, mauvais choix de l’anti-
tion bibliographique critique prend toute son importance. biothérapie probabiliste).
Le dossier de validation/vérification peut renvoyer à d’autres
documents (bibliographie, notices fournisseurs, documents 3.1.2. Étude des risques
internes au laboratoire, etc.), correctement référencés et L’étude des risques devant aboutir à identifier les risques
accessibles. pour les maîtriser est une étape décisive notamment pour
r Inversement, la vérification expérimentale sur site en les méthodes manuelles et qualitatives, particulièrement
portée A est plus réduite et s’appuie fortement sur l’étude en bactériologie.
des performances mais aussi sur des études de risques ou L’étude de risques peut se faire selon différentes approches.
encore sur la compétence et la qualification des opérateurs. r La méthode 5 M (ou diagramme de cause à effet ou dia-
Parmi les critères de performance, il est recommandé de gramme d’Ishikawa) est une méthode permettant d’analyser
vérifier sur site, la contamination entre échantillons (s’il y a des situations en se basant sur 5 critères. Elle facilite ainsi
lieu) et la comparaison avec une méthode déjà utilisée au l’identification des dangers associés à l’analyse sans rien
laboratoire si possible (avec des échantillons de contrôle oublier. Les causes produisant un effet sont classées en
ou des échantillons de sérothèque ou d’un autre utilisateur 5 familles nommées les 5 M (figure 1).
de la même technique). La réalisation des vérifications - Matières : en pratique, il s’agit de l’échantillon primaire
expérimentales doit se faire selon un protocole établi par (urine, sang, liquides de ponction…), des récipients utilisés
le laboratoire avec des critères d’acceptabilité définis et (tubes, pot à ECBU…), des additifs (acide borique….),
pourra s’appuyer sur la Fiche Type QUALITATIF (Portée des cultures, des réactifs, des contrôles de qualité.
A, SH FORM 44, [4]). Elle doit aboutir à une conclusion
et une décision quant à la validation opérationnelle de la
technique, au regard des spécifications initialement fixées. Figure 1 – Étude des risques selon la méthode 5 M
En pratique, une fois le protocole établi, il convient de (ou diagramme de cause à effet ou diagramme d’Ishikawa).
préparer les conditions nécessaires à la réalisation de la
méthode : période de validation et opérateur à définir, para-
métrage de la méthode si besoin, acquisition des réactifs
nécessaires, réalisation d’une sérothèque ou acquisition
des contrôles pour la comparaison…
Pour la coloration de Gram, il nous a paru important de
vérifier la contamination entre échantillons car en géné-
ral plusieurs spécimens sont colorés en même temps et
d’effectuer une comparaison entre les deux méthodes
utilisées en routine au laboratoire, coloration manuelle et
automatisée.
Une contamination inter échantillons peut aboutir à un dia-
gnostic erroné et à une mauvaise orientation thérapeutique.
r Les critères d’acceptabilité ont porté sur la coloration
des bactéries (Gram positif ou négatif) et la morphologie
observée (bacille ou cocci) sur des souches de référence
de coloration et morphologie connues. En effet, la nature
du Gram et la morphologie observée ont à la fois des
impacts techniques (choix des milieux à ensemencer,
choix des méthodes d’identification utilisées, choix de
l’antibiogramme à réaliser) et des conséquences cliniques

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461 // 39

 - Milieu : c’est le lieu de travail et notamment son amé-
nagement et son organisation, environnement physique,
éclairage, bruit, conditions ambiantes requises pour réa-
liser une manipulation (ex : température, hygrométrie,…).
- Méthodes : ce sont les instructions, manuels, procédures,
modes opératoires, flux d’informations…
- Main-d’œuvre : les ressources humaines, les qualifications
du personnel, la formation, l’aptitude sont des données
essentielles. Pour mener à bien une analyse, il convient
d’avoir du personnel qualifié, formé, évalué et habilité.
C’est d’ailleurs l’objet de tout un chapitre (paragraphe 5.1)
du SH REF 02 [7].
- Matériel : il est constitué des machines, équipements,
automates, et de leur maintenance…
Le choix, les règles d’utilisation, les contrôles, la main-
tenance, les exigences métrologiques et notamment les
paramètres critiques, les exigences informatiques spé-
cifiques s’il y a lieu doivent être définis. En pratique, une
procédure d’utilisation, de contrôle et de maintenance
du matériel doit être rédigée et prise en compte par le
technicien du poste.
r Une autre approche de l’analyse des risques est
l’AMDEC (analyse des modes de défaillance, de leurs
effets et de leur criticité). Elle consiste à évaluer la criti-
cité (pertinence et gravité) des risques. C’est un outil de
sûreté de fonctionnement et de gestion de la qualité. La
réalisation d’une AMDEC s’intègre avant dans l’analyse
globale du système. En effet, celle-ci permet d’identifier
les fonctions, les contraintes d’utilisation et d’environne-
ment, les paramètres critiques à mettre sous contrôle et
de définir ainsi le périmètre sur lequel l’AMDEC doit être
réalisée. On identifie ensuite de manière systématique les
modes de défaillance possibles liés à l’analyse. On peut
se baser sur l’expérience acquise ou sur des référentiels.
Pour chaque mode de défaillance, on déterminera :
- sa (ses) cause(s) ;
- sa fréquence (F), cotée de la façon suivante : 1 pour une
fréquence de 0 à 1 fois par an, 2 pour une fréquence de
2 à 3 fois par an et 3 pour une fréquence supérieure à
3 fois par an ;
- ses effets ;
- son impact et sa sévérité (indice de gravité G) sur le pro-
cessus analytique et ses incidences sur le diagnostic, le
traitement ou l’épidémiologie : 1 pour aucune incidence,
2 pour une incidence probable et 3 pour une incidence
certaine ;
- les mesures mises en place pour détecter la défaillance ;
- la probabilité de détecter l’anomalie au cours du proces-
sus analytique incluant la phase pré et post-analytique
(indice de détection D) : 1 pour une anomalie détectable
au cours du processus analytique, 2 pour une anomalie
dont la détection peut être possible et 3 pour une ano-
malie non détectable au cours du processus analytique.
Le produit des différents paramètres, indice de fréquence,
indice de gravité et indice de détection, donne l’indice
de criticité (IC) : IC = F X G X D. La priorité sera alors de
maîtriser les effets qui ont le plus haut niveau de criticité.
À chaque laboratoire d’établir ce seuil en fonction de sa
spécificité biologique et clinique.
r Les deux approches peuvent être complémentaires :
identifier les risques selon la méthode des 5 M puis
40 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461
évaluer leur criticité en réalisant une AMDEC. L’objectif est
de maîtriser tous les risques (via les procédures et modes
opératoires sur les phases analytiques mais aussi pré- et
post-analytiques, la maîtrise métrologique, la formation et
l’habilitation du personnel…) et éventuellement de mettre
en place des indicateurs sur les risques de criticité élevée.
En bactériologie, la stratégie de mise en place des CIQ
peut se baser sur cette approche.
Pour la coloration de Gram, la gravité est importante (3)
car une mauvaise coloration peut avoir une incidence à
la fois sur le diagnostic, le traitement ou l’épidémiologie.
La fréquence a été estimée à 2 avec la technique auto-
matisée et à 3 avec la technique manuelle avec un risque
notamment à l’étape de décoloration. La détectabilité a
été fixée à 2 avec les deux méthodes. L’indice de gravité
est donc de 18 pour la coloration de Gram manuelle et
de 12 pour la technique automatisée. Dans les deux cas,
cet indice est élevé. Il a influencé notre stratégie de mise
en place des CIQ (quotidien pour l’automate et à chaque
coloration manuelle) afin de maîtriser à la fois les réactifs
et le processus, et de détecter rapidement une anomalie.
Il a également renforcé l’importance d’assurer un maintien
continu des compétences en faisant participer le maximum
de personnels aux programmes d’évaluations externes de
la qualité. Une étude de risques de la coloration de Gram
est présentée dans le tableau II.
3.2 Confirmation des performances
en pratique quotidienne
Pour maîtriser une technique, l’utilisation, la gestion et
le suivi de contrôles internes de qualité et d’évaluations
externes de qualité (EEQ) sont indispensables. Le labora-
toire pourra s’appuyer sur le Guide technique abordant la
gestion des contrôles qualité (SH GTA 06, [8]).
Il importe donc de mettre en place des CIQ dont la nature,
la fréquence de passage, les critères d’acceptabilité et la
conduite à tenir en cas d’anomalie doivent être définis. Ils
doivent permettre de repérer rapidement toute anomalie
et de mettre en place des actions correctives immédiates.
Par ailleurs, il convient de s’abonner à des programmes
d’évaluation externe. Différents sont disponibles avec
une fréquence de passage de 3 à 4 fois dans l’année
le plus souvent, dédiés à la coloration de Gram (Gram
Bacterial staining direct chez Labquality) ou faisant appel
à coloration de Gram dans le cadre d’une identification
bactérienne (Centre toulousain pour le contrôle de qualité
en biologie clinique, Association de biologie praticienne,
Biologie prospective, Bactérionet…). Ils permettent le suivi
de la méthode mais aussi des utilisateurs et le maintien
des compétences.
4. Le dossier de validation/
vérification selon le SH FORM 44
La constitution du dossier de validation est une étape
décisive.
4.1. Description de la méthode
Pour un analyte ou un mesurande, elle doit définir le prin-
cipe de la mesure et la méthode de mesure, préciser si

Tableau II – Étude des risques de la coloration de Gram selon la méthode 5 M.
Risques
r Allongement des délais de rendu des
résultats, augmentation du risque patient :
échantillons primaires non conformes
(modalités de prélèvement, récipients,
additifs, délais de transport…)
r Rendu de résultats erronés : altération des
milieux de culture, mauvais isolement des
souches pathogènes
Matières
r Absence de réactifs ou réactifs périmés
r Réactifs altérés
r Rendu de résultats erronés
r Allongement des délais de rendu des
résultats, augmentation du risque patient :
mauvaise orientation pour l’identification et
l’antibiogramme
r Rendu de résultats erronés :
ensemencement non-conforme
r Coloration non homogène, difficile à lire :
difficulté d’interprétation, allongement
des délais de rendu des résultats,
Méthode augmentation du risque patient
r Difficulté d’interprétation : lecture du Gram
difficile
r Allongement des délais de rendu des
résultats, augmentation du risque patient
r Rendu de résultats non-valides
r Rendu de résultats erronés : mauvais
pre-étalement des lames, technique de
coloration incorrecte, méconnaissance
Main- du fonctionnement et de la maintenance
d’œuvre du colorateur, mauvaise lecture du Gram,
mauvaise gestion des CIQ
r Non respect des conditions ambiantes
requises
Milieu r Rendu de résultats erronés : mauvais
isolement des souches pathogènes
r Non respect des conditions de santé et de
sécurité du personnel du laboratoire
r Rendu de résultats erronés : technique de
coloration incorrecte
r Difficulté d’interprétation : lecture du Gram
difficile
Matériel r Rendu de résultats erronés : mauvais
isolement des souches pathogènes
Points critiques à maîtriser
r Conditions de prélèvement
et d’acheminement
des prélèvements
bactériologiques (sang, LCR
prélèvements pulmonaires,
urines, selles…)
r Contamination des
milieux de culture lors de
l’ensemencement à J0
r Conservation des géloses
r Gestion des commandes
r Condition de conservation
des réactifs (température,
humidité)
r Choix des milieux de culture
r Qualité de l’ensemencement
r Pré-étalement des lames
r Technique de coloration
r Compétence du personnel
r T° de fonctionnement et
humidité, éclairage
r Contamination des
milieux de culture lors de
l’ensemencement à J0
r Protection de l‘opérateur
r Maintenance
r Exigences métrologiques :
rotation du carrousel
r Intégrité du matériel de
lecture : microscope
r Contamination des milieux
ensemencés par le matériel
d’ensemencement (oëse,
pipette)
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461 //
ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE
Modalités de maîtrise
r Guide des examens de biologie médicale
r Transport et réception des examens de
biologie
r Respect de la documentation interne
r Conditions de conservations conformes
aux recommandations fournisseur
r Test de fertilité (par des souches de contrôle)
r Métrologie des enceintes de stockage des
réactifs et surveillance des températures
r Procédure de gestion des commandes
r Vérification à réception et de la date de
péremption à l’installation
r Certificats de conformité
r Métrologie des conditions ambiantes et
système de surveillance des températures
r Connaissance et respect de la
documentation interne (utilisation et
maintenance du colorateur de Gram,
coloration de Gram manuelle, procédure
de gestion des CIQ)
r Fiches techniques du fournisseur
(bioMérieux) disponibles au poste
r Compétence du personnel
r Résultats des contrôles de qualité internes
r Audits de la paillasse de bactériologie
r Fiche de poste
r Formation interne et externe
r Connaissances et respect des MO et
procédures
r Évaluation et habilitation
r Résultats des contrôles de qualité internes
et externes
r Audits de la paillasse de bactériologie
r Climatisation de la pièce
r Surveillance des conditions
environnementales (température,
hygrométrie)
r Organisation des locaux
r Travail sous PSM
r Maintenance annuelle du PSM
r Bionettoyage des paillasses et contrôle de
surface
r Application des précautions standards
r Audit des bonnes pratiques professionnelles
r Procédure de maintenance connue du
technicien
r Vérification métrologique de la rotation du
carrousel
r Entretien et suivi métrologique de l’oculaire
r Résultats des contrôles de qualité
(souche ATCC, CQN, CIL)
r Essai à blanc
41
 les réactifs sont marqués CE ou pas, ce qui influence la
nature de la portée flexible (obligatoirement B s’ils ne sont
pas marqués CE) et donner le codage du contrôle national
de qualité, s’il y a lieu.
4.1.1. Application à la coloration de Gram manuelle [9]
4.1.1.1. Principe
La coloration de Gram est basée sur l’affinité tinctoriale
différente des bactéries à certains colorants due à la consti-
tution de leur paroi. Cette coloration permet aussi d’observer
la morphologie des bactéries (formes allongées pour les
bacilles et arrondies pour les cocci).
Le principe de la technique est le suivant : le cristal violet
oxalaté colore la paroi de toutes les bactéries en violet,
le lugol est un mordant qui fixe le violet, l’alcool acétone
décolore les bactéries qui ont une membrane perméable
à l’alcool, la fuschine colore en rose les bactéries déco-
lorées par l’alcool, ainsi, les bactéries Gram négatif sont
colorées en rose et les bactéries Gram positif en violet.
4.1.1.2. Méthode de mesure
Les lames préétalées sont colorées manuellement à l’aide
de réactifs prêts à l’emploi.
4.1.2. Application à la coloration de Gram
automatisée sur le système PREVI Color Gram [10]
4.1.2.1. Principe
Les lames préétalées sont disposées dans un carrousel et
sont soumises à une rotation. Chaque réactif est associé à
une buse de vaporisation qui permet de délivrer la quan-
tité adéquate (gestion de la consommation de colorant).
Les réactifs sont alors pulvérisés séquentiellement sur
les lames : coloration au cristal violet (buse C), lavage des
lames à l’eau distillée (buse D), coloration à l’iode (buse
B), lavage des lames à l’eau distillée (buse D), décolora-
tion et contre coloration simultanées des lames (buse A)
à la safranine/méthanol, séchage des lames par rotation.
4.1.2.2. Méthode de mesure
Automatisation de la coloration de Gram via une pul-
vérisation en spray des colorants sur des lames pré-
étalées permettant d’obtenir des résultats rapides et
standardisés.
4.2. Mise en œuvre
La mise en œuvre de la vérification impose l’existence au
préalable d’une procédure générale de vérification/valida-
tion de méthode précisant la démarche du laboratoire et
les données expérimentales établies sur site dans le cas
d’une portée de type A et/ou de type B ainsi que d’une
procédure de gestion de la portée flexible listant l’ensemble
des opérations à réaliser pour maîtriser le processus lors
d’un changement de méthode ou de réactif ne faisant pas
intervenir de compétence nouvelle. Les références de ces
deux procédures seront précisées.
Le ou les opérateurs qui mettront en œuvre la vérification
doivent être habilités et nommément désignés.
La période d’évaluation doit être fixée. Elle implique la dis-
ponibilité de l’opérateur souvent un technicien mais aussi
42 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461
de la personne qui va exploiter les résultats, en général un
biologiste. En effet, il importe d’analyser les résultats au
fur et à mesure car il est plus simple d’effectuer en temps
réel l’étude des discordances, d’analyser leur cause et de
revoir si besoin le protocole, les critères d’acceptabilité
voire la méthode.
À l’issue, la vérification doit aboutir à une autorisation
d’utilisation de la méthode dont la date sera renseignée
ainsi que le nom de la personne qui a autorisé la mise en
service, un biologiste en général.
4.3. Maîtrise des risques
r Concernant le type d’échantillon, il peut s’agir d’échantil-
lon primaire c’est-à-dire de prélèvements bactériologiques
(sang, LCR, prélèvements pulmonaires, urines, selles…)
ou de cultures. Il importe alors que la phase préanaly-
tique soit maîtrisée avec l’existence d’une procédure sur
les conditions de prélèvement, d’acheminement préci-
sant notamment les délais de transport et de réception.
Les références de ces procédures seront précisées.
r Pour le prétraitement de l’échantillon, le point critique
à maîtriser est le préétalement des lames que la coloration
de Gram se fasse manuellement ou à l’aide du colorateur
car il conditionne à la fois la coloration et la lisibilité de
la lecture. Ce point pourra être intégré dans les modes
opératoires correspondants sur la coloration de Gram
manuelle et sur l’utilisation du colorateur.
r Main-d’œuvre
La compétence de l’utilisateur est un point crucial à maîtriser
surtout pour les méthodes manuelles et particulièrement
pour la coloration de Gram. L’étape de décoloration est
particulièrement décisive. Qui n’a pas un jour trop déco-
loré un Gram par manque d’expérience ou car certaines
bactéries se décolorent plus facilement que d’autres ?
Il importe en premier lieu que la méthode à maîtriser soit
intégrée dans les fiches de poste des personnes concer-
nées, que les modes opératoires de la technique ou de
l’utilisation de l’appareil soient écrits et connus de tous,
la prise en compte des documents devant être tracée.
Le personnel doit aussi être formé, évalué puis habilité.
L’habilitation est le fer de lance de l’accréditation. En effet,
c’est par cette démarche que le laboratoire reconnaît l’apti-
tude d’un individu à assurer une fonction, à tenir un poste
ou effectuer des tâches suite à une évaluation : c’est une
reconnaissance de la compétence. Une procédure et des
grilles d’habilitation doivent exister et être référencées dans
le système documentaire et dans le dossier de chaque per-
sonnel. Cette compétence doit être réévaluée périodique-
ment et maintenue en continu. La participation à des essais
interlaboratoires y contribue. La réalisation de contrôles de
qualité avec des critères d’acceptabilité et la conduite à tenir
en cas d’anomalie ainsi que la maintenance préventive des
appareils contribuent aussi à maîtriser les risques.
r Les conditions ambiantes requises (ex : température,
hygrométrie,…) 
Elles sont précisées dans les fiches techniques des fabri-
cants des réactifs et de l’automate. Il s’agit le plus sou-
vent de maîtriser la température ambiante de la pièce.
Cela impose de disposer d’une climatisation de la pièce,
d’une sonde de relevés des températures et d’un système
de surveillance attestant que la technique a été mise en

Tableau III – Caractéristiques des matériaux de contrôle utilisés
pour l’évaluation des performances de la coloration de Gram.
Nom de l’espèce Code CIP Morphologie
Escherichia coli 7624 Bacille Gram négatif
Corynebacterium striatum 8115 Bacille Gram positif
Staphylococcus aureus 7625 Cocci Gram positif
Neisseria gonorrhoeae 7918 Cocci Gram négatif
œuvre dans les conditions de température requise. L’idéal
est de disposer d’un système centralisé d’enregistrement
des températures pour suivre en continu la température
de la pièce ou de mettre en place un document d’enre-
gistrement où est tracée au minimum quotidiennement la
vérification de la température de la sonde. Pour la colora-
tion de Gram, la température requise est comprise entre
15 à 30 °C pour le colorateur et entre 15 et 25 °C pour la
technique manuelle.
Des contraintes sur l’hygrométrie peuvent être aussi pré-
cisées et nécessiteraient l’utilisation d’un hygromètre.
En fonction du taux d’humidité maximum annoncé par
le fabricant (pour le colorateur de Gram, taux d’humidité
maximum fixé à 80 %), de l’organisation des locaux, de
l’existence d’une climatisation qui génère à la fois une
stabilité thermique et hygrométrique, cette mesure s’avère
cependant plus ou moins indispensable. Pour le colorateur
de Gram par exemple, le taux d’humidité maximum est
fixé à 80 %. Notre pièce technique étant située en zone
tempérée, correctement ventilée, climatisée, sans trace
d’humidité, ni écoulement, nous avons estimé que le taux
maximum ne risquait pas d’être atteint. C’est typiquement
ce type d’analyse qui doit être effectué dans l’AMDEC.
r Référence du réactif (référence fournisseur, version)
Il convient de disposer des réactifs adéquats, en quantité
suffisante, non détériorés lors du transport, non périmés à
l’installation ainsi que des certificats de conformité et fiches
techniques correspondants. La maîtrise de ces points cri-
tiques passe par une procédure de gestion des commandes,
par une vérification de l’état des réactifs et de leur date
de péremption à réception et au moment de l’installation.
Les certificats de conformité et fiches techniques sont en
général disponibles sur les sites internet des fabricants. Ils
peuvent être imprimés et présents au poste dans un clas-
seur ou gérés de manière informatique, rattachés au réactif
dans le logiciel de commande par exemple. Une procédure
de gestion des versions doit être mise en place.
r Matériau de référence
Il s’agit de souches de référence connues qui peuvent
provenir de l’American type culture collection (ATCC), de
la Collection de l’Institut Pasteur (CIP) ou éventuellement
d’autres souches caractérisées dont le phénotype est connu
(« souchothèque »). Ces souches permettent de réaliser l’éva-
luation des performances et sont aussi utilisées comme CIQ.
Dans notre cas, l’évaluation des performances et notam-
ment le contrôle de qualité des réactifs et de la méthode de
coloration est réalisée à partir de souches de référence aux
caractéristiques morphologiques bien connues (tableau III)
provenant du CRBIP (Centre de ressources biologiques de
l’Institut Pasteur, certifié ISO 9001 pour l’acquisition, la produc-
tion, la conservation et distribution de matériels biologiques).
ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE
Milieu Conditions d’incubation Durée
TSA Aérobie, 30 °C 24 heures
TSA Aérobie, 37 °C 24 heures
TSA Aérobie, 37 °C 24 heures
Chocolat Polyvitex 5 % CO2, 37 °C 24 heures
Les certificats et les caractéristiques de chaque souche
(fiche catalogue), imprimées à partir du site (crbip@pasteur.fr)
sont conservés dans le dossier de validation. Le choix
de ces souches a tenu compte d’une part des espèces
les plus fréquemment rencontrées dans notre pratique
courante (E. coli et S. aureus) et de l’affinité tinctoriale
variable de certaines bactéries à la coloration de Gram
en intégrant une souche dite « Gram faible » ou « Gram
variable » (C. striatum).
Nous avons estimé qu’il était important de décrire la pré-
paration des lames de contrôle qui figure en annexe du
dossier de validation.
- Mise en culture des souches bactériennes lyophilisées
Dès réception, les souches lyophilisées sont conservées
à 4 °C et à l’abri de la lumière. Elles sont fournies dans
des ampoules sous vide et utilisées selon la procédure
suivante : sous PSM, désinfecter l’extérieur de l’ampoule
avec un coton imbibé d’alcool puis casser l’ampoule,
réhydrater le lyophilisat avec 200 μL de bouillon cœur
cervelle prélevé à l’aide d’une pipette à embout stérile,
ensemencer la suspension obtenue sur milieu gélosé
approprié en respectant les conditions de culture men-
tionnées dans le tableau III.
- Réalisation des lames de contrôle
Pour chaque souche de référence, le même technicien res-
ponsable de la vérification préparera 15 lames de contrôle :
mettre 3 mL de solution saline dans un tube à hémolyse
stérile, prélever une ou plusieurs colonies à l’aide d’une
anse stérile, la plonger dans la solution saline et la tourner
plusieurs fois afin d’obtenir une suspension bactérienne
homogène, à l’aide d’un densitomètre ajuster à 0,5 McF
(+/- 10 %) avec de la solution saline, déposer 20 μL de
suspension bactérienne au centre des 15 lames et étaler
de manière circulaire de façon à réaliser un frottis mince.
r Équipements
L’équipement doit être conforme aux exigences de perfor-
mances spécifiées par le fabricant initialement et de manière
continue et être en bon état de fonctionnement, afin de
garantir la qualité des analyses et des services rendus, ainsi
que la sécurité du personnel qui l’utilise. L’équipement doit
être maîtrisé et inventorié avec un dossier du matériel à jour,
géré en général par le référent matériel du laboratoire. Des
procédures doivent décrire les maintenances préventives
et des enregistrements doivent apporter la preuve de leur
réalisation. La continuité du service doit être garantie en
cas de pannes avec une gestion de l’activité analytique
en mode dégradé. En pratique, en cas de panne du colo-
rateur de Gram, une coloration manuelle sera effectuée.
Il importe aussi de vérifier si l’équipement a des exigences
métrologiques particulières. L’organisation de la métrologie
dans le laboratoire ne doit pas se limiter à la métrologie
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461 // 43
 Tableau IV – Étude de la contamination inter-échantillons de la coloration de Gram manuelle.
Date : Opérateur :

Contrôle Critères d’acceptabilité Résultat

Lame d’E. coli 1 Bacille Gram négatif Conforme … Non conforme …

Lame négative 1 Absence de micro-organisme Conforme … Non conforme …
Lame de S. aureus 1 Cocci Gram positif Conforme … Non conforme …
Lame d’E. coli 2 Bacille Gram négatif Conforme … Non conforme …
Lame négative 2 Absence de micro-organisme Conforme … Non conforme …
Lame de S. aureus 2 Cocci Gram positif Conforme … Non conforme …
Lame d’E. coli 3 Bacille Gram négatif Conforme … Non conforme …
Lame négative 3 Absence de micro-organisme Conforme … Non conforme …
Lame de S. aureus 3 Cocci Gram positif Conforme … Non conforme …
Lame d’E. coli 4 Bacille Gram négatif Conforme … Non conforme …
Lame négative 4 Absence de micro-organisme Conforme … Non conforme …
Lame de S. aureus 4 Cocci Gram positif Conforme … Non conforme …
Conclusion : Absence de contamination inter-échantillons Visa du biologiste :

Conforme …
Non conforme …

des instruments de mesure (thermomètres, pipettes de
mesures, balances) mais doit aussi intégrer la vérification
des équipements connexes aux automates (centrifugeuses,
enceintes thermiques, chronomètres…). En pratique, c’est
le responsable métrologie qui doit réaliser ou faire réaliser
les raccordements métrologiques nécessaires, assurer la
traçabilité de l’enregistrement des étalonnages ou véri-
fications ainsi que le statut de l’instrument de mesures
identifié. L’ensemble des mesures et documents peut être
regroupé dans le dossier du matériel. Pour le colorateur de
Gram, le point critique à maîtriser et à vérifier est la rotation
du carrousel.
Enfin, il ne faut pas oublier dans la partie équipement, les exi-
gences informatiques spécifiques. Des précautions doivent
être prises pour protéger l’intégrité et la confidentialité des
données de patients sous format électronique. L’accès aux
programmes doit être limité pour éviter l’altération ou la
destruction de données par des personnes non autorisées.
Chaque utilisateur doit pouvoir se connecter avec son propre
login et un mot de passe ayant un niveau de sécurité adapté
et en fonction de l’utilisateur et de son habilitation, différents
niveaux d’accès peuvent être mis en place.
- Critères d’acceptabilité et résultats
4.4. Évaluation des performances
4.4.1. Contamination
Les phénomènes de contamination peuvent affecter les
échantillons à analyser (contamination inter-échantillons)
lorsque plusieurs sont analysés simultanément ou les
réactifs (contamination inter-réactifs).
r Contamination inter-échantillons
- Protocole expérimental
Le principe est le même que la coloration se fasse en
méthode mode manuel ou automatisé.
L’absence de contamination croisée de la coloration de
Gram sera évaluée par le même technicien dans une
même série de coloration de 12 lames de contrôle :
- 4 lames de contrôle positives (P1) d’E. coli,
- 4 lames de contrôle positives (P2) de S. aureus,
- 4 lames de contrôle négatives (N1) réalisées en dépo-
sant au centre d’une lame 20 μL d’eau stérile ouverte
extemporanément.
En pratique, le bac de coloration (ne permettant pas de
réaliser plus de 12 colorations de Gram manuelle simul-
tanée) sera chargé de manière à alterner les échantillons
positifs et négatifs selon la séquence suivante : P1N1P2
P1N1P2 P1N1P2 P1N1P2. Pour la technique automati-
sée, le carrousel sera chargé selon la même séquence.
Par rapport aux recommandations du SH GTA04 nous
n‘avons pu faire 30 mesures en raison de la taille du bac
de coloration et nous avons préféré privilégier l’alternance
des séquences plutôt que d’analyser 3 fois consécutive-
ment le même échantillon. Par ailleurs, nous avons choisi
deux contrôles positifs différents pour évaluer l’impact
d’une bactérie à Gram positif et d’une à Gram négatif
d’où le choix de la séquence P1N1P2 P1N1P2 P1N1P2
P1N1P2 plutôt que P1P1P1 N1N1N1 P2P2P2 N1N1N1.
La lecture des lames se fait au microscope à l’immer-
sion (x1000).
Les lames de contrôle d’E. coli doivent fournir une colo-
ration et une morphologie de bacille Gram négatif (visua-
lisation de bacilles roses à rouges).
Les lames de contrôle de S. aureus doivent fournir une
coloration et une morphologie de cocci Gram positif
(visualisation de cocci en amas violets).
Les lames de contrôle réalisées avec de l’eau stérile ne
doivent fournir aucune coloration.
Les résultats de chaque lecture doivent être notés, sous
forme de tableau par exemple (tableau IV).

44 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461

 ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE

r Contamination inter réactifs r Critères d’acceptabilité et résultats

Il n’apparaît pas pertinent d’étudier spécifiquement la La lecture des lames se fait au microscope à l’immersion
contamination inter réactifs. (x1000) : bacilles roses à rouges pour E. coli, bacille en
Le phénomène de contamination inter réactifs peut se massue violets (figure 2) pour C. striatum, cocci en amas
produire sur un analyseur lorsque le système de distri- violets pour S. aureus, cocci roses à rouges (figure 2) pour
bution est commun à tous les réactifs. Avec le système N. gonorrhoeae.
PREVI Color Gram, chaque réactif est associé à une buse Les résultats de chaque lecture doivent être notés, sous
de vaporisation indépendante. forme de tableau par exemple (tableau V).
Par ailleurs, une contamination éventuelle se traduirait : À l’issue, l’évaluation des critères des performances doit
par une mauvaise coloration vérifiée tout au long de la aboutir à une décision de conformité ou non de la méthode
validation et confirmée par la concordance des résultats ; évaluée.
par la présence de micro-organismes vérifiée lors de
l’étude de contamination inter échantillons sur les lames
de contrôle négatives. 5. Conclusion
4.4.2. Comparaison de méthodes Plus qu’une exigence de la norme NF EN ISO 15189,
Pour comparer les résultats d’une méthode Y (à tester) l’objectif de la vérification sur site/validation des méthodes
avec ceux d’une méthode X (utilisée au laboratoire ou en biologie médicale est une garantie d’obtenir des résul-
prise comme référence), on analyse des échantillons tats sûrs et fiables pour les patients et les cliniciens dans
représentatifs de la population de patients
rencontrée en pratique courante. Pour le Gram,
Figure 2 – Coloration de Gram de différentes bactéries
il faut donc des bactéries à coloration Gram
Neisseria gonorrhoeae (a) et Corynebacterium striatum (b).
positif et Gram négatif, de morphologie variée,
cocci et bacilles.
Ces échantillons, frais de préférence, sont ana-
lysés en simple par les 2 techniques, dans un
délai le plus court possible. Les résultats sont
examinés au fur et à mesure et une étude de
concordance, à savoir résultat identique selon
les critères d’acceptabilité quelle que que soit
la technique utilisée, est réalisée pour exploi-
ter les résultats. L’analyse des discordances
(écart entre les deux méthodes), interprétation
et justification, doit se faire en continu et le %
de discordance entre les deux techniques, à ne
pas dépasser, doit aussi être fixé.
r Protocole expérimental
Les performances de la coloration sur le sys-
tème automatisé PREVI Color Gram seront
comparées aux performances de la colora-
tion de Gram manuelle. La corrélation entre
les 2 techniques est évaluée sur une journée,
en passant en parallèle par le même techni-
cien, 20 lames de contrôle sur le système
PREVI Color Gram et 20 lames en colora-
tion manuelle : 5 lames de chacune de ces
4 espèces, E. coli, C. striatum, S. aureus,
N. gonorrhoeae.
Afin de disposer d’un échantillonnage varié et
représentatif, de travailler sur des échantillons
frais et que les échantillons soient le plus pos-
sible similaires entre les deux méthodes (avec
l’impact le plus faible possible du pré étalement
des lames), nous avons décidé de travailler sur
des lames de contrôles et non sur des prélève-
ments de patients. Les 20 lames pour chacune
des techniques ont été passées en 3 séries dif-
férentes (7, 7 et 6), ce qui est le plus proche du
nombre de colorations lancées simultanément
en pratique courante et du nombre de séries
pratiquées quotidiennement.

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461 // 45

 Tableau V – Comparaison de méthodes : coloration de Gram automatisée
sur le système PREVI Color Gram (bioMérieux) versus coloration manuelle.
Date : Opérateur :

E. coli C. striatum S. aureus N. gonorrhoeae

Méthode
Bacille Gram négatif Bacille Gram positif Cocci Gram positif Cocci Gram négatif

Lame 1 Conforme … Lame 1 Conforme … Lame 1 Conforme … Lame 1 Conforme …

Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Lame 2 Conforme … Lame 2 Conforme … Lame 2 Conforme … Lame 2 Conforme …
Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Coloration Lame 3 Conforme … Lame 3 Conforme … Lame 3 Conforme … Lame 3 Conforme …
automatisée Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Lame 4 Conforme … Lame 4 Conforme … Lame 4 Conforme … Lame 4 Conforme …
Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Lame 5 Conforme … Lame 5 Conforme … Lame 5 Conforme … Lame 5 Conforme …
Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Lame 1 Conforme … Lame 1 Conforme … Lame 1 Conforme … Lame 1 Conforme …
Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Lame 2 Conforme … Lame 2 Conforme … Lame 2 Conforme … Lame 2 Conforme …
Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Coloration Lame 3 Conforme … Lame 3 Conforme … Lame 3 Conforme … Lame 3 Conforme …
manuelle Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Lame 4 Conforme … Lame 4 Conforme … Lame 4 Conforme … Lame 4 Conforme …
Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Lame 5 Conforme … Lame 5 Conforme … Lame 5 Conforme … Lame 5 Conforme …
Non conforme … Non conforme … Non conforme … Non conforme …
Conclusion : Absence de contamination inter-échantillons Visa du biologiste :

Conforme …
Non conforme …

l’environnement propre du laboratoire et à ce titre, le bio-
logiste doit se sentir particulièrement impliqué.
Si l’étude des critères de performance est incontournable,
l’analyse des risques doit permettre de mettre en place
des moyens cohérents de maîtrise adaptés à sa propre
pratique. Cette étape est particulièrement importante
pour les méthodes manuelles fréquentes en microbiologie
où interviennent de nombreux facteurs de variabilité. Ce
n’est pas non plus la plus facile à réaliser et les recom-
mandations des fournisseurs, des normes, des sociétés
savantes et la bibliographie ne sont pas toujours adaptées
à la microbiologie et aux attentes des biologistes. Dans
ce contexte, il importe à chacun de réfléchir mais aussi
de partager le fruit de ses réflexions dans une marche en
avant collective.
Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de
conflits d’intérêts en relation avec cet article.

Références
[1] Document Afnor, NF EN ISO 15189. Laboratoires d’analyses de
biologie médicale – Exigences particulières concernant la qualité et la
compétence. Décembre 2012.
[2] Document Cofrac, SH REF 08. Expression et évaluation des portées
d’accréditation. Révision 01 - mars 2012.
[3] P. Frybourg. Certification et management de la qualité : un atout stra-
tégique. Edition Arnaud Franel, Mars 2006.
[4] Document Cofrac, SH FORM 44. Fiche type qualitatif, Vérification
(portée A)/ validation (portée B) d’une méthode de biologie médicale.
Révision 00 - Avril 2011.
[5] Document Cofrac, Portées-types d’accréditation : SH INF 50.
Révision 01 - Janvier 2014.
[6] Document Cofrac, SH GTA 04. Guide technique d’accréditation de
vérification (portée A)/ validation (portée B) des méthodes en biologie
médicale. Révision 00 - Avril 2011.
[7] Document Cofrac, SH REF 02. Recueil des exigences spécifiques
pour l’accréditation des laboratoires de biologie médicale. Révision 04
- Octobre 2013.
[8] Document Cofrac, SH GTA 06. Guide technique d’accréditation :
contrôle de qualité en biologie médicale. Révision 00 - Juin 2012.
[9] Denis F, Ploy MC, Martin C, Bingen E, Quentin R. Bactériologie
médicale, techniques usuelles. Éditions Elsevier/Masson,
novembre 2007.
[10] BioMérieux. Manuel d’utilisation du Previ Color Gram. Mars 2009.

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