V A L I D A T I O ND ' U N EM T H O D EA N A L Y T I Q U ED EC O N T R L ED E Q U A L I T D EV A C C I N SV I R A U XV I V A N T S A p p l i c a t i o ne x p r i me n t a l e l am t h o d ed et i t r a g ed e sv a c c i n s v i v a n t sd el ama l a d i ed el ab u r s i t ei n f e c t i e u s ea v i a i r es u r u f s e mb r y o n n sE O P S V A L I D A T I O NO FA NA N A L Y T I C A LME T H O DO FQ U A L I T Y C O N T R O LO FL I V EV I R A LV A C C I N E S E x p e r i me n t a l a p p l i c a t i o no f t h et i t r a t i o nme t h o do f l i v ea v i a n i n f e c t i o u sb u r s a l d i s e a s ev a c c i n e si nS P Fe mb r y o n a t e de g g s

A u t e u r ( s ): F a t i maT A H I R I , D r i s sB E L G H Y T I , K h a d i j aI dS I D I Y A H I A , B e n a i s s aA T T R A S S I

C a t g o r i e:

S c i e n c e sd uv i v a n t >P h a r ma c i e

S c i e n c e L i bE d i t i o n sMe r s e n n e:V o l u me5, N 1 3 0 9 0 9 I S S N2 1 1 1 4 7 0 6 P u b l i l e :2 0 1 3 0 9 2 3

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Fatima TAHIRI

VALIDATION D'UNE MTHODE ANALYTIQUE DE CONTRLE DE QUALIT DE VACCINS VIRAUX VIVANTS

Application exprimentale la mthode de titrage des vaccins vivants de la maladie de la bursite infectieuse aviaire sur ufs embryonns EOPS

VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD OF QUALITY CONTROL OF LIVE VIRAL VACCINES

Experimental application of the titration method of live avian infectious bursal disease vaccines in SPF embryonated eggs
(*)Fatima TAHIRI(1), Driss BELGHYTI (2), Khadija Id SIDI YAHIA(1), Benaissa ATTRASSI(3)
1

Division de la Pharmacie et des Intrants Vtrinaires, Laboratoire National de Contrle des Mdicaments Vtrinaires, BP 4590 Rabat, Maroc. 2 Laboratoire de Biodiversit et de ressources naturelles. Facult des Sciences, universit Ibn Tofail BP13 Kenitra, Maroc. 3 Laboratoire de Biologie et Sant, Facult des Sciences, universit Ibn Tofail, BP 133 Kenitra, Maroc. *Corresponding author. E-mail: tahirifatima@yahoo.fr, tl: +212 600387149 Rsum La validation dune mthode danalyse passe par diffrentes tapes qui visent : tester la normalit de la distribution des mesures ; estimer les composantes de lincertitude de mesure, fidlit, justesse, dfinir des tests de contrle de la non dgradation des performances de la mthode. Cet article prsente les diffrentes tapes qui permettent de valider une mthode biologique d'analyse. La mthode consiste en la construction dun plan dexprience, dun modle statistique et la prparation dun matriau de rfrence interne laboratoire (vaccin tmoin), utilis pour tudier limpact des facteurs de drive et de variation afin doptimiser la mthode analytique, pour valuer le biais (erreur alatoire), pour calculer lincertitude de mesure et pour construire les cartes de contrle. Cette mthode est applique au titrage des vaccins viraux vivants de la maladie de la bursite infectieuse aviaire sur ufs embryonns EOPS. Les rsultats de notre tude exprimentale montrent que: la majorit des facteurs dinfluence potentiels lis la mthode de titrage, identifis et valus navaient pas dinfluence significative sur le rsultat obtenu. Un mode opratoire standard tenant compte de ces rsultats a t labor. La mthode finalise sest rvle fidle avec des carts types de rptabilit et de reproductibilit un niveau de confiance de 95% respectivement de 0,15 et de 0,18.Lincertitude de mesure calcule est de 0.20, qui reprsente le niveau derreur moyen sur un titre. Un stock homogne dun vaccin de rfrence interne laboratoire, dun titre moyen de 6,03 log DIO50 a t produit et sa carte de contrle tablie de faon doter le laboratoire dun outil important de contrle et de suivi de lvolution des titres viraux dans le temps et de maitrise des performances de la mthode de titrage valide. Mots cls: maladie de la bursite infectieuse aviaire, vaccin vivant, caractrisation de la mthode du titrage, validation de mthode, reproductibilit, incertitude, rptabilit, statistiques, carte de contrle. Abstract Validating a method of analysis goes through different stages, in order to: test the normality of measurements distribution, estimate the uncertainty components of a measurement (.i.e. accuracy and correctness), and finally, define the control tests of non degradation of the method performances. This paper outlines the steps for validating a biological method of analysis. It involves the construction of an experimental design, a statistical model, and the preparation of an interne laboratory reference material (pilot vaccine). This latter is used to study the impact of deviation and variation factors, in order to, optimize the analytical method, evaluate the bias (random error), calculate the uncertainty of measurement, and make the control charts. This method is used for the titration of live viral vaccines of infectious bursal disease on embryonated fowlseggs. In reference to the experimentation results, the majority of the influencing potential factors of the titration method had no significant influence on the given result. Taking into account these results, an operating mode has been developed. The finalized method was accurate with standard deviation of repeatability and reproducibility of, respectively 0.15 and 0.18, with a confidence level of 95%. The calculated uncertainty of measurement is equal to 0.2, which represents the average error level of a titer. A homogeneous stock of interne laboratory reference vaccine, with an average titer of 6.03 log DIT 50, was produced and the control chart set, in order to provide the laboratory with an important tool of control and monitoring of the viral titers evolution in time, as well as, the mastery of the validated titration method performances. Keywords: Avian infectious bursal disease; Live vaccine; Titration method characterization; Method validation; reproducibility; Uncertainty; Repeatability; Statistics; Control chart.

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1. Introduction
Toute analyse biologique ncessite des procdures de mise au point de mthodes de titrage, de dosage, dtalonnage et de validation des rsultats. Il est reconnu partout dans le monde qu'un laboratoire doit prendre les dispositions appropries pour s'assurer quil est en mesure de fournir des donnes du niveau de qualit requis. De telles dispositions comprennent l'utilisation de procdures de contrle interne de qualit et l'utilisation de mthodes d'analyse valides [1-2]. Lorsquun laboratoire utilise des mthodes non normalises ou hors du domaine d'application de la norme, une validation des mthodes et une vrification de la performance des mthodes analytiques sur site doit tre effectu [3]. Ceci fait clairement apparaitre le lien trs troit qui existe entre la qualit dune analyse et la validation de la mthode qui permet de la faire [4]. Le choix de la mthode est le point de dpart vritable de la validation. Il rsulte dun compromis entre les possibilits instrumentales du laboratoire, le cout dune mesure et les performances requises [5-6]. En bioanalyse, la validation a pour objectif de dmontrer les performances de la mthode danalyse et de prouver que les rsultats obtenus sont fiables, et ce dans des limites bien dfinies. La validation consiste donc, en une suite dtudes exprimentales qui permettront de prouver que la mthode est en accord avec son domaine dapplication. Ce domaine dapplication correspond une description faite par lanalyste des diffrents analytes, niveaux dincertitudes acceptables (justesse et fidlit), et parfois de certaines conditions demploi que lon est droit dattendre de la mthode [7]. Le contrle de la qualit dune mthode danalyse implique en outre, une maitrise statistique de ses performances dans le temps [8]. Or il existe une variabilit normale des mesures exprimentales [7]. Et tout analyste sait que, lorsquil fait plusieurs mesures sur un mme chantillon avec mme mthode, il obtient des valeurs diffrentes [4]. Cependant, le principe du contrle statistique dune mthode consiste, vrifier que cette variabilit reste entre des limites dincertitude acceptables tablies lors de la validation. Les cartes de contrles sont un exemple doutil trs classique qui permet de mesurer, en un point donn, si les performances restent entre des limites fixes lavance [7].Tous ces renseignements sont groups dans un dossier qui contient en outre les objectifs des tudes entreprises et les rsultats obtenus [9]. Il est donc utile de prvoir une organisation de la validation [5] qui est toujours un quilibre entre les cots, les risques, les possibilits techniques et le temps [10]. Ainsi, toute mthode de contrle interne de routine doit tre valide par rapport une mthode de rfrence pour que ses rsultats soient fiables, interprtables et valables pour une prise de dcision de conformit ou de non-conformit [11-12]. Le cycle de vie de la mthode peut continuer par lusage de routine de la mthode sauf si des modifications doivent se faire ou si des nouveaux besoins doivent tre satisfaits, dans ce cas une nouvelle revalidation doit tre excut [5-13]. Cest dans ce contexte, que le prsent travail se propose de prsenter les protocoles exprimentaux et les mthodes statistiques utilises pour valider une mthode danalyse. La dmarche est applique ici la mthode de titrage des vaccins vivants utiliss sur le terrain contre la maladie de Gumboro ou bursite infectieuse (Infectious Bursal Disease Virus : IBDV) et peut tre tendue sans difficults d'autres mthodes, afin de vrifier dune part que les rsultats obtenus sont fiables et apte assurer la qualit des vaccins utiliss sur le terrain et dautres part de minimiser en routine le risque de ranalyse du un manque de confiance dans la fiabilit des rsultats. Plus prcisment, lobjectif de cet article est dvaluer statistiquement la validit et la fidlit de cette mthode de titrage dans son domaine dapplication, et de dcrire les procdures de correction de biais, de calcul d'incertitude de mesure par lutilisation dun matriel de rfrence interne laboratoire (vaccin tmoin) et dlaboration de la carte de contrle du vaccin rfrence, afin de dmontrer son aptitude et sa fiabilit vis--vis des exigences rglementaires et normatives en vigueur. Pour rpondre cet objectif, nous allons mener la procdure de validation en deux tapes : la premire reposera sur lidentification, lvaluation et loptimisation des facteurs de variation de la mthode. La deuxime consistera en l'valuation des critres de qualits fixs, savoir la rptabilit; la reproductibilit et lincertitude de mesure de la mthode de titrage.

2. Matriels et Mthodes
La validation dune mthode consiste dfinir ses objectifs de performances analytiques, caractriser les performances du systme, puis discuter les rsultats obtenus, cela en associant dmarche exprimentale ou bibliographique et, surtout, en justifiant ses choix.

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2.1. Stratgie de la recherche et plan de ltude : 2.1.1. Stratgie de la recherche : La stratgie adopte pour cette tude a t consacre, dans un premier temps lobservation de la mise en uvre de la mthode afin didentifier, dvaluer et doptimiser les facteurs ayant un impact sur le rsultat et son incertitude de mesure pour proposer un mode opratoire dfinie et fiable, et dans un deuxime temps lvaluation des critres de qualit la mthode prtablis par le laboratoire. 2.1.2. Plan de ltude : - Etude de la mise en uvre de la mthode pour identifier les facteurs de variation pouvant influencer le rsultat de lessai ; - Prparation du vaccin tmoin qui reprsente le Matriel de Rfrence Interne Laboratoire; - Evaluation, laide du vaccin tmoin, des facteurs de variation identifis afin davoir un ajustement optimal du niveau des facteurs influenant la mthode analytique ; - Protocole de comparaison par titrages comparatifs ; - Analyse statistique des rsultats ; - Finalisation du mode opratoire ; - Evaluation, laide du vaccin Tmoin et dans un cadre normatif, des critres de qualit de la mthode, savoir : La rptabilit, la reproductibilit et lincertitude de mesure ; Etablissement de la carte de contrle du matriel de rfrence interne laboratoire; 2.2. Matriel biologique : - ufs et poulets EOPS. - Souche virale vaccinale. - Vaccin de rfrence interne laboratoire (vaccin tmoin). 2.3. Mthodes : 2.3.1. Description de la mthode de titrage des vaccins vivants dIBD Des dilutions du virus titrer sont inocules des ufs embryonns EOPS par la voie chorioallatoique (MCA). Les ufs embryonns EOPS sont incubs 37C pendant 5 7 jours. Le critre dinfectivit de lIBDV est la prsence des lsions spcifiques de la maladie de Gumboro sur les embryons inoculs. Le titre infectieux est exprim en dose infectant 50% des embryons inoculs (DIO50). 2.3.2. Evaluation de la mthode de titrage Lidentification des facteurs de variation de la mthode a t ralise en tudiant le mode opratoire existant au laboratoire ; et en observant la mise en uvre de ce mode opratoire par plusieurs oprateurs. Notre approche consiste mettre en vidence tout ce qui pourrait tre source de variation au niveau du rsultat. Parmi les facteurs qui peuvent influencer la fiabilit des rsultats on peut observer : Les facteurs lis une drive accidentelle dans lapplication de la mthode et les facteurs de variation rels [4]. Le traitement de lchantillon analytique constitue en rgle gnrale ltape clef de la mthode danalyse : elle contient la majeure partie de lerreur analytique et reprsente un facteur limitant en termes de rapidit et dautomatisation. 2.3.3. Prparation du Matriel de Rfrence Interne Laboratoire (vaccin tmoin) Le vaccin interne de rfrence sera produit en multipliant un virus vaccinal sur le support biologique les ufs embryonns EOPS. Le 1er passage reprsentera le lot de semence primaire qui reprsente une culture du virus de lIBD dont luniformit et la stabilit sont assurs. Il est sous forme liquide conserv une temprature dau moins -80C. Le lot de semence de travail est la culture du mme virus drive du lot de semence primaire et destine tre utilise dans la production du vaccin de rfrence interne. Le lot de semence de travail sera ensuite rparti en rcipients et conserver 80C. Une srie de conglation, dconglation et de centrifugations

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nous permet de rcolter un surnagent contenant les particules virales. Ce surnageant est filtr sous 0,45m est additionn 2% dantibiotique et dantifongique, pour viter tout risque de contamination. A chaque passage, un titrage comparatif du surnageant est effectu sur ufs embryonns EOPS pour vrifier sil ya une augmentation, diminution ou stabilisation du titre viral, afin de prendre une dcision pour utiliser le premier, le deuxime ou le troisime passage comme vaccin de rfrence. Un stock homogne sera prpar partir du passage choisi qui sera additionn 2% dantibiotique et dantifongique et aliquoter dans des godets striles raison de 600 L/ godet puis conserver 80C pour la ralisation des essais de la validation de la mthode de titrage des vaccins IBD virus vivant. 2.3.4. Etapes de prvalidation : Phase doptimisation du mode opratoire 2.3.4.1. Identification des facteurs de variation de la mthode de titrage Les facteurs de variations sont des lments du mode opratoire qui, faute davoir t dfinis, peuvent tre source derreurs ou damplification de lincertitude [7]. Lidentification de ces facteurs dinfluences, a t effectue lors de la mise en place du mode opratoire prliminaire partir des donnes bibliographiques savoir : Les dossiers fabricants ; la pharmacope europenne ; le code fdral amricain et la mthode du laboratoire Ploufragan (France). Notre approche consiste mettre en vidence tout ce qui pourrait tre source de variation et de drive au niveau du rsultat dessai lors du titrage du vaccin dIBDV. 2.3.4.2. Evaluation des facteurs de variations identifies Pour chaque facteur un certains nombre de titrages sera ralis. Et laide de ces rsultats de titrages et grce une analyse statistique on pourra ainsi dterminer si ce facteur de variation est rellement un facteur dinfluence ou pas. 2.3.4.2.1. Evaluation du facteur ge des ufs embryonns de poulets SPF Comme le prescrit la monographie de rfrence Pharmacope-Europenne [14], l'Office international des pizooties [15] et le code Fdrale Amricain [16], le titrage des virus vivants contre la maladie de Gumboro peut tre ralis sur ufs embryonns EOPS de 9 11 jours dge. Lobjectif de cet essai est de montrer statistiquement et par des essais rpts linfluence ou non du facteur ge des ufs embryonns EOPS sur le rsultat danalyse. 2.3.4.2.1.1. Protocole exprimental (1) Incubation des ufs embryonns EOPS de 9 jours ,10 jours et 11jours ; (2) Prparation des ufs : Mirage et dsinfection par lalcool ; (3) Prparation du vaccin de rfrence interne : Reconstitution dans du PBS ; (4) Prparation des dilutions au de10-0,6 au 10-7,2 ; (5) Inoculation des ufs embryonns EOPS de 9 jours, 10 jours et de 11jours partir de10-4,2 10-7,2 raison de 6 ufs embryonns EOPS par dilution et inoculation de 6 ufs embryonns EOPS tmoin ngatifs de chaque ge utilis par du PBS ; (6) Observation et enregistrement des rsultats pendant 05jours ; (7) Calcul du titre par la mthode de Sperman karber ; (8) Slection des rsultats exploitables; (9) Analyse statistique des donnes; (10) Interprtation des rsultats. Les oprations de prparation du vaccin tmoin et des dilutions sont faites dans un bain de glace, lessai se droule dans une hotte flux laminaire et le timing de lessai est pris en considration. 2.3.4.2.2. Evaluation du facteur Intervalle dincubation Lintervalle dincubation dcrit dans les monographies de rfrence [14-15-16], varie de 5 jours 7 jours dans le cas de titrage des vaccins virus vivant de lIBD. La dmarche adopte est deffectuer une srie de titrage par un intervalle dincubation de 5jours, une autre srie de titrage par un intervalle dincubation de 6 jours et une autre srie de titrage par un intervalle dincubation de 7 jours. 2.3.4.2.2.1. Protocole exprimental Le protocole exprimental est le mme que prcdemment ; la dure dincubation est de 5 jours, 6 jours ou de7 jours.

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2.3.4.2.3. Evaluation du facteur pH En gnral le pH des solutions dispersantes reprsente un facteur limitant pour la multiplication des particules virales dans un support biologique tel que luf embryonn EOPS. Les pH tests au cours de cette tude, sont respectivement de : 5,6 ; 7.2 et 7.9. 2.3.4.2.3.1. Protocole exprimental Le protocole exprimental est le mme que prcdemment ; les PH tests sont respectivement de : 5,6 ; 7.2 et 7.9. 2.3.5. Finalisation du mode opratoire Une fois tous ces facteurs fixs, la rdaction dun mode opratoire finalis serait possible tout en cartant les facteurs de variations imputables la mthode. Ainsi la mthode de titrage sera oprationnelle. 2.3.6. Etapes de la validation : Performance et critres de choix dune mthode danalyse La validation dune mthode analytique consiste dterminer certaines caractristiques du titrage d'une substance dans un substrat. Les principaux paramtres dterminer sont : La fidlit sous les conditions de rptabilit et de fidlit intermdiaire. La fidlit est, selon lISO 3534-1[17], ltroitesse de laccord entre des rsultats dessai indpendants obtenus sous des conditions stipules. La fidlit dpend uniquement des erreurs alatoires et na pas de relation avec la valeur vraie ou spcifie. La mesure de la fidlit sexprime en termes dinfidlit et est calcule partir de lcart type des rsultats dessais : plus cet cart-type est grand, plus est faible la fidlit. Les mesures de fidlit dpendent de faon troite des conditions stipules dont les conditions de rptabilit et les conditions de reproductibilit reprsentent les extrmes. Elle peut tre tudie par le passage dchantillons successivement pour la rptabilit, et sur une longue dure pour la fidlit intermdiaire (reproductibilit intra-laboratoire). Elle est interprte par le coefficient de variation CV (en %). A noter qu'une analyse de variances (ANOVA) peut optimiser le temps de l'tude. 2.3.6.1. Evaluation de la rptabilit Cet essai consiste titrer le taux de particules virales contenu dans le vaccin de rfrence interne sous des conditions identiques : mme oprateur, mme lot de ractifs, mme quipement, mme talonnage et dans un court intervalle de temps. Lessai sera rpt 12 fois, car L'effectif idal recommand est de 10 30 essais pour une interprtation statistique optimale. L'exploitation des rsultats consiste calculer la moyenne (X), l'cart-type () et le coefficient de variation (CV) des valeurs exprimentales de chaque srie : CVr = (/X) x 100 2.3.6.2. Evaluation de la reproductibilit Cet essai consiste titrer le taux de particules virales contenu dans le vaccin de rfrence interne en variant les oprateurs, les jours, le matriel et les aliquots du vaccin Tmoin. Deux oprateurs vont raliser des titrages du vaccin tmoin selon la mthode dcrite prcdemment (6 titrages par oprateur). Rpter lessai un certain nombre de fois permet une analyse statistique adquate. Les rsultats seront interprts selon lecartype de la reproductibilit et surtout selon le coefficient de variation (CV) de reproductibilit [18]. Le CV calcul permet donc, une valuation de la rptabilit et de la reproductibilit de la mthode exprime en %. Il est utilis pour contrler lacceptabilit des rsultats des essais raliss de rptabilit et de reproductibilit. Ainsi, lors de la vrification, le CV calcul est compar au CV limite admissible, pralablement Choisi : CVR<5% [19]. On peut conclure que la mthode est rptable et reproductible avec un risque de 5% si le CV des rsultats des essais de rptabilit et de reproductibilit est infrieur 5%. Le test ANOVA 1 est utilis galement pour confirmer nos rsultats. 2.3.6.3. Incertitude de mesure Lincertitude de mesure est un paramtre, associ au rsultat dun mesurage, qui caractrise la dispersion des valeurs qui pourraient raisonnablement tre attribues au mesurande [20-21]. Lincertitude de mesure rsulte donc, dincertitudes dtermines par des expriences et/ou dincertitudes estimes. Elle doit couvrir lensemble de la mthode dessai [22-23-24-25]. Si le rsultat se rapporte un chantillon homognis, lincertitude de mesure ne concerne que la partie analytique.

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Ainsi, toutes les mthodes d'analyse donnent des rsultats prsentant un certain degr d'incertitude, qui doit tre pris en compte lorsqu'on choisit la mthode utiliser une fin particulire. Cette incertitude peut avoir des incidences importantes lorsqu'une concentration donne d'une substance constitue un niveau d'intervention. Le client et l'analyste doivent tre bien d'accord sur la manire dont les donnes doivent tre utilises si l'analyste doit produire des rsultats de "qualit" (c'est--dire aptes leur emploi). La situation mrite un examen plus approfondi et doit prendre en considration des principaux facteurs causant la variabilit des mesures exprimentales pouvant influencer par la suite le rsultat dessai [4]. Ce qui est important au niveau du laboratoire qui doit interprter ses rsultats en terme de conformit / non conformit dun vaccin des spcifications de titre dfinies cest ltendue de mesure. E n effet, si ltendue de mesure est grande linterprtation des rsultats de titre obtenus en termes de conformit est pratiquement impossible. Pour cerner le problme de variabilit des mesures de titrages et rendre linterprtation des rsultats rels moins dlicate, on va dterminer lincertitude de mesure de notre mthode danalyse. Le calcul de lincertitude de mesure de notre mthode repose sur le calcul de lcart Type gnral qui est dfini comme tant la racine carre de la moyenne du carr de l'cart type entre toutes les mesures ralises de la rptabilit et la reproductibilit. Cet cart type sera appliqu tous les rsultats de titrage du vaccin vivant de lIBDV au sein de notre laboratoire, dans les mmes conditions et donnera une indication sur le niveau de prcision du rsultat. 2.3.7. Cartes de contrles La carte de contrle, est un outil graphique couramment utilis dans le cadre de la maitrise statistique de processus, permet de suivre les fluctuations dun processus en distinguant les causes de variabilit alatoire, prvisible condition que les variations naturelles de ce processus aient t caractrises des causes assignables, dues des facteurs identifiables, sur lesquelles il est possible dintervenir. Une fois oprationnelle, la carte de contrle permet de surveiller la stabilit dun processus dfinis pralablement par son centrage (moyenne) et par sa dispersion (cart-type). Elle privilgie la prvention en permettant de visualiser rapidement les fluctuations anormales et les drives [5]. Lchantillon de rfrence interne fait lobjet de plusieurs titrages (au minimum au nombre de six). Sur cette base nous calculons la moyenne X et lcart type . La moyenne des moyennes est utilise comme point mdian du diagramme et les seuils d'alerte sont indiqus +2 et -2 de l'cart type; les limites de rejet sont fixes +3 et -3 des carts types. Sur la base d'une rpartition normale, 95,5 pour cent des moyennes des sries ultrieures de titrages doivent se situer dans la fourchette de +2 et de -2 des carts types et 99,7 pour cent doivent se situer dans la fourchette entre +3 et -3 des carts types dcrit par shwane. Lchantillon de rfrence interne est analys rgulirement et les mesures sont reportes dans lordre chronologique de leurs collecte sur le graphique, si la carte montre quil ya des variations autour de la valeur attendue, on peut supposer que le titre de vaccin de rfrence est instable ou que lessai concern net pas valide ou que la mthode d'analyse n'est pas bien matrise, tel que par exemple : 7 points conscutifs, tous au-dessus ou tous au-dessous de la moyenne ceci est du soit une mauvaise prparation de lchantillon de rfrence, ou une mauvaise prparation des ractifs, ou un mauvais talonnage des instruments, ou une erreur de l'analyste ou bien une contamination de lessai [4]. 2.3.8. Tests statistiques utiliss Toute recherche dont les rsultats se traduisent par des donnes numriques, dduites dexpriences rptes, ncessite lutilisation de la mthode statistique. Cette exigence est dautant plus imprieuse quil sagit de recherches biologiques, car les phnomnes vitaux sont essentiellement caractriss par leurs fluctuations et leur variabilit [26]. Ainsi, le choix de la mthode statistique qui recueillera des informations comparables avec le minimum derreur est le dbut essentiel de toute tude. La comparaison entre les moyennes et la comparaison avec les variances vont nous servir pour lanalyse et linterprtation des rsultats obtenus au cours de notre tude. La moyenne calcule partir dun matriau de contrle est une estimation de la valeur centrale de la distribution des rsultats. Tout changement affectant lexactitude se traduira par une modification de la moyenne du contrle. Et lcart-type, qui est en rapport avec la distribution des rsultats autour de la moyenne, est un reflet de lerreur alatoire. Il traduit donc la prcision de la technique [27]. A travers lANOVA, nous sommes amens comparer deux sources de variation : une variance due lerreur (variance alatoire de la moyenne de lchantillon) et une variance systmatique ou factorielle (variance attribuable laction dune variable indpendante). Dans la pratique on est malheureusement

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incapable destimer la variance systmatique indpendamment de la variance due lerreur (t) [28]. En fait, on estime : - Une variance intra groupe qui est due lerreur seule ; - Une variance inter- groupe qui est due la fois lerreur et la variance systmatique si la variance systmatique inter- groupe est plus importante que la variance intra groupe, il ya clairement quelque chose dautres que la variance due lerreur qui agit sur la diffrance entre les moyennes [28]. Sur le plan statistique on test la significativit de la variance inter- groupe devant la variance intra groupe : Fobs = variance inter- groupe (CMa) / variance intra groupe (CMe) ; Fth suit une loi de distribution de Fischer ; - Si Fobs< Fth : pas de rejet possible de Ho au risque (coefficient / modle significatif). - Si Fobs > Fth : rejet de Ho au risque (coefficient / modle non significatif).

3. Rsultats :
3.1. Optimisation de la mthode 3.1.1. Evaluation des facteurs identifis 3.1.1.1. Evaluation du facteur ge des ufs embryonns SPF : Les coefficients de variation des titrages raliss par inoculation par voie membrane MCA des ufs embryonns EOPS des diffrents ges (9j, 10j, 11j) schelonnent de 2,29% 2,61%, avec un CV moyen de 2,45% Les rsultats ont t reports dans le tableau 1 et le tableau 2.
Tableau1:Effet du facteur ge ufs embryonn EOPS
ge des ufs embryonns en jours 9j 10j 11j

Titre en Log DIO50/ml

Moyenne Log DIO50/ml Ecart-type (s) coefficients de variation(CV)

6 ,0 6,3 5,9 6,2 6,1 6,3 6,13 0,16 2,61%

6 ,3 6,2 6,2 5,9 6,0 6,1 6,11 0,15 2,45%

6,1 5,9 6 ,1 6 ,0 6,3 6,2 6,10 0,14 2,29%

Tableau 2 : Analyse de la variance des rsultats de titrage des essais du facteur ge des ufs embryonns EOPS. Groupes 09 j 10j 11 j Source des variations Entre Groupes Intra- groupes Total Nombre dessais 6 6 6 Somme des carrs 0,17 0,36 0,53 Somme 36 ,8 36,7 Moyenne 6,13 6,11 Variance 0,05 0,02 0,03 F obs 0,10 Fth 3,68 Ecart -type 0,17 O, 19 O, 23 Probabilit 0,42

35,9 6,10 Analyse de variance ddl Moyenne des carrs 6,0 16,0 22,0 0,01 (CMa) 0,09(CMe)

Le traitement des rsultats obtenus, laide du test statistique ANOVA1, nous a montr que : Fobs=0, 10 et F critique =3, 68. Admettre l'hypothse H0 (i = 0i) c'est admettre que l'effet du facteur ge des ufs embryonns de Poulet EOPS n'a pas d'influence significative sur le rsultat. Fobs = CMa/ CMe = 0, I0; A comparer la limite Fth = F0, 95= 3,68

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d'aprs la table de la loi de Fisher Snedecore : Fobs (=0,10) < Fth (=3,68) Donc on accepte H0, ce paramtre n'a pas dinfluence significative sur le rsultat du titrage. Nous constatons donc que les variances ne diffre pas significativement et le facteur ge des ufs embryonns EOPS na pas dinfluence sur la mthode de titrage. Donc le fait dutiliser des ufs embryonns EOPS de 9, 10 ou 11 jours comme support biologique pour le titrage des vaccins virus vivant de la maladie de Gumboro ne va pas interfrer avec nos rsultats. 3.1.1.2. Evaluation du facteur dure dincubation Les coefficients de variation schelonnent de 2,41 % 1,82%, avec un CV moyen de 2,12%. Lvolution des titres du taux des particules virale de lchantillon tmoin au cours du temps est reprsente sur le tableau 3 et le tableau 4.
Tableau 3 : Effet du facteur dur dincubation Dure dincubation en jours Titre en Log DI050/ml 5j 6,0 5,9 6,1 6,2 6,0 6,04 0,11 1,82 6j 5,9 6,0 6,3 6,1 6,1 6,2 0,15 2,41 7j 6,2 5,9 6,0 6,2 6,1 6,1 0,13 2,13

Moyenne Log DIO50/ml Ecart-type (s) coefficients de variation (CV) en%

Tableau 4 : Analyse de la variance des rsultats de titrage des essais dur dincubation. Groupes 5j 6j 7j Source des variations Entre Groupes Intra- groupes Total Nombre des essais 5 5 5 Somme des carrs 0,02 0,22 0,24 Somme 30,2 30,4 Moyenne 6,04 6,2 Variance 0,02 0,03 0,04 F obs 1 Fth 5,32 Ecart -type 0,11 O, 155 O, 13 Probabilit 0,57

30,3 6,1 Analyse de variance ddl Moyenne des carrs 1 9 10 0,03 (CMa) 0,03(CMe)

Le traitement des rsultats obtenus, laide du test statistique ANOVA1, nous a montr que : Fobs= 1 et F critique =5, 32. Admettre l'hypothse H0 (i = 0i) c'est admettre que l'effet dur dincubation n'a pas d'influence significative sur le rsultat : Fobs = CMa/ CMe = 1 ; A comparer la limite Fth = F0, 95= 5, 32 d'aprs la table de la loi de Fisher Snedecore : Fobs (=1) < Fth (=5,32) Le test ANOVA1 nous a conduit accepter lhypothse nulle H0 avec un intervalle de confiance de 95%. Cela signifie que le facteur dur dincubation na pas dinfluence sur la mthode de titrage. Pour le mode opratoire, nous avons donc choisi dutiliser la dure dincubation la plus courte (5me jour) pour gagner la fois du temps et donner le rsultat le plus tt possible aux clients. 3.1.1.3. Evaluation du facteur pH du PBS : Les coefficients de variation des titres, du vaccin tmoin, vont de 4.31 % pour les pH acide 4.78 % pour les pH basique avec un coefficient moyen de 4,88%. Les rsultats ont t reports dans le tableau 5 et le tableau 6.

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Tableau 5 : Effet du PH des solutions dispersantes (PBS) PH du milieu 5,6 Titre en Log DIO50/ml 3,2 3,9 4,1 3,3 3,7 4,1 3,71 0,16 4,31

7,2 6,0 6,3 5,9 5,7 6,1 6,2 6,03 0,22 5,55

7,9 3,9 3,3 4,0 3,4 3,8 4,2 3,76 0,18 4,78

Moyennes Log DIO50/ml Ecart-type (s) coefficients de variation (CV) en%

Tableau 6 : Analyse de la variance des rsultats de titrage des essais du facteur pH du PBS. Groupes 5,6 7,2 7,9 Nombre des essais 6 6 6 22,3 36,2 22,6 Somme Moyenne 3,71 6,03 0,01 0,07 Variance Ecart -type 0,16 O, 22 O, 18 F obs 12,40 Fth 2,55 Probabilit 2 ,94

Source des variations Entre Groupes Intra- groupes Total

3,76 0,02 Analyse de variance Somme des carrs ddl Moyenne des carrs 0,02 0,22 0,24 1 9 10 2,48 (CMa) 0,20 (CMe)

Les titres obtenus pour les diffrentes valeurs de pH sont diffrents, cependant comme le dmontre le tableau 5 sont presque similaires dans le cas ou le pH du milieu est neutre (7 0,2), par contre ceux obtenu par un milieu ou le pH est acide (5,6) ou basique (7.9) sont trs bas. Le traitement des rsultats obtenus, laide du test statistique ANOVA1, nous a montr que : Fobs = 12.40 > Fth =2, 55. Admettre l'hypothse H0 (i = 0i) c'est admettre que l'effet pH des solutions dispersantes (PBS) n'a pas d'influence significative sur le rsultat. Fobs = CMa/ CMe = 12.40 A comparer la limite Fth = F0, 95= 2, 55 d'aprs la table de la loi de Fisher Snedecore : Fobs > Fth Donc daprs les deux conditions fixes dans le test statistiques pour valuer les diffrents paramtres dinfluences, nous rejetons H0, c'est--dire le PH des solutions dispersantes (PBS) prsente une influence significative sur le rsultat final du titre viral, avec un risque de 5%. Pour le mode opratoire, nous conseillons dutiliser toujours des solutions dispersantes pH neutre (70,2). 3.2. Etablissement dun mode opratoire optimis Les observations ralises et les rsultats obtenus montrent que les drives sont courantes dans lapplication des modes opratoires et que ces drives ont un impact sur la qualit des rsultats. Il est important quune mthode dessai soit formalise de faon prcise afin dviter ces drives. Cette premire partie aboutit donc, la mise en place dun mode opratoire optimis, dont les lments volutifs sont dcrit dans le tableau 7, dfini de faon prcise ceci en tenant compte des axes doptimisation des diffrents facteurs de variation valus, aux rsultats obtenus et suite aux remarques releves aux moments de la pratique de la mthode. Ce mode opratoire optimis permet davoir un rsultat plus fiable et efficace.

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Tableau 7 : Mode opratoire optimis avec les facteurs de variation modifi Age des ufs embryonns EOPS pH du PBS Dure dincubation diluant du vaccin Conditions ambiante Incubation De 9 11 jours 7 0,2 (vrifier le pH en cas de doute). 5 jours Le vaccin vivant lyophilis est reconstitu dans lEau Distille Strile -Contrle de surfaces, -utilisation dun bain de glace 4C pour la prparation des dilutions virales (Le virus ne tolre pas les tempratures leves) Incubation des ufs embryonns EOPS (utiliss comme support biologique lors du titrage) dans un incubateur 37c. - La rpartition du PBS 2% dantibiotiques pour la prparation des dilutions laide des pipettes classe A de 10 0.05 ml. - La ralisation de la gamme de dilution se fait laide des micropipettes 1001000L.

Mtrologie

3.3. Validation proprement dite de la mthode 3.3.1. Evaluation de la Fidlit : 3.3.1.1. Evaluation de la Rptabilit Le coefficient de variation calcule dans les conditions de rptabilit est de 2.47 % (tableau 8): valeur inferieur au seuil de variation acceptable qui est de 5% (CV<5%), par consquent la mthode de titrage est rptable.
Tableau 8 : Rptabilit des essais du titrage du vaccin de rfrence N des essais Titre en LogDIO50/ml 1 5,9 2 5,8 3 6,2 4 6,0 5 6,2 6 6,3 7 6,0 8 6,1 9 5,9 10 6,1 11 6,0 12 6,2 Moyenne (X) 6,05 Ecart type () 0,15 Coefficient de variation de rptabilit en (%) 2.47 %

3.3.1.2. Evaluation de la Reproductibilit Dans cette tude, nous avons chang juste le facteur oprateur pour voir son effet sur la mthode danalyse. Les rsultats des essais des titrages relatifs ltude de reproductibilit, raliss pendant diffrents jours par deux oprateurs diffrents, sont rsums dans Le tableau 9, tableau 10 et, tableau 11.
Tableau 9 : Reproductibilit des essais du titrage du vaccin de rfrence
N des essais 1 2 3 4 5 6 Moyenne oprateur 1 Moyenne oprateur 2 Moyenne gnrale (X) Ecart type gnrale () Coefficient de variation de reproductibilit en (%) Titre en LogDIO50/ml Oprateur 1 Oprateur 2 5 ,8 5 ,9 6,1 6,1 6,0 6,2 6,1 6,05 6,02 6,01 0.18 % 2 ,32 6,1 6,0 5,8 6,1 6,2

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Le coefficient de variation calcule dans les conditions de reproductibilit est de 2.32% (tableau 9): valeur inferieur au seuil de variation acceptable qui est de 5% (CV<5%), par consquent la mthode de titrage est Reproductible. Toutefois, lapplication du test ANOVA1 vrifie si leffet du facteur oprateur entrane une diffrence significative au niveau des rsultats.
Tableau 10 : Analyse statistique des donns par lANOVA Groupes Nombre des essais Somme Moyenne Oprateur 1 Oprateur 2 6 6 36,3 36,1 6 ,05 6,01 Variance 0,019 0 ,021 Ecart type 0,18 0,19

Les rsultats de lanalyse de la variance sont groups dans le tableau 11.

Tableau 11 : Rsultats de lanalyse de la variance Source des variations Entre Groupes A l'intrieur des groupes Total Somme des carrs 0,003 0,20 0,20 ddl 1 10 11 Moyenne des carrs 0,003 (CMa) 0,020 (CMe) Fobs 0,16 Fth 4,96

Daprs la table de Fisher Snedecor, Fth = 4,96 - Si Fobs < Fth : les deux variances ne diffrent pas significativement un risque de 5% et le facteur test na pas dinfluence, on accepte lhypothse nulle H0. - Si Fobs > Fth : Les deux variances diffrent statistiquement un risque de 5 % et le facteur test a une influence significative, on rejette lhypothse nulle H0. Admettre lhypothse nulle H0 cest admettre que leffet oprateur na pas dinfluence ; daprs le tableau 11, Fobs = 0,16 < Fth = 4,96. Donc nous acceptons lhypothse nulle, les deux variances ne diffre pas significativement et le facteur oprateur na pas dinfluence sur la mthode de titrage. L'cartype gnral calcul est de 0,18 nous permet d'encadrer le rsultat attendu (RA) et de dire que la valeur vraie du titre recherch a une probabilit de 95 % de se trouver dans l'intervalle X- < RA < X + ou X est la moyenne gnrale et est l'cart-type moyen entre diffrents oprateurs. Ainsi pour un titre moyen de 6,01 obtenu dans les conditions de reproductibilit, les rsultats attendu peut fluctuer entre: X - < RA < X + Nous pouvons conclure que la mthode de titrage des vaccins virus vivant contre la maladie de Gumboro sur ufs embryonns EOPS est fidle puisqu'elle est rptable et reproductible. 3.3.1.3 Evaluation de lincertitude de mesure globale Selon le Conseil canadien des normes [25], lincertitude de mesure est dfinie comme lecartype gnral de tous les essais effectus de la rptabilit et la reproductibilit. Le tableau 12 ci aprs prsente lensemble des rsultats effectus lors de la validation de cette mthode de Titrage fin de dterminer lincertitude de mesure globale.

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Tableau 12: Incertitude de mesure des essais de titrages N des essais 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Moyenne gnrale (X) Ecart type gnrale () Titre en LogDIO50/ml 5,9 5,8 6,2 6,0 6,2 6,3 6,0 6,0 5,8 6,2 6,1 6,0 N des essais 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 6,03 0.20% Titre en LogDIO50/ml 5,8 6,1 6,2 5,9 6,1 6,0 5,8 6,0 5,9 6,0 5,9 6,0

Lvaluation de lincertitude de mesure a t dtermine par ltude de ltendue de mesure de la fourchette des rsultats des essais effectus au cours de la rptabilit et la reproductibilit, aprs optimisation de la mthode de titrage et maitrise de lensemble de facteur de variation. Ltendue de mesure calcule est de lordre de 0,2 sest rtrci aprs optimisation. Ceci veut dire que les performances de notre mthode se sont amliores et que la dmarche adopte aboutit a une fourchette de mesures raisonnable que nous pouvons appliquer pour les mesures qui seront ralises en routine. 3.4. Etablissement de la Carte de contrle des matriaux de rfrence La carte de contrle a t tablie pour vrifier la stabilit du titre du vaccin tmoin, et permettre une surveillance continue des performances de la mthode au fil du temps. Elle reprsente graphiquement lvolution de la qualit du matriel de rfrence interne et de la mthode danalyse. Ainsi, si le titre du vaccin tmoin est compris dans l'intervalle de confiance de sa carte de contrle le rsultat de lessai est valide et la mthode est stable. 3.4.1. Etablissement de la Carte de contrle prliminaire du vaccin de rfrence Tous les rsultats obtenus partir des essais prliminaires du titrage du vaccin Tmoin sont rsum dans le tableau 13, ils sont prsents dans la carte de contrle prliminaire du vaccin tmoin et illustrs par la figure 1.
Tableau 13 : Rsultats prliminaires des titres viraux du vaccin tmoin N des essais 1 2 3 4 5 Titre en LogDIO50/ml 5,9 5,8 5,8 6,1 6,2 Moyenne (X) Ecart-Type () LAI (X-1,96 ) LAS (X+1,96 ) LIC (X -3 ) LSC (X+3 ) N des essais 6 7 8 9 10 Titre en LogDIO50/ml 6,2 6,0 6,2 6,3 6,0 6,05 0,18 5,69 6,40 5,51 6,59

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Pour illustrer correctement ces notions statistiques, on reporte la moyenne, les limites de contrle et les limites dalerte infrieures et suprieures sur un graphique (figure1) reprsentant la carte de contrle prliminaire du vaccin de rfrence interne de laboratoire de la maladie du Gumboro.

Titre en 6.7 LogDIo50/mL 6.59 6.4 6.2 6.,1 5.9 5.8 5.69 5.51 5.4 5, 3 0 5
LIC LAI LSC LAS

Carte de contrle prliminaire du VRI IBDV produit sur ufs EOPS

X+3 s X+1,96 s

X-1,96 s X -3 s

10 15 20 25 30 Nombre d'essai

MOYENNE (X)

LAI (X-1,96s)

LAS (X+1,96s)

LIC (X -3 s)

LSC (X+3 s)

Figure 1 : carte de contrle prliminaire du vaccin de rfrence interne laboratoire

3.4.2. Etablissement de la Carte de contrle proprement dite du vaccin tmoin. Tous les rsultats obtenus partir des essais de la rptabilit et de la reproductibilit sont rsum dans le tableau 14, ils sont prsents dans la carte de contrle du vaccin tmoin dIBDV et illustrs par la figure 2.
Tableau 14 : Rsultats des titres des essais de la rptabilit et de la reproductibilit N des essais 1 2 3 4 5 6 7 Titre en LogDIO50/ml 5,8 5,8 5,9 6,2 6,1 6,2 6,0 Moyenne (X) Ecart-Type () LAI (X-1,96 ) LAS (X+1,96 ) LIC (X -3 ) LSC (X+3 ) N des essais 8 9 10 11 12 13 14 Titre en LogDIO50/ml 5,8 6,0 5,9 5,8 6,0 6,3 6,1 6,02 0,16 5,70 6,34 5,34 6,6

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Figure 2: Carte de contrle du vaccin tmoin produit sur ufs embryonns EOPS

4. Discussion
La validation dune mthode danalyse est de la responsabilit du laboratoire qui doit dfinir son protocole exprimental, en fonction de lobjectif et des besoins de ses clients. En effet la norme NF ISO 17025 nimpose aucun protocole exprimental au laboratoire pour valider une nouvelle mthode danalyse, mais insiste beaucoup sur les preuves objectives de lexactitude des rsultats en prcisant que la validation est toujours un quilibre entre les cots, les risques et les possibilits techniques. A notre connaissance, lobjectif dune mthode danalyse est de pouvoir quantifier le plus exactement possible chacune des quantits inconnues que le laboratoire aura dterminer. C'est--dire que lcart du rsultat danalyse et de la valeur vraie inconnue soit infrieur une limite dacceptation qui peut tre variable selon les exigences de lanalyste (et/ou du client) et de la finalit de la mthode danalyse. Inspir dautres travaux scientifiques raliss par dautres chercheurs, ce nouveau protocole de validation a t ralis, en essayant de garantir la qualit des rsultats ultrieurs avec un risque connu prdfini en fonction de la finalit de la mthode danalyse valider. Ltude de la premire partie de ce travail de recherche a permis dans un premier temps de mettre en vidence les facteurs de drives et de variation les plus importants susceptibles daffecter lexactitude analytique de la mthode de titrage des vaccins vivant de lIBDV laide de lobservation et la mise en place de la mthode, et dans un deuxime temps loptimisation des ractifs et des protocoles pour dduire un mode opratoire oprationnel et prcis. Lvaluation des diffrents paramtres de variations tudis a permis de limiter ceux influenant le rsultat tel que : le facteur pH des solutions dispersantes. Ceci a t dmontr laide de Lanalyse de variance un seul facteur (ANOVA1) qui a mis en vidence lexistence dune diffrence hautement significative (F0.05 > Fth). Ainsi, llvation des moyennes des titres dans le cas ou le PH des solutions dispersantes est neutre est tout fait normale du faite que le pH reprsente un facteur limitant pour la multiplication des particules virales contenu dans lchantillon tmoin. En effet, un pH acide ou basique du milieu peut diminuer la vitesse de la multiplication des particules virales du vaccin tmoin entrainant par la suite une chute des titres viraux de lchantillon tmoin et par consquent le rsultat attendu de lessai nest plus fiable. Donc ce paramtre, est considr comme facteurs limitant lors de lapplication en routine du mode opratoire. Par ailleurs, lvaluation des autres facteurs de variations na rvl statistiquement aucune diffrence significative. En outre, ltude du facteur ge des ufs embryonns EOPS, utilis comme support biologique pour la mthode de titrage, a donn des rsultats identiques sur les diffrents ges des ufs embryonns EOPS tudis. Ceci a t dmontr laide de Lanalyse de variance un seul facteur (ANOVA1) qui na pas mis en vidence lexistence dune diffrence significative (Fth> F0.05).

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De mme, nous savons tous que les dures dincubations plus ou moins longues, pourraient influencer sur la multiplication des particules virales de lchantillon tmoin, affectant ainsi le rsultat final de lessai. Toutefois, notre exprimentation a dmontr que ce facteur na pas dinfluence sur lessai, dans une fourchette de 5 7 jours. Ainsi, un temps dincubation de 5 jours a t retenu pour donner le rsultat le plus tt possible aux clients. Ces rsultats sont cohrents avec les instructions dcrites dans les normes internationales de titrage [14, 15,16] qui voquent tous lutilisation des ufs embryonns EOPS de 9 11 jours dges et des intervalles dincubation de 5 7 jours sans pour autant prciser la fois ni un ge des ufs embryonns EOPS absolu, ni un intervalle dincubation absolu pour le titrage. Tous les paramtres dcrits ci dessus sont, lvidence, lis entre eux. Ils psent sur les performances analytiques globales de la mthode de titrage et en fin de compte sur le niveau de confiance des rsultats obtenus. Cest pourquoi il est important de prendre en compte la phase doptimisation de la mthode dans ltape de validation. En effet, loptimisation des protocoles et des conditions opratoires est lune des principales tapes de la validation des mthodes danalyse physico-chimiques et biologiques dans la mesure o elle amliore leurs performances [10]. Lvaluation de cette tape doptimisation peut tre faite en comparant les caractristiques de validation avant et aprs optimisation. Toutefois, labsence ou la difficult daccs des travaux similaires, ne nous permet pas de comparer nos rsultats ceux dautres chercheurs. Cette premire partie aboutit la mise en place dun mode opratoire optimis, dfini de faon prcise et permet davoir un rsultat plus fiable et efficace. La seconde partie de notre travail a t destine la validation proprement dite de notre mthode, ceci en en valuant les critres de qualit retenus, afin de garantir la validit constante du rsultat, savoir la rptabilit ,la reproductibilit et lincertitude de mesure et en les comparant aux niveaux recommands par les normes. Nous savons tous que, toute mthode danalyse se caractrise par un vrai bais (erreur systmatique) et une vraie fidlit (erreur alatoire mesure par un cart-type). Ces deux paramtres qui caractrisent la mthode danalyse sont inconnus, tout comme la valeur vraie de lchantillon analyser. En fait, les expriences ralises lors de la validation permettront destimer ce vrai bais et cette fidlit qui seront dautant plus fiables que les expriences effectues sur des chantillons connus (matriaux de rfrence) seront adaptes et le nombre dessais appropris. Ces estimateurs de bais et de fidlit ne sont pas une fin en soi; ils sont une tape intermdiaire obligatoire pour pouvoir valuer si la mthode danalyse peut rpondre son objectif qui est de pouvoir ou non quantifier avec une exactitude suffisante chacun des chantillons analyser. Ainsi, pour valider une mthode danalyse, il faut que les coefficients de variation (CV) dans des conditions de fidlit intermdiaire soient infrieurs une valeur de tolrance, par exemple 5% choisi par le laboratoire selon des exigences normatives; et la diffrence entre le rsultat obtenu et la valeur vraie inconnue de lchantillon soit petite ou du moins infrieure une limite dacceptation. Pour cela, les estimateurs de biais et de variance obtenus grce des expriences effectues sur des chantillons connus (vaccin tmoin) nous renseignent ce pendant, si la mthode danalyse va pouvoir titrer les particules virales contenus dans le vaccin de rfrence avec une exactitude suffisante. En outre au cours de notre tude exprimentale , Lanalyse statistique des rsultats obtenus a dmontr que le CV calcul dans les conditions de rptabilit (2,47%) et le CV calcul dans les conditions de reproductibilit (2,32%) sont largement inferieur au seuil de variation acceptable (5%) tabli par notre laboratoire selon le Guide de validation des mthodes en biologie mdicale Cofrac [19]. Les rsultats de nos travaux de recherche obtenus sont donc statistiquement peu variables. Par ailleurs, la variabilit des rponses obtenues trs minime peut tre explique par la variabilit naturelle des caractres biologiques. Or il existe une variabilit normale des mesures exprimentales [4]. En effet, on sait que la variabilit des rponses obtenues peut sexprimer mme dans les conditions les plus semblables possible ; ainsi le mme vaccin, titr le mme jour, par le mme oprateur et la mme technique, exactement dans les mmes conditions, peut fournir des rsultats un peu diffrents. Cette variabilit augmente en gnral au fur et mesure que le nombre de facteurs augmente. Ces rsultats sont similaires ceux obtenus par dautres chercheurs [10]. Dans ces conditions, notre mthode danalyse est juge rptable et reproductible. Les travaux de dtermination de lincertitude de mesure dpendent du problme analytique. Pour valuer lincertitude de mesure par lanalyse statistique de donnes exprimentales, on peut recourir des donnes provenant de la validation, dessais intralaboratoires. Toutefois, il faut sassurer quau moment de lvaluation de lincertitude de mesure les conditions ne sont pas fondamentalement diffrentes de celles qui rgnaient au moment de la validation. En effet, toute valeur exprimentale est entache d'une incertitude de mesure qui limite lapplicabilit de la mthode utilise. La validation tudie et caractrise donc, les

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performances et les limites des mthodes dessai. Elle atteste quune mthode dessai convient lexcution dune certaine tche ds lors que lon tient compte des incertitudes. Ainsi, ltendue de mesure dtermin au cours de notre tude est de lordre de 0.2, na pas dpass la norme interne tablie par notre laboratoire, nous permet dinterprter les rsultats qui seront obtenus en termes de conformit / non-conformit dun vaccin des spcifications de titre dfinies par le fabricant. Aucune tude similaire nest disponible, nous permettant de comparer ou de confirmer nos rsultats obtenus. Par ailleurs, lvaluation de lincertitude de mesure travers lintervalle de confiance recommand par dautres chercheurs, nest pas toujours satisfaite car certains auteurs ont mont que lintervalle de confiance diminue quand on augmente le nombre de mesure [10] cependant ceci a peu dimportance dans notre cas malgr un nombre peu lev de mesure (30 mesures) notre intervalle de confiance reste acceptable. La phase dapplication en routine de la mthode valide aura naturellement un suivi par la construction dune carte de contrle qui permet de contrler le maintien dans le temps des performances de la mthode. En effet, La construction et lutilisation de cartes de contrles est aujourdhui considre comme un moyen indispensable de la matrise dun processus [7-18]. On peut, grce l'utilisation du vaccin de rfrence interne, obtenir des informations importantes quant la fidlit de notre mthode telle qu'elle est utilise dans le laboratoire et identifier toute modification apporte. En ralisant un grand nombre de titrages du vaccin tmoin, lorsque la mthode semble fonctionner correctement, on peut calculer la moyenne et l'cart type pour les titres recherchs du vaccin tmoin. Les rsultats des analyses successives rgulires du vaccin de rfrence interne effectues dans le cadre d'une srie normale d'analyses permettent d'valuer si la mthode est bien matrise, c'est--dire si le titrage du vaccin tmoin donne des rsultats conformes l'estimation initiale de la moyenne et de l'cart type. Nous pouvons aussi, confirmer que le vaccin de rfrence interne laboratoire utilis comme matriel de rfrence interne laboratoire au cours la validation de notre mthode est stable : si tous les rsultats des titrages se rpartissent de part et dautre de la valeure cible (moyenne); et si aucune tendance ascendante ou descendante des limites dalarme et des limites de contrle nest observe ni aucun comportement non alatoire nest remarqu au niveau du graphique. Selon Max Feinberg en 1999, si un de ces cas est retrouv tout le systme de mesure doit tre remis en question. La mthode valide et La matrise de sa mise en uvre permettront donc, de donner des rsultats fiables pour la prise de dcision en termes de conformit. Dans la mesure du possible, la justesse doit tre dtermine avec un matriau de rfrence certifi. Il est alors recommand de vrifier la justesse de la mthode laide dun raccordement une valeur de rfrence. Cette valeur de rfrence peut tre obtenue soit grce un vaccin de rfrence international de titre connu soit grce des essais inter- laboratoires permettant de calculer une valeur conventionnelle vraie. Le vaccin de rfrence international nest pas disponible actuellement. Donc Ltude de la justesse de la mthode devrait donc tre ralise travers la mise en place dun essai inter- laboratoire.

5. Conclusion
La mthode de titrage des vaccins viraux vivants contre la maladie de la bursite infectieuse aviaire sur ufs embryonns EOPS valide dans les conditions du Laboratoire Nationale de Contrle des Mdicaments Vtrinaires (LNCMV) Rabat Maroc, sest rvle fidle avec un cart type de rptabilit de 0.15, un cart type de reproductible de 0.18 un niveau de confiance de 95% , et avec une incertitude de mesure globale de 0.2; permet au laboratoire : daffirmer la fiabilit des dcision prises en termes de conformit et de non- conformit par rapport la qualit des vaccins contre la maladie de Gumboro utiliss sur le terrain marocain ; dviter, ou du moins minimiser le risque dun surcout non ngligeable suite la ranalyse lors dun doute en la fiabilit des rsultats en routine ; de prouver quil a mis en uvre des moyens techniques et humains adquats pour la ralisation des analyses demands par ses clients selon une qualit dfinie et reconnue ; de donner confiance ses clients dans les rsultats quil met ; de mettre en place des outils lui permettant une reconnaissance internationale telle que l'accrditation. Paralllement, la prparation dun vaccin de rfrence interne laboratoire homogne et a titre lev et la construction de la carte de contrle de ce vaccin donnent au laboratoire un matriau de rfrence pertinent pour le suivi, la surveillance et le maintien des performances de la mthode valide permettant la confirmation des rsultats dessais obtenus. Par ailleurs, les essais mens ont montr quil est toujours possible damliorer les performances dune mthode en tudiant lensemble des facteurs pouvant avoir un impact sur la qualit des rsultats. Cest pourquoi, nous suggrons de complter cette tude par lvaluation de la justesse travers des essais inter-

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laboratoires et de ltendre aux autres mthodes de contrle de la qualit des vaccins virus vivants du Laboratoire Nationale de Contrle des Mdicaments Vtrinaires Rabat Maroc.

References Bibliographiques
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ScienceLib Editions Mersenne : Volume 5 , N 130909 ISSN 2111-4706